（食品科学专业论文）乳酸乳球菌中冷应激蛋白的表达及其抗冻保护作用.pdf

摘要 乳酸菌在食品工业中扮演者重要角色，参与许多个发酵过程。作为牛乳中检出率最高的 菌乳酸乳球菌( 1 , 1 a c t i ss u b s p 1 a c t i s ) ，有较强的产酸力及蛋白质分解能力，对多种链球 菌、葡萄球菌、芽孢菌、乳杆菌有抑制作用。在干酪、发酵奶油、奶酪的发酵剂中经常使用。 因此对其发酵后冷却及冷冻保藏过程中的存活率的研究至关重要。目前，国内有很多机构和 学者是从研究保护剂等外部条件的保护作用的角度出发，而对乳酸菌自身抵抗环境变化的保 护机制研究较少。 有一明显现象大多数微生物( 包括乳酸菌) 都能适应比其最佳生长温度低得多的低温环 境，诱导产生一系列分子质量7 k d a 左右的蛋白质，这一系列蛋白质被称为冷应激蛋白，它 们一般由6 8 到7 4 个氨基酸构成，都存在5 个反平行1 3 折叠股的b 桶状片层结构。它们的主 要功能是作为r n a 分子伴_ f g ( r n ac h a p e r o n e ) 与m r n a 结合，阻止m r n a 二级结构形成， 促进翻译。 本课题主要针对乳酸乳球菌中冷应激蛋白。研究了不同冷处理条件下冷诱导蛋白产生及 对菌体抗冻特性的影响，并通过n i c e 系统高效表达冷应激蛋白c s p c 、c s p d 基因，进一步 证实了c s p s 的作用。课题主要分为以下几部分： 1 通过a r r h e n i u s 的建立，确定了对乳酸乳球菌乳酸亚种k l d s 4 0 1 3 冷处理的两个温度区间， 分别为：2 8 1 3 之间和小于1 3 。 2 1 0 保持4 h 的冷处理使菌体冻融存活率较未处理的空白样增加了2 0 0 倍以上，而加入 氯霉素的对照组存活率接近于或低于未处理的空白样。初步推断可能是氯霉素抑制了某种蛋 白合成，而这种新合成的蛋自在低温条件下被诱导表达，保护细胞，使菌体获得抗冻特性。 3 通过s d s p a g e 电泳，发现冷处理样有两条分子量为分子量分别为7 3 、6 1 k d a 的蛋白， 初步确定为冷应激蛋白。 4 利用p c r 技术获得乳酸乳球菌乳酸亚种k l d s 4 0 1 3 中冷应激蛋白c s p c 、c s p d 的基因片 段。 6 利用n i c e 系统高效表达冷应激蛋白c s p c 、c s p d 基因并对表达产物进行s d s p a g e 电 泳分析，得出c s p c 、c s p d 的相对分子量分别为7 、6 2 k d a 。 6 为了确定玲应激蛋白c s p c 、c s p d 的作用。做了三个实验：1 1 测定3 0 菌体的生长曲线： 2 ) 菌体生长到对数期中期( o d s 】o = 0 8 ) ，转至7 培养，测定低温刺激对苗体生长影响；3 ) 测定4 个循环的冻一溶试验的活i 暂数。通过空白菌株与重组菌株的比较，可以得出：c s p c 使 菌体更加迅速的恢复了生长；冷应激蛋白c s p d 增强了菌体的抗冻存活率( 增加了3 0 - 4 0 倍) 。 本课题的研究结果表明冷处理能提高苗体抗冻存活率，并发现了在冷处理条件下有7 k d a 左右的冷休克蛋白的合成，这为乳酸菌中冷应激蛋白对低温受损伤菌体的改善作用提供了理 论依据。利并jn i c e 系统高效表达冷应激蛋白c s p c 、c s p d 基因，试验证实：c s p c 使菌体更 加迅速的恢复了生长；c s p d 增加了菌体冷冻存活率，但这种蛋白不是决定菌体抗冻性的唯 一因素。 关键词：乳酸乳球菌；冷应激蛋白；c s p c 、c s p d 基因克隆、表达及抗冻保护作用 a b s t r a c t e x p r e s s i o no fc o l ds h o c k p r o t e i n so fl 1 a c t i sa n dt h e i r e f f e c t si nc r y o p r o t e c t i o n a b s t r a c t l a c t i ca c i db a c t e d a ( l a b 、p l a ya l li m p o r t a n tr o l ei nt h ef o o di n d u s t r yb e c a u s eo ft h e i rw i d e a p p l i c a t i o na ss t a r t e rc u l t u r e si nm a n yf e r m e n t a t i o np r o c e s s e s l a c t s w h i c hi so n eo ft h em o s t i m p o r t a n tl a bi n v o l v e di nt h ed a i r yi n d u s t r y , h a v eaf e r m e n t a t i v em e t a b o l i s ma n dw a sw i d e l y a d o p t e df o rm a n u f a c t u r i n gd a i l yp r o d u c t sl i k eb u t t e r m i l k , y o g u r ta n dc h e e s e d u r i n gp r o c e s s i n g a n dr i p e n i n go ff e r m e n t e dd a i r yp r o d u c t s ，c o l ds t r e s sm i g h tb ei m p o r t a n tf o rt h es u r v i v a lo fs t a r t e r c u l t u r e sa f t e rf r o z e ns t o r a g ea n df o rf e r m e n t a t i o n st a k i n gp l a a tl o wt e m p e r a t u r e s m a n yb a c t e r i a ，i n c l u d i n gl a c t i ca c i db a c t e r i a , a r ea b l et oa d a p tt ot e m p e r a t u r e sf a rb e l o wt h e i r o p t i m u mg r o w t ht e m p e r a t u r e s a n das e to f7 - k d ap r o t e i n si ss t r o f l g l yi n d u c e di nr e s p o n s et oa r a p i dd e c r e a s ei ng r o w t ht e m p e r a t u r e ，n a m e dc o l ds h o c kp r o t e i n s t h e ya r e6 5 - 7 0a m i n oa c i d r e s i d u e sl o n ga n da l lo ft h es t r u c t u r e sc o n t a i nf i v ea n t i p a r a l l e lbs t r a n d st h a tf o r magb a r r e l c s p s m a yf u n c t i o na sr n ac h a p e r o n e s a st h e yp o s s e s sb i n d i n gm e s s e n g e rr n a i nt h i sw a yt h e yc o u l d m i n i m i z et h es e c o n d a r yf o l d i n go fm r n a , t h e r e b yf a c i l i t a t i n gt h et r a n s l a t i o np r o c e s s i nt h i ss t u d y , t h e r ei sg r e a ti n t e r e s to nt h ee f f e c to fd e a l i n gw i t hd i f f e r e n tc o l ds h o c ks t r e s s e s o nc o l ds h o c kp r o t e i n sa n df r e e z e - s u r v i v a lc a p a c i t yo f l 1 a c t i sa n dt h ee f f e c t so fo v e r p r o d u c t i o n s c s p c 、c s p di nc r y o p r o t e c t i o n s e v e r a le x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e do u t ： 1 i no r d e rt os e tc o l d - s h o c kt e m p e r a t u r e s a l la r r h e n i u sp l o to ft h eg r o w t ho fk l d s 4 0 1 3w a s e s t a b l i s h e d c o l ds h o c ks u b r a n g ea r ef r o m2 8 t o1 3 a n db e l o w1 3 2 a na p p r o x i m a t e l y2 0 0 一f o l di n c r e a s e ds u r v i v a la f t e rf r e e z i n gw a so b s e r v e dw h e nc e l l sw e r e s h o c k e dt oi o cf o r4 hc o m p a r e dt om i d - e x p o n e n t i a l p h a s cc e l l sg r o w na t3 0 c ，u p o na d d i t i o no f c h l o r a m p h e n i c o l t h i sc u l t u r ei sn o ta b l et or e c o v e rf r o mac o l ds h o c k i n d i c a t i n g a na c t i v ep r o t e c t i o n a g a i n s tf r e e z i n g 3 u s i n gs d s 一队g e7 3 、6 1 k d ac o l d i n d u c e dp r o t e i n s ( c s p s ) w a si d e n t i f i e da f t e r ac o l d s h o c kt r e a t m e n t 4 c s p ca n dc s p dg e n e so fl a c t ck l d s 4 0 1 3w e r ep c ra m p l i f i e dw i t hd y n a z y m ed n a p o l y m e r a s e 5 c s p ca n dc s p dw a so v e r e x p r e s s e du s i n gt h en i s i n - e o n t r o l l e de x p r e s s i o ns y s t e m a n a l y s i s o ft h es d s p a g er e v e a l e dt h a t7 l ( d ac o l d s h o c kp r o t e i nc s p da n d6 2 k d ac o l d s h o c k p r o t e i n c s p cw e r ei d e n t i f i e dr e s p e c t i v e l ya f t e ri n d u c e dw i t hn i s i n 6 i no r d e rt os t u d yt h ef u n c t i o np l a y e db yc s p ca n dc s p d ，w eo v e r p r o d u c e de a c ho ft h e mi n t u r nu s i n gt h en i s i nc o n t r o h e de x p r e s s i o ns y s t e m t h r e ee x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e do u t ：w ef i r s t o b t a i n e dt h eg r o w t h , c i l r v e si n c l u d ec o n t r o ls t r a i na n dc s p - o v e r p r o d u c i n gs t r a i n s a n dt h e n 东北农业人学工学硕i 学位论文 e x p o n e n t i a l l yg r o w i n gc u l t u r e s ( o d 6 0 0 - - - o 8 ) w e r et r a n s f e r r e df r o m2 7t o7 。ca n dg r o w t hw a s m o n i t o r e df o r3 0 h a ti a s t ，t h en u m b e ro fc f uw a sd e t e r m i n e dj u s tb e f o r ef r e e z i n ga n da f t e rf o u r c o n s e c u t i v ef r e e z e t h a wc h a l l e n g e s t h er e s u l ts h o w st h a to v e r p r o d u c i n gc s p ci m p r o v e sg r o w t h r e s u m p t i o na n do v e r p r o d u c i n g c s p de n h a n c e t h es u r v i v a l c a p a c i t ya f t e r f r e e z i n g ( 3 0 - 4 0 f o l d ) i nt h i ss t u d yw ep r o v i d ee v i d e n c ef o ra l la c t i v ea d a p t a t i o nr e s p o n s eo f l l a c t i sk l d s 4 0 1 3t o ar e p e t i t i v ef r e e z i n gc h a l l e n g ea f t e r e x p o s u r et ol o wt e m p e r a t u r ea n dp r o t e i ns y n t h e s i si sf o u n di n t h ec l a s so f7 k d ac s p s w h i c ha x et h e i m p l i c a t i o no fc s p si nc r y o t o l e r a n c u ：i na d d i t i o n o v e r p r o d u c t i o no fc s p i nr e l a t i o nt of r e e z es u r v i v a lw a ss t u d i e d t h i sr e v e a l e dt h a tl a c t sc e l l s o v e r p r o d u c i n g p ci m p r o v e sg r o w t hr e s u m p t i o na n do v e r p r o d u c i n g c s p de n h a n c e s c r y o t o l e r a n c u b u tt h a tt h i sp r o t e i ni sp r o b a b l yn o tt h eo n l yf a c t o rd e t e r m i n i n g c r y o p r o t e c t i o n k e yw o r d s ：l a c t o c o c c u sl a c t i s ；c o l d - s h o c kp r o t e i n s ；c l o n i n g ，e x p r e s s i o no fc s p c 、c s p da n dt h e i r e f f e c t si f lc r y o p r o t e c t i o n c a n d i d a t e ：l e iy u t i n g m a j o r ：f o o ds c i e n c e s u p e r v i s o r ：h u og u i c h e n g 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 l 洼；地遗直基丝益要挂型直明的：奎拦互窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 日期：口7 年毕月o 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 导师签名： 日期：年月日 日期：c ，7 年撇 1 引言 1 1 乳酸菌 1 1 1 乳酸菌的简介 乳酸菌( l a c 髓a c i db a c t e r i al a b ) 是一类可发酵碳水化合物，主要生成乳酸的细菌的 总称。根据伯杰氏细菌鉴定手册乳酸菌定义为过氧化氢酶为阴性，消耗葡萄糖5 0 以上生 成乳酸的革兰氏阳性的球菌或杆菌。特点是不生成内生孢子无运动( b u c h a n a n 1 9 7 4 ) 。广 泛分布于自然界，在工业、农业和医学等领域与人类生活密切相关。安全应用于食品生产 已经有很长一段历史了，乳球菌和乳杆菌的许多种都拥有通常被认为安全的特性，是一种 食品级的微生物。 目前在自然界中己发现的这类菌在细菌分类学上现在划分至少有2 3 个属。其中较为常 见的分属于乳杆菌属( l a c t o b a c i l l u s ) 、链球菌属( s t r e p t o c o c c u s ) 、明串珠菌属( l e u c o n s t o c ) 、 双歧杆菌属( b i f u t o b a c t e r i u m ) 和片球菌属( p e d i o c o c c u s ) 5 个属，每个属有很多菌种，某 些菌中还包括数个亚种。除少数外，绝大部分是人和动物体内必不可少的具有重要生理功 能的苗群( 凌代文，1 9 9 8 ) 。 1 1 2 乳酸菌的生理功能 乳酸菌的生理功能与机体的生命活动息息相关，是肠道微生态系统的重要组成部分。 它们具有各种各样的酶类，进行着非常出色的有条不紊代谢活动。如协同消化系统消化食 物，减缓部分肠道吸收不良的症状；提供某些维生素和氨基酸。此外，乳酸菌在降低血清 胆固醇水平。改善糖尿病症状，以及预防骨松症等方面也有作用。由于它们的存在阻止了 致病菌的定植、诱发肠道免疫、降低胆固醇、控制内毒素、制造营养物质、刺激组织发育， 所以它们对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿 瘤发生、衰老过程和突然的应激反应等都有作用。如果乳酸菌停止生长，人和动物的生理 参数都会受到影响，从而出现一系列的病理表现( 郭本恒，2 0 0 3 ) 。 目前，许多国家出售的乳酸菌制剂( 主要为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的固化产品) 及冻干活菌片。这些产品可对由于抗生素、化疗等原因造成的体内菌群失调疾病有疗效， 还可激活免疫细胞，提高机体免疫力。 1 1 3 乳酸菌的分子遗传和基因工程 2 0 世纪7 0 年代以来对乳酸菌的分子遗传学研究逐步开展起来。尤其在过去的十年取 得了飞速的发展。乳酸菌全基因组及重要的功能基因被进一步阐明，作为外源基因表达载 体的作用被广泛研究。 1 1 3 1 乳酸菌基因组学的研究 2 0 0 1 年乳酸乳球菌i l l 4 0 3 的全基因组测序以来，许多乳酸菌全基因测序工作已完成， 如乳酸乳球菌m g l 3 6 3 脚l 1 4 0 3 、嗜热链球菌l m g l 8 3 1 1 c r z l 0 6 6 、植物乳杆菌w c s f n c 8 、 长双歧杆菌n c c 2 7 0 5 等对基因组的分析显示乳球菌的基因组中有很多重要的功能基因。如 植物乳杆菌具有大量可以编码磷酸烯醇丙酮酸依赖的磷酸转移酶( p 1 丐) 以及其它的糖转运 系统相关酶类的基因，满足了通过糖酵解来获取能量的要求( t b d d ，2 0 0 2 ) ；乳酸乳球菌中 发现了编码合成n i s i n 的酶的基因簇，n i s i n 可通过溶解革兰氏阳性苗的肽聚糖层达到细胞 膜，然后在细胞膜上形成孔道，造成小分子代谢物如氨基酸、核苷酸、离子、a t p 等流出 细胞外，是细胞膜快速极化，导致细胞死亡从而达到对革兰氏阳性菌的抑制作用( 熊占， 1 9 9 5 ) 。 利用生物信息学数据库与基因组比较工具相结合，实现了对乳酸菌不同种属间基因组 的比较，可进行差异性和进化关系的研究，推测出乳酸菌种间、亚种间、株间存在很大差 异。依据不同株的的表型和生理学特性，许多种乳酸菌应用于工农业( 李华军，2 0 0 6 ) 。 1 1 3 2 乳酸菌的基因克隆及表达系统 由于乳酸菌在发酵食品中的广泛应用及在遗传技术中的可行及易操作性，其基因克隆 领域的研究越来越受到关注。 目前对乳杆菌的遗传和分子生物学的研究进展缓慢，主要障碍是缺乏有效的转化系统， 而对乳酸乳球菌基因表达的研究比较完善，并克隆了许多外源基因( 郭本恒，2 0 0 3 ) 。乳球 菌基因克隆分为复制型基因的克隆和整合型基因的克隆。尽管有大量不同的噬卣体，但所 有己知的乳球菌复制型基因克隆都是由质粒构建的。有两种本质不同的载体可以分别成功 地用外源的复制子和遗传背景清楚的乳球菌复制子构成( 吕晓英，2 0 0 3 ) 。 近年来食品级基因表达载体研究逐步开展起来，在构建食品级载体时，乳球菌对内源 性细菌素的抗性基因曾被研究作为安全基因标记的可能性( 郭本恒，2 0 0 3 ) 。9 0 年代芬兰和 丹麦合作研究构建了以n i s i n 为筛选标记的食品级受体载体系统( 范丽平，2 0 0 6 ) 。经过1 0 多年的发展，n i s i n 调控表达系统( n l c e ) 已经成为革兰氏阳性菌中应用最广泛的基因调控 表达的工具。n i c e 系统有许多优点，其诱导剂乳酸菌肽是食品级的；诱导剂量低于亚抑制 浓度菌体生长不会受到影响；在未诱导的条件下几乎检测不到表达产物；在一定范围内， 诱导表达水平与诱导剂量成正比限u y t e r , 1 9 9 6 ) 。这些优点为利用它作为外源基因的表达系 统来生产目的蛋白提供了方便。 n i c e 系统是以生物合成基因簇f 包括结构基 n i s a z ) 的启动子n i s a , z 和双组分调节系 统基因n s r k 为基础的，由n i s i n ( 乳酸链球菌素) 引发导致自我调节。其调节机制如图1 - 1 所示：组氨酸激酶n s k 作为的传感器，蛋白n s r 作为反应调节子激活靶基因的转录。 若胞外的n i s i n 存在，n i s i n 结合到受体 凸k 上，随后，n s k 通过磷酸化激活n s r ，被激活 的n s r 在n s a z 启动子处诱导n i s i n 操纵子( k u i p c r s ，1 9 9 5 ；i g o r ，2 0 0 5 ) 。 2 引言 图1 - 1n i s i n 诱导的基因表达系统示意图( i g o r ，2 0 0 5 ) f i 9 1 - 1s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no fn i s i n i n d u c e dg e n ee x p r e s s i o ns y s t e m n i c e 的宿主系统可以用产n i s i n 的菌株( 如l l a c t i s 9 7 0 0 等) 作为宿主菌，产生的n i s i n 可 以持续诱导克隆在n s a 启动子之后的目的基因表达，在一些情况下，这可作为一个有利条件 来利用产生菌持续表达外源基因，不必外加n i s i n 来主动诱导。然而更有效地则是应用另一 些不产n i s i n 的菌株进行诱导表达，目前应用最广泛的是n z 9 0 0 0 ，它对诱导最敏感当在 菌的对数生长期时加入微量的n i s i n ( 0 0 1 1 0 n g m 1 ) ，目的基因就会被诱导表达。且诱导效率 可超过1 0 0 0 倍以上( 张晶晶- 2 0 0 6 ) 。 1 2 冷应激蛋白的研究 几乎所有单细胞生物在外界环境急剧降温的条件下都会发生应激反应，产生一系列蛋 白质被称为冷应激蛋白( c i p s ) ，其中包括一些小分子量的( 大约7 5 k d a ) 的酸性蛋白质叫 做冷休克蛋白( c s p s ) ，这是一种主要的应激蛋白，这些蛋白对细胞在低温时恢复生长和 发挥细胞各种功能是非常重要的。 1 2 1 冷应激蛋白的研究史 1 9 5 7 年首次报道生活在北极的鱼血清冰点为1 4 c ，可能是鱼血液中存在一种抗冻剂， 使其冰点下降这么多。1 9 6 9 年斯坦福大学d e v r i e s 博士在南极m c m u r d o 海峡的一种 n o t o y h e n i i d 鱼的血液中首次发现具有抗冻性的物质是抗冻蛋白( a n t i f r e e z ep r o t e i n 简称 a f p ) ( d a v i e s ，1 9 9 0 ) 。a f p 具有抑制冰晶生长和重结晶抑制作用，保护细胞膜免受破坏( 尹 明安等，2 0 0 1 ) 。可用于改良动植物品种和冷冻保存等，有广阔的应用前景。通过添加a f p 的方法可以提高冷冻食品的质量，a f p 也可以作为一种高级防冻剂。 1 9 4 9 年b r i g g s 在越冬期的黑槐树皮皮中发现了2 旬条新蛋白谱带这是最早发现的植 物低温诱导蛋白( b r i g g s ，1 9 4 9 ) 。进入8 0 年代，植物的低温适应性问题受到各国政府和研 究部门的关注，大量试验及中寻找特异的冷驯化蛋白，研究其性质、结构、氨基酸序列、 3 功能以及编码c a i p ( c o l da c c l i m a t e di n d u c e dp r o t e i n ) 的基因、基因结构、核苷酸序列等，试 图揭示冷驯化蛋白生理生化作用及形成机理，为利用遗传工程技术改造细胞遗传组成，培 育抗寒新品种提供试验理论基础。 在微生物低温诱导蛋白研究史中，首先在大肠杆菌( ec o l i ) 中发现了冷应激蛋a c s p a 温度下降1 1 5 h 后，其浓度达到1 0 4 m o l l 。随后在许多嗜冷、耐冷、耐热细菌以及真菌酿酒 酵母和食用菌中都已得到发现。 1 9 8 7 年，j o n e s 研究发现在ec o l i 中，当细胞从正常温度( 3 7 ) 转换到1 0 ( 2 ，低温 诱导蛋白的含量与正常状态相比增加2 加倍( 1 9 8 7 ；1 9 9 4 ) 。目前被确认的冷应激蛋白有 十几种。c s p 是e c o l i 中的主要冷应激蛋白，占总冷应激蛋白的1 0 。c s p b ，c s p g 和c s p l 由低温诱导产生；c s p c 和c s p e 在3 7 与低温时都有表达；而c s p d 在稳定期，营养缺乏 时被诱导产生( j i a n g 。1 9 9 7 ；j e a n ，1 9 9 9 ；k a z u t o m i ，1 9 9 9 ；w e i n i n gj i a n g , 2 0 0 2 ) 。 枯草杆菌与e c o l i 不同，冷激后不会出现生跃延滞期，而是持续低速生长。冷激后3 0 6 0 分内，有3 6 种蛋白被诱导产生。在枯草杆菌中发现c s p b c s p c 和c s p d = 种冷激蛋白，主 要为c s p b ，与大肠杆菌中的c s p a 具有相似功能，有6 1 的序列同源性。在其他5 0 多种细菌 中也发现了冷应激蛋白。例如，在_ s t a p h y l o c o c c u s a u r e u s ，l i s t e r i a s a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m 、 a r t h r o b a c t e r g l o b 和r m u s e e 也发现了与c s p s 同源的冷激蛋白( w i l l i m s k y ，1 9 9 2 ；p e t e r , 1 9 9 9 ； t a a n ，1 9 9 9 ；k i b e o ml e e ，2 0 0 3 ；) 。 在耐冷型酵母中，当温度从2 1 降至5 1 2 时在1 2 h 内生成了2 6 中冷激蛋白。冷激蛋 白的生成出现在对数期和指数期。在真菌酿酒酵母中发现了n s r l 和t i p l 冷激蛋白g u i s e 叽 1 9 9 0 ；y o s h i n o f i 2 0 0 6 ) 。 1 2 2 冷休克蛋白结构与功能 对于冷休克蛋白的功能研究是有限的，但对其分子性质与结构研究很透彻。 枯草杆菌c s p b 和大肠杆菌c s p a 的三维结构有着极高的相似性，即都存在5 个反平行 1 3 折叠股的b 桶状片层结构。其特点是分为两层，一层由b 1 、2 、3 组成，另一层由b 4 、5 组成( 如图1 2 所示) ，形成了一个封闭的桶状结构( m a f i a ，2 0 0 4 ) 。5 个反平行1 3 折叠股 的b 桶状片层结构也存在于核苷酸和低聚糖中，在其他几种冷应激蛋白中也发现了相似的 结构，如n u s a 、p n p a s e 和i f l 。这种折叠桶结构首先是在核糖体蛋白s 1 上发现的，故称作 s 1 结构域( s 1d o m a m ) 。后来在大量的r n a 结合蛋白上都发现了s1 结构域。各种c s p s 存在形式存在差异，c s p a e c 作为单体存在于溶液及晶体中c s p b s c 作为二聚体存在于晶体 及不含磷酸盐的溶液中，在磷酸盐中主要以单体形式存在，c s p d e c 以单体形式存在于溶液 中( s c h i n d e l i n ，1 9 9 3 ；m a k h a l a d z e 1 9 9 4 ；y a m a n a k a ，2 0 0 l ；e r r a o l e n k o ，2 0 0 2 ) 。 4 图1 - 2 枯草杆菌c s p b 结构模式( m a r i a , 2 0 0 4 ) f i g 1 - 2r i b b o nd i a g r a mr e p r e s e n t a t i o no f t h et h r e e d i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo f c s p b 图1 3c s p a e c 、c s p b b c 、s 1 、y b - 1 h r y - b o x ) 中冷激域结构的比较( e r m o l e n k o 2 0 0 2 ) f i g 1 - 3c o m p a r i s o no ft h ec o l d s h o c kd o m a i n s t r u c t u r e so ft h ec s p a s c 、c s p b b c 、s 1 、 y b - 1 h ( y - b o x ) b1 、2 、3 上拥有总共8 个芳香族氨基酸中的7 个并且在溶液中都暴露在外表面，这其中 存在一个结构域，称为冷激域( c s d ) ，真核生物也包含有这样的高度保守域，由此生成的蛋 白叫作y - b o x 蛋白( 如图2 显示了冷激蛋白与y - b o x 蛋白冷激域结构) ，c s p s 与y - b o x 蛋白都含 有同样的核苷酸序列r n p l ( k r - g - f y g a - f - v i - x f y ) 、r n p 2 ( 1 2 f y g k - n g l ) ( 图1 3 中橘色红色区域) ( 郭建军，2 0 0 2 ) 。r n p l 、r n p 2 能与s s r n a 结合的模体( m o t i f ) ， 这可能是c s p s 执行其分子伴侣功能的部位。c s p b 表面3 个暴露的p h e 残基帮助其行使结合单 链核苷酸的功能。不仅如此，如果这3 个残基分别被a l a 替代，c s p b 就变得不稳定了，说明这 3 个p h e 残基不仅有结合核苷酸的功能，而且还起到稳定c s p b 结构的作用( s c h i n d l e r ，1 9 9 8 ) 。 在所有的c s p a 家族成员中，一些参与形成b 折叠结构的氨基酸残基总是很保守的，这暗示 了它们都形成类似的b 折叠构。 c s p s 都是由6 8 到7 4 个氨基酸构成的小分子蛋白质，而且它们之间具有较高的同源性 ( 4 4 8 0 ) 。目前对冷休克蛋白在细胞生理学中的功能研究有限c s p s 参与了翻译、转 录、细胞核形成过程。就像热休克蛋白一样，c s p s 不仅在低温下有作用，在常温下也有重 要作用，其主要功能与生物体的抗冻性有关。普遍认为c s p s 的功能是作为r n a 分子伴侣 ( g t o ac h a p e r o n e ) 与细胞中的m r n a 结合，稳定m r n a 促进翻译。一般而言，c s p s 绑定s s r n a ( s i n g l es 仃a n d e d ) 或s s d n a ，但不绑定d s d n a ( d o u b l es t r a n d e d ) ，c s p s 与s s r n a 绑定 优于d s r n a ，在相对分子质量水平上c s p a 和单链r n a 结合值为3 1 0 m o l l ( l o p c z ， 2 0 0 0 ) 。一种假设认为c s p a e c 通过对核糖核酸酶作用刺激r n a 水解( 大概是通过阻止m r n a 形成对抗核糖核酸酶的稳定二级结构) 。在e c o i l 九种c s p s 中，只有c s p a ，c s p b ，c s p g 和c s p l 为冷诱导的蛋白。在缺失c s p a , c s p b ，c s p g 的突变体中，c s p e 表达量增加了三倍， 这说明三种蛋白可能有包围的作用。c s p e 、c s p c 在3 7 c 时也存在，他们在基因转录时都 有抗终止因子的作用f 特别是对不依赖p 因子的转录终止子) ，可以减少转录的终止，也可以 减少转录时的停顿( x i a ，2 0 0 1 ) ；在细胞增长及葡萄糖缺乏时，c s p d 有校正功能也有证 5 据表明c s p d 与复制叉单链结合，阻止d n a 复制( y a m a n a k a ，2 0 0 1 ) ；在低温和低c s p b 浓 度时，亲水的m r n a 将发生折叠反应，从而使m r n a 的翻译发生困难，而c s p b 的存在，将有 效阻止m r n a 二级结构的形成，从而易化m r n a 的翻译过程( w i l l i m s k y ，1 9 9 2 ) 。c s p f 和 c s p h 功能未知，但其结构与其它成员明显不同：c s p l 功能未知。在1 5 。c 下，敲除c s p a ，c s p b ， c s p g 和c s p e 四中蛋白时，冷冻敏感性上升，细胞形成丝状结构。虽然根据实验数据推断 c s p s 在数个生理过程中发挥了作用，但应该指出，没有直接的证据说明c s p s 对r n a 结 构作用 1 2 3 冷休克蛋白表达的调控机制 c s p s 晟先被鉴别是通过冷应激反应产生的蛋白质，应激反应并不是降低到一定温度 而是降低1 0 或更多。温度降低越大，诱导反应越明显( j o n e s 1 9 9 2 ) 。现在研究的展深入 的是c s p a 日c 的诱导表达调控机制。实验测得在没有外界条件刺激的情况下大肠杆菌指数 生长早期的c s p a 含量达5 叽m ，之后减少，在指数生长末期几乎没有。但在冷刺激后在指 数生长末期c s p a e c 表达量增长y 3 0 倍，但在指数生长早期增长了不到2 5 倍。c s p a e c 的表达 不受温度影响，稀释培养基或增加营养物质也会诱导其表达( b r a n d i ，1 9 9 9 ) 。另外，抗生 素虽然抑制蛋白合成，但存在抗生素条件下，核糖核酸的延伸阶段可以发生冷诱导反应， 也就是说c s p a e c ，c s p b e c 和c s p g e c 存在抗生素条件下仍然被诱导产生( j i a n g ，1 9 9 3 ) 。由 于诱导反应发生机制并不完全清楚，因此以上结论不能通用。 对于c s p s 调控研究很多，其中包括转录的调控。实验表明，在大肠杆菌中，当细胞从 3 7 转换至l j l o ，由c s p a e c 启动子连接的口半乳糖营酶表达量增加y 3 - 5 倍，说明启动子 的核心区( - 4 0 u + 1 6 ) 对冷刺激产生响应。在一3 6 位置的一个突变在低温下会使启动子活性 提高3 倍( v a s i n a ，1 9 9 6 ) 。 温度降低对c s p s 表达影响很显著，在3 t c c s p a e c m r n a 的半衰期很低，但在冷冻条 件下却显著增加，c s p b b s 和c s p c = 同样如此，目前对于其机制研究并不清楚。b r a n d i 证明 存在超拷贝数c s d a 基因的条件下，m r n a 含量很高。c s d a 是一种r n a 解旋酶，作为一种冷 诱导蛋白，低温条件下大量表达，有人认为c s d a 与5 - u t r 的形成有关，而5 。一u 1 r 对m r n a 的稳定性有极大影响。e c o i lc s p a 的m r n a 有一1 5 9 b s 的5 非翻译区( 5 - u t r ) ，一方面 在3 7 c 时，5 - u t r 对c s p a e c 蛋白合成有消极影响，但若敲除，并不影响m r n a 的半衰期。 另一方面在低温条件下，5 - u t r 的存在提高t c s p a m r n a 的半衰期。对此进一步研究表 明一方面这是因为5 u t r 中有一段长1 1 个核苷酸的保守序列称为冷框( c o l db o x ) ，实验证 明敲除冷框导致m r n a 的半衰期显著降低说明冷框序列参与c s p s 转录调控( e r m o l e n k o ， 2 0 0 2 ) 。此外，枯草杆菌c s p b 的低温诱导还需要一个顺式作用元件d b 框( d o w ns t r e a mb o x ) 的存在。d b 框是一个位于翻译起始密码子下游1 2 n t 处的跃度为1 4 n t 的保守序列，它与 1 6 s r n a 的一段区域互补，它对生长延滞期的翻译是必须的，在此期间其它蛋白由于缺乏 冷激特异的核糖体因子，难以形成翻译启始复合物，导致非冷激蛋白的翻译在低温下难以 进行( l a t e a n a 2 0 0 0 ) 。在d b 框的帮助下，冷休克蛋白则可以进行翻译。另一方面，5 - u t r 含有p o l y u 富集区我们知道c s p b 可优先与单链d n a 的p o l y t 富集区和p o l y u 富集区绑定 这种绑定影响了5 - u t r z 级结构的稳定性，从而提高了翻译效率，抑制了m r n a 衰退，使 6 引言 c s p am r n a 在冷激条件下变得更加稳定( g r a u m a n n ，1 9 9 7 ) 。也就是说c s p b 促进了其他c s p s 的合成。 最近，有一种新的理论，低温下8 7 n t 的d s r a r n a 富集，调节h n s ( h n s ，d n a 结合 蛋白，是低温时晟适生氏所必需的) 和r p o s 的翻译。d s r a 抑制h n s 的翻译、减少h n s r n a 的半衰期井刺激r p o s f o l 目