（食品科学与工程专业论文）酶解乳清蛋白制备ace抑制肽的研究.pdf

摘要 血管紧张索转换酶( a n g i o t e n s i n i c o n v e r t i n ge n z y m e 利用酶解法从乳漪蛋白中制备a c e 抑制肚。 改进荠建立7 可靠的a c e 搦制率盼簿井糗测为法， 轼耀子各种样箍的a c e 撺翩率黪检测。 a c e ) 抑制剂具有降m 压的作j 】，本文 该方法典有是好的鞲溺性和垂现性，可 以a c e 抑制率为指标，从几种蛋白酶中筛选比碱性蛋闩酶为制备a c e 抑制肽的最佳用酶。 采用三因素二次派交旋转设计，咀a c e 抑制率和水解度为描标，对碱性蛋闩酶水解乳清蜇向的 条传进行了撬纯，褥出碱 圭蛋囊酶意l 备a c e 搀捌效麓最虢象蛾：为：拳蜒瀑瘦5 0 c ，底拯浓度为 5 ，e ：s 为5 5 ，通过单冈素试验确定了最遗承解时问为6 h ，在此条群下获得东解物薛l c s 。值 为0 9 7 m g m l 。同时发现水解度和a c e 抑制率之间没有相关性。 利用6 k d a 趟滤膜通过超滤对a c e 抑制肽进行分离，确定r 其工艺参数濑艘为2 0 。c ，压力为 0 + l 赫，在魏条髂 - 送行超滤，透过渡毒| 】截搿浚的a c e 搦铡攀分裂提裹了3 4 i i l l 9 ，5 8 ，由戴可 见使用6 k d a 超滤膜可以有效的分离a c e 抑制肽。 采用离子交换树腊对a c e 抑制肽进行脱赫处理，以5 0 r m i n 的流速过诃1 离子交换树脂柱，脱 热睾达到8 0 ，氮的回收辜达到9 0 ，而水解物的a c e 抑制率几乎没有什么变化。说明酶解乳 漓蓬鸯；| ；| | 冬a c e ，镩裁茬轰霹臻嘲藤子交接瓣稳躐麓是可行豹。 初步建立了生产a c e 抑制肽的最佳工艺流程：乳清蛋白一水化一蛋白酶水解一水解液离 子交换树脂脱盐一冷冻干燥一产品，该工艺直接对水解物进行脱盐可毗缩短生产a c e 抑制肽的 王艺步骤，减少鬣自鹱的损失，两且水解物的a c e 抑制率也较高，符合l ：业化生产的要求。 荧键词：乳渍爨自，酶解，a c e 搀嘉l 舷，超滤，聪盐 a b s t r a c t a n g i o t e n s i n - l * c o n v e n i n ge n 掣m e ( a c e ) p l a y sa ni m p o r t a n tp h y s i o l o g i c a lr o l ei nr e g u l a t i n g b l o o d p r e s s u r e a c ec o n v e y sa l li n a c t i v ef o r mo fd e c a p e p t i d e ，a n g i o t e n s i ni ，t oap o t e n ta s o c o n s t r i c t o r , o c t a p e p t i d ea n g i o t e n s i n1 i ，a n di n a c t i v a t e sb r a d y k i n i n ，w h i c hh a sad e p r e s s o ra c t i o n - c u r r e n t l y , m a n y a c ei n h i b i t o r sh a v eb e e nu s e da sa n t i h y p e r t e u s i v ea g e n t s ，i nt h ep r e s e n ts t u d y , t h ea c ei n h i b i t o r y p e p t i d e sw e l n ：p r e p a r e df r o mw h e yp r o t e i nw i t hp r o t e a s eh y d r o l y s i s ar e l i a b l ea s s a ym e t h o do fa c ei n h i b i t o r yp e p t i d e sw i t hh i g ha c c u r a a n ea n dr e p e a t a b i l i t yw a s m o d i f i e da n de s t a b l i s h e d ，a n di tc a l lb eu s e dt od e t e r m i n et h ea c ei n h i b i t o r ya c t i v i t i e so fa l lk i n d so f s a m p l e s t a k i n ga c ei n h i b i t o r ya c t i v i t ya si n d e x ，a f t e rs c r e e n i n go fs e v e r a lc o m m e r c i a lp r o t e a s e s ，a l c a l a s e w a su s e dt oh y d r o l y z ew h e yf o rp r o d u c t i o no fa c ei n h i b i t o r yp e p t i d e t a k i n ga c ei n h i b i t o r ya c t i v i t y a n dt h ed e g r e eo fh y d r o l y s i sa si n d e x e s ，o r t h o g o n a lr o t a t i o n a lr e g r e s s i o nd e s i g nw a su s e dt oo p t i m i z e t h eh y d r o l y s i sc o n d i t i o n so fw h e yp r o t e i nw i t ha l c a l a s e t h eo p t i m a lh y d r o l y s i sc o n d i t i o n so fw h e y w e r e ：t e m p e r a t u r e5 e ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n5 ，e n z y m et os u b s t r a t er a t i o5 5 ，h y d r o l y s i st i m e6 h o u r s i nt h e s ec o n d i t i o n s ，w h e yh y d r o l y s a t e sl c s ow a so 9 7 m g m l ， u l t r a f i l t r a t i o nw a sa p p l i e dt oi s o l a t e da c ei n h i b i t o r yp e p t i d e s t h eo p t i m a lu l t r a f i l t r a t i o nc o n d i t i o n f o r6 k d am e m b r a n e ew a sa t2 0 cw i t hp r e s s u r e0 + i m p a 。a f t e ru l t r a f i l t r a t i o nt h ea c ei n h i b i t o r y a c t i v i t i e so f t h ep e r m e a t e sa n dp o t e n t a t e ss e p a r a t e l yi n c r e a s e d3 4 a n d1 9 ，5 8 s a l tw a sr e m o v e db yi o ne x c h a n g er e s i na taf l o wr a t eo f5 0 r m i nw i t hd e s a l i n i z a t i o nr a t eo f a p p r o x i m a t e8 0 a n dn i t r o g e nr e c o v e r yr a t eo f9 0 n od i f f e r e n c e sw e r eo b s e r v e do nt h ea c e i n h i b i t o r ya c f i v i t yo f s a m p l e s a no p t i m u mp r o c e s s i n gt e c h n o l o g yo f a c ei n h i b i t o r yp e p t i d e sw a se s t a b l i s h e da s ： w h ， h y d r a t i n g - * p r o t e a s eh y d r o l y s i s - - , h y d r o l y s a t e - _ d e s a l i n i z a t i o nb yi o ne x c h a n g er e s i n - - , f f e e z e d r y i n g - a c ei n h i b i t o r yp e p t i d e s i nt h i sp r o c e s s i n gt e c h n o l o g y , h i g ha c ei n h i b i t o r ya c t i v i t i e sa n dl o w p r o t e i nl o s sw e r eo b t a i n e dw i t hd i r e c td e s a l i n i z a t i o no f w h e yh y d r o l y s a t e s ， k e yw o r d s ：w h e yp r o t e i n ，e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ，a c ei n h i b i t o r yp e p t i d e s ，u l t r a f i l i t r a t i o n ， d e s a l i n i z a t i o n l l 缩略词表 英文缩写 英文名称 中文名称 a c e a n g i o t e n s i n i c o n v e r t i n ge n z y m e 血管紧张素转换酶 e d t a e t h y l e r i ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 r a s r e n i n a n g i o t e n s i ns y s t e m 肾素- 血管紧张素系统 k k s k a l l i k r e i n k i n i ns y s t e m激肽释放酶激肽系统 s h r s p o n t a n e o u s l yh y p e r t e n s i v er a t 自发性高血压大鼠 leufl)leucine 亮氨酸 lys(k)lysine 赖氨酸 p r o ( p 、p r o l i n e 脯氨酸 a s n ( 肼a s p a r a r t i ea c i d 天冬氨酸 m e t ( m 、 m e t h i o n i n e甲硫氨酸( 蛋氨酸) g i y ( g 、 g l y c i n e 甘氨酸 t y r ( y 、t y r o s i n e 酪氨酸 v a l ( v ) v a l i n e 缬氨酸 p h e f np h e n y l a l a n i n e 苯丙氨酸 l l e ( 1 、 i s o l e u c i n e异亮氨酸 a j af a l a l a n i n e 丙氨酸 a s n ( n ) a s p a r a g i n e 天冬酰胺 h i s o t ) h i s t i d i n e 组氨酸 s e r ( s 、 s e r i n e丝氨酸 t r p ( w 、t r y p t o p h a n 色氨酸 a r g ( r 、 a r g i n i n e精氨酸 w p c w h e yp r o t e i nc o n c e n t r a t e乳清浓缩蛋白 l c 5 0 g i n ( q ) t h r ( t ) g l u ( e ) w p i c y s ( c ) h h l t n b s e ：s 5 0 i n h i b i t o r yc o n c e n t r a t e g l u t a m i n e t h r e o n i n e g l u t a m i ca c i d w h e yp r o t e i ni s o l a t e c y s t e i n e h i p p u r y l - h i s t i d y l - l e u c i n e t r t r o b e n z e n es u l f o n i ca c i d e n z y m et os u b s t m t er a t i o 抑制5 0 a c e 活性需要的 a c e 抑制剂的浓度 谷氨酰胺 苏氨酸 谷氨酸 乳清分离蛋白 、r 胱氨酸 马尿酰组氨酰亮氨酸 三硝基苯磺酸 酶与底物的比例 i l i 独创性声明 v7 7 4 4 0 2 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名 鸯鲰跨， 时间：砂巧年f 月7 午r 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：鸯朗鸳 刀 导师签名：彳 叫 l i 1 时间： 2 。6 年月卵 时间：彬年月r 乒日 躇 主雪奎些_ 丈兰翌圭茎堡茎耋二。，。，。，。，。，。，呈：耋，彗兰 第一章绪论 1 1 高血压 高血压病是最常见的心血管疾病，它不仅患病率高，而且是引起冠心病、心肌梗塞、脑萃中、 心脏及肾功能衰竭的最主要的发病因素。高血压是对人类健康危害极大的一种疾病，潜伏期睦。 高血压的早期阶段，一般没有明显不适症，直至发生临床迹象心脏病发作、脑血管破裂而导致死 亡f ”。据统计，全世界每年因高血压引起的心脑血管疾病的死亡人数超1 2 0 0 万，高血压病已成 为成为全球性的重大的公共卫生问题。 1 1 1 高血压的分类及标准 有关高巍氍的定义和标凇，不同的国豢农不同的规定。国际上普遍认w 的是1 9 9 9 年 进界卫 生组织( w h o ) 与匡际嘉毅笨联盟( i s h ) 联合发表l 鼋t 9 9 9 年高盘压治疗指南对高藏压豹定 义和分类。该指南规定高血聪的最低限为：束服降压药的情况下，收缩压1 4 0 m m h g 缄舒张压 ， 9 0 m m h g 。w h o i s h 对m 滕水平的定义和分类具体情况见表1 1 【2 j o 衰1 - t 盘压承举豹定义鞍分类锵 o 1 s o ) t a b l e l - 1d e f i n i t i o na n dg r a d eo f b l o o dp r e s s u r el e v e l 我国发袭的 2 0 0 4 年中弱高血压防治搬南( 实用本) ，该指南根据近年来大量有笑篙瓶压流 行病学及循证医学研究结果。参照各国商m 赝防治指南，缀图内心血管、内分泌等相关领域专家 反复讨论，在1 9 9 9 年中翻随血压防治指南的基础上修订丽成。该指南将血压水平分类为： 正常盎莲( 1 2 0 8 0 m m h g ) ，菱鬻寒蓬 2 e 1 3 w 8 0 8 9 m m h 翁，商整歪( 1 4 0 9 0 m m h g ) 嚣l 攀缝渡 缩期高血压，其中高血压分l 级高血压( 1 4 0 1 5 9 9 0 9 9 m m h g ) 、2 级高廊厩( 1 6 0 1 7 9 1 1 0 0 1 0 9 m m h g ) 、3 级商血压( 1 8 0 1 1 0 m m h g ) ，单纯收缩期高血压( 收缩压1 4 0 ，舒张压 9 0 m m h g l 3 j 。 按病因分一般将高血压分为两大类：有些已知原因g l 起的高血压，称为继发性离血压，也 就是说这转高盘厩赘发病骧阑e 较明确，只疆治愈了诱发瓤蓬升高静菜静痰瘸，瀣压藏可壤滚复 孛茹寂韭夫学壤士攀经论文 第一章绪渣 匝常，这类高血腾柱临床上范较少魁，约占惑蕊赢压患者酶1 左右p j 。男一大类静商盎压静菠 痫胤因尚不清楚，临床特点以皿压升高为主要特征，随着病情的加重和年龄的增加而逐渐发展， 在控展过程中常常使心、脑、肾簿脏器受累，使逮些脏器发生功能性或器质性的政变，如高瓶愿 心脏瘸、心力衰竭，鹭珐麓不叠、膝窭蛊等荠菠疲，这耱高盎匿蛊离盘压意老熬9 5 陵主，是惫 害人体健康的主蘩疾稿f j 。 l 。1 2 嵩血压的趣客 商血压是一种以动脉血管收缩压或舒张压升商为主要特征的临床综台症，它常伴有心脏、瓶 管、脑和肾脏等器官功能性和器质性改变的全身性疾病p j 。高m 压是心血管病的决定因素，与心 血管瘸发生的危险性呈正相关，其主要危害是造成脑、心、肾等道要器官的损害，脑卒中和冠心 痪燕薅蘸歪最严蘩鹣并发症。蠡予巍蘧长麓维持簌较毫的瘩平上，翔重心蕴受耱；。争麓发生代镁 性左心室肥厚，随潜病情发展心脏继续扩张，最后可能发生心力衰竭及严重心律失常；妖期血腰 升离可促进动脉粥样硬化的形成，尤其是冠状动脉硬化的发展，也可使小动脉硬化易于破裂出戚 或癃挛丽导致弦斑捻的形成。肾贼入球和出球小动脉痉挛、硬他、退变导致肾脏缺血、缺氧、肾 实震纾维耗。齑斑攒巍麓多停毒避行往臀珐麓减邋，露时矗压长麓费毫健褥视弼麓动菰发生玻璃 样变化。值得注意的是：高血压早期阶段一般没肖什么不适症。敷至发生临床迹琢心脏病发作， 脑衄管破裂( 中风) 等，因此，商皿压被称为人类健康无形的杀手。 感血压发病率：全球1 0 亿患者，中国1 3 亿1 6 。我国的高血压瘸存在“三离”现象高发病， 瑗鸯亿三千万a 患有高盘压、簿竣残、高死亡：还有一个“三骶”现象翦 浇率诋、治疗辜 低、控制率低。困此，治疗和防治高血压是当今社会一个重要的课题。 1 2a c e 与高盘压的关系 1 2 1a c e 搬管紧张素转换酶( a n g i o t e n s i n * i - c o n v e r t i n ge n z y m e ，a c e ) 是一种含锌的二默羧基肽酶 ( d i p p e p t i d y l c a r b o r y o n x y p e p t i d a s e ) ，在a 髂缝缓及瞧浆孛广泛存在，主要存在，瞧管的肉皮纲魏 内，在肺毛细血管中含量最为丰寓，在肾及雄性嫩殖器官( 睾丸) 中含量也较多f ”。a c e 是膜髂 合酶，分子量为1 2 9 1 0 5 1 3 6 1 0 5 ，沉降系数为7 9 s ，等点电为4 7 5 ，由单一肽链组成，含火 量躲低聚糖( 蚨甘露糖、半乳藉、n 7 - , 酝基葡萄耱禽星最多，占越璧的8 3 2 ) ，锌、氯离子是 维持辩活性必需的舅。该酶能棱金藩螫台裁、薰念寝盏和特定欺奖所摊制。最富皴的抑鞠裁麓 e d t a 、溴化镉、舰管紧张素转化酶i i 、舒缓激肽等。己证实a c e 有较宽的底物j 警一性，除作用 于曲l 管紧张素i 外，还与含不同c 朱端氨基酸的黻底物起反应，如好缓激肽、p 物质、脑啡肽、 促黄体生成素释放激素等。但该翡仍具有默键专瞧，需要胡离子馁纯，其中氧懑子是最有效的 激活翔”q 。a c e 最然有较宽静斌彩，值最重要的必然底物是盎篱紧张素i 和舒缓激蔽，a c e 对 它们的作用都产生m 管收缩活性。引起血压升高【i o l 。 2 1 2 2a c e 对血压的调节作用 a c e 在人体肾素一血管紧张素系统( r e n i na n g i o t e n s i ns y s t e m ，r a s ) 和激肽释放酶一激肽系统 f k a l l i k r e i n - k i n i ns y s t e m ，k k s ) 中，对血压调节起着重要的作用，见图1 1 。r a s 是体内重要的血压 凋控系统，无活性的血管紧张素原在肾素的作用下转化为血管紧张素i ，血管紧张素i 在a c e 的作 用下转化为血管紧张素i i ，血管紧张素i i 是r a s 中最强的血管收缩剂，能刺激血管收缩使血压升 高，同时血管紧张素i i 也能促使醛固酮分泌，直接对肾脏作用，引起钠储量和血溶量增加，使血 压升高。k k s 中的缓激肽是降压物质，它能促使血管扩张和刺激扩张血管物质前列腺素的合成增 加，二者共同作用使血压下降，而缓激肽在a c e 的作用f ，会分解成失活片段，引起血压升高。 r a s s n k k s 在血压调节方面是一对相互拮抗的体系，其平衡协调对维持正常血压有重要作用这 两者的平衡失调被认为是高血压发病的重要因素之一。a c e 在这两者系统中起重要作用，a c e 活 力升高破坏了正常体液中升压和降压体系的平衡，使得血管紧张素i i 生成过多，而体系中扩张血 管物质缓激肽和前列腺素合成减少，此三种因素共同存在使血压升高”。抑带i j a c e 活性对降低 血压有积极的影响，因而研究开发有效的a c e 抑制剂引起人们极大的关注。 肾焉一瓢髯疑强暴系统激肢释放嚣激肽系统 肾豢 瓜譬紧张素原 理篓鬈簇尹1蝴 图1 1 血管紧张素转化酶对血压的调节作用 f i g u r e l - la n g i o t e n s i n - e o n v e r t i n g e n z y m er e g u l a t i o no nt h eb i o o dp r e s s u r e 1 3a c e p s i 肽的研究进展 1 3 1a c e q $ 1 j 肽的概述 a c e 抑制肽指的是一类具有抑制a c e 活性的多肽物质，这些多肽的氨基酸序列和肽链长度各 有不同，但都具有类似的功能。a c e 具有两个活性的作用位置，分别名为n 一区和c 一区，这两个 稷8 滞 活蚀区域具有凡乎相同的功能，哭是对不同底物的亲和力有所不同。a c e 掷制腻对a c e 的亲台艘 比j 由l 管紧张素i 或舒缓激肽还要强，而且也不易从a c e 结合区释放a c e 抑制肽，可以有效地抑制 a c e 的活性，从而阻0 导a c e 催化啦管紧张素1 水解成为血管紧张索i i ，以及催化舒缓激肽水解成为 失添冀毅弱嚣秘垒纯菠应过程，越薄盘匿痒爱。囊麸1 9 6 5 年f e r r e l r r a 蔷次扶巴嚣竣蛇蛇毒中分藏 m a c e 抑制肽以来| 1 2 l ，人们现已从麦胚蛋白、乳酪蛋白、乳清爱臼、大豆蛋白、大米蛋白等蛋白 质中分离纯化到了符种结构、序列及大小不一的媳有抑带r j a c e 活性的小肽”“】。 1 3 + 2 灌手菲嚣食蒜蛋鑫藩熬a c e 赛潮瑟 o s h i m a 等人在1 9 7 9 首次报道丁从食品蛋白质中获取a c e 抑制肽，研究人员利用细菌胶原酶降 解明胶，获得了6 条典有显著的抑制a c e 活性的小胶，其分子量郝在15 0 0 d a 以下，其c 端都具有 a l a - h y p 缝梅。蠡郡疆嚣发褒了多秘来源不弱静a c 嚣拿枣裁获l l “。 对于从鱼肉蛋白中获取a c e 抑制肤，b 本研究的最多。1 9 8 6 华s u c s u n a s t a o s a j i m a 等人最先报 道了沙丁鱼和带煎的水解物中含有a c e 抑制肽，麒分子量在l0 0 0 2 0 0 0 d a 范围内”。1 9 9 4 年， m a t s u f u j 例明碱性鬣自酶水勰沙了。惫获得了1 1 条链妖为2 4 个氨熬酸基j a c e 抑制髋。s u g i y a m a 镣 人弼溅程蛋垂酶承瓣瓣器静丁嶷痰，东解穆不仪骞髂静静s g a c e 靛活性，电崧傣蠹活性，以 2 1 0 m g m l ) l j 量喂养自发性高血压大鼠( s p o n t a n e o u s l yh y p e r t e n s i v er a t ，s h r ) t l 易中风的高血压鼠 时，舡压明显降低，另外s h r 的寿命朗显延长。h i r o y u k i f u j i t a 等人1 9 9 9 年从鲣鱼中分离山8 条a c e 抑划肽，其中五脓l e u - l y s - p r o - a s n - m e t 抑$ j a c e 的活性最高，其 c s o 值为2 。4v - m o l l ，静脉注射 s h r ，注越裁囊鸯3 1 7 # 豁g 体重，瘫压降低t 5 0 m m h g ，班壤夔水解物作l 疆藤交叉实验，在6 l 像 自愿临界高血压和轻度高血压受试者中，3 0 名受试者每人按1 2 5 m g k g 体重服用水解物，3 l 位受试 者月用安慰剂。5 周后，服用水解物的受试者收缩压下降了1 1 7 m m h g ，舒张压下降了6 9 m m h g 。 随聪般用安慰裁的3 l 位受试者缀耀水艇耪，服耀承瓣物豹3 0 名受试者赧用安慰刹，交叉螽瑕翊承 辫耘收缩压下降7 9 4 m m h g ，器；藤下降了4 。6 m m h g 。同时发现搿脊的受试者体矮指鼗没有任俺 明照的变化，表明水解物对人体没有昌q 作片j f l 印”。b y u n 等人在2 0 0 1 年用蛋白酶水解从鳕鱼皮中获 取的明胶，其水解物具有较高的a c e 抑制率，通过趣滤和液相色潜从水解物中分离出g l y - p r o l e u 和g t y - p r o - m e t 两条熬餐搀裁a c e 灏憋麓短默，其l c 5 。僮分剩是2 6 秘1 7 1 3pm 。f a h m i 等人鑫 2 0 0 4 年稻碱性鲎彝酶求解海东鲤燕静鱼肉蛋自，胰承解物中分离纯仡出4 条具有抑制a c e 活性的 短肽( g l y - t y r , v a l t y r ，g l y - p h e 和v a l i l e - t y r ) ，藏短肽的a c e 抑制率是未纯化的水解物的5 0 0 倍h “。此外人们还从南极磷虾、盘枪鱼中发现t a c e 抑制肽，南极磷虾脱脂蛋白经胃蛋白酶、胰 蛋鑫酶分解褥到的水解魏其有穰强触簿盎延终翅。 大豆蛋自是重鬻的植锈蛋白资源，大豆蛋白不仪社会经济成本低廉，两且其奢优良的营养蘸 质，研究大豆蛋白水解物是否具有抑制a c e 活性具有十分重要的意义。国内外对大豆蛋i 刍a c e 抑 制肽的研究都比较彩。s h i n 等人1 9 9 5 年从韩国豆酱分离出了大豆a c e 抑制肽h i s - h i s l e u ，其半抑 摹l 浓瘦| e * 蕴为2 。2 # 劬n l ，趣摸获漩救菝舍藏的h i s 。h i s l e u 在s t r 豹太动辣孛可鹈遂酶甄a c e 豹 活慷，按s m g m g 体熏次注射三次扁词。使心脏收缩厩f 降6 1 m m h g ，其有较好的降愿效果。g i b b s 等人在2 0 0 4 年研究外源性蛋白酶水解大豆、大豆发酵食品、纳恿和豆豉水解物抑制a c e 的活性， 研究发现链酶蛋白酶的纳豆水解物舆有较高的抑制a c e 的活性，除了抑制a c e 活憔之外，还具有 4 抗i i n 栓形成的活性| 2 4 l 。k u b a 等人程2 0 0 5 年用红曲褥产生的酸性蛋出酶水解大豆缀融，从中分离掇 出了4 条( l a i p v n k p 、l p h f 、s p y p 和w l ) 具有抑f # i j a c e 活性的肽段，其i c 5 0 德分别是7 0 m m 、 6 7 0 r a m 、8 5 0 m m j i l 6 5 m m t 2 ”。吴建平等人系统地研究了蛋白酶水娜大豆蛋白所得到的a c e 抑制肽， 对生产离活性a e e 静篱l 获豹蛋鑫酶避行了筇选，避行了酶条转蕊貔纯帮酶承舞参数豹疆究，努掇 了水解产物的肽谱，探讨了分离出的a c e 抑制肽在s h r 体内作硐效果，讨论了萁大致的作用机理 弗h 对其稳定性避行了研究，他j i = j 蛋白酶e 水解大豆蛋白，其水解物上清液的i c 5 0 值为 t 2 m g m l t 2 ”q 。蒗俊峰等人2 0 0 4 年研究了两种工业他酶p r o t e a s e a 和o r i e n t a s e b 豹大豆蛋白农解锄 幸霉$ 1 1 a c e 静活毪，并基对囊霉翻鹣淫性较高懿拳耱物迸孬了感客谱徐。这嚣秘酶瓣农解物鹃a c 嚣 抑制率均随着水解时间的增加呈 日数规律增加。熟中o r i e n t a s e b 水解人豆蛋白1 0 h ，其产物的a c e 抑制率最高达到9 5 ，p r o t e a s e a 水解物的a c e 抑制率最高也可达到9 1 3 3 。p r o t e a s e a 水解4 1 0 h 的产物以及o d e n t a s e b 承解6 1 0 h 魏产物，是由2 5 个氨基酸组成憋寡教，其a c e 的抑制率离， 盈蓠睬轻徽或没鸯p “。 玉米是人类重要的食品之一，宵报道从玉米鬣自的水解物中分离i j a c e 抑制肽，m i y o s h i 等人 1 9 9 1 年从嗜热蛋白羁簿的玉米蛋白水锵物中分离出a c e 抑制肽，多数为三肽，研究发现n 一末端为巍 氨酸比n 一末端雨氮黢的三弦的捧铡活性强i 3 2 1 。y a n o 等入1 9 9 6 年剥耀噻热蛋鑫酶永粲玉米蛋白， 获褥了大量斡小获片段，其中三款l e u - a r g p r o 静静$ a c e 的活性聚强，在俸蠢也艇肖降压活性。 s u b 等人在2 0 0 3 用六种商业蛋白酶水解玉米麸皮，其中风味蛋白酶水解物显示具有最高的抑制 a c e 的活性，其i c 5 0 值为0 1 8 m g n 伺k t l “。 另外，学者翻逐从植物 予、蕉溃、蛋黄、蜂手浆、蘑菇、火拣、发酵蚝油、涵菜籽、猪露 髓蠡琏摄自、鹰嘴豆的鹱球蛋白、串肉、豌豆、蜂糍筒包等食晶中发蠛t a c e 捧制歉盼存在i “4 q 。 1 3 3 乳源性a c e 抑制肽的研究现状 虢楚幼年动锈瓣簸好禽豌，除了萁有营养髂嚣l 静，两盈还是许多生物活性膝盼重要来滚，生 物活性肽能够在消化酶或微生物酶的作用下从牛乳蛋向中释放出来，从牛乳蛋白中获得的生物活 性雾脓已经在体内和体外显示了不同的功能，例如：抗高血压、抗微生物、抗氧化、抗血栓、免 疫调i 捧、捉避矿物壤暇嫂和阿片榉秘矮h ”。其孛簸其蠢研究靼拜发份毽驰是抗薅盎压获，是从 m a r u y a m a q 臣1 9 8 2 萃蓠次扶酪蛋自中分离到其喜拇镯a c e 活性的小虢以来p 8 ，现在已经从乳清蛋 白、酪蛋白和发酵乳制品中发现了许多具有抑$ i i a c e 活性的肽。 1 ，3 , 3 i 乳清蛋白来源的a c e 抑制魅 巍清蛋皇是生产于酪的副产耪，占牛巍蛋自磺的2 0 左右，其生物学效价离并盛含有多种生 物活性肽。m u l l a l l y 等1 9 9 7 年研究了b 一乳球蛋白、d 一乳白蛋白和乳清浓缩蛋白( w p c ) 水解物 抑$ 1 0 a c e 的括性，米水解的底物具有较低的a c e 抑制率 】0 ) ，乳清蛋向经过管蛋白酶、胰 蛋巍酶、演凝魏蛋囊瓣、c o m l a s c $ 4 l p n t 酶承解蜃承瓣麴其有7 3 粥掰a e e 瓣翱奉，弹性蚤自 酶承解物具有较低的a c e 率，e 一飘塔蛋白和w p c 的胰蛋自酶承解物通过两步超滤历其透过液的 i c s 0 值为1 3 0 2 0 1 r r i e e l ”。m u l l a l | y 等人进一步研巍b 乳球蛋向麒蛋白酶水解物抑制a c e 的活 性。宪艇的b 一乳球骚自没有抑* 0 a c e 的活性，而胰蛋白酶水解物熙有8 4 1 3 的抑制a c e 的作用。 5 通过c 1 8 同相提取1 3 一乳球蛋白胰骚自酶水解物时，用2 0 2 5 z 腈洗脱得至6 的肽物质的a c e ： 搿制 率迭到9 36 ，随后m u l l a l l y j 对固棚提取物进行了脯潜分析，对成的b 一乳球蛋内r 0 4 2 - 一1 4 8 ) 片段r 它不能被胃蛋自酶避一步消化，胰凝乳蛋向酶能微小程度地水解这驰默p q 。a m h a r 等人在t 9 9 8 年 弼，t 静巍韭蛋岛簿拳辫子醛巍溥，臻承解秘对s h 转述露灌霉，繇瑟蛋垂酶k 豹农媾镌表觋鑫壤强 的降j 衄压效果，血压降低了5 5 m m h g ，接着用反搁高校液相色谱和凝胶过滤色谱分离出了- t y r - p r o * p h e - p r o - g l y ，g l y l y s - p m ，l l e - p r o - a l a ，p h e - p r o ，v a l - - t y r - p r o $ 日t h r - p r o v a l v a l - p r o - p r o - p h e - l e u - g i n - p r 0 6 条- a c e 抑制肽，化学合娥的这6 条驳，除了十肽辨其余5 条敢在s h r t = p 都其有抗离搬 基溪壤，丽结梅象螽一嚣球蛋白黪三弦吴毫最戳豹抗寒盘压活陡p “。a n n e 等天2 0 0 0 ：年萃l 矮骧餐 自酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶单一或复合水解乳清蛋白，其中脯 擞自酶水解物和胃礞白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶复合水解乳清蛋白所得的水解物具有抑制 a c e 的活性，并遥避两步超滤和发向渡相色谱，从水解秘中分离如8 条a c e 抑制黻，其l c ，。的范搿 为7 7 1 0 6 2 # m 5 2 1 。拉眷夫等入蕊死种热不稳定的蛋白酶隶解g b 渍蛋自获得了蒹有整好瑾话特幢 并飘间时具有抑胄4 a c e 活性的水鹪物，乳清分离瑕自( w p i ) 水解物的i a c e 酶i 的抑制率几乎是w p c 水解物的两倍，w p c 的进一步水解可以造成抑制a c e 的活性的增加，但相对于w p i 水解物可以观 察到风辣的显著下蹲，其对风眯的不是影响归结予若睐帮收敛瞧的增加，进一步通过皲滤和反翊 液籀鬯谱分离毒了凡种其育擒e 镪i a c e ：活性静多髓( s a p ，m k g ，a l p m h ，l i v t q t l v s l p e w ) ”“。c o m e l l y ：等a 2 0 0 2 年用二次正燮旋转设计，研究了预处理温度、底物浓度、p h 、温度和水解 时间对胰腺蛋白酶孽l 清蛋白水解物抑制l a c e 活性的影响，分析了玄们之间的相互作用，结果表明 可以逶过调整这纛个因素的条件i | i 控钢乳渣蛋自永瓣耪弱j a c e j 雄铡牵1 5 4 1 。牛| l 嚣滔蛋矗来淫静 a c e 抑皋l 膝觅表1 2 即l 。 1 3 , 3 ，2 酪蛋白来源白勺 a c e i 抑制肽 薅蛋自是牛乳巾的主要蛋自痿，占牛乳蛋白餍泌8 0 。m y a m a 等摄串翼酪滋鑫簇蛋白酶承 解物分离纯纯f ： l 其脊辑i 霸j a c e 活性黯十二肽、七胶、a 获科夏脉，其中五肽( f f v a p ) 是用脯氨 酸专性内肽酶水解十二肽( f f v a p f p e v f g k ) 得到的，它的a c e ! 抑制率是十二肽的1 3 倍左右 5 ”。随后k a r a l i 嚣用酪蛋白的胰蚤白酶水解物谯i 喂s h r , 饲喂量为3 9 k 叠时，3 5 h 后血压摄 薯簿低；当囊物中承解物占1 对，s r t r 盘嚣无变豫，磊食兹中承瓣褥占3 靖，瓶第二撼到第鞠 周，s h r m i 压一童黧下降趋势，至第4 周末，血压降为1 6 m - 4 m m h g ( j 静照组为1 7 7 士4 m m h g ) p ”1 。由 此可见，抑制剂的剂量与其抗高m 聪作用是呈正棚关的。m a e n o 等人1 9 9 6 j 年用上 8 f v e t i c u s c p 7 9 0 蛋童j 酶水解酪蛋向，并且通过两步反相高效液相色谱分离水解物，仅有一部分分离物在! s h r 中袭 现凌撬裹盘压话装i 蹦。h a u e s e l a s s i e 篱入在1 9 9 9 每璃褒监蛋鑫藩窝擞生麴蛋蠡酶术瓣手繇，遥过簸 相液相色谱分离出一条具有抗高舷压活性的短脓( b 一酪蛋白f ( 6 0 - 6 6 ) y p f p g p l ) 1 6 0 1 。 1 3 3 3 发酵乳制品米源胜i a c e i 抑制肽 第一次关予获羧奶中分枣、糖缝秘篓定a c e 热裁薤翡投遴跫在1 9 9 5 年。n a k a m m 等久班 l a c t o b a c i l l u s h e l v e t i c u s 和s a c c h a r o m y c e s c e r o v i s i a e 菌株作为乳发酵剂制成c a l p i s 酸乳，通过四步高 校液相色谱从c a i p i s 酸乳中纯化出两强 a c k 抑制肽v a l - p r o - p r o ；f l l l i e - p r o p r o ，其j c 5 0 值分别为9 和5 um ”。随后n a k a m u r a 等研究s h r 饲喂c a l p i s 酸乳溅这两种肽的动物试验，结果袭明日服一定荆 6 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 量的酸奶或这两种肽对s h r 均有明显的降血压作用，弗且对正常鼠血压没有任何影响p “。 y a m a m o t o 等人1 9 9 9 年从上h e l v e t i c u s c p n 4 发酵制成酸奶类似品中分离出一条抗高血压活性的二肽 t y r - p r o ，t v r p m 的浓度随着发酵过程的进行而增加【6 3 j 。王海燕研究了发酵乳中降血压产品的制备， 利用h 1 菌种在接种量为4 的条件f 3 0 培养1 8 h ，不冷藏，其发酵乳具有最大抑$ 1 a c e 的活性 1 6 4 。v e r m e i r s s e n 等人在2 0 0 3 年用l a c t o b a c i l l u s h e l v e t i c u s , f n s a c c h a r o m y c e sc e r o v i s i a e 作为发酵剂发酵 乳清蛋白，或则是用蛋白酶进行水解获取a c e 抑制肽，研究结果表明乳清蛋自在2 8 用 s a c c h a r o m y c e s c e r o v i s i a e 发酵以后，a c e 抑制率几乎没有变化，而其他处理a c e 抑制率则提高了 1 8 3 0 ，其中未发酵的乳清蛋白经过蛋白酶的水解后a c e 抑制率最大”。 表卜2 牛乳乳清蛋白衍生的血管紧张素l 转化酶( a c e ) 抑制肽 t a b l e l 一2a n g i o t e n s i n - c o n v e n i n ge n z y m ei n h i b i t o r yp e p t i d e sf r o mb o v i n ew h e yp r o t e i n 婴a a 序列3 来源 i c 5 0 ( “m ) “ 口一l a 用胃蛋白酶然后用胰 蛋白酶胰凝乳蛋白酶水解 仃一l a 用胃蛋白酶水解 d 一工4 用胰蛋白酶水解 p 一埘用胰蛋白酶水解 一堙用胃蛋白酶然后胰蛋 白酶和胰凝乳蛋白酶水解 乳清发酵然后用胃蛋白酶和 胰蛋白酶水解 乳清用蛋白酶k 水解 y g l y g l f e v g i n y w l a h k w l a h k l a m a l d a o s a p l r v f k a l p m h i r v l d t d y k c m e n s a a l p m h y l l f e l a h k a l g l d i q k v a g t w y l p a a l a f 【5 0 - 5 2 ) 4 0 9 口一l a f l 5 0 5 3 ) t 2 一l a l ( 9 9 - 1 0 8 ) 口一l a f f l 0 4 1 0 8 、 f l - l g f ( 2 2 2 5 ) p - l g f 【3 2 4 0 ) a - l g f ( 8 1 8 3 ) f l - l g f ( 1 4 2 1 4 8 ) p 一衄h 9 4 1 0 0 ) p l f t u 0 6 - 1 1 1 ) 口一堙1 4 2 1 4 6 ) , a - l g f ( 1 0 2 1 0 5 ) 口一l a 1 0 5