（食品科学专业论文）传统腌制和发酵动物性食品致突变性研究.pdf

摘要 传统腌制和发酵动物性食品致突变性研究 食品科学专业硕士研究生：符昌雨 指导老师：丁晓雯教授 摘要 本文对重庆地区人们日常食用的4 种传统腌制和发酵动物性食品：香肠、腊肉、泡凤爪、 板鸭进行研究，以确定这些食品是否具有潜在的致突变性和致突变的程度。以及引起致突变 作用的物质基础和影响因素。并通过几种常规的烹饪方式对样品进行处理，评估这几种烹饪 方式处理后对样品致突变性的影响。获得以下实验结果： 1 选择蒸馏水、甲醇、二氯甲烷、石油醚和甲醇+ 氯仿( i ：1 ) 这五种不同提取溶剂提取 样品，对照比较甲醇+ 氯仿( 1 ：1 ) 提取液的蚕豆根尖微核率最高，纯溶剂蒸发后的残留量不 会影响蚕豆根尖微核实验的结果。 2 蚕豆根尖微核实验表明：选择的四种样品具有不同程度的致突变性其微核率与阴性对 照微核率相比均具有极显著性差异( p 0 0 1 ) ，微核指数均大于2 。 3 选择泡凤爪、香肠和板鸭各一种产品做a m e s 实验。泡凤爪、香肠和板鸭中的组氨酸含 量分别为5 0 o o m g 绌g 、2 4 9 6 1m g 厥g 和7 6 9 3m g 徼g 。并用相应剂量的组氨酸纯品做a m e s 实 验，发现样品中含有的组氨酸不影响加m s 实验结果。 4 泡风爪样品提取物可诱发1 a 9 7 、1 a 1 0 0 和t a l 0 2 的回变菌落数有一定增加，但与未 处理对照相比未达到2 倍，在1 5 0 m 平皿、2 0 0 m g ，平皿时t a 9 8 菌株回变菌落数分别达到未 处理对照的2 3 3 、2 0 5 倍，表明泡凤爪样品可能具有致移码突变的作用。 香肠样品提取物可诱发t a 9 7 、1 a 1 0 0 和1 a 1 0 2 的回变菌落数有一定增加，但与未处理对 照相比未达到2 倍。在2 0 m g ，平皿、3 0 1 1 1 9 平皿、4 0 n 影平皿和5 0 n 平皿的香肠提取物剂量 下，t a 9 8 菌株同变落数分别达到未处理对照回变菌落数的3 5 5 倍、5 3 6 倍、5 5 9 倍和3 7 7 倍。表明香肠样品可能具有致移码突变作用。 板鸭提取物可诱发1 a 9 7 和t a l 0 2 的回变菌落数有一定增加，但与未处理对照相比，未 达到2 倍，在5 0 彬平皿、1 0 0 n 彬平皿、1 5 0 l n g ，平皿和2 0 0 i l l 平皿的板鸭提取物剂量下，t a 9 8 西南大学硕士学位论文 菌株的同变菌落数分别是来处理对照同变菌落数的2 4 l 倍、2 7 3 倍、3 4 6 倍和2 1 2 倍，在 2 0 0 m g 平皿时1 a 1 0 0 菌株回变菌落数是未处理对照的2 2 2 倍。表明板鸭样品可能具有致移 码突变和碱基对置换突变的作用。 5 香肠样品在微波加热处理l m i l l 时间内，其致突变性与未处理对照相比不增加，但1 f n i i l 后随着微波加热处理时间的延长，致突变性增加。微波加热处理不影响板鸭样品的致突变性。 蒸汽加热不影响香肠样品的致突变性。板鸭样品用蒸汽加热时，开始致突变性有一定增 加，与阴性对照相比差异显著( p 0 0 5 ) 。 用沸水加热处理可以降低香肠样品的致突交性，但达到一定时闯以后随着处理时间的延 长，这种作用逐渐降低。沸水加热处理不影响板鸭样品的致突变性。 一级菜籽油、二级菜籽油和猪油油炸处理，均可增加香肠和板鸭样品的致突变性，但达 到一定时间后，随着油炸时间延长香肠样品致突变作用逐渐降低，板鸭样品致突变性逐渐增 加。 6 泡风爪、香肠和板鸭样品的亚硝酸盐、硝酸盐、仲胺含量范围分别为：o 8 4 5 8 5 m g k g 、 3 o 铲- 7 5 8m g l 【g 、1 2 8 2 3 3 9 l 【g ，均未超过国家的限量标准。 泡凤爪、香肠、板鸭样品的苯并( a ) 芘均未检出。亚硝胺、砷、镉、铅的含量范围分别 为：o 4 0 1 3 l 昭l ( g 、7 0 0 8 4 2 嵋k g 、o 3 8 0 7 2 m g 爪g 、1 9 8 3 9 8m 班g ，亚硝胺和砷均 未超过国家的限量标准。泡凤爪、香肠、板鸭样品的铅含量分别是国家标准的1 0 i o 、9 9 0 和1 9 9 0 倍，镉含量分别是国家标准3 8 0 、4 2 0 和7 8 0 倍。 7 亚硝酸钠在5 m 刚l 一- 2 0 0m 昏，l 的范围内不具有致突变性，泡凤爪、香肠、板鸭样品中含 有的亚硝酸盐量范围在0 8 4 5 8 5m g l ( g 之间，因此不具有致突变作用；二乙胺盐酸盐在 2 0 m g l 5 0 0 删班的范围内不具有致突变性，泡凤爪、香肠、板鸭样品中二乙胺盐酸盐的含量 范围在1 2 8 3 0 4n 舭g 之间，因此不具有致突变作用。 砷的浓度达到o 3o f i 呜l 时，即具有致突变作用，泡凤爪、香肠、板鸭样品中砷的含量范围 在7 0 0 一8 4 2 i i g l ( g 之间，未达到致突变作用的水平；镉的浓度达到o 3 0m g ，l 时，即具有致突变 作用，泡风爪、香肠、板鸭样品中镉的含量范围在o 3 8 o 7 2 m 班g 之间，已达到致突变作用 的水平：铅的浓度在o 5 5 m g l 时，即具有致突变作用，泡凤爪、香肠、板鸭样品中铅的含量范 围在1 9 8 3 9 8m g l 【g 之间，已达到致突变作用的水平。 二甲基亚硝胺在5 0 0 0 飕l 时，即具有致突变作用，泡凤爪、香肠、板鸭样品中的亚硝胺 含量范围在o 4 0 1 3 l 腿l c g 之间，未达到致突变作用的水平。 关键词：动物性食品a m 瞄实验蚕豆根尖徽核试验致突变性 a b s t r a c t s m d y o nt h em u t a g e n i c i t yo ft r a d i t i o n a lc u r e d a n df e m e n t e da n i m a lf o o d m a s t e ro ff o o ds c i e n c e ：f uc h a n g y u s u p e r v i s o r ：p r o d i n gx i a o w e n a b s t r a c t s a 峭a g p ，c u 代dm e a t ，p i c l 【l e dc l l i c k e nc l a wa n dp 聆s ds a l t c dd u c kw e 他t i i ef o u r 砸l d i 曲豫i “l ye d i b l e 锄i m lf 1 0 0 d sb yc u 咖g 龃df e m 枷t i n gi i ic h o n g q i n ga r e 舔n e i r 眦t a g e i l i c 时w 舔 s t i l d i e dt 0d e c i d ew h e n l e r l e s es 锄叩l e sp o s s e s s e dp o t e m i a l 舢t a g e n i c i 妙i i lt l l i sp a p 旧r h o ww 鹤 m ed e g r e eo fi n u t a g 喇c i 够w h a tw 嬲t l l es u b s t a i l c eb 舔i s 锄di n n 嘲t i a lf a c t o ro fc a 瑚i i l g m u t a g e i l i c i 吼p r o c e s s i i l gs 锄1 p l e sb ys 伽r o u t i i l ec o o k i n gm e n l o d st 0d e c i d ew h e l l l 盯t l l e 辩w a y s h a de 疏c to nm e i rp m e n t i a im u t a g e n i c 时o rn o t t h e 咒跳l t s 协d i c a t e d ： 1 e x n a c t e ds 唧l e sw i md i s t i l l e dw a t e r ，m e m 柚o l ，m e m y l e n ec h l o r i d e ，p e 仃o l e u mb e i 屹i i l ，a n d m e t l l 觚o l - c h l o r o f o 肋( 1 ：1 ) ，r e s p e c t i v e l y r e s u l t si i l d i c a t e dt l m tm e t i l 柚o l - c l l l o r o f o n n ( 1 ：1 ) w 勰t l i e b e s ts o l v e n t 1 k 他s i d u el e v e lo ff i v es o l v e r i t sl l a dn oe 毹c t e x p 甜i m 删聆蛐l t sa f t e rm 乜i d r e v a p o r a t i o n 2 r e s u l t so fi i l i c r o n u c l e 吣t e s ti i iv i c i a 伍b a 瑚tt i pc e n si i i d i c 砷e d ：f 0 i l ro f 圮s e l e c 自e ds a m p l 豁 l l a dd i 舵r e n td e g r e e so f 枷t a g e l l i c 咄m e i rm i c r o n u c l e 甜r a t e sh a de x 仃e m e l ys i 鲥f i c 锄td i 肫r c l l c e ( p 0 0 5 ) v r a p o rh e a t i n gc o u l dd e c r e 雏et l l em u t a g e n i c 时o fs a u s a g et 0c e n a i ne x t e n t ，b u td i 位犯n c e s w e 豫n o ts i g i l i ：f i c 鲫t t h em u t a g e n i c i t yi n c 托嬲e di nm eb e g i 皿i i l g ，t l l ed i 丘i c r e n c e s 、张r es i g n i f i c a n t 觞c o r 印a r e dw i t i ln e g a t i v ec o n t r 0 1 ( p 0 0 5 ) 1 w oc 懿e sd i dn o t 陀a c he x t 吲眦l ys i 鲥6 c a n tl e v e l - b o i l i n gc o u l dd e c r e 鹪e 吐圮m u 姆n i c 时o fs 卸s a g es a n l p l e 1 1 1 ee 妇tw o u l dd e c 僧a g 础a 1 1 y 舔m ep r o l o n g a t i o no f b o i l i n gt i m ea f t e ra c e n a i l li i l i 舢t e s b o i l i i l gh a d 肿e 腩c to nt l l e m u t a g e l l i c i t yo fp r e s s e ds a l t e dd u c k 。 f f i e dw i mf i 墙t - c l 邪sr a p e s e e do i l 锄dl a r dc o u l di n c 把a t i l em u t a g e i l i c i t yo fs 砒毽a g e 锄d p r e s s e ds a l t e dd u c k f r i e dw i n ls e c o n d c l 弱sm p e s e e do i lc o u l di n c r e 髂et l l em u t a g e n i c i t ) ro f s a 弧a g e 锄dp 他s s e ds a l t e dd u c k b u tm em u t a g e i l i c i t yo fs a 惦a g ed e c r e 舔e dg r a d u a l l yw i 1t l l e p r o l g a t i o n “五b ，i i l gt i r n e ，w l l i l et l l e 舢啪i c i t yo f p 托豁e ds a l t e dd u c ki n c f e a s e dg f a d 豫l l y 加 ac e 蹦nt i l n e 6 t h ec 伽l t e n tr a f 嶝e so fi l i 砸钯，n i 衄l c e ，s o n d a d ，a i i l i r 圮o fp i c e dc l l i c k e nc l a w ，s a 吣a g ea n d 雕s s e ds a l t i e dd u c kw e 陀0 8 4 5 8 5 m g 瓜g 、3 0 6 7 5 8n 砭啦g 、1 2 8 2 3 3 眺gf e s p e c t i v e l y w l l i c h w e 代w i t h i i lt l l el i m i t a t i o no fs t a t eh y 百e i l i cs t a i l d 捌 b e i l z 0 ( a ) p y 他n ew 弱n o td e t e c t e di i lt l l e s en l r e es a m p l e s t h ec 讲y t e n tm g e so fn i 心o s 蛐e ， a r s e l l i c ，c a d l i l i u m ，j e a dw 饿o 4 0 1 3 l 峙他、7 肿8 4 2 舭g 、o 3 8 7 2i n g l ( g 、1 ，9 8 - 3 。9 8m g 瓜g n i 缸s a 玎l i i l e ，a r s 锄i c 锄dc 枷u mw c 犯、i 蛐t l l el i i i l i 伽0 no fs t a t eh y g i e r i i cs t a i l d a r d t k c o n t e n t so fl e a di nn 他s 唧l e sw e 他9 1 0 ，8 9 0 锄d1 8 9 0t i i i l e sl l i g h e rm 觚s t a t es t a n d 嗣叫 l i m i t a t i 蚰，r e s p e c t i v e l y 7 n es o d i 啪n i t r i t ew 笛n o t 舢t a g c i l i ci n 血c 瑚g eo f 5 m g 肚2 0 0m g l n ec o n t 锄to fs o d i 啪 i l i t r i t ei np i c l ( 1 e dc h i c l 【e nc l a w s a u s a g e 卸dp r e s s e ds a l t e dd u c kw 弱n o tm u t a g e n i c d i e t l l y i a m i n e h y i 搬l l i 嘶d ew 弱n o t 舢协g e m ci nm e 鲫g eo f2 0 m g i ，5 0 0m 叽t i l ec o n t 蛐to fd i e 蚓硼i i l e a b s i r a c i h y d r o c h l o d em t 1 1 e s et 1 1 r e es a m p i e sw 勰n o tm u t a g e n j c a r s e i l i cw 硒m u t a g e n i cw h 饥i t sc o r l c e n 仇i t i o n 陀h c d0 3 0m g l t h e n t 伽临o f 缸n i ci i l p i c l 【l e dc l l i c k e nc l a w s 叫s a g c 孤dp 陀s ds a l t e dd u c ks 卸 1 p i e sw e 陀u n d 盯m u t a g e i l i ca c b l e v e l c a m l l i u mw 弱m u t a g e i l i c 、j l ，_ h e ni t sc o n c e n m l t i o n 他扯h e d0 3 0m g ，l t h ec o n t e n t so f c a d r m u mi nt i l e h 砖es a i n p l e sa l r e a d yr e 孔h e dm u 鲥ca c t i o nl e v c l i 朋dw 罄m u t a g e 血cw h 饥 i t sc o n c e n 觚t i o nr e h e do 5 5 m g ，l t h ec o n t c l l t so fl e a di i lt l l e s em 坞es a n l p l e sa l i a d y 他h e d m u t a g e n i ca c t i o nl e v e l d i m e t h y ln i n 0 s a m i l l ew 蠲i 刑妇g e n i cw h e ni 乜c o n c e 咖t o n 他h e d5 0 0 0 她皿t h ec 0 呲e 鹏 o fd i i l 艟t t l y li i i n 0 s a m i n ei i lp i c l 【l e dc l i i c k e l ic l a w s 躺a g e 锄dp 佗髓e d 鼢l t c dd 眦kh a dr me 丘e c t 蚰 g e n o t o x i c i 哆 k e yw o r d s ：_ n l 眦i 舢d a m 鹤懈t ；m l c m n u c l e u st 哪细v i c hf 妯ar t 廿p ； m u 纽妒n i c i 锣 v 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中己加 了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同 仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者：厮勿和 签字日期：竭年占月妒日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：曰不保密， 口保密期限至年月止) 学位论文作者签名：厮易印导师签酊谚 签字日期：乃年6 月妒日签字日期： 彤年月尹日 第一章文献综述 第一章文献综述 传统腌制动物性食品，大多是以促进自然保护、防腐、延长食品保存期、拓展在不同食 用季节的可食性为目的。最初起源于食品保藏，是保证食品安全性最古老的手段之一。后来， 腌制技术经过不断的演变、分化，已成为一种独特的食品加工方法。用于满足人们对不同风 味、口感，乃至营养、生理功能的要求。长期以来，已形成了富有特色的肉制品体系。其代 表品种有：火腿、香肠、板鸭、腊肉等。但遗憾的是，这些有着几百年甚至上千年历史的传 统动物性腌制食品，并未因是传统风味食品而有过硬的质量。 近年来人们的研究发现，某些地区的特定食品与当地的肿瘤发生密切相关i l 】【2 1 。传统的动 物性腌制食品。由于含有n 皿硝基化合物、多环芳烃等致突变物质，具有潜在的致突变、致 癌作用。 1 1 动物性食品中致突变物质的研究概况 在人们对食品的安全性及健全性要求越来越高的今天致突变物质已引起了消费者的高 度重视。其原因是它与影响着人们及其后代身心健康的致癌、遗传毒性有相当的关联。至今 的各种研究结果表明，癌的形成是一个非常复杂的过程，简单地说是经诱发和促进这两大不 同的作用过程而形成的。所谓诱发作用，是指化学等物质作用于有遗传因子的细胞上，引起 了损伤。其损伤程度如果过强，可以致细胞于死亡；如果较弱，则细胞尚可存活，但这个受 损伤的细胞可导致氨基酸排列杂乱的蛋白质生成，进而使细胞的机能发生变化。而所谓促进 作用，则是指受损伤的细胞不遵守生物体应有调节支配，向自身增殖性极其强的异常细胞转 化的过程。当这个异常细胞的增殖达到相当数量时，就产生了癌。众多的试验结果证明，致 突变物质相当于诱发阶段作用于细胞的物质。虽然少数致突变物质属于非致癌性物质，但致 癌性物质几乎都呈致突变活性【”。 1 9 5 6 年国外学者首先从腌制食物中发现了n 亚硝基化合物，1 9 “年国外学者从烤牛肉中 发现了多环芳烃化合物，1 9 7 6 年又从沙丁鱼中又分离和鉴定了i q 和m e i q 等杂环胺化合物。由 于这3 类化学物的致癌性均非常强，因而引起人们对食物中的致癌物的极大兴趣与关注。 我国学者于上世纪7 0 年代从食管癌高发区的腌制食物中也发现了n 亚硝基化合物的存 在；8 0 年代初开展了杂环胺的研究，从煎烤的明太鱼中分离鉴定了2 个新型的杂环胺化合物【4 1 。 进入8 0 年代，人们对食物中致癌物的研究又出现了两个新的热点，一是食物中前致癌物 的研究，尤其是那些具有直接诱变或致癌性的前体物，可能在解释胃癌病因中具有重要意义， 因而格外受到重视；另一类热点是食物中存在的天然化学物质，这类物质致突变或致癌作用 比较弱，但由于它们在食物中j 。泛存在，而且含量较高，亦受到了各国学者的普遍关注。 1 9 9 1 年日本的o h t | 耐3 5 种加入亚硝基化合物的食品进行研究，发现其中的香肠及另外4 种 食品对加琳s 实验中的1 a 1 0 0 的实验结果为阳性嘲。 l 西南大学硕士学位论文 1 9 9 1 年北京肿瘤研究所的韩弛等人，选取l o 个具有代表性的中国传统食品以a m e s 实验进 行致突变性检测。其中的动物性样品都具有致突变性，还检出8 种致癌性亚硝胺，并在实验动 物中诱发了胃腺癌l 们。 1 9 9 6 年中国医科大学肿瘤研究所的袁嫒等人，对胃癌高发区辽宁省庄河市咸猪肉进行研 究，发现庄河市咸猪肉对t a 9 8 有强致突变作用川。 1 9 9 7 年l ( a n g 鼢d a l a n l p a i 对烟熏的肉、鱼和香肠食品中，再加入亚硝酸盐，通过a m e s 实验， 发现1 a 9 8 和t a l o o 的结果为阳性i 引。 1 9 9 9 年瑞典的a u g e s t s s o n 用加m s 实验对经常用来盛装油炸香肠等动物性食品的器具进行 研究发现，这些器具含有致突变物质【9 1 0 2 0 0 1 年浙江省疾控中心，花了2 年的时间对浙江省1 3 种腌制和发酵食品，以a m e s 实验进行 致突变性检测，发现其中的动物性食品咸肉与火腿有致突变性f l o j 。 1 2 腌制动物性食品中的硝酸盐、亚硝酸盐 动物性食品在加工中经常加入硝酸盐或亚硝酸盐作为发色剂，硝酸盐或距硝酸盐经过一 系列复杂变化产生的一氧化氮与肉中的血红蛋白和肌红蛋白结合，生成鲜红色稳定的亚硝基 血红蛋白和肌红蛋白，当其受热时，呈现玫瑰色，从而保证了动物性腌制品的色泽；在发色 同时生成新生态的氧，又能抑制厌氧菌，尤其是肉毒梭菌的生长繁殖，避免了肉毒梭毒素中 毒事件的发生【1 1 1 。 但过量添加亚硝酸盐，人体大量吸收造成正常的低铁( f e 2 + ) 血红蛋白变成高铁( f e 3 + ) 血红蛋 白，高铁血红蛋向不仅失去载氧能力，而且同时还能阻止正常血红蛋白释放氧，当高铁血红 蛋白达到血红蛋白总量的3 0 _ 4 0 ( 正常0 5 2 ) 时，即表现出轻微缺氧的中毒症状，当达到 6 0 7 0 时，可导致全身严重缺氧而引起机体迅速死亡。另外亚硝酸盐有松驰平滑肌的作用， 导致血压过低。使心肌缺血进一步恶化，亦可加速机体死亡。另外更为严重的是，动物性腌 制品中残留的皿硝酸盐可与机体组织中的仲胺在酸性条件下a p h l 4 ) 转化成亚硝胺化物，亚硝 胺化合物具有强烈的致癌性。【1 2 j 上世纪七十年代早期，在挪威爆发了农场动物的肝病( 包括肝癌) ，调查显示这些肝病是由 存在于鲱鱼体内的二甲基亚硝胺引发的，但研究发现，新鲜的鲱鱼不含二二甲基弧硝胺，它是 在腌制过程中鲱鱼体内的胺和亚硝酸钠反应生成的。这个结果使许多科学家开始产生了在人 类食品中是否也存在像挪威鲱鱼同样过程的疑问。【1 3 】 1 3 腌制动物性食品中的亚硝胺 n 亚硝胺是研究最多的n 亚硝基化合物。f h u n d 于1 9 3 7 年首次报道了2 例在职业接触n 亚 硝基二甲胺( n d ，又称二甲基亚硝胺) 中毒案例，病人表现为中毒性肝炎和腹水，其后以 n d m a 给小鼠和小狗染毒也出现肝脏退化性坏死。l 4 1 此后直到1 9 5 6 年，由2 位英国科学家j o i l i l 2 第一章文献综述 b 锄e s 和p e t e rm a g e e 对硝胺经过2 年的研究。他们揭示了n d m a 不仅是肝脏的剧毒物质，也 是强致癌物，可以引起肝脏肿瘤，从而引起了人们对n d m a 的广泛注意。【1 5 】 研究发现距硝胺是一类广泛存在于自然界、人类食品和药物中的致癌物质。通过在不同 动物和器官的实验发现被实验的大约3 0 0 种亚硝胺化合物，9 0 被检测出有致癌作用也就是 说，绝大多数亚硝胺化合物是致癌的，其中某些是转移致癌剂。i 幡】 1 3 1 亚硝胺的种类及理化性质 亚硝胺是n 弧硝基化合物的一种，按化学结构分为两类：即亚硝胺伽仃d 鞠m i n e ) 和距硝酰 胺( 1 1 i 仃0 s 锄l i d e ) ，弧硝胺比亚硝酰胺稳定，不易分解，他们的化学结构一般为r l ( r 2 ) n n = o 当 r i = r 2 = 烷基时，称为弧硝胺；当r l ( 或r 2 ) = 酰基时，称为弧硝酰胺。r l 与r 2 可以相同也可以不 同，当r l 和r 2 相同时，称为对称性亚硝胺，如n 亚硝基二甲胺( n d m a ) 和n 亚硝基二乙胺 ( n d e a ) ：当r l 和r 2 不相同时，称为非对称性亚硝胺，如n - 亚硝基甲乙胺( n m e a ) 和n 一亚硝基 甲苄胺烈m b 2 a ) 等。亚硝胺由于分子量不同，可以表现为蒸气压大小不同，能够被水蒸气蒸 馏出来并不经衍生化直接由气相色谱测定的为挥发性亚硝胺，否则称为非挥发性亚硝胺。 低分子量的亚硝胺( 如n 亚硝基二甲胺) 在常温下为黄色液体。高分子量的亚硝胺多为固 体。除了某些n 亚硝胺( 如n 弧硝基二甲胺、n 亚硝基二乙胺、n - 亚硝基二乙醇胺以及某些n 亚硝基氨基酸等) 可以溶于水及有机溶剂外，大多数亚硝胺都不溶于水，仅溶于有机溶剂中。 亚硝胺在紫外光照射下可发生光解反应。在通常条件下，不易水解、氧化和转为亚甲基等， 化学性质相对稳定需要在机体发生代谢时才具有致癌能力。 1 。3 2 腌制动物性食品中亚硝胺的来源 人体通过食用腌制动物性食品，而受到亚硝胺的危害，主要可分两个方面：1 直接摄入含 有亚硝胺的腌制动物性食品：2 。摄入含有亚硝胺前体物( 硝酸盐、亚硝酸盐和仲胺等) 的腌 制动物性食品，从而在体内合成。 1 3 2 1 直接摄入亚硝胺腌制动物性食品在加工过程中，经常加入加硝酸盐或亚硝酸盐作 为防腐剂和护色剂，而这些食物如香肠、腊肉、火腿和热狗等，直接加热( 如油炸、煎和烤等) 会引起亚硝胺的合成。 另外在腌制动物性食品时，添加的某些添加剂含有挥发性亚硝胺，当这些添加剂加人食 品时就将亚硝胺带人食品。如腌肉的预混剂亚硝胺含量尤其高。此外，食品工业用水( 如用离 子交换树脂) 也会带入少量亚硝胺，一般污染水平在1 9 k g 以下。 1 3 2 2 体内合成亚硝胺人们通过腌制品摄入大量的硝酸盐和亚硝酸盐。在口腔内的细菌、 唾液和酶的催化下，很容易将硝酸盐还原为亚硝酸盐。我们摄入的亚硝酸盐有6 0 6 5 由口 腔细菌产生【例。当这些亚硝酸盐进入人体胃中，在p h 值为2 5 3 4 的酸性条件下，可与仲胺反 3 西南大学硕士学位论文 应生成亚硝胺。同时在有硫氢酸根存在的条件下，伯胺和亚硝酸盐亚硝化反应的速度也很快。 此外，卤化物、甲醛对上面的弧硝化反应有一定的催化作用。另外，黄裕光等研究发现。人 体肠内的细菌也可以将n h 4 + 硝化成亚硝酸盐，进而与胺反应生成亚硝酸胺2 0 1 。 1 3 3 亚硝胺的致癌机理 亚硝胺在体内受到酶作用后，很快变成重氮烷并与细胞内的核糖核酸和脱氧核糖核酸结 合，最终使细胞发生癌变。人和实验动物的代谢机理相似，因此通过研究实验动物体内弧硝 胺的致癌机理来阐明人体内的癌变过程。1 9 5 6 年m a g e e 和b 姗e s 首先进行了二甲基亚硝胺的动 物体内试验发现：亚硝胺本身没有致癌作用，但其代谢物可以致癌l ”1 。同期p 他u s m a 加进行了 二烷基弧硝胺的氧化实验1 2 。人体内的代谢研究是由b r o u w e f s 和e m m e l o t 完成的，试验证明： 二甲基亚硝胺在肝微粒体酶作用下脱除一个甲基生成甲醛和单甲基弧硝胺，后者不稳定，迅 速分解，在非水溶液中分解成重氮甲烷，在水溶液中分解为重氮甲烷或碳阳离子【2 2 】。另外的 实验证明：单甲基亚硝胺及其衍生物具有烷基化能力，用甲胺和亚硝酸钠在p h = 4 时生成的单 甲基亚硝胺能使d n a 甲基化，这个过程可能与致癌有关。但单烷基亚硝胺生成烷化剂不是分 解的唯一途径，因为它可以和水作用再生成甲胺和亚硝酸【2 3 】。此外，二烷基亚硝胺也可以被 还原成肼和羟胺，这些化合物也是可能的代谢产物( 矧。 上世纪六十年代中，c r a d d o c k 证实：二甲基亚硝胺可使动物核酸中鸟嘌呤的第七位甲基化 【2 弱。随后m a g e e 发现，蛋白质、鼢妊、d n a 均可以被二二甲基亚硝胺甲基化【2 6 1 。接着v j l l 卜删n o 发现：r i 汛n a 被甲基化后，功能缺损或受到破坏f 2 7 1 。近年来有人提出部分亚硝胺可以产生自 由基并与d n a 反应形成无碱基位点，从而使遗传密码错乱导致肿瘤。但这类化合物作为烷化 剂而诱发肿瘤这一点比较统一。【2 8 】【2 9 1 亚硝胺的致癌活性首先取决于它们的代谢活性。而a 羟 基化或氧化脱烷基可能是致癌反应的限速步骤。由于p ，w 位氧化物在代谢产物中也有发现， 它们也可能对致癌有一定的作用p 们。 1 4 腌制动物性食品中的苯并( a ) 芘 苯并( a ) 芘又称3 ，4 苯并芘，由于它是第一个被发现的环境化学致癌物，而且致癌性很 强，故经常以b ( a ) p 作为多环芳烃( p a h ) 类化合物的代表。它是一种由5 个苯环构成的多环芳 烃，分子式为c 2 0 0 h 1 2 分子量为2 5 2 。常温下苯并( a ) 芘为浅黄色针状结晶，可分为单斜晶或 斜方晶，性质稳定，沸点3 l 旺3 2 0 ( 1 0 咖汞柱) ，熔点1 7 9 1 8 0 ，在水中溶解度为 0 0 0 4 o 0 1 2 m g l 。易溶于环己烷、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、丙酮等有机溶剂，微溶于乙 醇、甲醇。在常温下不与浓硫酸作用，但能溶于浓硫酸，能与硝酸、过氯酸、氯磺酸起化学 反应。人们可利用这一性质来消除苯并( a ) 芘。苯并( a ) 芘在碱性条件下较稳定。苯并( a ) 芘在有机溶剂中。用波长3 6 0 1 1 m 紫外线照射时，可产生典型的紫色荧光。 腌制动物性食品中的苯并( a ) 芘，主要来源于某些食品在加工过程中会用烟熏，由于所 4 第一章文献综述 用的燃料不完全燃烧，在这过程中会产生一定量的苯并( a ) 芘，因为这些燃烧产物与食品表 面直接接触，从而在食晶表面沉积。另外当某些食品在烧烤时。滴在火焰上的油脂含有的脂 肪、蛋白质等有机物在高温下分解，从而也形成一定的苯并( a ) 芘。但其具体的形成机制目 前尚不清楚，有学者认为是通过自由基反应、分子内加成或者小分子的聚合而形成，这一部 分苯并( a ) 芘也会附着在食品表面上f 3 l l p 2 1 。另外用一些含有苯并( a ) 芘的饲料喂养动物， 使苯并( a ) 芘在动物体内残留。从而使动物性食品含有苯并( a ) 芘。 动物实验已证明b ( a ) p 能诱发皮肤癌、肺癌和胃癌。经多年研究证明，b ( a ) p 本身是“前致 癌物”，需在体内代谢转化后方成为“终致癌物”。b ( a ) p 进人人体后，有很少一部分以原形从尿 或经胆汁随粪便排出体外，其余大部分经肝、肺细胞微粒体中的混合功能氧化酶氧化形成环 氧化物。然后氧环打开，第l o 位上的亲电子阳离子与细胞大分子( d n a 、l 玳a 、蛋白质等) 共价 结合，构成癌变的物质基础【3 3 】。 h 雒l e r 经过研究发现b ( a ) p 进入人体后，主要经过细胞色素p 4 5 0 混合功能氧化酶系统 ( c y p 4 5 0 s ) 中的c y p 4 5 0 l a l 代谢活化，生成具有强致癌活性的亲电子环氧化物，因此，他认为 c y p 4 5 0 l a l 同工酶的活性成为决定b ( a ) p 致癌性的关键1 3 4 】。 芳香烃受体是一种公认的配体激活的转录因子，在几种i 相解毒的细胞色素p 4 5 0 基因的表 达中有调控活性。s h i m a d 等研究发现b ( a ) p 的致癌作用可能是通过a h r 依赖的途径诱导c y p l a l 和c y p i b l 表达，这些诱导的p 4 5 0 参与b ( a ) p 的激活，生成有关的致癌物，从而导致肿瘤的启动 【3 5 】。但也有研究表明，b ( a ) p 在的代谢激活在小鼠肝脏存在不依赖a h r 和c y p l a l 的机制。说 明p a h 致癌也存在不依赖砧诹和c y p l a l 的途径【3 6 1 。 另外还有人研究发现，b ( a ) p 在与细胞膜相互作用时能够分解出一些物质，阻断细胞间的 联系，导致癌细胞的进一步增殖扩散，这可能是b ( a ) p 具有致癌性的原因之一 3 ，】。 1 5 食品中抗突变物的研究 随着人们对食品中致突变物研究的深入，人们发现食品中也存在许多天然的抗突变、抗 癌物，这为癌症的化学预防提供了大量的物质基础。食品中存在抗突变物、抗癌物大体上可 分为二类，一类是食物中的某些营养素，如氨基酸、维生素和微量元素；另一类是食物中的 非营养素，指食物中天然存在的、含量较少的一类具有抗突变、抗癌或其他生理活性的化学物 质。 1 9 7 0 年发现抗坏血酸维生素c 可抑制亚硝胺的形成。因此美国规定在肉类加工业中必须加 入5 5 0 熘瓜g 的抗坏血酸维生素c ，但在实际加工中加入的主要是异抗坏血酸( 抗坏血酸维生索c 的异构体) 而不是抗坏血酸维生素c ，这土要是因为异抗坏血酸比较便宜。另外也有研究发现 维生素e 被加到腌制肉中也能抑制亚硝胺的形成【3 8 】。s u r h 等研究还显示维生素c 可抑制b ( a ) p 的终致癌物所致突变性，其机理是与终致癌物结合生成不具致突变性的d n a 内收物。【3 9 】 刘爱文等研究发现，以蒸馏水为溶剂，于1 0 0 水浴冷凝回流提取l h ，提取荔枝核， 5 6 西南大学硕士学位论文 该提取液对亚硝胺的阻断率可达钳5 3 对亚硝酸根清除率可达8 4 7 l ，钙离子的加入能使 清除率有所提高阳】。 1 9 9 9 年福州的杨碧卿等人对4 4 种天然食物进行筛选发现其中的1 9 种具有不同程度的抗 突变作用【4 。 2 0 0 2 年浙江的袁振华等人研究发现将叶绿酸铜钠盐、松针、大蒜。加入到具有致突变性的 腌制发酵食品中，发现这三类物质有显著的抗突变作用4 2 1 。 s i l l g l l 在受试小鼠投予b ( a ) p 后再饲喂姜黄素的实验中发现，饲喂姜黄素组小鼠肝环氧化 物水解酶( e h ) 及谷胱甘肽转移酶( g s t ) 活性明显高于对照组，而肝乙氧基异吩恶唑o 脱 乙基酶( e l 的d ) 活性基本无变化，认为姜黄素可能通过降低b ( a ) p 的活化和增强肝的解毒 能力而抑制b ( a ) p 在小鼠前胃中的致癌作用。【4 3 】 第二章绪论 第二章绪论 人类肿瘤的发生与环境因素。特别是食品有密切关系。目前一般认为有3 0 与5 的癌症 与膳食有关，其中与饮食关系最为密切的肿瘤为消化道肿瘤，如胃癌、肝癌等。中国的百姓喜 欢吃传统的腌制和发酵品，而目前的研究发现某些腌制食品含有n 亚硝基化合物等致突变物 质，具有潜在的致癌作用。 2 1 研究的目的和意义 对重庆地区人们日常食用的四种传统腌制和发酵动物性食品：香肠、腊肉、泡凤爪、板 鸭进行研究。以确定这些食品是否具有潜在的致突变性和致突变的程度，以及引起致突变作 用的物质基础和影响因素。为指导消费和相关政策、法规的制定提供参考 2 2 研究的主要内容 1 1 选择4 种不同极性的溶剂处理样品，进行蚕豆根尖微核实验，以确定何种溶剂是提取上述1 样品的最佳溶剂。 2 以蚕豆根尖微核试验对选择板鸭、香肠、腊肉、泡凤爪品是否有致突变性进行初步筛选 3 用加n c s 实验对上述样品进一步进行致突变性检测，以确定它们的致突变性。 4 对板鸭、香肠样品用微波加热、油炸、蒸汽加热、沸水煮的方式进行处理后，通过蚕豆根 尖微核试验检验处理后的样品致突变性是否改变。 5 检测样品中致突变物的含量。 6 用检测到的直接致突变物和间接致突变物的纯品，来傲蚕豆根尖微核实验 7 第三章实验材料与方法 第三章实验材料与方法 3 1 实验材料 香肠、板鸭、腊肉 泡凤爪 蚕豆种子 3 2 实验菌株 购于重庆百货大楼北碚分店 购于重庆百货大楼北碚分店及重庆北碚批发市场 购于重庆北碚批发市场 鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型突变菌株t a 9 7 、t a 粥、1 a 1 0 0 、1 i a l 0 2 ，重庆市疾病控制中 心提供。 3 3 主要仪器设备 u v 二2 4 5 0 分光光度计日本岛津公司 电热鼓风恒温干燥箱上海跃进医疗器械厂 w d 7 0 0 微波炉l g 电子( 天津) 电器有限公司 s q 2 1 1 9 粉碎机 慈溪市西贝乐电器有限公司 r e 5 2 c s 一1 旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂 u ) 5 - 2 a 离心机北京医用离心机 数显电热恒温水浴锅上海跃进医疗器械厂 s q 2 1 1 9 粉碎机 慈溪市西贝乐电器有限公司 显微镜重庆光电仪器有限公司 1 1 2 8 型磁力搅拌器金坛市富华仪器有限公司 p h & 一8 型精密p h 计 上海虹益仪器仪表有限公司 z 5 0 0 0 原子吸收分光光度计日本日立公司 3 4 主要试剂 琼脂粉生化试剂( b r 级)成都市科龙化工试剂厂 组氨酸生化试剂( b r 级)国药( 集团) 上海化学试剂有限公司 生物素生化试剂( b r 级)国药( 集团) 上海化学试剂有限公司 叠氮化钠 东阳市天宇化工有限公司 n 1 萘乙二胺盐酸盐天津市光复精细化工研究所 na2s205浙江省温州市东升化工试剂 碱性品红中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 环磷酰胺上海第十二制药厂 9 西南大学硕士学位论文 d 生物素( a r )上海化学试剂三厂 l 组氨酸( a r )上海化学试剂三厂 g 6 p ( 葡萄糖6 磷酸) 国药( 集团) 上海化学试剂有限公司 黄曲霉毒素b l北京恒业中远化工有限公司 3 5 实验方法 3 5 1 不同极性溶剂提取物的蚕豆根尖微核实验“h 力 3 5 。1 1 不同极性溶剂提取物的制备选择4 种不同极性的溶剂：水、甲醇、二氯甲烷、石油 醚，其极性指数【4 8 】分别为l o 2 、6 6 、3 4 、o 0 1 ，另外选择甲醇+ 氯仿( 1 ：1 ) 混合溶剂。取l o 0 0 9 泡风爪、板鸭、香肠、腊肉样品，分别加入2 0 n l l 上述五种极性溶剂，于磁力搅拌器上搅拌 i h ，取上清液，各加入1 5 n 1 l 上述溶剂，再提取2 次，每次3 0 m i n ，合并3 次的上清液。用3 0 0 n 离心1 5 m i i l ，取上清液，于旋转蒸发器蒸发至干。用5 0 i l l l 蒸馏水定容。 加2 0 i t l l 上述纯溶剂( 其中甲醇，氯仿是各取1 0 l l _ l l ) 旋转蒸发致干，放数分钟后，加入 5 m l 蒸馏水淌洗蒸发瓶，定容到2 0 n l l 。 3 5 1 2 蚕豆根问微核实验选择饱满、大小均匀的蚕豆种子，于蒸馏水中浸泡2 6 3 0 h 让其 吸胀。2 5 恒温培养，每8 h 换水1 次，每天至少换水3 次，待根长至2 3 啪时，选择粗细、 长短一致且发育良好的种子作为实验用。 分别用蒸馏水作阴性对照，l o o 蚓m l 的环磷酰胺作阳性对照，用不同溶剂提取液及用样 品提取液处理根尖6 l l ，用卡诺氏固定液( 无水乙醇：冰醋酸= 3 ：1 ) 固定2 4 h ，置7 0 乙醇于4 冰箱中保存。 取根尖常规制片，用碱性品红染色，镜检。每个浓度的处理镜检5 个以上根尖，每个根 尖至少观察1 0 0 0 个间期细胞，统计细胞微核数，按下式计算微核率： 微核一茎骂萎慕暴翥孑差嘉景熹乌毳萋黼o