（食品科学专业论文）乳杆菌的肠道定殖和菌群调节作用研究.pdf

摘要 摘要 研究证实，对于具有调节肠道菌群等生理功能的益生菌，在肠道黏膜上皮细胞定 殖是其发挥作用的首要条件。本文以干酪乳杆菌b d i i 、植物乳杆菌s t - i l l 和干酪乳 杆菌l c 2 w 三株自己筛选的益生菌为目标菌，从中选出生物学特性最好的一株菌，研 究其肠道定殖性及对肠道菌群的调节作用。 研究了三株乳酸菌的生长特性及体外对模拟消化道环境的抵抗能力，选定植物乳 杆菌s t - i i i 作为研究菌株。实验结果表明与其他两株菌相比，植物乳杆菌s t - i 生长性能 较好，在m r s 中3 7 培养1 6 h 活菌数达1 0 9 c f u m l ；保藏特性优良，在4 冷藏2 8 d 后活菌 数数量级未下降；在盐浓度为7 5 时仍可生长；对肠道致病菌有一定的抑制作用：一对 模拟消化道环境抵抗能力较强。 采用培养与p c r d g g e 相结合的方法研究植物乳杆菌s t - 1 i 的肠道定殖性。实验 结果表明s t - i l l 主要定殖在大鼠的回肠和结肠部位，最高分别达1 0 7 c f u g 与1 0 s c f u g ， 盲肠和回肠定殖量很少，最高仅为l o s c f u g ，在十二指肠和直肠没有定殖。植物乳杆 菌s t - i i i 在结肠中定殖时间较长，达1 0 天以上，在回肠定殖约7 天。 采用传统培养的方法研究不同剂量的植物乳杆菌s t i i i 对肠道菌群的调节作用。 实验结果表明s t - i l l 可以促进小鼠肠道中乳杆菌量的增加及产气荚膜梭菌、肠杆菌量 的减少，而对双歧杆菌和肠球菌基本无影响，有效剂量为1 0 s c f u m l ，调节效果可以持 续5 天左右。 本研究表明植物乳杆菌s t - i l l 生物学特性良好，对消化道环境抵抗能力强：可以 在回肠和结肠大量短期定殖，对肠道菌群具有调节作用，有效剂量为1 0 s c f u m l ，调节 效果可以持续5 天左右。 关键词：植物乳杆菌，生物学特性，定殖，肠道菌群 n l 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t i ti sc l a r i f i e dt h a tt h ep r o b i o t i cw h i c hh a v eap o s i t i v ei n f u e n c eo nt h em e t a b o l i ca c t i v i t y o ft h ei n t e s t i n a lf l o r a m u s tc o l o n i z et h ei n t e s t i n a lt r a c tb e f o r et h e ye x e nt h eb e n e f i c i a l e f f e c t s l a c t o b a d l l u sc a s e il c 2 w 、l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u ms t - i l l a n dl a c t o b a c i l l u sc a s e i b d 一1 1w h i c hh a v ed i f f e r e n tb e n e f i t s w e r es c a n n e db yt e c h n i c a lc e n t e ro fb r i g h td a i r y i n t h i sp a p e ral a c t o b a c i l l u sw i t ht h eb e s tb i o - c h a r a c t e r sw a sc h o s e n ，a n di t sc o l o n i z a t i o ni n i n t e s t i n a lt r a c ta n dj t se f f e c to nt h ei n t e s t i n a lf l o r aw e r ei n v e s t i g a t e d b yc o m p a r i n gt h eg r o wc h a ra c t e r sa n d t h ea b i l i t yf o rl o n g t e r ms u r v i v a li ns i m u l a t e h u m a ng a s t r o i n t e s t i n a lt r a c tt h el a c t o b a c i l l u sw i t ht h eb e s tb i o - c h a r a c t e r sw a sc h o s e n r e s u l t ss h o w e dt h a tl a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u ms t - i i l sb i o c h a r a c t e r sw e r eb e t t e rt h a no t h e r o n e s a f t e ra n a e r o b i c a l l yi n c u b a t e di nm r sb r o t ha t3 7 ，1 6 h ，t h ea m o u n to fs t - 1 1 1w a s m o r et h a n1 0 9 c f u m l ，a f t e rt h ec u l t u r e ss t o r e da t4 cf o r2 8d ，t h ea m o u n to f b a c t e r i as t i l ln o t l e s st h a n9 0 i tc o u l ds u r v i v a la n dg r e wi nm r sb r o t hw i t h7 5 ( m m ) n a c lo r0 3 0 b i l ea n de x c e e da n t i b a c t e r i a le f f e c to ns o m ep a t h o g e n i cb a c t e r i a s t - i i i sr e s i s t a n tt o s i m u l a t eh u m a ng a s t r o i n t e s t i n a lt r a c tw a ss t r o n g e rt h a na n yo t h e rb a c t e r i a ，p h 2 5 sg a s t r i c j u i c ea n d i n t e s t i n a lj u i c eh a v el i t t l ee f f e c to nt h i ss t r a i n t w om e t h o d s ，i n c u b a t i o na n dd e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，w e r ea p p l i e dt o a s s e s sg r - i i i sc o l o n i z a t i o ni ni n t e s t i n a lt r a c to fw i s t a rr a t s r e s u l t ss h o w e dt h a ts t - i i i m o s t l yc o l o n i z e dr a t s c o l o na n di l e u m ，t h ea m o u n tr e a c h e ds e p a r a t e l y1 0 c f u ga n dl o f u g , o n l yl i t t l es t i i ic o l o n i z e dt h ej e j u n u ma n d t h ec a e c u m ，t h ea m o u n tw a sl e s st h a n1 0 p c f u g ， b u ti tc o u l d n tc o l o n i z et h er e c t u ma n dt h ed u o d e n u m s t i i ic o l o n i z e dt h ec o l o nf o ra b o u t t e nd a y s ，t h ei l e u mf o rs e v e nd a y sa n dt h ec a e c u mf o ro n l yt h r e ed a y s b yi n c u b a t i o nt h ee f f e c t so fs t - i i io nt h ec o m p o s i t i o no ft h ei n t e s t i n a lm i c r o f l o r aw a s a s s e s s e d r e s u l t ss h o w e ds t - 1 1 1c o u l dj n c r e a s et h ea m o u n to fl a c t o b a c i l l u si nf e c e so fr a t s a n dd e c r e a s et h ea m o u n t so fc l o s t r i d i u mp e f f f i n g e n sa n de n t e r i c b a c i l l i ，b u th a dl i t t l ee f f e c t o ne n t e r o c o c c u sa n db i f i d o b a c t e r i u m s k i mm i l kw i t hl o s c f u m ls t i l lh a si m p r o v e dt h e b a l a n c eo fi n t e s t i n a lm i c r o f l o r a ，a n dt h er e s u l t f u ld o s ew a s1 0 5 c f u m l ，a n dt h ea d j u s t m e n t h o l da b o u tf i v ed a y sa f t e rs t o p p i n gt h ei n g e s t i o n t h er e s e a r c hs h o w e dl a c t o b a c i l l u sp l a n t a m ms t - h ih a de x c e l l e n tb i o c h a r a c t e r sa n d c o u l dr e s i s tt ot h es i m u l a t eh u m a n g a s t r o i n t e s t i n a lt r a c t ；s t - i m o s t l yc o l o n i z e dt h ec o l o n a n dt h ei l e u m ；s k i mm i l kw i t hl o s c f f u m ls t i i ic a ni m p r o v et h eb a l a n c eo ft h ei n t e s t i n a l m i c r o f l o r af o rs e v e r a ld a y s k e y w o r d s ：l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ，b i o - c h a r a c t e r , c o l o n i z a t i o n ，i n t e s t i n a lf l o r a ； 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：盗耋圭迄 日期：彬年7 月；日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：筮烂导师签名： 日期：沙喏年；月t ：- - 曰 第一章绪论 第一章绪论 1 1 肠道菌群及其作用 1 1 1 肠道菌群 健康人和动物的胃肠道内寄居着种类和数量繁多的微生物，这些微生物统称为肠 道菌群1 1 j 。肠道菌群按一定的比例组合，各菌互相制约，互相依存，在质和量上形成 一种生态平衡。 肠道菌群的形成是伴随胎儿出生才开始的。胎儿在子宫内处于无菌的环境，所以 肠道内是无菌的。婴儿在出生过程中经有菌环境产道及与空气等接触导致细菌迅速侵 入，2h 左右肠道内就已经出现肠球菌、链球菌和葡萄球菌等需氧细菌，双歧杆菌数 量很少，以后通过饮食等，肠道有更多的不同菌群进驻，第3 天开始迅速增加，到第 7 天细菌数量接近高峰，双歧杆菌成为优势菌1 2 】。一个健康成人胃肠道细菌数大约有 1 0 “个，这些细菌在分类学上分为大约3 0 个属、5 0 0 种，分为厌氧菌、兼性厌氧菌和 好氧菌【3 4 j 。研究证明：肠道菌群中大多数微生物是有益的，并与宿主问存在共生关 系，这种共生关系表现为：动物为肠道菌群提供生长所必须的适宜环境，肠道菌群为 动物提供有益物质。 肠道分为小肠和大肠，其中小肠又分为十二指肠、空肠、回肠，大肠分为盲肠、 结肠和直肠。与人体大约2 m 2 的体表相比，肠道是人与外来环境接触最大的部位，它 的表面积可达到2 0 0 3 0 0 m 2 ，从而为外来微生物黏附并定殖提供了必要的空间【5 】。由 于肠道环境差异导致各部位定殖的细菌数量和种类也不相同，小肠p h 值稍偏碱，含 有消化酶，蠕动激烈，肠液流量大，足以将细菌在繁殖前冲洗到远端回肠和结肠部位。 如表1 - 1 所示，自上而下，胃到结肠之间的菌量逐渐增多，十二指肠细菌的种类及数 量极少，主要为革兰氏阳性好氧菌链球菌、葡萄球菌和少量的厌氧菌等；空肠部位的 细菌仍以需氧菌为主，菌数约1 0 4 c f u m l ；回肠菌较多，菌数1 0 3 1 0 ”c f u m l ，在回 肠末端，细菌数逐渐增加到1 0 ”c f u m l ，主要含乳酸杆菌、大肠杆菌、类杆菌和梭 状芽孢杆菌等。盲肠、结肠和直肠内细菌数明显增加，菌量最多达1 0 “1 0 ”c f u m l ， 厌氧菌占绝对优势，占9 8 以上，细菌种类也达3 0 0 多种l 堋。 表1 - 1 肠道各部位菌群分布 1 2 肠道菌群的分类 根据肠道菌群对宿主的生理影响，可将肠道菌群可分为三大类：( 1 ) 与宿主共生 的生理性细菌，为专性厌氧菌，是肠道的优势菌群，如双歧杆菌、类杆菌、优杆菌和 江南大学硕士学位论文 消化球菌等是肠道菌群的主要构成者，具有营养及免疫调节作用；( 2 ) 与宿主共栖的 条件致病菌，以兼性厌氧菌为主，为肠道非优势菌群，如肠球菌、肠杆菌，在肠道微 生态平衡时是无害的，在特定的条件下具有侵袭性时，才对人体有害；( 3 ) 病原菌， 大多为过路菌，长期定殖的机会少，生态平衡时，这些菌数量少，不会致病，如果数 量超出正常水平，则可引起宿主发病，如变形杆菌、假单胞菌和韦氏梭菌等1 1 , 7 , 8 j 。 不同类的细菌在肠腔的空间分布也不相同，一般来说，肠道菌群在肠腔内形成3 个生物层：深层的紧贴粘膜表面并与粘膜上皮细胞粘连形成细菌生物膜的菌群称为膜 菌群，主要由最具生理意义的双歧杆菌和乳酸杆菌组成：中层主要为粪杆菌、消化链 球菌、韦荣球菌和优杆菌等厌氧菌；表层的细菌可游动称为腔菌群，主要是大肠杆菌、 肠球菌等好氧和兼性好氧菌1 7 ，8 j 。 1 1 3 肠道菌群的作用 肠道菌群含有种类繁多的酶系统，参与宿主物质和能量转换及遗传信息传递等一 系列生理过程。在正常的情况下，肠道菌群与宿主、外部环境三者之间形成一个动态 平衡的微生态系，与宿主的生长、发育、物质代谢、衰老等关系密切，对人体健康起 着重要作用1 9 , 1 0 l 。组成典型肠道菌群的细菌可以通过多种生理功能影响或促进宿主的 机体健康。 1 1 3 1 营养作用 肠道内一些正常微生物，如双歧杆菌、乳杆菌、真杆菌和大肠杆菌等能合成多种 蛋白质和维生素，供宿主利用：肠道菌群可结合氨基酸分解的n h 2 ，合成蛋白质或 其他氨基酸，同时它们具有利用非蛋白氮合成氨基酸、蛋白质的生物固氮能力；肠道 菌群可以合成多种维生素，如维生素b 1 、b 2 、b 6 、b 1 2 ，v c 、v k ，尼克酸、生物素和 叶酸等，其中维生素k 主要来源于肠道中大肠杆菌的合成，若使用抗生素杀死大肠杆 菌，则可能使该类维生素缺乏l “l 。此外，肠道菌群能促进亚油酸的吸收，促进胆固醇 向类固醇的转变，促进胆汁酸脱饱和、脱羟基等正常代谢，并参与一些药物、毒物的 体内代谢。 1 1 3 2 提高防御能力 在个体生长发育的不同阶段，相应种类和数量的正常微生物群定殖在胃肠道黏膜 及胃肠道内容物中，形成胃肠道的动态微生态平衡，该平衡能有效阻止致病细菌和病 毒等外籍微生物的入侵和繁殖。 ( 1 ) 直接作用：胃肠道中，定居在肠粘膜上皮的常住菌与胃肠道黏膜上细胞紧 密结合，形成一层膜能有效阻止潜在致病菌或外袭菌在粘膜上定殖，从而对宿主起到 了占位性保护作用【1 2 】；由于厌氧菌数量巨大，在营养竞争上处于优势，加之在厌氧条 件下繁殖很快，因而限制了兼性菌的生长，同时厌氧菌产生的h 2 0 2 对不能产生过氧 化氢酶的细菌有抑制作用：有些常住茵在代谢过程中产生挥发性脂肪酸和乳酸，降低 小生境内的p h ，从而抑制外籍菌的生长繁殖；此外某些菌还能产生抗菌物质，杀死 或抑制外袭菌，如乳酸杆菌能杀灭伤寒杆菌和痢疾杆菌1 4 j 。 2 第一章绪论 ( 2 ) 间接作用：肠道菌群一方面可促进免疫器官的发育成熟、刺激宿主建立完 备的免疫系统。在检查无菌动物的免疫系统时，发现其淋巴系统、抗体形成系统等均 发育不良，无菌鸡小肠和回肠部位淋巴结较普通鸡小4 5 。而暴露于普通条件下饲养 2 周后，免疫系统就与普通鸡相近【1 3 1 。另一方面，肠道菌群刺激宿主产生免疫及清 除功能，如增强抗体产生，刺激吞噬细胞功能和增加干扰素产生等。从新生儿免疫系 统的发育过程也可看出正常菌群的作用，无菌动物的体液免疫、细胞免疫功能均低于 普通动物，如无菌动物血液中球蛋白含量降低，基本测不出分泌型l g a ，无菌小鼠血 液中的i g g 含量仅为普通小鼠的1 1 0 。此外，无菌动物淋巴细胞增殖能力很低，浆细 胞形成受抑制，细胞免疫反应能力弱。这说明正常微生物不仅能刺激机体免疫器官的 发育，而且对增强机体特异性细胞和体液免疫是不可缺少的 8 , 9 , 1 4 】。 肠道菌群所起的生物拮抗作用，对防治疾病，特别是消化道疾病具有重要意义， 实验发现，以鼠伤寒杆菌攻击小鼠，需1 0 万个活菌才能致死，若先给予口服链霉素 抑制肠道菌群，则1 0 个活菌即可致死【2 】o 1 1 3 3 延缓衰老 肠道菌群随年龄增大有所变化，表现为发酵型菌和腐败型菌的比例增大。正常情 况下，健康婴儿肠道菌群的中双歧杆菌约占9 8 ，主要为婴儿双歧杆菌，成年后双歧 杆菌数量明显减少，进入老年后，有些人根本检测不出双歧杆菌，即使检出，菌数也 很少，而产生硫化氢和吲哚的芽孢杆菌类却增多。肠道内有害菌增多并产生大量有害 物质进入血液内，在体内循环使身体组织的活力下降。也就是说如果胃肠道内细菌的 平衡被打乱，有害茵大量繁殖，将加快身体的老化。调查显示，现在2 0 一3 0 岁的女性 中，肠年龄老于实际，有百分之二十的肠年龄已经处于6 0 岁以上。相反，在日常中 可以通过一些措施，增加有益茵的数量，保持良好肠道菌群状态，提高肠道的健康状 况，可以延缓衰老i l i 。 1 1 3 4 抑肿瘤作用 有人发现双歧杆菌的增加有抗癌作用，主要机制是通过降低肠腔p h 值，抑制致 癌物或辅致癌物的形成，转化某些致癌物质成非致癌物质，以及激活巨噬细胞等免疫 功能 1 6 , 1 7 1 。如肠道中一些菌可以分解、转化随食物进入人体内的亚硝酸盐等。 1 1 4 调整肠道菌群失调的措施 肠道菌群的种类和数量只是相对稳定的，它们受饮食、生活习惯、地理环境、年 龄及卫生条件的影响而变动。处于理想状态的动物是在消化道内有特定量的有益微生 物，以维持消化道内的平衡和养分的消化吸收，但是在生理和环境应激时，则会造成 消化道内微生物区系紊乱，病原菌大量繁殖，使动物的生产力下降或出现临床病态。 要改善肠道菌群状况，达到增加有益菌的量和抑制病原菌的生长的目的，可以通过以 下一些措施。 1 1 4 1 抗生素疗法【1 8 1 当由于某些原因导致致病菌或条件致病茵在肠道内大量增生，造成肠道菌群紊 3 江南大学硕士学位论文 乱，宿主健康受影响时，可以针对致病菌，通过药敏试验，选用敏感的抗生素，抑制 甚至杀死有害菌，通过减少有害菌的量纠正肠道菌群失调。抗生素疗法曾经风靡一时， 但是抗生素抗菌谱过广，长时问应用，在杀死病菌的同时也杀死有益菌群，破坏了肠 道微生态平衡，引起菌群失调，破坏胃肠道的微生态平衡；还能引起耐药性菌株的产 生。因此使用抗生素疗法具有很大的负作用。 1 1 4 2 微生态制剂调节 针对抗生素的弊端，近年来提出了微生态疗法的概念，微生态制剂是利用机体的 生理性优势菌或非常驻性共生菌及其代谢产物制成的制剂，主要作用包括营养调整、 抗菌调整、内服菌群促进物质和活菌制剂( 益生素) 等四个方面，其目的是恢复和稳定 原有的微生态平衡，而胃肠道正常微生态平衡有助于人抵抗病原菌感染，如可通过细 菌拮抗作用、细菌干扰作用、屏障效应、定居拮抗作用和竞争排斥作用等机制来实现 抗感染【1 ”。微生态制剂从功能上看有2 种： ( 1 ) 优势菌群制剂：常用的是双歧杆菌和乳酸杆菌等益生菌制剂，主要成分为 微生物。 ( 2 ) 益生元：一类不能被人消化、利用而可以优势种群生长的物质，通过选择 性刺激一种或有限数量的对健康有益菌双歧杆菌和( 或) e l 酸杆在肠道中的增殖或激活 其新陈代谢，从而提高宿主的肠道平衡。主要为一些化学物质，如食源性核苷酸，近 年来许多科学家发现食源性核苷酸可增加老鼠、猪及婴儿肠道中的双歧杆菌。 微生态制剂调节是调整肠道菌群失调的一种有效方法，用微生态制剂来防治疾病 已受到了广泛的关注，微生态制剂防治不仅能克服抗生素治疗时的缺点，还会对机体 产生许多其它方面的有益作用，并且微生态制剂没有药物制剂的某些刺激作用和副作 用，因此成为人们研究的热点，具有很大的发展前途。 1 2 益生菌 1 2 1 益生菌简介 益生菌m b i o t i c 起源自希腊语，其意思是“专管生命( p r o l i f e ) ”。益生菌概念 最早起始于1 9 6 5 年当时l i l l yd m 首先建议益生菌是指对动物肠道菌群平衡有益的促 进物质或微生物【删。1 9 8 9 年，f u l l e rr 将其修改为：“益生菌是补充喂养的具有活性 的微生物，而且可通过改善肠道菌群的平衡，对宿主动物产生良好的健康效应1 2 ”。 尽管此定义当时仅指动物，但仍为大多数医学文章所引用。近年来随着有关保健产品 的不断涌现，对于人体而言的益生菌的定义和概念也在不断提出和不断被修订。其中 s c h a a s m a 的有关益生菌的定义是被认同和引用较多的一个。他强调益生菌“应指摄入 的一定数量的活的微生物，这些微生物除了它原有的营养价值之外，更重要的是要有 肯定的健康效应阎”。 1 9 8 9 年美国食品与药物管理局( f d a ) 与饲料协会( a a f c o ) 发布了可以直接饲喂 动物的安全菌株4 1 种，其中乳酸菌类1 7 株，双歧杆菌类6 株，芽孢杆菌类5 株，拟 杆菌类4 株，霉菌类2 株( 黑曲霉、米曲霉) ，酵母菌类1 株，球菌和丙酸菌类6 株。 4 第一章绪论 我国农业部1 9 9 9 年公布了1 2 种可以直接饲喂动物的饲料级微生物菌种，包括干酪乳 杆菌、植物乳杆菌、粪链球菌、乳酸片球菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、嗜酸乳 杆菌、乳链球菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母、沼泽红假单胞菌。 乳酸菌是人及动物肠道中极为重要的生理菌群之一，包括1 0 多个属，2 0 0 多个种， 它们与人体的多种生理功能有着密切的关系。近3 0 年来。随着生物技术的发展，乳 酸菌的研究越来越引起了微生物学家、营养学家、病理学家、免疫学家、微生态学家 的关注和重视。而应用在功能性食品的常见益生菌主要指两大类乳酸菌：一类为双歧 杆菌，常见的有两歧双歧杆菌，婴儿双歧杆菌，长双歧杆菌，短双歧杆菌，青春双歧 杆菌，动物双歧杆菌等，该类菌为全球公认的有益菌，尚未有不利于人体的报道出现。 另一类为乳杆菌，如嗜酸乳杆菌，干酪乳杆菌，和较新的植物乳杆菌( 该菌种暂未被中 国卫生部批准列入可用于保健食品的益生菌种名单) 和罗伊氏乳杆菌两个菌种。从最 近市场看，新菌种的引入是必然趋势。 伴随人们工作压力的加大，人们对肠道健康的也愈加重视，多种有益肠道的乳制 品和功能性食品不断涌现。乳酸菌制剂之所以倍受人们的青睐，与其对人体的保健功 效是分不开的，比如：增加肠道内乳酸菌量，减少有害菌，防止腹泻；提高机体免疫 力、活化巨噬细胞以及产生肿瘤坏死因子、干扰素和l g a 等抗体；吸附致癌物及减少粪 便中致癌突变物的浓度和降低与突变物或致癌物的激活有关的酶活性；降低血清胆固 醇；降血压等。 1 2 2 益生菌对肠道菌群的作用 在胃肠道正常微生物群落与宿主和环境之间所构成的微生态系统中，微生物群落 中的优势菌群对整个微生物群落起着决定性的作用。一旦失去了优势菌群，可以导致 胃肠道微生态系统平衡失调，原有的优势菌群发生变更，宿主出现生产性能下降或疾 病症状。一般认为，益生菌进入肠道后，与极其复杂的微生态环境中的正常菌群会合， 出现栖生、互生、偏生、竞争或吞噬等复杂关系，调整并平衡胃肠道的微生态环境【捌， 作用方式如下： 1 2 2 1 定殖抗力与生态占位 肠道内细菌从来源上分，有原籍菌和过路菌两种。前者并非由口摄入，在肠道内 保持稳定的群体；而后者则由口摄入并经胃肠道，原籍菌是使过路菌不能定殖的因素。 胃肠道的原籍菌群能抑制其它外来微生物在肠道中定殖或增殖，这就是定殖抗力，也 称竞争排斥。这种定殖抗力的产生是因为体内微生物与致病菌竞争肠道上皮的吸附位 点而产生的。如果这些吸附位点被较多有益微生物所占据，病原微生物就会被排斥。 研究表明，一些乳杆菌能定殖于鸡和猪的肠道上皮，直接参与构成肠道定殖抗力， 阻止病原菌的定殖和侵入，如阻止沙门氏菌对宿主的感染。这种黏附定植可能是因为 乳酸菌表面有能与肠粘膜细胞牢固结合的特异性物质，推测可能是脂磷壁酸或肽聚 糖，或细胞表面层蛋白，或者其中二者，或三者全部。这些特异性物质被称为粘附素， 乳酸菌通过粘附素与肠粘膜紧密结合，在肠粘膜表面定殖占位，是形成生理屏障的主 5 江南大学硕士学位论文 要组成部分。该屏障可以抵御外来细菌的入侵，维持肠道内微生态平衡1 2 4 芦j 。 1 2 2 2 产生抑菌物质 乳杆菌能产生细菌素、类细菌素拮抗物质和其他具有抑菌作用的代谢物( 如过氧 化氢和某些有机酸等1 。细菌素是细菌代谢过程中合成并分泌到环境中的，一类对亲缘 关系较近的种有抑制作用的蛋白类抑菌物质。到目前为止有4 0 多种乳酸菌细菌素被 描述，它们是一种复杂的拮抗物，其分子量、生化特性、敏感范围及其作用方式有较 大差异。 罗特氏乳杆菌能在鸡肠道内分泌抗菌物质，在1 5 3 0 g m l 的浓度下杀死沙门氏 菌、大肠杆菌等致病菌，在6 0 1 5 0 9 9 m l 的浓度下，乳酸菌包括罗特氏乳杆菌本身也 被抑制，其抗菌原因尚不清楚。国外研究发现，双歧杆菌能产生一种未知的广谱抗菌 物质，具有抑制沙门氏菌、志贺氏菌、霍乱弧菌等病原菌的活性1 4 j 。我国一些学者曾 对从婴儿肠道中分离出来的两株嗜酸乳杆菌的抑菌特性的研究表明，该菌株对致病性 埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及炭疽杆菌有明显的抑菌作用瞄j 。 尽管细菌素在肠道内的作用机理尚不清楚。但是，乳酸菌产生的一些低分子量的 初级代谢物( 如过氧化氢、乳酸、乙酸及其他芳香类化合物) 和一些次级代谢物对有 害微生物( 如沙门氏菌、大肠杆菌、梭状芽孢杆菌等) 有很强的抑制作用。有机酸的 作用被证实是由于能降低肠道的p h 值，从而抑制病原菌1 2 6 1 。 1 2 2 3 益生菌夺氧作用 在胃肠道微生态系统内，正常情况下厌氧菌占9 9 ，需氧菌仅占1 。当微生物 进入宿主胃肠道后，通过需氧菌的迅速繁殖，消耗胃肠道内的氧气，使胃肠道内氧分 子浓度下降，氧化还原电势下降，促进厌氧菌的生长，使厌氧菌保持在较高的数量水 平，从而维护胃肠道内微生物群落之间的生态平衡，提高定殖抗力，达到防治疾病的 目的。 1 2 2 4 其它作用 益生菌及其制剂对肠道还具有营养作用，能增强宿主巨噬细胞的活力，间接抑制 肠道革兰氏阴性菌的过度繁殖：可以恢复宿主的抵抗力，有利于修复肠道菌群屏障： 益生菌还能防止肠道菌群发生易位，及调节肠道菌群紊乱1 2 8 1 。 1 2 3 益生菌筛选标准 具有对宿主生理功能有益菌很多，实际被应用于生产的益生菌却很少，如已报道 很多乳酸菌对肠道中的致病菌具有拮抗作用，在临床试验报告中乳酸菌也显出了较好 的效果，但国外报道被应用的仅嗜酸乳杆菌n c f l 4 7 8 、鼠李糖乳杆菌l g g 、干酪乳 杆菌s h i r o t a 、双歧杆菌b b 1 2 、植物乳杆菌d s m 9 8 4 3 等。这是因为实际应用的益生 菌必须符合以下条件：能够耐受胃酸、胆汁，以存活的状态到达肠道，并能在肠内增 殖；被科学实验证明能够改善肠道菌群；此外益生菌必须是公认安全的微生物，在筛 选的时候符合如人体胃肠道来源等标准，有可考证的安全和耐受记录1 4 j 。 对于最终产品的目的纠正各种肠道异常症，在体内发挥生理功能的益生菌，它以 第一章绪论 下几个方面的特性是能否对宿主发挥生理作用的决定因素i 捌。 1 2 3 1 生长特性 益生菌筛选研究的最终目的为了应用于工业化生产，因此必须符合工业化生产的 的条件，其生长能力必须旺盛，如对盐的耐受性，生长条件的要求，4 。c 保藏特性以 及生长状况等。如果益生菌这些特性不好，那么就不可能进入工业化生产的阶段，也 就难以产生效益。如尽管双歧杆菌是公认的对人体健康具有促进作用的益生菌，但由 于其对氧的耐受能力和其它一些生长特性教差，导致相关的双歧杆菌产品很少。 1 2 3 2 耐消化道环境能力 一般来说，益生菌以活菌的状态到达宿主的肠道，才能够有可能定殖于肠道，持 久的发挥对宿主有利的生理功能】。但是益生菌在被人或动物摄入后，从口腔到达肠 道要经历一系列不良环境，会导致益生菌大量死亡，影响益生菌生理作用的发挥。因 此实际应用的益生菌必须对消化道环境具有一定的抵抗能力，即益生菌对于胃液、肠 液、胆盐具有较强的抵抗能力。 1 2 3 3 益生菌定殖性 肠道中的菌只有常驻菌才能持久发挥生理作用，而过路菌由于不能定殖于体内， 很快就随肠的蠕动，排出体外。近年来研究认为益生菌制剂按其进入机体后发挥作用， 的性质，可以分为间接发挥作用和直接发挥作用两大类，前者是根据康白教授提出的 “生物夺氧说”，利用无毒、无害、安全需氧微生物在肠道内的暂时性定殖，适合有 益厌氧菌生长的环境，促进正常的微生态平衡；后者是根据生态平衡理论，生物拮抗 理论，免疫赋活作用，营养作用等机制，采用机体内固有的有益菌，制成的一类益生 菌制剂，它在机体内的多种功能是菌体自身和其代谢产物共同作用的结果。而益生菌 和肠黏膜上皮细胞之间的粘附定植，形成稳定的菌群却是其发挥作用的首要条件1 3 0 l 。j 因此黏附、定殖能力是益生菌影响肠道免疫系统和寄主微生态平衡的决定因素，它已 经成为益生菌筛选的指标之一。 乳杆菌的表面吸附呈高度菌种专一性，它通过茵的酸性多糖黏附于上皮细胞而有 可能发生定殖，但是体内肠道表面菌层的形成受营养和生理因素的影响呈高度专一化， 这些因素影响固有微生物的繁殖能力要强于菌对上皮细胞的专一吸附能力，在环境适 合定殖的情况下乳杆菌对肠道的定殖依赖于自身性质1 6 , 2 8 ) 。益生菌在体内的定殖性，包 括在肠道的定殖部位和定殖数量，只有在定殖的部位达到一定的数量，才可能成为局 部优势菌，在局部微环境起到调节肠道菌群和发挥其功能。 1 3 肠道微生态研究方法 1 3 1 经典研究方法 用来分析肠道菌群微生态的经典方法包括依赖和不依赖培养过程的技术，这两种 途径对于了解肠道菌群的性质具有重大的意义，但都存在准确性差以及分析过程繁琐 等特点。 ( 1 ) 依赖于培养过程的经典技术【4 l 江南大学硕：i 二学位论文 传统的技术是从肠道分离微生物，经培养的分离物作为分析肠道菌群的惟一来 源，进一步对其获得的分离物进行表型特征性状的测定和鉴定。迄今为止，人们对肠 道菌群的全部知识，基本上来自于将粪便或肠道标本来源的微生物分离、培养、分析 所得到的结果，这种技术现在仍然是研究人肠道微生态系统的主要方法。 对于某一类特定的细菌的计数通常是在特定的培养基上进行，一般培养基上要添 加一些选择性物质，这些物质对肠道细菌具有一定的抑制性，因此在他们存在时获得 的数量可能比实际值偏低。如肠道中主要的菌双歧杆菌，常用来分析人肠道中该均数 量的培养基有y n 一6 、p s m 、b s i 、b i m 一2 5 和b e e r e n s 培养基，这些培养基中选择性 试剂主要包括抗生素( 卡拉霉素、p a r a m y c i n 和多黏菌素一b ) 或丙酸。 ( 2 ) 不需要培养过程的鉴定方法 分析某些微生态系统的细菌组成时，如果完全依赖于培养方法，由于无法了解所 采用的方法对其中大量微生物的有效性，但是传统方法中的显微镜分析以及酶代谢 产物分析法可以对样品中微生物的真实数量提供直接的依据。前者是使用光学显微镜 直接分析粪便中细菌数量的一种非常有效的工具，但是该方法由于涉及加热固定和染 色等过程，而且并不是所有的细胞都着色，所获得的结果可能严重低于实际值。后者 是通过测定样品中某种特定酶或代谢产物的含量，间接计算其中某类微生物的数量， 如测定粪便中短链脂肪酸含量来判定乳酸菌活性是否增强；同样，粪便中1 3 一葡糖醛 苷酶的活性与大肠内双歧杆菌的数量之间也存在显著关系1 3 “。不过，到目前为止，还 难于将某种特定的酶活性与肠道中某类特定的微生物种群联系在一起，还需要进行更 多的研究以便在某种特定的酶活性与肠道中某一类的微生物类群之问建立对应关系。 传统方法所获得的鉴定结果的可靠性与所进行的试验的多少有关，其准确性不是 很高，且操作繁琐，但尽管存在不足之处，培养方法仍然是用来了解肠道微生态菌群 组成与作用最重要的方法。 1 3 2 对肠道微生态研究的新方法 由于传统的经典方法鉴定肠道菌群的组成和某类已知菌的分布情况具有很大的 缺陷，随着科技的发展，新技术不断涌现，尤其是建立在d n a 指纹技术基础上的分 子生物学方法及分子工具，大大扩展了对肠道分离物的鉴定能力，对研究人肠道菌群 的生物多样性和深入了解益生菌及其在肠道中的定殖情况有着重大影响。目前常用技 术有如下： ( 1 ) 1 6 sr r n a 基因的序列分析 w o s e s 首先提出利用该方法进行细菌分类和不同细菌间进化关系的研究，该方法 是根据1 6 sr r n a 基因序列高度保守，其核苷酸位点的变化具有种的特异性【3 2 j 。这种 方法的基本过程是，先经聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，简称p c r ) 扩增 1 6 sr r n a 序列，然后对扩增片段进行测序和使用测序数据分析软件包自动解读，测 序的正、反链序列经校正后可排列成一个一致序列l ”。比如：将被检分支杆菌的一致 序列中的特征性序列和己知分支杆菌的特征性序列进行比较，就可以准确地鉴定这种 第一章绪论 分支杆菌，或者通过计算机从数据库寻找d n a 序列相似度，当被检分支杆菌的相关 序列和数据库的参考序列1 0 0 相同时，可以作确切的鉴定。f r o t h i n g h a m 等对来源于 肠道的7 种共8 株双歧杆菌的1 6 sr r n a 基因进行测序，7 个种的双歧杆菌的1 6 sr r n a 基因相似性是9 4 9 9 1 3 3 1 。该技术极大地增加了人们对组成肠道菌群的主要类群 之间进行发育亲缘关系的了解及提高了菌群鉴定的准确性，但是该方法扩增d n a 前 所提取的d n a 都要求是纯菌落，当需要对大量的菌群进行定量和定性鉴定时，其效 率达不到实际需要。 ( 2 ) 原位分析法( i ns i t u ) 建立在敏感度极高的荧光标记基础上的原位分析法的出现，为直接获得某种细菌 在粪便和肠道样品中分布情况提供了可能。该方法包括荧光原位杂交m u o r c s c c n ti n s i t uh y b r i d i z a t i o n 。简称n s n ) 和原核细胞原位p c r ( p i p c r ) 。前者是将带有荧光标记 的寡核苷酸探针直接与固定在载玻片上的细胞进行杂交，寡核苷酸探针渗透到到固定 的细胞内进行核酸杂交，用荧光显微镜即可观察到带有荧光标记探针的杂交细胞 j 。l a n g e n d i j k 等已应用此技术检测粪便样品中双歧杆菌，其用荧光标记靶1 6 s r r n a 寡核苷酸探针，使用荧光显微镜测定粪便样品中双歧杆菌中的数量l 划。后者是采用带 有荧光标志的引物在完整细胞内直接进行特定基因的扩增，扩增后含有目标基因的细 胞可以在荧光显微镜下观察到。t a n i 等采用一种经过改进的荧光标记后，证明这种方 法对于从单细胞水平上观察特定细菌在自然界中的分布非常有效1 3 ”。荧光原位分析法 提供了直接观察肠道菌群的可能，但是由于目标菌被添加一段基因后对其本身的黏附 定殖性的影响，以及菌在繁殖过程中荧光基因可能发生变化的情况都没有得到研究， 所以该方法对研究特定菌在肠道中分布情况尚有困难。 ( 3 ) 随机扩增多态性技术 随机扩增多态性技术( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，简称a p p c r ) 是采用 随机序列的1 0 1 2 个碱基的短引物，这些引物在模板d n a 的两条链上同时结合，对 基因组d n a 进行扩增，非特异的引物可以结合在模板d n a 的多个位点，产生多个 p c r 产物，经电泳分离开和溴化乙锭染色，即可直接检测d n a 多态性的产生，并用 于d n a 指纹分析，被扩增的产物越多，该方法的分辨率越高i 。d up l e s s i s 等应用此 方法区分l b a c i d o p h i l u s 、l b c r i s p a t u s 、l b a m y l o v o r t t s 、l b g a l l i n a r u m 、l b g a s s e r i 和 l b j o n h s o n i i i ”j 。此技术快速，可应用于那些缺乏序列信息的菌类，但缺点在于反应条 件发生轻微改变就可能影响引物与模板的结合方式，重复性差。 ( 4 ) 1 6 sr r n a 基因的限制性片段长度多态性分析 1 6 sr r n a 基因的限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o n f r a g m e n tl e n i g t hp o l y m o r p h i s m ， 简称r e e l ) 是一种快速分析方法，整个过程以1 6 sr r n a 基因内通用保守序列的寡聚 核苷酸为引物，用p c r 技术扩增1 6 sr r n a 基因，所得的d n a 片段，经特定的限制 性内切酶切割，产生长短不同的限制性片段，用琼脂糖凝胶电泳分离，从而生成一特 征性的限制性片段长度多态性。对每一个d n a 限制性内切酶组合来说，所产生的片 9 江南大学硕士学位论文 段都是特异性的，而所选择的限制性内切酶取决于被分析的微生物的种类，而且需要 经过经验来决定。r f l p 作为检测细菌种内或种间水平的方法，近年来被应用于细菌， 如双歧杆菌的分类及鉴定中。m a n g i n 等对2 1 株双歧杆菌采用不同的限制性内切酶 切割，根据r f l p 所显示的带型图谱，将2 1 株菌归为8 个种p 。同时r f l p 还显示 了各菌株之间d n a 差异，这使得r f l p 可作为种以下菌株问的鉴定成为可能。该技 术是以p c r 技术为基础的分析方法，只需要几个细胞就可以完成整个分析，因此可 以省略培养过程，由于1 6 sr r n a 基因具有保守性，这种指纹法的分辨率比较低，但 本方法可能是所有以p c r 技术为基础的指纹法中重复性最好的一种i 加j 。 ( 5 ) 脉冲场凝胶电泳 脉冲场凝胶电泳( p u l s e d f i e l dg e le l e c t r o p h o r e s i s ，简称p f g e ) ，基本原理是利用电 泳脉冲系统通过琼脂糖凝胶分离大片段的d n a 。即用一种稀有的限制性内切酶( 通常 有可识别的位点8 b p 或6 b p ) 将分离物的基因组消解成相对少的( 5 5 0 ) 大片段后，用脉 冲场凝胶电泳将它们分开，从而获得d n a 片段的指纹图。通过计算机凝胶扫描、软 件分析，可以建立对所有微生物的p f g e 图谱的数据库，以便各菌株间的比较。p f g e 对特异