（食品科学专业论文）2酮基D葡萄糖酸半连续发酵及其动力学研究.pdf

学位论文版权使用授权书 江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊( 光盘版) 电子杂 志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制 手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致，允许论文被查阅和借阅， 同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入中国学位论文全文数据库并向社会提 供查询，授权中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社将本论文编入：中国优秀博硕士学位论 文全文数据库并向社会提供查询。论文的公布( 包括刊登) 授权江苏大学研究生处办理。 本学位论文属于不保密 学位论文作者签名：f 司廷彩乙 z d lt 年石其l 昌 指导教师签名：厂弓护素豸；钮 z q i 1 年6 勇| 肾 s t u d y o ns e m i c o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o no f 2 一k e t o - d g l u c o n i c - a c l da n c li t s - 【l n e t i c s 姓 2 0 1 1 年0 6 月 摘要 2 酮基d 葡萄糖酸( 2 k e t o - d g l u c o n i ca c i d ，2 k g a ) 是一种以葡萄糖为主要原料发 酵生产的有机酸，具有广泛的工业用途。目前规模化生产2 k g a 普遍采用的是补料分批 发酵工艺。虽然补料分批培养的方法能够通过提高发酵培养基的总糖浓度，从而达到提 高发酵液中目标产物2 k g a 浓度的目的，但是生产效率难以进一步提高。本研究试图在 2 k g a 生产中以半连续发酵工艺替代国内现行的补料分批发酵工艺，以达到提高生产强 度、增加设备利用率、降低发酵成本的目的。本研究的主要内容如下： 1 通过测定发酵液的旋光度及其葡萄糖质量浓度，计算发酵液中2 k g a 的质量浓 度，并考察该方法实际应用的可行性。结果表明：对照品溶液的旋光度、2 k g a 质量浓 度和葡萄糖质量浓度之间存在良好的线性关系，r 2 0 9 9 9 9 1 该方法精密度、稳定性和 重现性良好，2 k g a 的平均回收率为1 0 2 6 0 ，r s d 为2 1 7 ( n _ 5 ) 。该方法可用于发 酵液中2 k g a 的定量检测。 2 对2 k g a 产生菌荧光假单胞菌a r 4 的种子培养过程和不同葡萄糖浓度条件下的 分批发酵过程进行了研究。考察了种子培养过程中的p h 值、菌体生长量、葡萄糖浓度的 变化，发现种子培养至2 0 h e t 较适合移种，以进行后续的发酵；考察了糖浓度分别为 8 8 9 l 、1 2 1 9 l 、1 5 4 9 l 、1 8 7 9 l 、2 2 0 9 l 时分批发酵的转化率和生产强度，发现适合 分批发酵的葡萄糖浓度范围在1 5 4 1 8 7 9 l ，该范围可以作为适合于补料分批发酵和多级 半连续发酵的初始葡萄糖浓度范围。 3 在单级半连续发酵和两级半连续发酵过程中，研究了不同补料时机、分割量和补 料培养基糖浓度对2 k g a 发酵的影响。结果表明，2 k g a 单级半连续发酵的最佳工艺条 件是：补料时机为葡萄糖降至2 0 9 l ，分割量为6 0 ，最佳补料培养基浓度为1 7 8 2 9 l ； 2 k g a 两级半连续发酵的最佳工艺条件是：补料时机为葡萄糖降至2 0 9 l ，一级罐分割 量7 0 ，二级罐最佳补料培养基浓度为1 7 8 2 9 l 。在优化的条件下，单级半连续发酵和 两级半连续发酵的转化率和生产强度分别达到8 7 9 6 2 7 6 、6 7 1 o 0 8 9 l h 和8 9 1 2 4 - 4 9 5 、5 8 14 - 0 m g l h 。综合各种因素考虑，可以认为单级半连续发酵工艺是一种 生产2 k g a 的高效方法。 4 对优化后的2 k g a 单级半连续发酵的动力学进行了研究。由l o g i s t i c 和 l u e d e k i n g p i r t 模型方程分别建立了荧光假单胞杆菌产2 k g a 发酵过程中菌体生长、产物 积累和底物消耗的动力学模型。模型模拟计算结果与实验值可以较好地吻合，平均相对 i 2 一酮基一d 一葡萄糖酸半连续发酵及其动力学研究 误差在1 0 以内。 关键词：2 酮基d 葡萄糖酸，荧光假单胞杆菌，半连续发酵，动力学 江苏大学硕士学位论文 a b s t r a c t 2 - k e t o - d g l u c o n i ca c i d ( 2 k g a ) i sa ni m p o r t a n to r g a n i ca c i dp r o d u c e df r o md g l u c o s e a n dh a saw i d ea p p l i c a t i o ni ni n d u s t r i e s t h ef e d b a t c hf e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g yi ss t i l lak e y s t r a t e g yf o rt h ep r e s e n t2 k g ab i o p r o d u c t i o np r o c e s si na ni n d u s t r i a ls c a l e f e d - b a t c h s t r a t e g y c i l i a i m p r o v et h ef i n a l2 k g ac o n c e n t r a t i o n i nt h eb r o t h b yi n c r e a s i n g t h e c o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t eg l u c o s e ，h o w e v e li t sp r o d u c t i v i t yc o u l dn o tb ei n c r e a s e df u r t h e r h e n c e ，t h ep r e s e n ts t u d ya t t e m p t e dt oe m p l o yas e m i c o n t i n u o u so p e r a t i o nf o rs u b s t i t u t i n gt h e c u r r e n t2 k g af e d - b a t c hp r o d u c t i o np r o c e s si no r d e rt oa c h i e v eh i g h2 k g ap r o d u c t i v i t y , l o w e rf e r m e n t a t i o nc o s t ，a n di n c r e a s et h eu t i l i z a t i o nr a t i oo fe q u i p m e n t s t h em a i nr e s u l t s o b t a i n e da r el i s t e da sf o l l o w s ： lt h ec o n c e n t r a t i o no f2 k g ai nf e r m e n t a t i o nb r o t hw a sc a l c u l a t e do nt h eb a s i so f g l u c o s ec o n c e n t r a t i o nd e t e r m i n e d 谢mo p t i c a lr o t a t i o nd e g r e e ，a n dt h ea p p l i c a t i o nf e a s i b i l i t y o ft h ed e t e r m i n a t i o nm e t h o dw a sa l s oi n v e s t i g a t e d r e s u l t ss h o w e dt h a tal i n e a rr e l a t i o n s h i p b e t w e e no p t i c a lr o t a t i o nd e g r e ea n dt h ec o n c e n t r a t i o n so f2 k g aa n dg l u c o s ew a ss i g n i f i c a n t 0 9 9 9 9 ) 1 1 1 ea v e r a g er e c o v e r yr a t eo ft h i sd e t e r m i n a t i o nm e t h o dw a s1 0 2 6 0 w i t h r s do f2 17 ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h i sm e t h o dh a sc h a r a c t e r i s t i c so fp r e c i s i o n ，s t a b i l i t ya n d r e p r o d u c i b i l i t y , a n dc a n b eu s e df o rd e t e r m i n i n g2 k g a i nf e r m e n t a t i o nb r o t h 2t h es e e dc u l t u r eo f2 k g a p r o d u c i n gs t r a i n ，p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n sa r 4 a n de f f e c t o fg l u c o s ec o n c e n t r a t i o no nt h eb a t c hf e r m e n t a t i o np r o c e s s e sw e r ei n v e s t i g a t e d t h eo b s e r v e d c h a n g e so fp hv a l u e ，c e l lg r o w t ha n dg l u c o s ec o n c e n t r a t i o nd u r i n gt h ec u l t u r ep r o c e s s i n d i c a t e dt h a t2 0 hc u l t u r e ds e e dw a sag o o di n o c u l u ma n df a v o r i t ef o r s u b s e q u e n t f e r m e n t a t i o n e f f e c to fd i f f e r e n tg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n si n c l u d i n g8 8 9 l ，1 2 1 9 l ，1 5 4 9 l ， 18 7 9 la n d2 2 0g lo nc o n v e r s i o nr a t ea n d p r o d u c t i v i t yo f2 k g ab a t c hf e r m e n t a t i o n sw e r e a l s os t u d i e d ，a n dr e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg l u c o s ec o n c e n t r a t i o nb e t w e e n15 4 18 7 9 ld i df a v o r f o rf o rb a t c hf e r m e n t a t i o n , a n da l s of o rt h ei n i t i a lc o n c e n t r a t i o n so ff e d - b a t c hf e r m e n t a t i o n a n d m u l t i p l y i n g - s t a g es e m i c o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o no f2 k g a 3i no r d e rt oo b t a i nah i i 曲2 k g ay i e l di ns i n g l e - s t a g ea n dt w o - s t a g es e m i - c o n t i n u o u s p r o d u c t i o no f2 k g a ，t h ei n f l u e n c e so ff e e d i n gt i m e ，d i s c h a r g er a t ea n dg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n i nt h ef e e dw e r ei n v e s t i g a t e d t h eo p t i m a lp r o c e s sp a r a m e t e r so f s i n g l es t a g es e m i c o n t i n u o u s i i i 2 一酮基一d 一葡萄糖酸半连续发酵及其动力学研究 2 k g af e r m e n t a t i o nw e r eo b t a i n e d 舔：t h ef e e d i n gw a ss t a r t e dw h e nt h eg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n d e c r e a s e dt o2 0 9 ；l ，d i s c h a r g er a t ew a s6 0 ，a n dg l u c o s ec o n c e n t r a t i o ni nt h ef e e dw a s 17 8 2 9 l a n dt h eo p t i m a l p r o c e s sp a r a m e t e r so ft w os t a g es e m i c o n t i n u o u s2 k g a f e r m e n t a t i o n ：t h ef e e d i n gw a ss t a r t e dw h e nt h eg l u c o s ec o n c e n t r a t i o ni l lt h ef i r s ts t a g e d e c r e a s e dt o2 0 9 l ，d i s c h a r g er a t ew a s7 0 ，a n dg l u c o s ec o n c e n t r a t i o ni nt h ef e e d i n gw a s 17 8 2 9 li nt h es e c o n ds t a g e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m i z e dp a r a m e t e r sc o u l dg i v et h e c o n v e r s i o nr a t ea n d2 k g ap r o d u c t i v i t yi n o n e - s t a g e a n dt w o s t a g es e m i c o n t i n u o u s f e r m e n t a t i o ns y s t e ma s8 7 9 6 4 - 2 7 6 ，6 7 1 + 0 0 8g l ha n d8 9 1 2 4 - 4 9 5 ，5 8 1 4 - 0 0 1g l 也 r e s p e c t i v e l y , f r o mt h ea b o v er e s u l t s ，t h es i n g l e s t a g es e m i - c o n t i n u o u ss t r a t e g yc o u l db e a sa l l 江苏大学硕士学位论文 目录 第一章绪论。 i 12 ，酮基d 葡萄糖酸概述1 1 1 12 酮基d 葡萄糖酸的用途及其合成途径l 1 1 22 k g a 的发酵工艺2 1 2 半连续发酵的研究进展3 1 2 1 半连续发酵的应用范围4 1 2 2 半连续发酵的特点6 1 2 3 半连续发酵的类型6 1 2 4 半连续发酵与连续发酵的联系7 1 2 5 半连续发酵过程中菌体的重复利用7 1 3 立题意义一9 1 4 研究的主要内容9 第二章旋光法测发酵液中2 一酮基d _ 葡萄糖酸 1 l 2 1 材料和方法1 2 2 1 1 材料和试剂一1 2 2 1 2 仪器与设备1 2 2 1 3 方法1 2 2 1 4 数据处理1 3 2 2 结果与分析13 2 2 1 对照品溶液的旋光度与其葡萄糖及2 k g a 浓度之间的线性关系1 3 2 2 2 精密度实验1 4 2 2 3 稳定性实验1 4 2 2 4 重现性实验1 4 2 2 5 回收率实验1 4 2 3 小结1 5 第三章2 一酮基- 0 - 葡萄糖酸分批发酵 1 6 3 1 材料和方法1 6 3 1 1 菌种1 6 3 1 2 培养基1 6 3 1 3 仪器与设备一1 6 v 2 一酮基d 一葡萄糖酸半连续发酵及其动力学研究 3 1 4 培养条件1 7 3 1 5 测定方法1 7 3 1 6 数据处理1 7 3 2 结果与讨论18 3 2 1 种子生长曲线1 8 3 2 2 葡萄糖浓度对分批发酵影响1 8 3 2 3 分批发酵曲线1 9 3 3 小结2 0 第四章2 一酮基一d - 葡萄糖酸半连续发酵 4 1 材料与方法2 1 4 1 1 菌种2 1 4 1 2 培养基2 l 4 1 3 仪器与设备2 2 4 1 4 培养条件2 2 4 1 5 测定方法2 3 4 1 6 数据处理2 3 4 ，2 结果与讨论2 3 4 2 1 单级半连续发酵2 3 4 2 2 两级半连续发酵2 5 4 3 不同发酵工艺的比较2 8 4 4 多周期单级半连续发酵培养过程曲线2 8 4 5 小结2 9 第五章2 酮基d - 葡萄糖酸半连续发酵的动力学研究 3 l 5 1 材料和方法3 2 5 1 1 菌种一3 2 5 1 2 培养基一3 2 5 1 3 仪器和设备3 2 5 1 4 培养条件3 2 5 1 5 测定方法3 3 5 1 6 动力学模型的建立3 3 5 2 结果和讨论3 4 5 2 1 荧光假单胞杆菌a r 4 发酵动力学类型3 4 5 2 2 半连续首批次发酵模型3 6 5 2 3 半连续重复批次发酵模型：3 8 5 2 4 模型的验证4 l 5 3 小结4 2 第六章工作总结及展望。 6 1 全文主要结论4 4 6 2 存在的问题及展望4 4 参考文献 致谢 4 6 在攻读硕士学位期间发表的论文。 i 1 12 酮基d 葡萄糖酸概述 1 1 12 酮基d 葡萄糖酸的用途及其合成途径 2 酮基d 葡萄糖酸( 2 k e t o - d g l u c o n i ca c i d ，2 k g a ) 是一种以葡萄糖为主要原料发 酵生产的有机酸，具有广泛的工业用途，如作为饲料的富钙添加剂、洗涤剂的促净剂、 水泥增塑剂和摄影显影剂等，还可以作为合成除莠化合物、糠醛、n 阿拉伯糖、d 核酮 糖、d 异抗坏血酸及其钠盐的前体，其中最重要的用途是作为合成食品添加剂d - 异抗 坏血酸及其钠盐的前体【1 1 。 2 k g a 的生产方法主要有酶法、化学合成法和发酵法3 种。( 1 ) 酶法：在吡喃糖2 氧化酶( p y r a n o s e - 2 一o x i d a s e ) 、葡萄糖一2 氧化酶( g l u c o s e 2 - o x i d a s e ) 以及葡萄糖1 氧化 酶( g l u c o s e - l - o x i d a s e ) 中任何一种酶的催化下，用0 2 将溶液中的d 葡萄糖氧化为d 葡糖醛酮或d 葡萄糖酸6 内酯，然后选择吡喃糖2 氧化酶和葡萄糖1 氧化酶的一种 酶，催化氧化d 葡糖醛酮或d 葡萄糖酸6 内酯为过氧化氢和2 k g a t 2 】；( 2 ) 化学合成 法：以葡萄糖为起始原料，以p t p b 作为催化剂，使0 2 与葡萄糖反应生成2 k g a 3 】：( 3 ) 发酵法：利用细菌将发酵培养基中的葡萄糖直接转化为2 k g a 4 1 。 考虑到生产成本方面的因素，目前在2 k g a 工业生产中通常采用的是发酵法，即利 用细菌直接转化发酵培养基中的葡萄糖为2 k g a 。国内外己报道的2 k g a 产生菌有荧光 假单胞杆菌( p s e u d o m o n a s f l u o r e s e e n s ) 、粘质沙雷氏菌( s e r r i t i am a r c e s c e n s ) 、鸡血藤欧 文氏菌( e r w i n i am i l l e t i a ) 、球状节杆菌( a r t h r o b a c t e rg t o b f f o 朋豇) 、铜绿假单胞杆菌 ( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) 、恶臭假单胞杆菌( p s e u d o m o n a sp u t i d a ) 和产酮产碱菌 ( a l c a l i g e l , l e $ k e t o g e n e s ) 等【5 】，其中以荧光假单胞杆菌的应用最为普遍。 脱氧核糖酸途径( e d 途径) 似乎是假单胞杆菌属葡萄糖代谢的主要途径【6 ，在铜 绿假单胞杆斟引、荧光假单胞杆菌【9 1 和恶臭假单胞杆斟1o 】中，葡萄糖进入e d 途径可能 有3 条途径：第一条途径包括葡萄糖的吸收和随后的磷酸化、氧化过程，形成6 磷酸葡 萄糖酸( 6 p g ) ：第二条途径包括葡萄糖的直接氧化形成胞外葡萄糖酸、随后为葡萄糖 酸的吸收和磷酸化产生6 - p g 的过程；在第三条途径中，葡萄糖氧化形成的葡萄糖酸被 进一步氧化，在胞外形成2 k g a ，然后胞外的2 k g a 被吸收、磷酸化和还原，产生6 - p g 。 2 一酮基一d 一葡萄糖酸半连续发酵及其动力学研究 某些假单胞菌属的细菌具有氧化葡萄糖为2 k g a 的能力。在适宜的培养条件下，这 些菌株缺乏进一步代谢2 k g a 的某些酶，使氧化葡萄糖并积累2 k g a 在葡萄糖代谢中 占有主导地位【i l 】。2 k g a 的生物合成途径1 1 2 , 1 3 1 如图1 1 所示。 葡萄糖脱氢酶葡萄糖酸脱氢酶 葡萄糖葡萄糖酸2 k g a 图1 12 k g a 的e 物合成途径 f i g 1 1b i o s y n t h e s i sp a t h w a yo f 2 k g a 1 1 22 k g a 的发酵工艺 最初的2 k g a 发酵生产采用的是分批发酵工艺。在2 k g a 分批发酵过程中，发酵 培养基的葡萄糖浓度一般不超过18 0 9 l ，控制在1 0 0 1 4 0 9 l 。葡萄糖浓度过低，会增 加产物在下游分离提取的难度：葡萄糖浓度过高发酵周期明显延长，发酵转化率也会有 所降低【1 4 1 。 鉴于分批发酵的生产效率远远无法满足大规模工业化生产需要，因此国内外相关学 者对一系列的改进工艺进行了研究。 早在19 6 4 年，m i s e n h e i m e r 等【1 5 】就对粘质沙雷菌生产2 k g a 的补料分批发酵进行 了研究。通过流加补料的方式，能够使总糖浓度达到1 8 0 9 l ，转化率达到8 8 1 4 一- 9 2 7 8 ， 但是不足之处发酵周期比较长。n u n h e i m e r 等报道了一种用氨水或氨气代替c a c 0 3 作为中和剂生产2 k g a 的补料发酵工艺。通过采用补氨工艺，在发酵过程中将p h 值控 制在5 2 5 8 之间，有可能将葡萄糖浓度提高至3 0 0 9 l 左右。这种方法可以达到提高 投糖浓度和缩短发酵周期的目的，缺点是难以达到较高的转化率。 2 0 世纪9 0 年代中期，国内学者也对2 k g a 的补料分批发酵工艺进行了研究。何建 明等【1 7 】利用产酮产碱基菌e 5 4 分别在5 l 和1 4 7 l 发酵罐上分别进行了2 k g a 的补料分 批发酵，发酵转化率和发酵周期分别为9 1 1 7 、8 9 3 2 和3 5 h 、4 6 h ，为2 k g a 工业化 生产提供了一定的参考。孙文敬等n 8 1 在5 0 0 0 0 l 发酵罐规模上进行了2 k g a 的补料分批 发酵试验，实现了2 k g a 补料分批发酵工艺的产业化。 2 k g a 的连续发酵在较早的时候也有报道。在两个发酵罐中，b u l l 等【1 9 】以部分菌体 再循环的方式进行了2 k g a 连续发酵研究。发现膜阻塞问题并没有发生，连续发酵3 0 0 h 2 江苏大学硕士学位论文 没有出现异常。但作者也指出，通过膜过滤的方式进行培养基的消毒在工业化生产中似 乎不可行，另外这种发酵：亡艺的工业应用需要大型再循环技术的支撑，而这种技术还不 成熟。李中兵【2 0 】考察了不同的补料葡萄糖浓度、不同的稀释率和刁i 同补料速率对单级连 续发酵生产2 k g a 的影响，并且对平衡态的转换过程也进行了研究，但是在这种方式生 产2 k g a 似乎无法实现高转化率与高生产强度的统一。 利用固定化细胞技术生产2 k g a 是近些年来的一个研究热点。钟晓红等【2 1 】选用了海 藻酸钠、k 卡拉胶和脱乙酰几丁质三种载体分别包埋恶臭假单胞杆菌生产2 k g a ，通过 对载体包埋细胞后的机械强度、菌体泄漏、平均2 k g a 转化率和反复利用时间等指标进 行考察，发现以海藻酸钠为载体固定化细胞来生产2 k g a ，产量能够接近游离细胞，产 酸水平较为稳定，能够反复利用8 6 4 h ，可以认为是较为理想的一种固定化载体，作者同 时也指出，由于凝胶表层营养成分高、氧含量充足，导致表层形成了高密度的细胞薄层。 郑志勇等1 2 2 】也对固定化细胞生产2 k g a 进行了尝试，以海藻酸钠和聚乙烯醇作为载体进 行荧光假单胞杆菌的固定化，反复利用多次固定化细胞生产2 k g a ，产量较为稳定。虽 然固定化增值细胞生产2 k g a 在某些方面有一定的优势，但是诸如氧传递受到限制、菌 体细胞泄漏等问题无法得到有效的解决。因此b i c h 等【1 】通过固定化休止细胞的方式，以 海藻酸钠为载体进行2 k g a 的发酵。在每一个反应周期结束后，将所有的反应混合物全 部移出反应器，取出固定化细胞，用含有氯化钙的醋酸盐缓冲液来进行冲洗，以进行下 次反应。结果发现这种方法能够实现菌体的再循环，利用菌体1 4 d ，菌体活性没有大的 损失，而且转化率能够达到9 4 ，高于现行生产工艺所达到的水平。但是这种方式生产 2 k g a 也有一定不足之处：底物的浓度较低导致无法获得高浓度产物、以溶解氧为指标 控制发酵进程的操作方式过于繁琐等。 鉴于现有的各种2 k g a 发酵工艺已经不能适应大规模工业生产的要求，本研究试图 在2 k g a 生产中以半连续发酵工艺替代国内现行的补料分批发酵工艺，以达到提高生产 效率、增加设备利用率和降低发酵成本的目的。 1 2 半连续发酵的研究进展 半连续培养，又称反复分批培养或换液培养，是指在分批培养的基础上不全部取出 反应系，剩余部分重新补充新的营养成分，再按分批培养的方式进行操作。这是反应器 内培养液的总体积保持不变的操作方式【2 3 1 。本文讨论了半连续发酵工艺的相关研究进 展，为半连续发酵工艺的应用提供了一定的参考。 3 2 一酮基一d 一葡萄糖酸半连续发酵及其动力学研究 1 2 1 半连续发酵的应用范围 1 2 1 1 菌体的生产 对于部分微藻的培养，无论是工业生产规模还是实验室研列2 籼2 7 1 ，半连续培养模式 都是最佳的模式之一。在微藻的半连续培养过程中，更新率对微藻的生长和细胞内生化 组分有重要的影响，是一个比较关键的参数【2 8 1 。 1 2 1 2 代谢产物的生产 在规模化工业生产中，半连续培养应用于生产微生物代谢产物的实例主要有：醋酸、 青霉素和酒精。 ( 1 ) 醋酸 早在1 9 7 7 年，v e r a 等就曾证实：假如采用深层液体发酵工艺生产醋酸，醋酸的生 成速率主要取决于两个因素：醋酸菌的生长速率和活菌体浓度。在连续培养体系中，由 于醋酸菌的比生长速率较低和处于高浓度醋酸环境中，导致比产物生成速率较低，因此 高产酸率和高浓度醋酸的发酵不宜采用连续发酵【2 9 1 。为了尽可能的提高生产强度，缩短 非生产时间，工业上广泛采用的是半连续发酵工艺生产醋酸。 国外一些企业较早将半连续发酵工艺应用于醋酸生产中，以西德h e i n r i e hf r i n g s 公 司为例，其醋酸的工艺过程基本如下：当发酵进行至乙醇浓度接近零时，将发酵罐中的 发酵液放出4 0 ，然后将新鲜酒醪( 含醋酸l g 1 0 0 m l 和乙醇1 3 9 1 0 0 m l ) 泵入发酵罐 中进行下次发酵。在整个过程中需要不断通气和保持温度恒定，醋酸的浓度可以达到 1 3 3 9 1 0 0 m l ，发酵液中残存乙醇含量为0 2 9 1 0 0 m l 左右。如果新鲜酒醪的添加方式正 确( 包括输送管的排列方式合理和发酵液快速而均匀的混合) 和放罐时间掌握恰当，下 次发酵不会有生长延滞期出现，而是直接进入对数生长期【2 9 1 。宫明宇等【3 0 】做过半连续醋 酸发酵的小试和生产性试验，认为醋酸发酵过程中分割时机的选择是非常关键的，应该 在酸度不再上升之前，结合大生产的需要，以2 2 - - 一2 4 h 分割一次为宜，且分割量应该保 持在2 5 左右。半连续发酵的试验结果与分批发酵相比，原料出品率和淀粉利用率均下 降4 左右，但是上罐率和产量分别提高3 4 和4 0 。 ( 2 ) 青霉素 半连续发酵工艺另一个非常重要的应用在青霉素的生产方面。自从f l o r e y 成功从点 青霉的培养液中获取了青霉素，青霉素行业在随后的几十年中得n t 迅猛发展。最初青 霉素的效价总是停留在一个较低的水平，但是随着对青霉素发酵动力学的深入研究，发 现比生长速率在0 0 1 5 h - 1 时青霉素生产能力最大，这一认识推广到工业生产中，就形成 4 江苏大学硕士学位论文 了目前青霉素发酵工业普遍采用的半连续流加发酵工艺，我国工业界通俗地称为青霉素 发酵带放工艺 3 q 。青霉素半连续发酵工艺的大致操作为：在达到发酵终点时，放出2 0 4 0 的发酵液进入后续的提取工艺，尉时补充相同体积的新鲜培养基继续进行发酵，这 种操作可以反复进行多次而不会导致产量的减少，还能增加发酵罐的体积利用率【3 2 】。徐 猁弱l 傲道了另一种半连续发酵生产青霉素的方法：将青霉素半连续发酵过程中带放的发 酵液，通过管道转移到另一个无菌发酵罐中进行补料再培养，直至青霉菌进入自溶阶段。 这种方法充分发挥了处于稳定期青霉菌的次级代谢能力，大大缩短了生产周期，节约的 成本相当可观。 ( 3 ) 酒精 酒精的大规模生产现在大多采用连续浓醪发酵工艺，尤其是年产几十万吨的大型酒 精生产企业，一般采用4 - - 6 级连续发酵工艺，通过减少整体返混的方式来缓解产物的 抑制作用阻i 。但也有采用半连续发酵工艺生产酒精的报道，如刘晓峰等【3 5 1 在特大型发酵 罐生产酒精的过程中，从设备投资、杂菌污染控制等方面对连续发酵工艺与半连续发酵 工艺进行了比较，得出了利用半连续发酵工艺在特大型发酵罐中生产酒精更为合理的结 论。表华伟【3 6 】认为以淀粉为原材料半连续发酵生产酒精，一方面对于间歇发酵而言提高 了设备利用率，缩短了发酵周期；另一方面为将来的连续发酵生产酒精打下基础，以便 整个酒精生产实现自动化控制。岳国君等【3 刀对燃料乙醇的生产技术做过评述，认为国外 企业生产乙醇的过程中，通过将多级连续发酵工艺、同步糖化发酵工艺以及酵母的自絮 凝技术相结合，显著降低了成本，优于国内企业多采用的半连续发酵工艺。 除了醋酸、青霉素和酒精之外，未见应用半连续发酵工艺大规模生产代谢产物的报 道。有的代谢产物的生产虽然采用半连续操作方式取得了成功，如：乳酸【3 8 】、富马酸【3 9 】、 甘油 4 0 l 、脂肪酶【4 1 1 、二羟丙酮【4 2 ，4 3 】等，但仅限于实验室规模中，离实现大规模工业生产 还有一段距离。 1 2 1 3 垃圾的厌氧消化 厌氧消化，是在无氧条件下，污泥中的有机物由厌氧微生物进行降解和稳定的过程， 由水解产酸阶段和厌氧发酵产气阶段组成 4 4 1 。目前，垃圾的厌氧生物处理工艺种类较多， 有学者尝试了利用半连续操作方式进行垃圾的厌氧消化，如w a n g 等【4 5 】在实验室规模和 实际生产规模中，通过对分批操作模式和半连续操作模式下甲烷的生产强度和挥发性固 体的转移量进行了比较，得出了半连续操作模式效率更高的结论。k e a r n e y 等【4 6 】在半连 续厌氧消化过程中，研究了大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌等几种 2 一酮基一d 一葡萄糖酸半连续发酵及其动力学研究 菌的活性，为下一步更高效的进行厌氧消化提供了定的参考。李来庆等【4 7 】建立了番茄 废物半连续厌氧消化的动力学模型，该模型能够用于蔬菜废物半连续厌氧消化过程的参 数优化，并可以为工程上的应用提供一定的技术支持。 1 2 1 4 微生物的体外培养 早在上世纪五十年代就有利用体外系统来模拟胃肠生态系统的相关研究，如 r u f e n e r 等【4 8 1 较早提出连续培养系统可以用于模拟瘤胃微生物系统。但也有报道 4 9 , 5 0 称 对于肠道微生物系统的模拟，采用半连续培养系统能取得更好的效果，例如c a m p b e l l 等【4 9 1 研究肠道菌群对异型生物质毒性的解除作用时，认为连续培养与半连续培养的区别 就在于营养物添加和废物移除的方式不同：连续培养系统虽然能够提供相对恒定水平的 营养物，使微生物保持在稳定的状态，但回肠内的流质却是以类似脉冲的方式进入大肠 的，因此半连续培养模式与之更为相似，也更适用于肠道微生物的模拟。 1 2 2 半连续发酵的特点 微生物发酵过程可分为分批、补料分批、半连续、连续等几种方式【5 1 】。分批发酵的 人力、物力消耗较大，每批发酵都需要进行装料、灭菌、接种、放料、清洗等操作，工 序繁琐，发酵周期较长，生产效率较低；补料分批发酵虽可通过补料补充养分或前体的 不足，但是由于有害代谢产物的不断积累，产物合成最终难免受到阻遏。连续发酵较分 批发酵和补料分批发酵生产强度大大提高，但容易遭受杂菌的污染，菌种易退化，设备 投资较大，且发酵产物浓度较低。 半连续发酵过程中，放掉部分发酵液，再补入适当料液不仅补充养分和前体而且代 谢有害物被稀释，从而有利于产物的继续合成。但半连续发酵也有它的不足之处：( 1 ) 放掉发酵液的同时也丢失了未利用的养分和处于生产旺盛期的菌体；( 2 ) 定期补充和带 放使发酵液稀释，送去提炼的发酵液体积更大；( 3 ) 发酵液稀释后可能产生更多的代谢 有害物，最终限制发酵产物的合成；( 4 ) 一些经代谢产生的前体可能丢失。据此，采用 此工艺必须考虑上述的技术限制，不同的品种应具体情况具体分析【5 。 1 2 3 半连续发酵的类型 1 2 3 1 单级半连续发酵 单级半连续发酵具有操作简单和应用普遍的特点，但是它无法充分利用底物和菌 体。合理的补料与放料的策略是其达到理想产率的关键。m a c i a s 等5 2 1 在醋酸的单级半连 续发酵过程中，采用计算机模拟的方法，对不同的补料放料策略( 指定时间放料与指定 6 江苏大学硕士学位论文 产物浓度放料) 进行比较。结果表明在工业生产中指定的时间下补料放料较为合适，而 对于高浓度醋酸的生产，则在产物浓度达到指定值时补料放料更合适。 1 2 3 2 多级半连续发酵 鉴于单级半连续发酵往往无法充分利用底物和菌体，许多学者 5 3 - 5 5 】尝试通过增加反 应器的级数的方式柬提高底物的利用率、避免代谢产物或代谢副产物在后期影响菌体的 活性，如：董晋军等【5 3 1 为了避免发酵后期菌体大量死亡并尽可能缩短发酵周期采用了两 级半连续发酵工艺进行琥珀酸的生产，生产强度达到2 3 8 9 l h ，远远高于分批发酵和 补料分批发酵的生产强度1 1 3 9 l h 和1 3 6 e ：l h ，取得了较好的效果。b a u e r 等【5 5 】 在两级半连续发酵生产二羟基丙酮的过程中，利用荧光原位杂交技术，研究了高浓度产 物对菌体生长的抑制作用，并据此确定了两级半连续发酵工艺中一级罐的放料时机( 二 羟基丙酮浓度达到8 2 9 l ) ，是一种比较稳定的方法。 1 2 4 半连续发酵与连续发酵的联系 半连续发酵工艺与连续发酵工艺的应用能够大大延长产物的生成期，但由于补料和 放料策略的不同，又导致了两种发酵工艺存在一系列的差异。 p i r t l 5 6 j 认为如果以流加的方式进行反复补料分批发酵，使整个培养系统达到拟稳态 ( 比生长速率约等于稀释率) ，那么培养液的体积、稀释率以及相关的参数都会出现周 期的变化。当反复补料分批发酵的周期趋近于无穷多，放料体积趋近于无穷小时，可以 获得近似恒化培养的稳态，获得的产物浓度趋近但不超过通过恒化培养得到的浓度。而 且由于恒化培养对化学环境要求严格，反复补料分批发酵在技术上更容易实现。 f e n c l 等 s t l 在培养产蛋白圆酵母菌体时，对半连续培养和连续培养这两种方式进行 了比较。他认为菌体的比生长速率越低，二者的区别会越小，假如半连续培养的两次补 料的间隔非常短( 例如几分钟)