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产氢菌的分离鉴定及产氢条件的优化 摘要 氢能是一种清洁能源，它不仅可以缓解能源危机又可以解决化石燃料带来的环境污 染，因此具有广泛的应用前景。厌氧发酵制氢是获得氢能的一种比较有潜力的方法，因 为它可利用有机废水和固体废弃物进行生产，而且操作过程比较简单。 本文采用二重叠皿隔绝空气培养法和平板涂布法从西安污水处理厂和宝鸡阜丰味 精厂的活性污泥中分离了l o 株产氢菌株。其中菌株w s 3 和菌株w j 5 的产氢量较高，菌 株w s 3 的产氢量最高，可达至u 9 8 8m l l ，产率为0 7 2 m o l h 2 m o l 葡萄糖。菌株w j 5 的 产氢量为9 0 5m l l ，产率为0 6 6 m o l h 2 m o l 葡萄糖。 依据伯杰细菌鉴定手册( 第八版) 、常用细菌鉴定手册，对2 株高效产氢菌 株w s 3 和m 5 进行了鉴定，初步鉴定结果如下：w s 3 为梭菌属( c l o s t r i d i u m ) ， w j 5 为肠杆菌属( e nt e r o b a c t e r ) 。 本实验还初步探索了产氢菌w s 3 生长特性。并对菌株w s 3 的发酵条件进行了优 化，最终确定菌株产氢菌w s 3 发酵产氢最优条件为：葡萄糖浓度为i o g l ，氮源为组 合氮源( 0 4 蛋白+ o 3 牛肉膏+ 0 2 酵母膏) ，l 半胱氨酸的浓度为o 5g l ，菌龄为1 6 h ， 接种量为1 0 ，温度为3 7 c ，初始p h 值为7 0 。优化后该菌的产氢量达1 6 8 9m l l ， 产氢率为1 2 4 m o l h 2 m o l 葡萄糖，比优化前提高了7 0 9 ，优化后菌株的平均产氢速率 为7 8 6 m l ( l h ) 比优化前的4 2 2m l ( l h ) 提高了8 6 3 。菌株w s 3 是一株具有高产氢 潜能的菌株，值得对该菌株进行更深入的研究。 本文还初步探讨了果渣预处理方法，以及果渣浓度对菌株w s 3 产氢的影响。初步 确定采用0 7 5 氨水室温下处理2 0h 是最佳的处理方法，菌株利用氨水预处理后的果渣 进行产氢实验时，最适的果渣浓度为2 0 9 l 。此时，产氢量和平均产氢速率达到最大值， 分别为9 3 4n ll l 和5 7 0m l ( l h ) 。 关键词：厌氧发酵产氢，产氢菌，条件优化 i s o l a t i o n ，i d e n t i f i c a t i o no f b i o h y d r o g e np r o d u c i n gb a c t e r i aa n dt h e o p t i m i z a t i o no fh y d r o g e np r o d u c t i o nc o n d i t i o n a b s t r a c t h y d r o g e ni sac l e a ne n e r g y , w h i c hc a nn o to n l ye a s et h ee n e r g yc r i s i sb u ta l s os 0 1 v et h e e n v i r o n m e n tp o l l u t i o nc o m i n gf r o mf o s s i lf u e l s t h e r e f o r ei th a s aw i d er a n g eo fa p p l i c a t i o l l s a n a e r o b i ch y d r o g e np r o d u c t i o ni sam o r ep o t e n t i a lm e t h o dt oo b t a i nh y d r o g e n e n e r g yf o rt h e r e a s o nt h a tc a nu s eo r g a n i cw a s t ew a t e ra n ds o l i d w a s t et op r o d u c eh y d r o g e na n dt h e o p e r a t i o ni sr e l a t i v e l ys i m p l e i nt h i sp a p e r , 10s t r a i n sh y d r o g e np r o d u c i n gb a c t e r i aw e r ei s o l a t e db yt h em e t h o d so f t w oo v e r l a p p i n ga i r - c u l t u r ed i s ha n dt a b l e tc o a t i n g m e t h o df r o mt h es e w a g et r e a t m e n tp l a l l ti 1 1 x i a na n db a o j if u f e n gm o n o s o d i u mg l u t a m a t ea c t i v a t e ds l u d g ep l a n t t h es t r a i nw s 3a n d t h es t r a i nw j - 5w e r eh i g hh y d r o g e np r o d u c t i o nb a c t e r i a t h es t r a i nw s 3w a st h e h i g h e s t h y d r o g e np r o d u c t i o nb a c t e r i af r o mw h i c hc a na c h i e v e9 8 8m l l ，t h eh y d r o g e np r o d u c t i o nr a t e w a s0 7 2 m o l h 2 m o lg l u c o s e ，t h eh y d r o g e np r o d u c t i o no f t h es t r a i nw j 5r e a c h e d9 0 5m l l t h eh y d r o g e np r o d u c t i o nr a t ew a s 0 6 6 m o l h 2 m o lg l u c o s e a c c o r d i n gt o ”b e r g e rb a c t e r i a li d e n t i f i c a t i o nm a n u a l ( e i g h t he d i t i o n ) ，”g e n e r a lm e t h o d s f o ri d e n t i f i c a t i o no fb a c t e r i ac o m m o n l yu s e d ，”t h e s t r a i nw s 3a n dt h es t r a i l lw j 5w a s i d e n t i f i e d t h ep r e l i m i n a r yi d e n t i f i c a t i o nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ：w s 3b e l o n g s t oc l o s 护触“所 w j 5b e l o n g st oe n t e r o b a c t e r t h i se x p e r i m e n ta l s os t u d i e dt h eh y d r o g e n p r o d u c t i o nc h a r a c t e ro f t h es t a i nw s 一3 w h i c h i n c l u d e dt h eb i o m a s sg r o w t h ，h y d r o g e np r o d u c t i o n ，g a sp r o d u c t i o n , v i a b l ec o u n t ，p h ，s u g a r c o n c e n t r a t i o nc h a n g e s c e l lg r o w t h ，h y d r o g e np r o d u c t i o na n dg a sp r o d u c t i o nh a dad e l a y p e r i o d ，t h e i rv a l u e sa tt h i ss t a g ee s s e n t i a l l yu n c h a n g e d ，w i t ht h ef e r m e n t a t i o nt i i l l ei n c r e a s e d t h e i rv a l u ei n c r e a s e sf i r s ta n dt h e ns t a b i l i z e du n t i lt h eh y d r o g e nt h ee n d o ff e r m e n t a t i o n t h ei m p o r t a n tf a c t o r so f i n f l u e n c i n gh y d r o g e nf e r m e n t a t i o nc o n c l u d ec a r b o na 1 1 di l i 缸o g e n s o u r c e s ，i n o c u l u ms i z e ，i n i t i a lp h ，f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e t h e s es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t w e r es t u d i e d t h e nu s i n gt h eo r t h o g o n a ld e s i g nt e s tm e t h o dt od e t e r m i n et h es t r a i nw s 3t s o p t i m u mh y d r o g e np r o d u c t i o nf e r m e n t a t i v ec o n d i t i o n t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eo p t i m u m m e d i u mg l u c o s ec o n c e n t r a t i o nw a s10 9 l t h eo p t i m i z e d n i t r o g e nc o m p o s i t i o nw a s0 4 p r o t e i na n do 3 b e e fe x t r a c to 2 y e a s te x t r a c t ，l c y s t e i n ec o n c e n t r a t i o nw a s0 5g l t h e o p t i m u mh y d r o g e np r o d u c t i o nf e r m e n t a t i v ec o n d i t i o nw e r et h a tb a c t e r i u ma g e16 h t h e i n o c u l a t i o n10 ，t e m p e r a t u r e3 7 ，i n i t i a lp h7 0 a f t e ro p t i m i z a t i o n ，t h eb a c t e r i a - sh y d r o g e n p r o d u c t i o nc a p a c i t yw a s16 8 9m l l t h eh y d r o g e np r o d u c t i o nr a t ew a s1 2 4 m o l h 2 m o l g l u c o s e i tw a si n c r e a s e d b y7 0 9 t h a nb e f o r e ( 9 8 8m l l ) t h eb a c t e r i a sa v e r a g eh y d r o g e n p r o d u c t i o nr a t ew a s7 8 6 m l ( l h ) ，i tw a si n c r e a s e db y8 6 3 t h a nb e f o r e ( 4 2 2m l ( l h 1 ) t h es t r a i nw s - 3w a sas t r a i nw i t hh i g hy i e l dp o t e n t i mo fh y d r o g e na n d w o r t h yo fm o r e i n d e p t hs t u d y t h i sa r t i c l ea l s od i s c u s s e dt h ee f f o r to ft h ep r e t r e a t m e n tm e t h o d so f a p p l er e s i d u eo nt h e s t r a i nw s 一3 sh y d r o g e np r o d u c t i o n t h ee f f o r to fa p p l er e s i d u e sc o n c e n t r a t i o nw a sa s l o i n v e s t e d t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eb e s tc o n c e n t r a t i o no fa m m o n i a l i q u i dw a so 7 5 a n dt h e b e s td i s p o s a lt i m ew a s2 0h o u r s u n d e rt h eo p t i m a lp r e t r e a t m e n to fa m m o n i a l i q u i d ，t h e o p t i m a lc o n c e n t r a t i o no fa p p l er e s i d u ew a s2 0 9 l a tt h i st i m e ，h y d r o g e np r o d u c t i o nw a s 9 3 4ml la n dt h ea v e r a g eh y d r o g e np r o d u c t i o nr a t ew a s5 7 0m l ( l h ) k e yw o r d s ：a n a e r o b i cf e r m e n t a t i v eh y d r o g e np r o d u c t i o n ，h y d r o g e np r o d u c i n gb a c t e r i a , o p t i m i z a t i o n 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许 论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所等机构将本学位论 文收录到中国学位论文全文数据库或其它相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名： 墨堡监 z指导教师签名： n i 2 + m 9 2 + 。万伟【删在f e 2 + 浓度对生物产氢动力学的研 究中发现，当f e 2 + 浓度为0 3 0 0m g l 时，混合细菌利用葡萄糖产氢发酵的产氢量和平均 产氢速率都随着f e 2 + 浓度的增加而增加；当f e 2 + 浓度为3 0 0m e d l 时，产氢量和平均产氢速 率达到最高，分别为3 0 2 3m l 和3 0 0m l h 。f e 2 + 是许多细菌生长的必需因子，它是铁 氧还原蛋白、细胞色素、铁硫蛋白和有关酶的辅助因子的组成部分，它也可以跟某些重 金属离子发生络合作用，以减轻这些重金属离子对菌体的毒害。在厌氧产氢发酵过程中 f e 2 + 发挥着重要的作用。m 9 2 + 是构成细胞壁和细胞膜的组分，也是许多酶的辅助成分， 对于产氢发酵而言也是必需的金属离子。 1 4 存在的问题及发展方向 现阶段绝大多数生物制氢的研究都处在实验室研究阶段，距离产业化还有较大的差 距，有许多问题和难点都需要进一步研究和解决【6 l 】： ( 1 ) 高效产氢菌株的选育。如何获得高效产氢菌是生物制氢首先要解决的问题，目前 还没有特别优良的高效产氢菌的报道，所以以后要加强这方面的研究，此外可采用基因 工程育种等方法对产氢菌进行诱变，使产氢菌的产氢能力得到提高。 ( 2 ) 产氢菌发酵产氢的稳定性。虽然利用产氢细菌发酵产氢的研究取得了较大的进 展，但如何保持产氢菌产氢的稳定性一直是困扰厌氧产氢工艺化的一个大障碍。许多科 研人员正试图通过固定化生物制氢技术来解决这一问题。 ( 3 ) 选择最优的产氢发酵工艺也是要亟待解决的问题。最适发酵的工艺条件对于提高 产氢效率具有重要的意义，在以后的研究中也要从这方面进行。 ( 4 ) 末端产物反馈抑制和混合菌间的相互作用。在进行产氢发酵过程中，底物的利用 率般很难达到1 0 0 ，就是因为存在末端产物抑制作用。在以混合菌( 光合细菌和发 酵细菌) 的有机废水产氢发酵过程中，发现了光合细菌和发酵细菌间存在抑制作用，以 致产氢效率较低。此外也发现有的高效产氢菌产氢的效率高于混合菌。但我们相信随着 现代科技的发展，这些问题在不久的将来都会得到解决。 ( 5 ) 可利用基质的研究。工农业废弃物( 如秸秆，糖蜜，果渣等) ，城市污水和固 体垃圾等都可作为产氢发酵的基质，利用这些基质产氢不仅可降低生产成本又可净化环 境。 9 第一章前言 ( 6 ) 副产物利用方面的研究。在生物制氢过程中不仅产生氢气，也会有许多副产物， 比如：乙醇、乙酸、丙酸、丁酸等。如何将这些产物分离并得到利用也是需要解决的问 题。 随着科技的进步生物制氢技术将得到更深入的发展。生物制氢技术也将会备受世人 瞩目。 1 5 本研究的目的和内容 生物制氢技术是一种获得清洁能源氢气的理想方法，其中的厌氧发酵生物制氢 技术，是一种极具工业化前景的制氢方法。利用有机废水或固体废弃物作为底物进行厌 氧发酵生物制氢研究，既能缓解能源危机，又能减少环境污染，具有重要的实际意义。 目前生物制氢技术仍然处于初级研究阶段，许多关键性问题，如高效产氢菌种的获 得、降低制氢成本以及产氢代谢机理的深入研究等仍未解决。针对目前生物制氢技术中 的研究热点及难点，本研究主要的目的是获得高效产氢菌并优化它的发酵条件，并最终 以固体废弃物为底物进行产氢发酵以达到减少环境污染和产生新能源的双重作用。结合 本实验室的研究基础和条件，主要展开以下几方面的工作。 ( 1 ) 优良产氢菌分离、理化性能及菌株初步鉴定。 ( 2 ) 研究培养基成分( 不同碳源、氮源、生长因子，) 和不同发酵条件( 菌龄、接种量、 初始p h 值、温度) 对菌株产氢的影响，采用正交设计法对分离得到的优势产氢菌进行 产氢培养基和工艺参数进行优化，提高其产氢能力。 ( 3 ) 以果渣为底物，对底物进行初步的预处理后进行产氢发酵，最终得到果渣发酵产 氢的最佳处理条件。 1 0 西北大学硕士学位论文 第二章产氢菌的分离纯化和鉴定 2 1 实验仪器与材料 2 1 1 实验仪器 l d z x 5 0 k b s 立式蒸汽灭菌锅，生化培养箱，超净工作台，m e t t l e ra e 5 0 分 析天平，7 2 2 型可见光分光光度计，s p 6 8 9 0 气相色谱仪( 热导检测器，氢火焰检测器) ， n i k o ne c l i p s e5 5 i 显微镜，n i k o nd i g i t a ls i g h td 卜_ 4 2 显微照相仪。梅特勒一托勒多 d e l t a 3 2 0 精密p h 计。 2 1 2 生物制氢装置 本实验采用的装置如图1 所示为自制的厌氧装置，主要由2 5 0 m l 锥形瓶，自制 1 0 0 0 m l 玻璃管，玻璃三通和1 0 0 m l 量筒组成的一套气体连通装置。装置在连接时一定 要检查气密性，保证厌氧环境。抽样口处的橡胶塞要经常检查，防止漏气。反应时，锥 形瓶放入恒温水浴锅中，温度设定为3 7 。 图2 1 生物制氢反应装置 f i g2 1e x p e r i m e n ts e t u pf o rt h eb a t c ht e s t s 2 1 1 3 培养基 ( 1 ) 产氢菌的分离纯化和产氢培养基 a 、产氢培养基( l ) ：蛋白胨4 ，牛肉膏3 ，酵母膏l ，n a c l 3 ， k h 2 p 0 4 1 5 ， m g s 0 4 7 h 2 0o 0 5 ， f e s 0 4 7 h 2 0o 0 5 ，葡萄糖1 0 ，l 半胱氨酸o 5 ，六合维 生素( v c ，v a ，v d 2 ，v b i ，v m ，v b 6 ) 2 5 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h = 7 0 ，1 1 5 c 灭菌3 0 m i n 。 b 、固体培养基：液体产氢培养基，加入琼脂1 6 之，用于分离菌种。 c 、半固体培养基：液体产氢培养基，加入琼脂0 5 0 7 ，用于保存菌种。 第二章产氢菌的分离纯化和鉴定 ( 2 ) 细菌生理生化鉴定培养基【6 l j a 、牛肉膏蛋白胨培养基，b 、葡萄糖蛋白胨培养基，c 、西蒙氏柠檬酸盐培养基 d 、明胶液化培养基，e 、吲哚试验液体培养基，f 、淀粉水解培养基， g 、m r 与v p 试验培养基( l ) ，h 、h 2 s 培养基，i 、尿素培养基， j 、硝酸盐还原培养基，h 、糖发酵培养基。 2 2 分析方法 2 2 1 气相组分分析 产生的气体用气相色谱法测定【6 2 1 ，采用g c s p6 8 9 0 型气相色谱仪，配置如下：热导检 测器( t c d ) ，色谱柱为3i 衄内径不锈钢柱( t d x 0 1 分子筛填充柱) ，氩气为载气，其 流速为4 0m l m i n 1 ，柱温、汽化室和检测室分别为9 0 c 、1 3 0 c 、1 3 0 。 氢气校正曲线：将氢气与氩气按不同的比例( 1 ：4 ；2 ：3 ；3 ：2 ；l ：1 ) 混合，用 微量进样器抽取不同体积( 5 0ul 、1 0 0l al 、1 5 0l al 、2 0 0l al ) 的混合气体注入气相色 谱仪，检测出不同体积氢气的峰面积，根据氢气的摩尔数( y ) 和峰面积( x ) 得到氢气 的校正曲线( um o l a r e ac o u n t ) y = 8 3 1 4 7 4 1 0 一x 1 8 3 1 4 1 0 。3 。 气相组分分析，定期从发酵产生的气体中取1 0 0ul 注入气相色谱仪中，通过检测出 氢气的峰面积计算氢气的产量。计算公式如下： 混合气体中氢气的物质的量： ，z ( 坍甜) = 墨翌塑尘旦譬高型矿 x 1 0 0l al 混合气体中氢气的锋面积 1 0 0 进样体积( ul ) v排水体积( 混合气体积l ) 底物产氢量，平均产氢速率，混合气体中氢气的百分含量分别为： 底物产氢量( m l l 培养基) ：y h 2 - - 1 0 0 0 - 旷n 一, r t 平均产氢速率( m l ( l 培养基h 1 ) ) ：r h 2 塾 f 氢气的百分含量( ) ： c = 一n l l 1 2 r 一是摩尔气体常数，r = 8 3 1 4 j ( k m 0 1 ) 。 t - 表示温度，用k ( 开尔文) 表示。 p 一一表示标准大气压p = 1 0 1 3 2 5p a 1 2 西北大学硕士学位论文 1 1 l 一发酵过程中累积产生的总氢气的摩尔数 n 2 发酵过程中累积产生的总气体的摩尔数 t - 一总的反应时间 2 2 2 发酵液的组分分析 发酵液中有机酸、醇的浓度用气相色谱法测赳6 3 石5 1 ，采用g c s p6 8 9 0 型气相色谱仪， 检测时先对发酵液进行预处理，进样量为1ul 。采用g c s p6 8 9 0 型气相色谱仪，其配置 如下：氢色谱柱为3m l t l 内径不锈钢填充柱( t d x 0 1 高分子小球) ，火焰离子化检测器 ( f i d ) ，载气为n 2 ，其流速为4 0m l m i n 1 ，h 2 流速为4 0m l m i n 1 ，空气流速为4 0 m l m i n ，柱温为17 0 ，汽化室和检测室温度均为2 0 0 。 液相产物标准曲线的绘制 试剂：乙醇分析纯密度0 7 8 9f e r a l ； 乙酸分析纯密度1 0 9 4g m l ； 丁醇分析纯密度0 9 6 1g m l ；丁酸分析纯密度0 9 5 9g m l ； 丙酸分析纯密度0 9 9 3 酌n l 首先确定每种有机酸或醇类的保留时间，然后将乙醇、丁醇、乙酸、丙酸和丁酸以 1 ：1 ：l ：1 的体积比准确配置成标准混合溶液，混合均匀后分别准确吸取0 0 4ul 、0 0 8 ul 、0 1 2ul 、0 1 6pl 、0 2pl 注入气相色谱。根据各个标样的物质的量( y ) 和峰面积( x ) 得到各个液体组分的校正曲线及各成分的保留时间如表2 1 ： 表2 1 液相组分的校正曲线和在气相色谱中的保留时间 t a b l e2 1c a l i b r a t i o nc u r v e sa n dr e t e n t i o nt i m eo fl i q u i dp h a s ep r o d u c t 样品校正曲线 r 保留时间( s ) 乙醇 y = 1 0 8 9 9 1 0 以2 x + 1 5 9 1 6 4 1 0 0 9 9 7 1 2 2 1 9 乙酸y = 1 8 6 1 7 1 0 0 2 x + 8 2 6 1 4 1 0 7 0 9 9 9 33 4 8 6 丙酸 y = 8 7 0 0 8 1 0 3 ) 【+ 2 7 5 7 8 1 0 7 。0 9 9 9 33 9 3 4 丁醇 y = 7 1 5 7 6 1 0 q 3 x + 3 2 2 0 4 1 0 0 9 9 9 7 2 5 3 2 丁酸y = 7 0 2 6 5 1 0 。1 2 舢4 3 7 1 1 0 。3 0 9 9 9 64 6 9 7 样品测定：在发酵结束后，取lm l 发酵液在5 0 0 0 r r a i n 下离心3m i n ，取上清液进样。 测定时用微量进样器准确吸取1ul 上清液，注入气相色谱仪检测，将检测得到各成分的 峰面积分别带入液体组分的校正曲线得出各种成分的含量。 2 2 3p h 值测定 培养基的p h 值直接采用p h 计( 梅特勒一托利多d e l a t3 2 0 ) 测量；在测量发酵液 1 3 第二章产氢菌的分离纯化和鉴定 p h 值时，取1 0 “发酵液，2 0 0 0r m i n 离心2 0m i n ，取上清液用p h 计测量。 2 2 4 细菌生物量的测定 将发酵液进行适当的稀释后，采用7 2 2 型可见分光光度计在6 0 0 n m 处测定发酵液的 吸光度值，记作菌浊o d 6 0 0 。 2 2 5 发酵液中还原糖含量的测定 采用3 ，5 二硝基水杨酸法( d n s ) 【删测定发酵液中还原糖含量。 ( 1 ) 葡萄糖标准曲线的绘制 a 、试剂： d n s 试剂：称取酒石酸钾钠4 5 5 9 ，溶于1 2 5m l 蒸馏水中，加热溶解，于热溶液 中依次加入3 ，5 - 二硝基水杨酸( d n s ) 1 5g ( 先配成溶液) ，n a o h5 2g ( 先配成溶液) ， 苯酚1 2 5 9 ，无水硫酸钠1 2 5g 搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至2 5 0 m l ，过滤。贮于 棕色瓶中，室温保存放置一周后使用。但是一定要注意，3 ，5 二硝基水杨酸和n a o h 的加入时间一定要很近，或者是先加入n a o h 。否则会产生难溶的沉淀，导致配制溶液 失败。且配置过程中，溶液加热温度不宜超过5 0 。 葡萄糖标准溶液( 1 m g m l ) ：用分析天平称取干燥后的葡萄糖0 1 0 0 9 ( 在烘箱1 0 5 干燥4 h ) ，溶于2 0m l 蒸馏水中，之后转移溶液至1 0 0 m l 的容量瓶，用蒸馏水定容 至l o o m l 。 b 、操作步骤： 按照表2 2 规定的量进行实验，每个管做3 个平行样，0 号为空白对照。 表2 2 葡萄糖标准曲线反应体系组成 t a b l e 2 2c o n s t i t u e n to fs t a n d a r dg l u c o s es o l u t i o n 1 4 西北大学硕士学位论文 将各管充分混匀后同时置于沸水浴中加热煮沸5r a i n ，冷却至室温后再分别向各试 管中加入蒸馏水定容至2 0r n l ，混匀。试管o 为空白对照，在5 4 0a m 波长处测各管的 吸光度。绘制葡萄糖浓度和吸光度的关系曲线，得到回归方程，回归系数在0 9 9 5 0 以上 才能使用。最终确定葡萄糖的标准曲线为：y = 1 0 8 1 7 x + 0 3 8 6r 2 = o 9 9 7 5 如图2 2 1 4 1 2 1 毯0 8 爱0 6 o 4 o 2 o oo 20 40 60 811 2 a 值 图2 2 葡萄糖的标准曲线 f i g2 2 t h es t a n d a r dc u r v eo fg l u c o s e 2 3 实验方法 2 3 1 菌种筛选 产氢菌的选育流程图如下： 圃l 匝夏虱一匪困一垭匾圃 卜 匦亟回一圆一匿亟卜圆 图2 3 菌种选育流程图 f i g2 3t h ep r o c e e d i n go ft h eb r e e d i n go ft h es t r a i n 2 3 1 1 样品采集和预处理 本实验采集的样品分别取自宝鸡阜丰味精厂和西安市污水处理厂的厌氧池和沉淀 池。 将采集的活性污泥样品分成两组进行试验，一组不做处理，一组进行热处理。热处 理具体过程如下：将采集的活性污泥样品取1 0 9 用无菌水稀释至1 0 0 m e ，加热煮沸 1 5 r a i n 。加热的目的主要是限制耗氢菌和产甲烷菌的生长，而使产氢菌存活下来。 2 3 1 2 富集培养 1 5 第二章产氢菌的分离纯化和鉴定 在超净工作台上，分别取l o m l 预处理后和未处理的菌悬液接种于盛有1 5 0 m l 产氢 培养基的2 5 0 m l 的三角瓶，连接产氢装置，置于3 7 水浴锅中培养，2 0 h 后三角瓶中 的培养基变浑浊并有大量气体产生，测量所产气体的组分，若有氢气存在，则说明产氢 菌得到富集。 2 3 1 3 产氢菌的分离： 采用二重叠皿隔绝空气培养法和平板分离方法。 取l m l 富集好的培养液用无菌术或生理盐水依次制成1 0 1 0 7 稀释梯度的菌悬液。 ( 1 ) 分别取1 0 4 ，1 0 ，1 0 石，l o 7 四种稀释梯度的菌悬液进行双层板操作，3 7 。c 培养 1 2 3 6 h ，挑取产气泡的单个菌落于液体试管培养基中，上封液体石蜡以隔绝空气，3 7 培养1 2 - - 2 4 h 后，看是否有气泡产生，若有气体产生，对菌体进行染色，观察茵体形态， 大小是否一致，若菌种不纯，重复上述操作直到得到纯化的菌株。 ( 2 ) 分别取1 0 4 ，1 0 一，1 0 。6 ，l o 7 涂平板，3 7 。c 培养2 4 h 后，挑单茵落于液体试管培 养基中，上封液体石蜡以隔绝空气，3 7 培养1 2 - - 2 4 h 后，看是否有气泡产生，若有气 体产生，对菌体进行染色，观察菌体形态、大小是否一致，若菌种不纯，重复上述操作 直到得到纯化的菌株。 2 3 1 4 菌种初筛 将分离到得产氢菌株接种于盛有6 0 m l 产氢培养基的小瓶中，以翻口橡皮塞密封， 置于3 7 。c 的生化培养箱中培养，1 2 - - 3 6 h 后，用1 0 0 1 t l 的微量进样器抽取小瓶中的气体， 采用气相色谱法检测其是否含有h 2 ，以此来判断此菌株是否为产氢菌株。 2 3 1 5 产氢菌的复筛： 将初筛到的菌株接种于盛有6 0 r a l 的产氢培养基的小瓶中，上封1 5 m l 石蜡以隔绝空 气，3 7 。c 的生化培养箱中培养，作为种子液，培养2 0 h 后，将种子液接种于2 0 0 m l 产氢 培养基，连接产氢装置，置于3 7 * ( 2 水浴锅中培养。在培养期间，检测气相组分中h 2 的含 量，根据单位体积培养基产氢量的多少来比较不同菌株的产氢能力，筛选出产氢能力较 高的菌株。 2 - 3 1 6 菌种保藏 本实验主要半固体培养基保藏法和斜面宝藏法。 2 3 2 产氢菌的鉴定 通过对菌株的菌落形态、个体形态、革兰氏反应、芽孢和鞭毛有无的观察和生理生 化【6 7 】检测结果，依据伯杰细菌鉴定手册( 第八版) 1 6 8 | 、 常用细菌鉴定手册1 6 9 1 对 1 6 西北大学硕士学位论文 菌种进行鉴定。 2 3 3 产氢菌生长曲线测定 采用间歇试验测定菌株的生长曲线，将培养2 4 h 的产氢细菌按5 的接种量接种于 盛有1 0 0 0 m l 液体产氢培养基的1 0 0 0 m l 锥形瓶中，在3 7 。c 恒温水浴条件下培养，定时 测其产气总量、产氢量、p h 值、菌浊o d 6 0 0 和活菌数的变化，从而绘制产氢菌的生长 曲线。 2 4 结果与讨论 2 4 1 产氢菌的分离与筛选 经过初筛和复筛，最终筛选出1 0 株产气能力较高的菌株。不同菌株的产氢能力有所 差异，如图2 4 所示。其中菌株w s 3 ，w s 2 ，b h 1 7 ，b h 一2 0 ，w j 5 ，w j 8 的产氢量 ( yh 2 ) 均大于8 0 0m l l 培养基，其中w s 3 的产氢量( yh 2 ) 可以达至1 j 9 8 8m l l 培养基，最 大产氢速率q m a x ( m lh 2 ( l h ) ) 可达至u 1 0 3 2m lh 2 ( l h ) 。这6 株菌的产氢能力与文献 报道的比较见表2 3 。 1 0 0 2 0 o z 翻最大产氢速率q m a x ( m l ( l h ) ) w s 一2w s 一3w s 一6w s 一8b h 一11 b h 一1 7b h 一2 0w j 一5w j 一8w j 一1 4 菌株 图2 4 复筛所得产氢菌的产氢能力 f i g2 4h y d r o g e np r o d u c t i o na b i l i t yo fr e - i s o l a t e dh y d r o g e np r o d u c t i o ns t r a i n 1 7 。 简呻吾芎cl) 帅 l 9 8 7 6 5 4 3 2 l o 一车1)，1en工ea褥艘嫡钆k嚼 翦= 章产氧菌的分离纯化和罄定 表2 j 缔选出的产氢菌株产氢能力的比较 t a b l e 2 3 h y d r o g e np m d u c f o ea b u i t y o fr e - i s o l a t e db y d r o g e np r o d u c t i o n 实验参考文献 茁株产氢量( m l ，l 培养基)菌株 产氢量( m l l 培基基) w s - 3 w s - 6 b h 1 7 w j - 5 9 8 8 8 0 7 8 4 3 9 0 5 4 0 76 0 7 0 】 4 5 0 1 7 1 l 通过复筛得到的这6 株产氢菌，单位培养基的产氢量都大于8 0 0 r n l 几，与文献中的 产氢量相比这些菌株具有较高的产氢量。其中菌株w s 一3 的产氢量最高，可达n 9 8 8m l 几，葡萄糖的产率为07 2 m o l h 2 m o | 葡萄塘。菌株w j - 5 的产氢量达n 9 0 5 m l l ，葡萄糖 的产率为06 6 m o lh 2 t o o l 葡萄糖。 2 4 2 菌株的鉴定 对于复筛出来的6 株菌，选择其中产氢量较高的两株w s 3 和w j 5 进行了鉴定。 其形态学观察见袁2 4 和图25 。其生理生化反应结果见表2 5 。 表2 4 细蘸的形态特征 t a b l e 2 at h e m o r p h o l e f i c a l c b a r a c t e r i s t l e s o f b a c t e r i a 菌株编号 菌体形态 革兰氏染色芽孢 运动性菌体大小( 咖) s t a i n s m o r p h o l o 蛩, g r a m ss t a i n s p o r em o t i l i t y b a c t e f i e ds i z e w s - 3杆状6+ 中生芽孢运动 0 6 t t m l 30 p m - 56 t u n “、 w s - 3w j - 5 圈2 5 菌株w s - 3 z 和w j 5 革兰氏染色细胞形态圈 f 幢2 5 m i c r o 酏o p i e m o r p h o l o g l eo b s e r v a t i o n s o f t h ec e l l so f t h es t r a i n s w s - 3a n d w j - 5 蟛 、 一 ， 一 西北大学硕士学位论文 表2 5 菌株w s - 3 和w j - 5 的生理生化鉴定结果( 一) t a b l e2 5 p h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f t h es t r a i nw s - 3a n dw j - 5 _ _ _ _ - _ _ _ _ - _ _ _ - _ _ _ _ 一i l l _ _ - _ - _ _ _ - - - _ _ - _ _ _ _ _ - - - _ _ _ - - - - - _ _ _ - - _ _ _ - - _ _ _ 一 试验名称 e x p e r i m e n t 结果r e s u l t w s 3w j 5 对氧的需求 t h e d e m a n df o ro x y g e n 氧化酶 o x i d i z i n ge n z y m e t e s t 产生h 2 s h 2 s t e s t 利用柠檬酸盐 c i t r a t at e s t 吲哚试验 i n d o l et e s t 接触酶 c o n t a c te n z y m et e s t 水解尿素 h y d r o x y e t h y lu r e a m r 试验 m e t h y lr e dt e s t v p 试验 v o g e s - p r o a k a u e rt e s t 硝酸盐还原 n i t r a t er e d u c t i o nt e s t 厌氧 a n a e r o b i c 兼性厌氧 a m p h i m i c r o b i a n 附注：表中“+ ”代表阳性反应，“一”代表阴性反应。 表2 5 菌株w s - 3 和w j - 5 的生理生化鉴定结果( 二) t a b l e2 5 p h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h es t r a i nw s - 3a n dw j - 5 附注：表中“+ + ”代表产酸产气，“+ 一”代表产酸不产气，“一一”代表未产酸产气。 一 + 一 + + + 一 十 一 一 + + 一 一 + 一 一 第二章产氢菌的分离纯化和鉴定 依据伯杰细菌鉴定手册( 第八版) 、 常用细菌鉴定手册，初步鉴定结果如下： w s 3 为梭菌属( c l o s t r i d i u m ) ，w j 5 为肠杆菌属( e nt e r o b a c t e r ) 。 2 4 3 菌株w s 3 生长特性测定 菌株w s 3 的产氢能力是筛选出的产氢菌种中最高，所以首先测定该菌株的生长特 性。并进行后面的产氢条件的优化实验。 2 4 3 1 菌株w s 3 的生长曲线 菌株w s 3 的生长曲线如图2 6 所示。 81 0 1 21 41 61 82 02 22 42 6 2 8 t h 图2 6w s - 3 生