（食品科学与工程专业论文）香菇、金针茹交配型b位点的分子遗传学结构的解析.pdf

j 上海海洋大学博硕士学位论文 答辩委 昌 少 压成员名单 姓名工作单位职称备注 谭钠上游槲彪加訇函屠渤研究炙 主席 秀蛘上旖裳嗣落盆周自刷彤j 7彳彳麒 委员 艇论崩黝茛苏亨瞄磁毖 委员 委员 委员 委员 委员 j | 长j 上胸膨料隧荭阑断嗷7剜；，f 舣 秘书 答辩地点 上均均巧入t 缎红。宦 答辩日期 炉苦 l 、 。 上海海洋人学硕士论文 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 孝蜀、 f i 期：埘年il 月； 日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密d，在) 年解密后适用本版权书。 本学位论文属于， 不保密酽 学位论文作者签名： 鸯毒 同期：厶广靖年f 上月j ，同 指导教师签名：俺碉建 同期：渊钆月口同 圭量塑鲎奎堂堡主笙茎 一 上海海洋人学硕十论文 目录 摘要i a b s ：t r a c t i l i 第一章引言1 1 1 担子菌交配型因子的研究进展1 1 1 。1 担子菌的典型生活史1 1 1 2 交配型基因的功能和交配性系统2 1 1 3 担子菌模式菌种交配型a 因子的研究进展3 1 灰盖鬼伞的交配型a 因子的结构特点3 2 玉米黑粉菌的交配型b 因子的结构特点5 3 裂褶菌的交配型彳因子的结构特点6 1 1 4 担子菌模式菌种交配型曰因子的研究进展6 1 灰盖鬼伞的交配型房因子的结构特点7 2 玉米黑粉菌交配型a 因子的结构特点8 3 裂褶菌的交配型口因子的结构特点9 第二章材料与方法1 1 2 1 供试菌株1 1 2 2 试剂11 2 3 仪器与设备1 2 2 4 主要试剂盒的介绍与主要试剂的配制1 2 2 4 1 主要试剂盒1 2 2 4 2 主要试剂的配制1 4 2 5 方法14 2 5 1 香菇、金针菇原生质体的制备、再生1 4 2 5 2 香菇、金针菇原生质体单核体交配型的确定1 5 2 5 3 基因组d n a 的提取1 5 2 5 4 简并p c r 扩增信息素受体的保守片段1 6 2 5 5d n a 的纯化1 7 2 5 6 连接反应1 8 2 5 7 克隆转化1 8 2 5 8 克隆验证1 9 2 5 9 染色体步行1 9 2 6d n a 序列的生物信息学分析2 l 第三章结果与分析2 3 上海海洋人学硕+ 论文 3 1 香菇原生质体单核体1 3 5 1 号菌株交配型彦位点上基因的克隆2 3 3 i 1 简并p c r 扩增香菇1 3 5 - i 号菌株疣因子中的保守片段2 3 3 1 2 基因组步行扩增香菇1 3 5 1 号菌株保守片段的上、下游序列2 4 3 1 3 基因组步行获得的香菇1 3 5 - i 号菌株d n a 序列的生物信息学分析2 6 3 2 香菇原生质体单核体1 3 5 - 3 2 号菌株交配型口位点上基因的克隆2 9 3 2 1 简并p c r 扩增香菇1 3 5 - 3 2 号菌株忽因子中的保守片段2 9 3 2 2 基因组步行扩增香菇1 3 5 - 3 2 号菌株保守片段的上、下游序列3 0 3 2 3 基因组步行获得的香菇1 3 5 - 3 2 号菌株d n a 序列的生物信息学分析3 2 3 3 香菇研和屁因子编码的信息素受体氨基酸之间的同源性分析3 4 3 4 特异引物验证原生质体和孢子单核体菌株中交配型因子的类型3 5 3 4 1 特异引物验证交配型夙因子3 6 3 4 2 特异引物验证交配型忽因子3 7 3 5 金针菇原生质体单核体1 5 2 8 - il 号菌株交配型占位点上基因的克隆3 9 3 5 1 简并p c r 扩增金针菇1 5 2 8 - i1 号菌株历因子的保守片段3 9 3 5 2 基因组步行扩增金针菇1 5 2 8 一li 号菌株保守片段的上、下游序列4 0 3 5 3 基因组步行获得的金针菇1 5 2 8 一li 号菌株d n a 序列的分析4 2 3 6 金针菇原生质体单核体1 5 2 8 2 1 号菌株交配型彦位点上基因的克隆4 5 3 6 1 简并p c r 扩增金针菇1 5 2 8 - 2 1 号菌株屁因子的保守片段4 5 3 6 2 基因组步行扩增金针菇1 5 2 8 2 1 号菌株保守片段的上、下游序列4 6 3 6 3 基因组步行获得的金针菇1 5 2 8 2 1 号菌株d n a 序列的分析4 9 3 7 金针菇研和彪因子编码的信息素受体氨基酸之间的同源性分析5 3 第四章讨论5 5 4 1 香菇、金针菇交配型彦位点的分子遗传学结构的初步解析5 5 4 2 简并p c r 与基因组步行的方法克隆交配型因子方法的探讨5 6 参考文献。5 9 致谢6 5 论文发表与参加会议6 6 上海海洋大学硕士论文 香菇、金针菇交配型8 位点的分子遗传学结构的解析 捅要 大型真菌香菇、金针菇是典型的四极性异宗结合的担子菌，它们的交配系统 是由不亲和性因子a 与锣这两个非连锁的交配型位点所控制的。 本研究以香菇1 3 5 号原生质体单核体1 号菌株( 彳j 鲫、3 2 号菌株( 脚，金 针菇1 5 2 8 号原生质体单核体11 号菌株( 彳尉) 、2 1 号菌株( a 2 砌为材料，结合简 并p c r 和染色体步行两种方法，克隆位于香菇、金针菇占位点上的基因序列并运 用生物信息学解析所获得的序列，初步解析b 因子的分子遗传学结构主要研究结 果如下： 1 、从香菇研因子中得到了1 个信息素受体基因厅c 6 卜椤j ( 11 6 8 b p ) 和1 个 信息素前体基因l e p h b l - b l ( 1 9 2 b p ) ，从屁因子中得到了1 个信息素受体基因 邑，c 6 ，_ 层2 ( 11 9 0 b p ) 。 2 、从金针菇研因子中得到了1 个信息素受体基因尸盱c 6 们( 1 1 9 9 b p ) ，屁因 子中得到了1 个信息素受体基因f v r c b l - b 2 ( 11 9 8 b p ) 和1 个信息素前体基因 f v p h b l - b 2 ( 1 7 7 b p ) 。 香菇和金针菇中的信息素受体序列均具有7 次跨膜结构特征，并与狄盖鬼伞 和裂褶菌的信息素受体序列之间有很高的相同率和相似率，可以判定为同源序列。 信息素前体l e p h b l - b 1 、f v p h b b 2 均具有c a a x 基序特征。 根据香菇研因子和屁因子的d n a 序列分别设计的两组特异引物可以特异性 地鉴别含研因子的单核体和含屁因子的单核体。 本研究首次从香菇、金针菇的交配型口因子中得到信息素受体基因和信息素 前体基因，所建立的技术路线可以为运用于克隆其它食用真菌的交配型位点上的 基因奠定了初步基础。 关键词：香菇，金针菇，交配型房位点，信息素受体，信息素前体，简并p c r ，基 因组步行 t h eo r i g i n a ls t u d yo nm o l e c u l a r m a t i n g - t y p e l o c u si nl e n t i n u l a -j v e l l l t l p e s a bs t r a c t g e n e t i c s s t r u c t u r e0 fb e o d e sa n d，z 口肌，咒跖z z 甩口 一l 1 一- l e n t i n u l ae d o d e s ，f l a m m u l i n av e l u t i p e sw e r eh e t e r o t h a l l i ca n dc a r r yt e t r a p o l a r i n c o m p a t i b i l i t y f a c t o r s ：aa n dbf a c t o r s ，w h i c hc o n t r o l l e dt h e i rm a t i n g c l a s s i c a l g e n e t i c sh a ss h o w nt h a tt h eam a t i n g - t y p ef a c t o r c o n t r o l sc l a m pc e l lf o r m a t i o na n d n u c l e u sp a i r i n g ；t h eb m a t i n g t y p ef a c t o rc o n t r o l sn u c l e a re x c h a n g e ，n u c l e u sm i g r a t i o n a n dc l a m pc e l lf u s i o n i nt e t r a p o l a rm u s h r o o m ，t h eam a t i n g t y p el o c i c o n s i s t so f m u l t i g e n e se n c o d i n gh o m e o d o m a i np r o t e i n sa n dt h ebm a t i n g - t y p el o c ia l s oc o n s i s t so f m u l t i g e n e se n c o d i n gp h e r o m o n ea n dp h e r o m o n er e c e p t o rp r o t e i n s i nt h i ss t u d y , b ym e a n so fd e g e n e r a t ep c ra n dg e n ew a l k i n g ，w eo b t a i n e do n e p h e r o m o n er e c e p t o rg e n el e r c b l b 1a n do n ep h e r o m o n ep r e c u r s o rg e n el e p h b b 1 f r o mt h e p r o t o p l a s tm o n o k a r y o ns t r a i n n o 1o fl e d o d e ss t r a i nn o 13 5 ；o n e p h e r o m o n er e c e p t o rg e n el e r c b l b 2f r o mt h ep r o t o p l a s tm o n o k a r y o ns t r a i nn o 3 2o f l e d o d e ss t r a i nn o 13 5 ；o n ep h e r o m o n er e c e p t o rg e n ef v r c b l - b 1f r o mt h ep r o t o p l a s t m o n o k a r y o ns t r a i nn o 1 1o ff v e l u t i p e ss t r a i nn o 15 2 8 ；o n ep h e r o m o n er e c e p t o rg e n e f v r c b l b 2a n do n ep h e r o m o n ep r e c u r s o rg e n ef z p h b b 2f r o mt h ep r o t o p l a s t m o n o k a r y o ns t r a i nn o 2 1o fe v e l u t i p e ss t r a i nn o 15 2 8 t h ea l lp h e r o m o n er e c e p t o r h a dt h eh o m o l o g yw i t ht h e s ep h e r o m o n er e c e p t o r sf r o mc o p r i n u sc i n e r e u sa n d s c h i z o p h y l l u mc o m m u n eb a s e do na l i g n m e n t ，a n dw e r es e v e nt r a n s m e m b r a n ep r o t e i n s f o l l o w i n gt h ea n a l y s i su s i n gt h es o s u is o f t w a r e t h et w op r e d i c t e dp h e r o m o n e p r e c u r s o r sc o n t a i nt h ec t e r m i n a lc a a xm o t i f b a s e dt h ed n as e q u e n c e so fp h e r o m o n er e c e p t o rg e n ef r o mbm a t i n gt y p ef a c t o ri n l e d o d e s ，w ed e s i g n e dt w og r o u p so fs p e c i f i cp r i m e r s ：r c b l 一b 1 一s f l ，r c b l - b 1 一s r l ； r c b b 2 s f l ，r c b l b 2 s r l ，t oa m p l i f yt h ef r a g m e n to fp h e r o m o n er e c e p t o rf r o mt h e p r o t o p l a s tm o n o k a r y o n s t r a i n sa n ds p o r em o n o k a r y o ns t r a i n s w eo b t a i n e d t h e p h e r o m o n er e c e p t o rf r a g m e n tf r o mm o n o k a r y o ns t r a i n sw i t ht h em a t i n gt y p ef a c t o rb 1 u s i n gs p e c i f i cp r i m e r s r c bl - b1 s f1r c bl - b1 s r l ；a l s oo b t a i n e dt h ep h e r o m o n e r e c e p t o rf r a g m e n tf r o mm o n o k a r y o ns t r a i n s w i t ht h em a t i n gt y p ef a c t o rb 2u s i n g s p e c i f i cp r i m e r sr c b b 2 一s f 1r c bl b 2 一s r l i i i l v 上海海洋人学硕十论文 香菇、金针菇交配型房位点的分子遗传学结构的 初步解析 第一章前言 1 1 担子菌交配型因子的研究进展 1 1 1 担子茵的典型生活史 灰盖鬼伞的生活史是许多担子菌中是具有代表性的。( 图1 1 1 ) 有性担孢子 萌发形成具有单核细胞的无性单核菌丝j 。两个可亲和的单核菌丝通过融合，质配 进而形成有性双核菌丝体。紧接着是进行核的交换：引入的核迅速迁移并穿过它 的交配细胞进入到一个新的单核顶端细胞，这个新的单核顶端细胞远离起初两个 可亲和的单核菌丝融合的位置j 曩。在新的单核顶端细胞中，引入的核与剩下的核 发生同步的分离。顶端细胞的分裂是一个复杂的过程，它包括了锁状联合结构的 形成。锁状联合确保了每个双核菌丝细胞保持它的“双核分配”的核，一个核进 入锁状联合细胞并进行分裂，另一个核在双核菌丝细胞的主要部分中进行分裂。 隔膜使得它们产生3 个细胞，一个新的双核细胞和两个单核细胞! ，每个细胞含有 不同的核。当锁状联合细胞顶端与近顶端细胞融合时，核分裂也就完成了。分裂 的核迁移并进入到它的可亲和体中。这在每个顶端细胞的分离的过程中反复着。 当受到环境刺激时，双核发育成有组织分化的子实体，核融合也最终完成。但是 紧接着发生减数分裂和有性担孢子的形成。担孢子弹射，待环境条件适宜时：担孢 子萌发又开始新的生活周期。 交配型基因在蕈菌中的作用是阻止自交从而维持种群中的遗传多样性。在担 子菌中，只要体细胞融合就满足了交配的条件。交配型基因使来自于遗传上不同 的个体中的仅仅一个核相互融合形成双倍体核。双倍体核再进行有性孢子形成之 前的减数分裂。自身不育的物种被称为异宗结合，而那些能自交的物种被称为同 宗结合扫2 。担子菌绝大多数是异宗结合，并且具有一个明显的特征就是含有多对等 位交配型基因。f 因为如此，一些担子菌具有成千上力的不同的交配型。 担子菌的减数分裂发生在孢子台这个特殊的细胞中“，所产生的担孢子在细胞 外发育。这与其他主要的蕈茵有所不同，例如子囊菌，它的减数分裂是在子囊细 胞进行的，所产生的囊孢子在细胞中发育口；。玉米黑粉菌，狄盖鬼伞，裂褶菌是最 初被用来对担子菌遗传学进行研究的模式菌种，这旱从这3 个模式菌种来介绍交 配型基因以及交配型因子的研究进展。 1 上海海洋人学硕十论文 、冀罗哩 图1 1 1 灰盖鬼伞的生活史 f i 9 1 1 1t h el i f ec y c l eo fc c i n e r e u s 1 1 2 交配型基因的功能和交配性系统的类型 在模式菌种中，交配型是由两个不连锁的位点上的基因所决定的；。例如食 用菌中的彳和房，玉米黑粉菌中的a 和b 。可亲和的交配也就是交配位点上的不同 的等位基因相结合的一个过程。例如次盖鬼伞和裂褶菌中的a i b i a 2 8 2 , m a y d f s 中的a l b l a 劢幺一般认为爿因子控制核配对与锁状联合的形成，曰因子控制核 迁移与锁状联合的融合。( 图1 1 2 ) 8g e n e r o g u l a t e ds t o p p h e r o m o n es 姆r m ! ) j n g n u c 酶a re x c h a n g ea n dn u c l e a rm i g r a t k ) n 誓蹩爱蠢篓芝篡篡冀辩 synch毒ronized n u c l e a rd i v | s 脚j ：瀑鬻爹；i 0 1 1o 一。：矗黼鬣蔷爹。 j 叁| | 篇瓣j = 型墅这 j 豳已曼三8 g e n 尊r e g u ) ) t e ds t e p l | i 。 爹 | |l 一笋沁：吱乐霉 上海海洋大学硕士论文 所组成，每个亚单位是编码2 种不同的同源结构域蛋白_ ”j 。口因子同样由3 个功能 独立的亚单位所组成，每个亚单位编码1 个信息素受体和2 个信息素| ：1 。( 图1 1 3 ) ( a ) i l eai o c u so fc o p r i n u sc l n e r e u s g r o u p lg r o u p2g r o u p3 h 0 1h 0 2h d l h d 2h 0 1h 0 2 电章酾量m 重量三璋量 月，l o c u s 又 o a 2l o c u s l e 。占a 。 iii h o m e o d o m e i np r o l e i n s f b ) t h e 日l o c u so tc o p n n u sc n o t o t i s g r o u p1g r o u p2g r o u p3 b i l o c u s p e p t i d ep h e r o m o n e sa n dg p r o t e i n - c o u p l e dr e c e p t o r s l j i m n s c n p t 时n a id c t w 8 t i 。n n u d e 。rm i g m t o n ，c l a m p c e i lf u s o n 积爵币亨万蕊丽蕊 图1 1 3 灰荒鬼伞交配州a 、b 位点的结构 f i g1 1 3t h es t r u c t u r eo f a 、bm a t i n gt y p el o c u si nc c i n e r e u s 大多数担子菌是异宗配合进行有性生殖的，该过程有一个或两个遗传因子决 定，由一个因子决定交配型的机制称为二极性交配系统皑j ：由两个独立分配的因 子控制的交配称为四极性交配系统 ”“。二极性交配系统的遗传结构相对简单，a 因 子是唯一的控制因子，它实际上由两个紧密连锁的基因簇组成，四极性交配系统 中，a 和曰因子分别对应位于不同染色体上的两个交配型位点( m a t i n gt y p e l o c u s ) ，两个单核菌丝相遇，只有当它们形成aqa1 3bqb1 3 型时，爿能产生具有 锁状联合的双核体，完成整个有性生活史。 1 1 3 担子菌模式菌种交配型爿因子的研究进展 1 、灰盖鬼伞的交配型月因子的结构特点 根据同源结构域序列的不同，a 位点的交配型蛋白分成两个具体的亚组：h d l 和h d 2 。h d l 类的同源结构域被认为是非典型的，主要是因为它偏离保守的同源 结构域序列( 尤其在识别螺旋中) 并在螺旋的空隙处发生变化。h d 2 类的蛋白具有 序列的特征结构，这使得它们更相似于保守序列。只有当来自于一个交配异二聚 物的h d l 蛋白与另一个交配异二聚物中的h d 2 蛋白相结合时，才发生细胞内的有 性亲和的识别，并形成一个功能性的控制蛋白1 j 。( 图1 1 4 ) 这个异二聚物被推定 为转录因子，能够结合6 玎体基因中唯一的靶位点。它会使得细胞完成一个新的发 图1 1 4 灰盖鬼伞中交配型彳何点的结构 f i g 1 1 4t h es t r u c t u r eo fm a t i n gt y p eal o c u si nc c i n e r e u s 很明显，细胞内的可亲和蛋白的识别是很重要的。个h d l 蛋白不能与由相同 的不交配细胞编码的任何h d 2 蛋白异二聚化。否则彳因子的控制途径不需要交配 就可以激活了。同源结构域的氨基酸木端区域是用来区分可亲和与不可亲和作用 的，在识别的区域内，用关键的残基来代替会影响蛋白的特异性n 引。 可亲和蛋白亚单位之间的二聚作用可以在没有d n a 的条件下进行，更多的是 在细胞质中发生。尽管这样，将结合d n a ，具有活性的转录因子必须被迁移到核中。 h d l 蛋白家族含有经典的一分为二的核位点信号，并以一些基本的氨基酸为特征 n 。h d 2 蛋白中没发现相似的核位点信号。因此，异二聚化是形成某些功能所必需 的。这些功能包括我们所推定的h d 2 蛋白不能进入到与h d l 蛋白不直接联合的核。 h d l 蛋白可以进入没有h d 2 亲和体的核，是因为它没有识别在d n a 上的联合靶位点 的特异性h 川。 目前在灰盖鬼伞中，使用同源探针筛选文库，已经得到了含, 4 4 2 位点的d n a 片段，对这些片段进行亚克隆，获知a 4 2 位点由两个基因复合物组成，q 复合物 包括两个交配型基因：q 卜1 和q2 1 ，b 复合物含有5 个基因：b 卜1 、b2 1 、 1 33 一l 、b4 1 和b5 - 1 ，后来由g i e s e r “跚等统一名称，以上基因分别改称为q f g 、 1 2 12 - 1 、b l - 1 、b 2 一l 、c 卜l 、d 卜1 和b f g ，其中a f g 和b f g 是交配型基因的边 界序列( b o r d e rs e q u e n c e ) ，在不同位点中，这一序列高度保守。a 和b 复合物之 上海海洋人学硕十论文 间有7 k b 的间隔，在不同位点中，该序列也高度保守，这一7 k b 的距离与遗传学 中的推测的彳q 和月1 3 位点之间的距离相符，所以传统遗传学中的彳q 和彳1 3 位点 分别就是彳q 和彳1 3 复合物。；。彳位点的其它基因均是用同源探针筛选文库这一途 径克隆得到的。 2 玉米黑粉菌的交配型b 因子的结构特点 交配型位点的定义先于对交配型基因的性质了解，后来的研究发现食用菌中 的彳基因相当于玉米黑粉菌中的b 基因，占基因相当于玉米黑粉菌中的a 基因。图 1 1 5 给出了玉米黑粉菌的b 位点的结构。在每个b 位点上具有两个基因。分别定 义为钮和b w , 两者的转录是不同的。叭。6 基因编码h d l 蛋白，6 编码h d 2 蛋白。 施和6 除了具有一些在同源结构域区域的限制性保守序y l j 夕l , ，其他序列没有相似 性。尽管如此，砸( 或6 功的不同等位基因在同源结构域和c 末端区域几乎是相同 的。但是研究推定的两个蛋白的氨基末端是具有很大的不同性拉。正如我们已经 提到的，这些氨基识别区域决定了每个b 位点编码蛋白的特异性。编码b 蛋白的 不同氨基端区域的d n a 序列和中间插入的2 6 0 b p 的基因前体对每个b 等位基因来 说是不同的。因此，在任何b 位点上的两个基因通过传统的重组是不可分离的， 它们将作为一个单一的遗传单位在一起。在模式种中穿过两者交配型位点的不同 的基因结合的方式或中间是由同源序列隔开的基因区域是保守的。 图1 1 5 玉米黑粉菌交配型b 位点结构 f i g 1 1 5t h ef u n c t i o no fm a t i n gt y p ebl o c u si nu m a y d i s 当一个6 ，种和一个彪种融合时，4 个不同的b 多肽也就形成于融合细胞中： 5 上海海洋人学硕+ 论文 b e l ，b e 2 ，b w l 和b w 2 。( 图1 1 5 ( a ) ) 通过剔除交配体中的基因表明仅仅两个多肽就 足以满足交配池21 。这一对多肽必须包括一个h d l 蛋白和一个h d 2 蛋白。例如一个 b e 蛋白和一个b w 蛋白。多肽必须来自于不同的交配型。例如b e l 和b w 2 或者是 b e 2 和b w l 。( 图1 1 5 ( b ) ) 表明了仅仅编码b e l 或b w 2 蛋白的两个菌种的可亲和交 配。完整的交配必须是编码b e 2 或b w l 蛋白也得完全的可亲和驯。 这一原理包含了食用菌中同源结构域蛋白相互作用使得可亲和交配体在细胞 内的识别| ：2 4 1 。尽管这样，食用菌中的a 位点上的基因比玉米黑粉菌b 位点上的基 因多，相应地在细胞内更多的可亲和的与不可亲和的交配体基因产物需要加以区 分丌来。 3 、裂褶菌的交配型a 因子的结构特点 在裂褶菌中，a q4 复合物与p a b l ( p 一氨基苯甲酸合成) 基因紧密连锁晗5 ，利用 这一特点，g i a s s o n 等利用基因组步行，分离出与p a b l 紧密连锁的含aq4 复合物 的d n a 片段，转化分析和交配实验证实了该片段在依赖于aq 的发育过程中的活性 ：! 。序列分析表明aq4 复合物包含两个大的开放阅读框架，分别称为j ，和z 基因 卫i 。然后以此克隆片段作探针，筛选另外的基因组文库，得到了含a q1 和a q 3 复合物的d n a 片段。( 图1 1 6 ) 图 ( ：s ：心t ”越，牡h h e 图1 1 6 裂褶菌的交配型a 傅点的分子结构 f i g i 1 6m o l e c u l a rs t r u c t u r eo ft h eam a t i n g t y p el o c u so f s c o m m u n e 由于a q 和a 1 3 序列之间的同源性很低汪8 。，用ac t 探针不能克隆a b ，而采用 染色体行走的方法费时费力。为此s h e n 等提出了一种非常巧妙的策略功能互 补和质粒抢救的克隆策略，并成功地从裂褶菌中克隆了具有a 1 3 活性的基因v 6 。瓠。 后来研究证明这一策略也应用于裂褶菌中矗q 和房b 复合物的分离i3 0 i 。 1 1 4 担子菌模式菌种交配型口因子的研究进展 1 、灰盖鬼伞的交配型占因子的结构特点 信息素信号对食用菌的交配与有性发育起着必要的作用。在交配型口位点 中，编码信息素和7 次跨膜信息素受体的多等位基因是相互隔开的 3 。研究已经 分离出灰盖鬼伞的交配型房位点。序列分析和转化分析鉴定了编码3 个7 次跨膜 受体基因和6 个信息素前体基因，共9 个基因，长度总共为1 7 k b 。9 个基因的排 列显示出该位点由三个功能独立的亚单位所组成。每个亚单位编码一个信息素受 体基因和2 个信息素基因。记1 。( 图1 1 7 ) - _ 。_ 。_ _ 。1 b 6 爵圆h 圆 啊圈墨簟曩奠圆 -i _ 誓一冀叠鞠 ：= + _ i ：= = ； 一i 一 4 - - - 一- - - - 呻 砷 玉2 jp k b 3 1 r 曲s t 砷妇2 ，p 妇- f - 删1 p w - 2 。舛- l i r 曲j 8 诏 瞄固吨勿臣咽h 圜 _ 一一_ - _ _ - 黛硼圈 一 一啼 - _ 一一- - + 坤6 柏2p - j 2 r 曲i 2 p 堙2 2 砂搬，2 r o b 22 洳l 七i lp 池l l l r i b ；i s u b f a m i l y3 s u b - f a m i l y2 s u b f a m i l y 1 图1 1 7 灰盖鬼伞交配型曰何点结构 f i g 1 1 7m o l e c u l a r s t r u c t u r eo f t h ebm a t i n g t y p ei o c nl c 。门已r e u 3 像彳位点一样，口位点具有特异性是取决于3 个功能独立的基因。而且，这 些基因属于独立的亚单位。亚单位内的每个等位基因是由一个“盒”组成，其中 包括了一个受体和两个信息素基因。两个种交配只需一个亚单位的盒不同，并 是可亲和的。 真菌信息素受体基因编码的蛋白质二级结构很相似，都具有7 个疏水的跨膜结 构域( t r a n s m e m b r a n ed o m a i n ) “，其作用是与信息素分子特异结合，并诱发下游 基因的表达。真菌信息素基因编码的蛋白质中也存在保守结构，如c 一, 端都9 - c a a x 或类似结构。琏i ，其中c 表示c y s ，a 表示脂肪族氨基酸，x 表示任何一种氨基酸，c a a x 是真菌信息素前体的特征结构，其作用是作为成熟过程中多肽c 一木端进行异丙基 修饰的信号，修饰后的信息素是高度疏水的；一。所有的真菌信息素基因都编码相 7 图1 1 8 灰盖鬼伞、裂褶菌交配型曰位点中推定的信息素前体氨基酸序列 f i g 1 1 8p r e d i c t e da m i n oa c i ds e q u e n c e so fp h e r o m o n ep r e c u r s o r se n c o d e db yg e n e so ft h eb m a t i n g t y p el o c io fc c i n e r e u sa n ds c o m m u n e 2 玉米黑粉菌的交配型a 因子的结构特点 玉米黑粉菌像& c e r e v i s a e 一样，仅仅有信息素和受体两个基因。图1 1 9 a 位点的两个等位基因，a 和a 2 ，它们是由不相似的d n a 序列所组成，序列中i b j 具有同源区域。每个位点含有两个基因，这两个基因编码一个交配特异性信息 素基因和相应的受体基因。憎】。编码信息素受体的基因分别为p r a l 和p r a 2 0 编码信 息素或交配因子的基因分别为m f a l 和m f a 2 “；。而且a 2 位点含有两个基因 g a 2 和 r g a 2 ，这两个基因的功能还不清楚，但是是由信息素反应途径所激活川。 u n u z y 船 _h一卜_ n蝴p柑f 量_ _ c = = 悯蔼昏既一 一一_ 一_ - l 舢绁, t a - 删 图1 1 9 玉米黑粉菌的交配型a 位点结构 f i 9 1 1 9t h es t r u c t u r eo fam a t i n gt y p el o c u si nu m a y d i s 上海海洋大学硕七论文 3 、裂褶菌的交配型口因子的结构特点 在裂褶菌中，交配型曰基因被分成两个间接的位点。彦a 和曰1 ：。图1 1 1 0 理论上把9 个易q 等位基因中的一个与9 个占b 等位基因中的任何一个重组产生8 1 个不同的交配型占的种。两个位点之间的重组不能导致自我亲和的反应，表明锣 q 和b f 3 功能上是独立的_ 1 1 。而且，两个位点上的基因是多功能的。在可亲和的交 配过程中，可以共用一个位点上的等位基因。例如口ql01 和口q1b2 两个菌株 之间的杂交是可亲和的。这与交配型a 基因中的情况是相似的，交配型彳基因中， 两个位点含有功能独立但是又多功能的基因。 ；sd 黼龇e 盥量马1 咽，。、1 卜一 鹭1 阉”一 b 雌斌轴脚l 伪b 峄k l l 蚰 l脚辩l 娜1 1 2 l蛐舛mb b r l 鹭盘l o c n i 即i 螂s 图1 1 1 0 裂褶菌的交配? 性b 位点的结构 f i 9 1 1 10t h es t r u c t u r eo fbm a t i n gt y p el o c u si ns c o m m u n e 根据每个交配型( 房q1 和房b1 ) 位点上的序列1 1 j ，每个位点上含有一个受体基 因( b a r , b b r ) 和2 个信息素基因( b a p , b b p ) 。因为b o 和口b 位点似乎代表了基因的 两个独立的亚单位。这样很容易地认为一套基因作为功能性的盒，这个盒必须保 持不被破坏j i 。在给定的彦a 的种中，一个信息素可以刺激来自于另一个盒中的曰 q 受体，但是不能刺激它本身的受体或任何的房b 受体。同样，b 1 3 刺激除了它本 身之外的其他b 1 3 受体，并不能激活曰q 受体m 一。有趣的是，任何一个受体必须能 够识别大量的信息素，并对信息素作出反应，却不能区分它们，因此不能被自身 所激活。 上海海洋大学硕士论文 1 0 上海海洋人! 学硕十论文 2 1 供试菌株 第二章材料与方法 本研究所用的香菇及金针菇菌株如表2 一l 所示： 表2 1 本实验所用材料 t a b l e2 1t e s t e ds t r a i n so f l e n t i n u l ae d o d e sa n df l a m m u l i n av e l u t i p e si nt h i ss t u d y 2 2 试剂 表2 - 2 一般生化试剂 t a b l e2 - 2b i o c h e m i c a lr e a g e n t su s e di nt h i ss t u d y 上海海洋人! 学硕十论文 t a k a r al at a qk i t 10 0 b pd n al a d d e r 2 0 0 b pd n al a d d e r 6 x l o a d i n gb u 行e r p g m t 连接试剂盒 t a qd n ap o l y m e r a s ek i t t o p i o 感受态细胞 琼脂糖凝胶d n a 回收试剂盒 t a k a r a ( 大连) 有限公司 天根生化科技( 北京) 有限公司 t a k a r a ( 大连) 有限公司 t a k a r a ( 大连) 有限公司 p r o m e g a ( s h a n g h a i ) c o m p a n y 天根生化科技( 北京) 有限公司 天根生化科技( 北京) 有限公司 爱思进生物技术( 杭州) 有限公司 t a k a r a e xt a qk i t t a k a r a ( 大连) 有限公司 v s 15 0 0 0 c f ni i 高速冷冻离心机 h w s l 2 型电热恒温水浴锅 x w 一8 0 a 漩涡混合器 3 2 0 p h 酸度计 j y 6 0 0 + 型电泳仪 d h p 9 2 7 2 型电热恒温培养箱 b e c k m a nd u 5 3 0 紫外分光光度计 p r o l i n e 手动移液器 w p 8 5 0 a 微波炉 p t c 10 0 ，p t c 2 0 0p c r 扩增仪 m d f u 3 2 v 超低温保存箱 2 9 e 1 8 t j 冰箱 b c d 2 8 1 e 冰箱 e p p e n d o r f 上海一恒科学仪器有限公司 上海医大仪器厂 m e t t l e rt o l e d o 公司 b i o r a d 公司 上海一恒科学仪器有限公司 德国b e c k m a n 公司 法国吉尔森公司 格兰仕公司 b i o r a d 公司 日本三洋公司 德国西门子公司 e l e c t r o l u x 公司 e c 3i m a g i n gs y s t e m 凝胶成像系统s y n g e n e 公司 2 4 主要试剂盒的介绍及主要试剂的配制 2 4 1 主要试剂盒： ( 1 ) t a k a r a 厨乃口 本制品是应用l ap c r 原理研制的具有3 一5 e x o n u c l e a s e 活性( p r o o f r e a d i n g 活性) 的耐热性d n a 聚合酶。在普通p c r 条件下，与t a qd n ap o l y m e r a s e 相比，具有扩增效率高、错配率低的优良性能。使用本制品扩增得到的p e r 产物3 端附有一个“a ”碱基，因此可直接克隆于t - v e c t o r 中。 1 2 上海海洋人学硕十论文 ( 2 ) 饧k a r al at a q 本制品是应用l ap c r 原理研制的具有3 一5 e x o n u c l e a s e 活性( p r o o f r e a d i n g 活性) 的耐热性d n a 聚合酶。当扩增具有复杂二级结构( g cr i c h 等) 的模 板或具有重复序列的模板时使用g cb u f f e r 进行p c r 扩增将非常有效。无论是扩 增短链d n a 还是长链d n a ，其效率都优于其它同类产品，尤其在扩增大于l o k b p 的 d n a 片段方面，其优势更加明显，而且保真性能强。使用本制品扩增得到的p e r 产 物3 端附有一个“a ”碱基，因此可直接克隆于t v e c t o r 中。 ( 3 ) 乃肠肋l ap c r 。i nv i t r oc l o n i n gk i t 本试剂盒利用p c r 法，使用c a s s e t t e 以及c a s s e t t ep r i m e r 。可特异性地扩 增c d n a