（食品科学专业论文）DON无毒phageELISA检测方法的建立及展青霉素免疫学检测初探.pdf

抗脱氧雪腐镰刀茁烯醇和展青啦紊单克隆抗体的研制及应用研宄 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌史学或其他教 育机构的学位或证书而使用过的杳才料。与我一同工僬的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 、 i 学位论文作者签专形舻勿f 签字嘞扣哞钼拥 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后使用本授权书) 学位论文 签字曰刘 日 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 导师躲诌棒 签字目期：善彳年彳月训 电话 邮编 抗脱氧雪腐镰刀两烯醇和展青霉素单吏琏抗体的研制及应用研究 本研究的创新之处 1 在合成脱氧雪腐镰刀菌烯醇( d o n ) 免疫抗原和检测抗原过程中分 别采用了不同的化学合成方法和载体蛋白，可准确判断哪只免疫 小鼠针对d o n 产生了较好的免疫应答，从而消除了在单克隆抗体 研制时免疫小鼠选择的盲目性，也减少了杂交瘤细胞筛选的工作 量。 2 研制了d o n 单克隆抗体免疫亲和层析柱，为d o n 免疫亲和层析柱 国产化打下了基础。 3 建立了d o n 无毒l i s a 方法：利用抗d o n 单克隆抗体1 2 d i ，从 噬菌体随机七肽库中淘选到d o n 的七肽模似表位，并以之替代 d o n 人工抗原建立了d o n 无毒e l i s a 方法( p h a g e e l i s a ) 。同时 用p h a g e e l i s a 、g c 、传统e l i s a 试剂盒( 德国r b i o p h a r m 公司) 检测了4 4 份小麦和玉米样品中的d o n ，三者的结果经统计学分 析无显著性差异。 4 以6 ，7 一二氢一4 ( 5 h ) 一苯并呋喃酮为原料，经四步化学反应，合成 了展青霉素结构类似物( 4 一羟基一4 i i 一5 ，6 一二氢一苯并呋喃 ( 3 ，2 c ) - 2 - 酮) 。实验中合成的中间化合物2 一羧亚甲基一3 羟基一 环_ 己酮为一种新的化合物( 经网络版s c i f ir i d e rs c h o l a r 查询) 。 南昌大学2 0 0 2 级博士研究生毕业论文 d o n 无毒p h a g e e l i s a 检测方法的建立及展青霉素免疫学检测初探 中文摘要 脱氧雪腐镰刀菌烯醇( d e o x y n i v a l e n o l ，d o n ) 和展青霉素( p a t u l i n ，p a t ) 都属于真菌毒素。脱氧雪腐镰刀菌烯醇是由镰刀菌的某些种产生的化学结构和 生物活性相似的有毒代谢产物一单端孢霉烯族化合物中的一种，主要污染小麦、 玉米等谷物及其制品，温带地区的谷物污染严重，在收割季节如雨量偏多则d o n 的污染更为严重。脱氧雪腐镰刀菌烯醇不仅具有致动物呕吐等急性毒索性、生 殖毒性、免疫毒性，而且与人的癌症相关。展青霉素是由某些真菌( 扩张青霉、 展青霉、棒型青霉等) 产生的一种次级代谢产物，主要污染苹果和山楂及其制品， 具有肾脏和消化系统毒性、致癌性、致畸、致突变作用和免疫毒性。因此，及 时对食品及其原料中的真菌毒素进行检测，防止真菌毒素( 如d o n 、p a t ) 污染的 食品进入食物链，是预防真菌毒素对人和动物带来危害的主要手段。虽然薄层 层析法( t l c ) 、高效液相法( h p l c ) 、气相色谱法( g c ) 已应用于脱氧雪腐镰刀 菌烯醇和展青霉素的定量检测，但这些检测方法比较昂贵和耗时，因为检测过 程中需要使用大量的有机溶剂、贵重的设备和繁杂的样品净化。免疫学检测方 法具有高选择性、灵敏、快速、一次可检测多个样品、对样品的纯度要求不高、 操作简单等特点，特别适合于大批量样本的检测。为建立d o n 的免疫学检测方 法，本研究在制各d o n 人工抗原的基础上，研制抗d o n 单克隆抗体；利用抗d o n 单克隆抗体建立d o n 酶联免疫检测方法( e l i s a ) ：制备d o n 单克隆抗体免疫亲和 层析柱，应用于h p l c 等检测中样品的净化处理；从噬菌体随机七肽库中淘选 d o n 的模拟表位，并以之替代d o n 人工抗原建立间接竞争e l i s a 方法。本研究 还进行了抗展青霉素多( 单) 克隆抗体的初步研究，并合成了一种展青霉素的结 构类似物。结果如下。 1 采用n ，n - 羰基二咪唑( c d i ) 法将脱氧雪腐镰刀菌烯醇分子与载体蛋 白m b s a 偶联制各人工抗原，免疫b a l b c 小鼠，应用杂交瘤技术，筛选到一株 能稳定分泌抗d o n 单克隆抗体的杂交瘤细胞株( 命名为1 2 d i ) ，小鼠单抗腹水的 效价达l ：5 1 2 x1 0 5 ，抗体亚类为i g g 2 a 。单克隆抗体1 2 d 1 与1 5 一a c d o n 、 3 一a c d o n 、雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮和桔霉素的交叉反应率分别为4 0 0 、 1 6 、4 3 、 1 和 0 3 。应用单克隆抗体1 2 d 1 建立的d o n 间接竞争e l i s a d o n 无毒p h a g e e l i s a 捡：则方法的建立及展青霉索免疫学检测初探 方法，检测范围为2 0 4 6 0 n g m l ，用蒸馏水提取加有d o n 标品( 2 5 0 - - 4 0 0 0 r i g g ) 的小麦、玉米样品，回收率分别为8 2 卜9 6 6 、8 5 5 9 5 6 ，变异系数分别为 0 6 7 1 、0 8 - 8 3 。 2 将抗d o n 单克隆抗体1 2 d 1 与c n b r 活化的s e p h a r o s e4 f f 胶的偶联， 研制了d o v 单克隆抗体免疫亲和柱，柱窖量为j g 。小麦样品添加d o n 标品( 1 趴g g ) ，用蒸馏水提取样品中d o n ，经免疫亲和柱净化、甲醇洗脱，h p l c 检测， 回收率大于8 8 ，变异系数4 6 - 7 4 。 3 采用固相淘选方法，从噬菌体随机七肽库中淘选到脱氧雪腐镰刀菌烯 醇七肽模似表位，其氨基酸序列为c m r p w l q 。以含有d o n 七脓模似表位的噬菌 体替代d o n 人工抗原建立了d o np h a g e e l i s a ，检测范围为2 0 4 0 0 n g m l ，小麦 和玉米样品加标回收率分别为8 9 3 9 8 2 、8 3 7 9 6 5 ，变异系数分别为 2 卜7 9 、07 - 6 2 ，应用于小麦和玉米样品中d o n 含量的检测，检测结果与 气相色谱法、传统d o ne l i s a 试剂盒( r i d a s c r e e n m 2 f a s 1i ) o n ，德同r b io p h a r m 公司) 经统计学分析无显著性差异。 4 目前未见展青霉素免疫学检测方法的报道，可能是由于展青霉素的 不稳定性。本研究采用n ，n l 羰基二咪唑( c d i ) 法将展青霉素分子与载体蛋白 m b s a 偶联制备展青霉素检测抗原。采用戊二酸酐法合成p a t h g ，通过活泼醣 法将p a t h g 偶联到载体蛋白o v a 制备展青霉素免疫抗原，免疫b a b l c 小鼠， 4 次免疫后，小鼠血清中抗展青霉素抗体效价为1 ：1 6 0 0 ，且小鼠抗展青霉素多 克隆抗体与展青霉素检测抗原的结合能被展青霉素阻断。由于多克隆抗体对展 青霉素亲和力低，未能建立展青霉素免疫学检测方法。 5 希望通过合成化学性质稳定的展青霉素结构类似物替代展青霉素制 备人工抗原，研制单克隆抗体，建立展青霉素免疫学检测方法。本研究合成了 展青霉素结构类似物( 4 一羟基一4 h 一5 ，6 一二氢一苯并呋喃( 3 ，2 c ) 一2 一酮) ，但该类似 物在小鼠血清中比展青霉素更不稳定，不能用于替代展青霉桑制备人工抗原。 实验过程中合成的中间产物2 一羧亚甲基3 一羟基一环己酮为- 4 十新的化合物( 经 网络版s c i f i n d e rs c h o l a r 查询) 。 关键词：脱氧雪腐镰刀菌烯醇；展青霉素；p h a g e e l 。i s a ；模拟表位 南昌大学2 0 0 2 级博士研究生毕业论文 d e v e l o p m e n to fp h a g ee n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a yf o rd e t e c t i n g d e o x y n i v a l e n o la n dp r e l i m i n a r ys t u d yo ni m m u n o a s s a y o fp a t u l i n a b s t r a c t m y c o t o x i nd e o x y n i v a l e n o l ( d o n ) i sak i n do ft r i c h o t h e c e n e sp r o d u c e db y f u s a r i u m a l t h o u g hd o n i so n eo ft h el e a s ta c u t e l yt o x i ct f i c h o t h e c e n e s ，i ts h o u l db e t r e a t e da sa n i m p o r t a n tf o o ds a f e t yi s s u e ，b e c a u s ei ti sa c o m m o nc o n t a m i n a n to f w h e a ta n d c o r n ，u s u a l l yo c c u r si nt e m p e r a t ec l i m a t e si ny e a r st h a ta r ep a r t i c u l a r l yw e t a tt h et i m eo fh a r v e s t d o nc a u s e sf e e dr e f u s a l ，e m e s i s ，i m m u n o s u p p r e s s i o no r i m m u n o s t i m u l a t i o n ，t e r a t o g e n y ，c y t o t o x i c i t y ，r e p r o d u c t i v et o x i c i t ya n dh u m a n c a n c e r s m y c o t o x i np a t u l i n ( p a t ) i sat o x i cs e c o n d a r ym e t a b o l i t ep r o d u c e db yaw i d er a n g eo f f u n g a ls p e c i e so f p e n i c i l l i u ma n d a s p e r g i l l u s ，a n di s c o n s i d e r e dt ob em u t a g e n i c ， c a r c i n o g e n i c ，t e r a t o g e n i ca n di m m u n o l o g i ct o x i c i t y t h e r e f o r e ，ar a p i da n d r e l i a b l e m e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fd e o x y n i v a l e n o la n dp a t u l i ni si m p o r t a n tt oa v o i dt h e ； r i s ko fd o n c o n s u m p t i o nb yh u m a n sa n da n i m a l s s o m em e t h o d sh a v e b e e n d e v e l o p e df o rd e t e c t i n gd e o x y n i v a l e n o la n dp a t u l i ni nf o o dp r o d u c t s ，s u c ha s t h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) ，h i g h - p e r f o r m a c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) a n dg a sc h r o m a t o g r a p h y ( g c ) ，b u tt h e s em e t h o d st h a tp r o v i d eq u a l i t a t i v er e s u l t sa r e c o n s i d e r a b l ye x p e n s i v ea n dt i m ec o n s u m i n go w i n g t ot h eu s eo fl a r g ea m o u n t so f o r g a n i cs o l v e n t s ，c o m p l i c a t e dc l e a n u pp r o c e d u r e sa n de x p e n s i v ee q u i p m e n t s ， i n c o n v e n i e n tf o rr o u t i n ea s s a y e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y s ( e l i s a ) e m p l o y i n g m o n o c l o n a lo rp o l y c l o n a la n t i b o d i e si sb yf a rt h em o s tw i d e l yu s e d s e r o l o g i c a lt e s tf o rt h ed e t e c t i o no fm y c o t o x i n sb e c a u s eo fi t ss i m p l i c i t y , r a p i d i t y , a n d s e n s i t i v i t y , a n de l i s a h a sa u n i q u ea b i l i t yt or o u t i n e l yh a n d l eal a r g en u m b e ro f s a m p l e sa n dd o n tr e q u i r et i m e - c o n s u m i n gp r o c e d u r e sa n ds o p h i s t i c a t e de q u i p m e n t s i i it h i ss t u d y ，t h e3 - h e m i g l u t a r a t e d e o x y n i v a l e n o l ( 3 - h g - d o n ) w a sp r e p a r e db y p r o t e c t i o no ft h ec 7 - a n dc 1 5 - h y d r o x y l sw i t hac y c l i cb o r o n a t ee s t e r , e s t e r i f i c a t i o n w i t hg l u t a r a t ea tt h ec 3 一h y d r o x y l ，a n dr e m o v a lo ft h eb o r o n a t ee s t e r 3 - h g d o n w a sa c t i v a t e db ya c t i v ee s t e rm e t h o d ，a n dc o n j u g a t e dt oo v a l b u m i n ( o v a ) a st h e d o n d e t e c t i n g a n t i g e n( d o n h g - o v a ) d o n w a sa c t i v a t e d b y 7 d o n 无毒p h a g e e l i s a 检删方法的建立及展青霉素免疫学检测初探 1 ，1 - d i c y c l o h e x y l c a r b o d i i m j d e ( c d i ) ，a n dc o n j u g a t e d t om o d i f i e d b o v i n es e r u m a l b u m i n ( m b s a ) a st h ed o ni m m u n o g e n ( d o n - m b s a ) o n eh y b r i d o mp r o d u c i n g a n t i d o nm o n o c l o n a la n t i b o d y ( m c a b ) w a so b t a i n e db yl i m i t e dd i l u t i o n ，n a m e d 1 2 d 1 t h es u b c l a s st y p eo fm c a b1 2 d 1w a sl g g 2 a t h et i t e ro fa s c i t i cf l u i dw a s 1 ：5 1 2 x 1 0 5 ，a n dt h ec r o s sr e a c t i v i t yo fm c a b1 2 d 1t o1 5 一a c e t y l d e o x y n i v a l e n o l ， 3 - a c e t y l d e o x y n i v a l e n o l ，n i v a l e n o l ，z e a r a l e n o n ea n dc i t r i n i nw e r e4 0 0 ，1 6 ，4 3 ， 2 0 0 吼g k g g k g ；存病粒率 2 2 0 0 g k g “”。 b l a c k w e l l 等( 1 9 8 5 ) 用1 。1 c 标记研究了禾谷镰7 j 菌生物合成d 。n 和过程，并 推测出d o n 生物合成路线( 图卜3 ) “”。 南昌大学2 0 0 2 级博士研究生毕业论文 斗， 2 一“+ 一。；一妒、椰。，t ” ta o h 窜一一渖 j 卜 舯口、“， 、“铲一? q 争 “ “ ”：藕4 图1 - 3 禾谷镰刀菌的d o n 生物合成路线推测图 f i g 1 - 3p r o p o s e dd o nb i o s y n t h e t i cp a t h w a yo ff u s s t i u mg r a m i n e a r u m 1 3 谷物及其制品d o n 的污染情况 d o n 的污染广泛存在于全球，中国、日本、美国、德国、前苏联、南非、 挪威等均有报道。d o n 主要污染小麦、大麦、燕麦、玉米等谷类作物，也污染 粮食制品，如面包、饼干、麦制点心等。另外，在动物的奶、蛋中均发现有d o n 残留。d o n 在谷物中的污染状况与产毒菌株、温度、湿度、通风、日照等因素 有关。小麦赤霉病主要分布在潮湿的温带地区，我国大部分地区又恰恰处于这 一地区，这是我国d o n 的污染较严重的原因之一，在多雨年分d o n 的污染状况 则更为严重，赤霉病麦中毒也是我国最主要的真菌性食物中毒之一，越来越引 起了人们的重视。各国对谷物及其制品中d o n 的含量都制订了限量标准，我国 谷物中d o n 的限量标准为1 o m g k g 。”。 郭红卫等检测了我国上海及河南地区赤霉病流行年份与非流行年份小麦中 的镰刀菌污染情况，发现d o n 与雪腐镰刀菌烯醇( n i v a l e n o l ，n i v ) 、玉米赤霉烯 酮( z e a r a l e n o n e ，z e n ) 存在联合污染。在流行年份样品d o n 含量的中位数为 9 3 3 o m g k g ，非流行年份d o n 为1 4 2 m g k g 。其含量远远超过我国制定的d o n 的允许量标准( 1 o m g k g ) ”“2 = ”。陆刚等( 1 9 9 4 ) 采用薄层层析法调查了安徽小 1 9 8 3 1 9 9 1 年小麦、玉米、大麦及面粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的污染水平及其 影响因素，分析样品6 7 2 个，d o n 阳性率为6 3 2 ，平均含量为9 0 8 7 口g k g ， 范围在o 一1 3 3 3 m g k g 。其中以小麦和面粉污染比较严重，小麦中d o n 的污染水 平与该年度和地区小麦赤霉病的流行程度有关。”。 t u t e l y a n 等( 2 0 0 4 ) 采用t l c 和h p l c 法对苏联1 9 8 9 - 2 0 0 2 年的5 6 5 2 份小麦、 黑麦、大麦和玉米样品中的d o n 和z e n 含量进行了检测，从k r a s n o d a r ：地区采 抗脱氧雪腐镰刀茁烯醇和展青毒素单克隆抗体的研制及麻用研究 集的2 1 6 6 份样品中的1 4 9 8 ( 6 9 ) 份检出了d o n 的污染，样品中d o n 污染量为 0 卜8 6 p p m “。m a r t jn s 等( 2 0 0 1 ) 从葡萄牙里斯本的不同超市随机采集了8 8 份不同品牌的早餐麦片，采用免疫亲和柱- - n p l 6 法( 检测下限为l0 0 肛g 仃( g ， 平均回收率为8 0 ) 检测d o n 的含量，7 2 8 样品中d o n 含量为1 0 3 6 0 4 0 k g k g ，平均为7 5 4 班g ，2 7 2 样品未检测出d o n ( 含量小于1 0 0 眺g ) “”。e l e n 等( 2 0 0 3 ) 采用g c 法在挪威检测了1 9 9 2 - 1 9 9 6 年春季和冬季的麦 类中? o n 的含量，春季燕麦d o n 含量为o 3 2 p g 幢，冬季小麦d o n 为o 2 犁g 幢， 春季小麦d o n 含量为1 4 即g ，春季大麦d o n 含量为o 5 锄g g ”。s o h n 等 ( 1 9 9 9 ) 从韩国的大麦、黑麦、麦芽等4 2 个样品中分离到3 6 株镰刀菌，其中1 5 株镰刀菌在产毒培养中有6 株产生d o n ，最高产毒量为5 3 m g k g 。”。t r u c k s e s s 等( 1 9 9 3 年) 收集了美国2 5 个州的6 3 0 份样品( 其中小麦样品4 8 3 份，大麦样品 1 4 7 份) ，采用直接竞争e l i s a 测定结果表明：4 0 的小麦样品，5 7 的大麦样品存 在d o n 污染，小麦样品中d o n 的含量为0 5 1 8m g k g ，平均值为2 0 m g k g ，而大 麦样品中d o n 的含量为o 5 2 6 m g k g ，平均值为4 2 m g k g 。污染程度均超过 美国食品和药物管理局制定的d o n 的建议含量( 2 o m g k g ) 。s c h o 1e n b e r g o r 等( 2 0 0 5 ) 采用g c m s 方法检测了1 9 9 9 年从德国采集的1 0 1 份样品中的d ( ) n 含 量，9 2 的样品检测出了d o n ，d o n 含量为1 5 - - 6 9 0 # g k g ，平均为1 3 蛳g k g ”。 食品中d o n 污染状况见表l 一2 ”。 表卜2食品中d o n 污染状况 t a b 1 2 c o n a m i n a t j o r so fd o ni nf o o d s 1 4d o n 的毒性和作用机理 ， 人和动物在误食被d o n 污染的粮谷类后可以产生广泛的毒性效应，它还常 1 6 南昌大学2 0 0 2 级博士研究生毕业论文 与其它的真菌毒素如黄曲霉毒素共同污染农作物，进入人体后可以相互影响， 对人类及动物的健康构成威胁。 1 4 1d o n 的急性毒性 d o n 的急性毒性与动物的种类、年龄、性别和给药途径有关。雄性动物比雌 性敏感，经口毒1 1 1 4 于皮下注射，不同动物的半致死剂量( l d 。) 见表卜3 。急性 中毒后，动物的主要表现为站立不稳、反应迟钝、竖毛、腹泻、食欲下降等。b 6 c 3 f 1 雌鼠用毒素灌胃后在4 8 内死亡，经口和腹腔注射的l d 。分别为7 8 m g k g 体重、4 9 m g k g 体重，急性死亡鼠病理解剖可见胃肠道粘膜、骨髓和淋巴组织的坏死，肾 脏和心脏的损伤。”。 表1 3d o n 不同染毒途径的l 峙 t a b 1 3l d 5 0o fd o nw it hd i f f e r e n t e x p o s u r ea p p r o a c h e s 动物种属 小鼠 新生大鼠 大鼠 北京雏鸭 染毒途径 经口 腹腔注射 经口 经口 皮下注射 表卜4d o n 不同染毒途径的致吐剂量 t a b 1 4 v o m i td o s a g eo fd o nw i t h d i f f e r e n te x p o s u r ea p p r o a c h e s 呕吐，是人和动物脱氧雪腐镰刀菌烯醇急性中毒的主要症状之一，不同动物 的致吐剂量如表卜4 所示。f o r s y t h 等( 1 9 7 7 ) 通过实验证实体重为9 - l o k g 的仔 猪的腹腔注射致呕剂量为0 0 5m g k g 体重，口服致呕剂量为0 卜0 2m g k g 体重， 同时表现拒食现象”。 几乎所有的单端孢霉烯族毒素都有可引起鸭雏、猫、狗、猪、鸽子等动物的 呕吐，尽管d o n 的致死毒性比其他单端孢霉烯毒素弱，但d o n 致动物厌食和呕 吐的作用最强”。1 5 一a c d o n 是d o n 的前体之一，引起猪呕吐的剂量稍低于与 d o n ，腹腔注射致呕剂量分别为7 5 和5 0 # g k g 体重”。t 一2 毒素致鸽呕吐的剂 量分别为0 7 2 m g k g ( 静脉注射) 、0 1 5m g k g ( 口服) ，经口致死剂量为2 7 5 m g k g 。 当饲料中d o n 含量为3 6 p p m 、4 0 p p m 时，2 0 4 5 k g 体重的猪分别有2 0 、9 0 出现采 食下降“”。猪对d o n 的致呕吐作用最敏感，约为其他动物的1 0 0 - - 2 0 0 倍，致呕 吐作用的机理除了d o n 对粘膜的刺激作用外，同时也有对中枢神经的作用。 1 4 2d o n 的吸收及代谢 牛瘤胃微生物在体外能将部分d o n 分解，分解产物为脱环氧d o n ( d o m = i ) 。”。 p r e l u s k y 等( 1 9 8 8 ) 用“c 标记的d o n 研究d o n 在猪体内的药代动力学，结果 垤8 o 3 3 o 凹蚯m l - 观 抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇和展青霉紊单克隆抗体的研制及应研究 发现9 5 以上的d o n 原体形式经尿液排出体外，3 5 通过胆汁排泄；d o n 经口 服后，1 0 3 0 分钟血浆d o n 浓度达到峰值，吸收率为5 4 8 5 ；猪体内的d o n 迅速通过尿液、胆汁排出体外，在2 4 小时内d o n 被完全排出体外，未发现d o n 的代谢物d o m - i “”。g l a k e 等( 】9 8 7 ) 将“c 标记的d o n 灌喂雄性p v g 小鼠( 1 0 m g k g 体重) ， 9 6 小时内从粪便和尿液中排出的放射性物质量分别为6 4 和2 5 ，从 呼出的气体中检出量小于0 1 5 ，9 6 小时后只能从组织中检出极微量的放射性 物质：对尿液和粪便中排出的放射性的物质进行结构鉴定，主要为二种物质： 一种是d o n 的代澍产物3 a ，7 a ，1 5 t r i h y d r o x y t r i c h o t h e c 9 ，1 2 d i e n 8 o n e ，占1 0 ， 另一种是d o n ，占2 5 ”。研究结果表明d o n 进入动物体内后主要通过消化道 和泌尿系统排泄，而且排泄速度较快，在体内的积蓄量很少。 l 4 3d o n 的免疫毒性 许多研究表明，d o n 干扰机体免疫系统的免疫应答，d o n 既是一种免疫抑制 剂，又是一种免疫促进剂，与剂量、作用时间、动物种类有关。近年来发现d o n 与动物和人的癌症：”、i g a 肾痫有关“、”、“，同时d o n 还可以诱发辅助性t 细胞诱导产物细胞因子的产生、激活巨噬细胞、t 细胞产生炎症前细胞因 子。 脱氧雪腐镰刀菌烯醇对鼠类的免疫毒性主要表现为促进i g a 的分泌、抑制 i g g 、i g m 的产生。p e s t k a 等( i 9 8 9 ) 在b 6 c 3 f 1 小鼠饲料中添加0 、10 、2 5 、 5 0p p r d o n ，发现2 5 p p m 组小鼠4 周后血清中i g a 水平显著提高，i g a 水平比未 添加d o n 的对照组高1 7 倍，且i g a 免疫复合物也逐渐增加，而血清中i g g 、i g m 水平却降低，将饲喂d o n 的小鼠脾细胞进行体外培养也发现培养液中i g a 水平 比未添加d o n 的对照组高。通过免疫荧光染色及电镜观察发现饲喂d o n 组小鼠 肾脏中i g a 沉积比对照组多。实验结果显示d o n 能扰乱小鼠i g a 的产生并导致 i g a 肾病“”。p e s v k s 等( 1 9 9 0 ) 将小鼠分成四组：( 1 ) 喂酪蛋白，( 2 ) 喂酪 蛋白和d o n ( 2 5 p p m ) ，( 3 ) 喂酪蛋白和霍乱毒素，( 4 ) 喂酪蛋白、d o n ( 2 5 p p m ) 和霍乱毒素。结果喂d o n 的小鼠血清中总i g a 、抗酪蛋白特异性i g a 比对照组 高，但抗c t 特异性i g a 与对照组无差异；喂d o n 组小鼠血清中抗酪蛋白、霍乱 毒素特异性i g g 比不喂d o n 组均低。说明d o n 能干扰经消化道免疫的免疫应答 “。r a s o o l y 等( 1 9 9 2 ) 研究了d o n 对雌性b 6 c 3 f l 小鼠免疫系统的影响，小 鼠连续饲喂8 周含d o n 的饲料( 饲料中d o n 含量为2 5 p p m ) ，血液中i g a 在第4 、 8 周分别为对照组高2 、1 3 倍，而i g g 、z g m 却l l l , 1 照组低“。g r e e n e 等( 1 9 9 4 ) 研究了d o n 对雌性和雄性b 6 c 3 f i 小鼠i g a 及i g a 在肾脏沉积产生的i g a 肾病的 影响，b 6 c 3 fj 鼠分成四组，饲料中分别添加0 、2 、i 0 、2 5 p p md o n ，连续饲喂 1 2 周，发现雄性比雌性对d o n 诱导的i g a 分泌调节及导致的t g a 肾病更敏感( 所 需的时间更短、d o n 剂量更小、病变更严重) ，雌性和雄性b 6 c 3 f 1 小鼠口服d o n 南昌大学2 0 0 2 级博士研究生毕业论文 后，血清中i g m 、i g g 、i g e 量均比对照组低“”。p e s t k a 等( 2 0 0 2 ) 通过实 验也发现d o n 能导致小鼠厌食、生长变慢，血清中i g a 量增加，i g a 在肾脏的 沉积增加类似人类的i g a 肾病“”。 一些学者在对d o n 对鼠类免疫功能的影响研究中发现i g a 的升高与白细胞 介素( i l ) 呈现相关性。y a n 等( 1 9 9 8 ) 通过体外培养b 6 c 3 f 1 鼠( 经口服d 。n 后2 小时，2 5m g k g 体重) 脾细胞和肠集合淋巴结细胞，检测培养液中i l 一6 、i g a ， 结果发现巨噬细胞在d o n 诱导i g a 产生中起关健作用。口服d o n 的小鼠脾细胞或肠 集合淋巴结细胞培养时，如去除巨噬细胞，则i l 一6 、i g a 的产生与对照组无差异， 如加入口服d o n 的小鼠的腹腔巨噬细胞，则i l 一6 、i g a 的量比对照组高。对照组小 鼠( 未经d o n 口服处理) 的肠集合淋巴结b 细胞如与试验组小鼠脾脏c d 4 + 细胞共培 养时，i g a 的分泌水平也能提高，证实t 细胞能辅助提高i g a 的产生，i l 一6 水平与 血清i g a 的含量正相关“”。但是p e s t k a 等( 2 0 0 0 ) 研究了i l 一6 在d o n 对小鼠i g a 分泌的影响，发现i l 一6 的消除不能改变d o n 引起小鼠的呕吐和厌食现象，i l 一6 缺 失型小鼠饲p 畏d o n 后，i g a 的分泌升高、i g a 肾病并未减弱”。m e k y 等( 2 0 0 i ) 从 人【l 液中分离淋巴细胞进行体外培养，在血液中分别加不同量的d o n 、t - 2 、a f b ，、 f b 。真菌毒素，植物血凝素( p h y t o h e m a g g l u t i n i n ，p h a ) 刺激淋巴细胞有丝分裂， 采用m t t 法测定淋巴细胞的增殖，e l i s a 法测定i l 一2 、i l 一4 、i l 一6 的含量。研究结 果显示：5 0 抑制淋巴细胞的增殖的d o n 浓度为2 1 6 n g m l ，5 0 抑制淋巴细胞的增 殖的t 一2 浓度为卜5 n g m 1 ：2 0 0 4 0 0 n g m ld o n 作用7 2 & 时能显著提高淋巴细胞分 泌i l - 2 ( 比对照组高1 2 倍) ，对i l 一4 、i l 一6 分泌的影响不显著。i n s t a n e s 等 ( 2 0 0 4 ) 证实d o n b m 降t 氐c a c o 一2 ( 结肠细胞) 、a 5 4 9 ( 肺细胞) 、u 9 3 7 ( 单核细 胞) 细胞系的蛋白质合成、增殖和存活时间，且与d o n 的量成正相关；d o n 提高u 9 3 7 细胞分泌i l 一8 ( 比对照组高8 倍) ；但d o n 不能提高小鼠与过敏相关的抗体i g e 或 i g g 。的量。该研究结果表明d o n 通过呼吸道或消化道进入体内后，对动物或人的 巨噬细胞、肺脏和结肠的上皮细胞产生毒性，但不会提高致敏原的过敏反应“”。 白细胞介素一6 ( i l 一6 ) 是d o n 产生免疫毒性的关健因子，m o o n a 等( 2 0 0 3 ) 研究发现环氧化酶一2 ( c o x 一2 ) 的表达与d o n 诱导i l 一6 分泌增加密切相关。 1 0 0 - 2 5 0 g m ld o n 使鼠巨噬细胞系( r a w2 6 4 7 ) 的c o x 一2 蛋白表达增加。如 果在细胞培养液中加入c o x 一2 抑制剂( 如茚甲新、n s - 3 9 8 ) 则可明显降低由脂 多糖( l p s ) 和d o n 诱导调节i l 一6 的产生量，但c o x 一2 抑制剂( 如茚甲新、n s 一3 9 8 ) 不能降低单独由l p s 诱导的i l 一6 的产生。小鼠灌服5 - 2 5 m g k g 体重d o n 后2 小 时，肠集合淋巴结和脾脏内c o x 一2 m r n a 表达量达到峰值，而i l 一6m r n a 在2 - 4 小时达到峰值，该结果提示c o x 一2 的基因表达凋节早于或与i l 一6 基因表达调节 同步进行。小鼠经c o x 一2 抑制剂茚甲新或n s 3 9 8 预处理后灌服d o n ，脾脏i l 一6 m r n a 、血清中i l 一6 的含量均比未经茚甲新或n s - 3 9 8 预处组小鼠显著降低。c o x 一2 抗脱氧雪腐镰川菌烯醇和展首霉素单克降抗体n 0 研制及应用研究 缺失型小鼠由d o n 诱导的脾脏t l 一6m r n a 、m 清中i l 一6 的量均显著低于野生型 小鼠”。c o x 一2 及其代谢物对d o n 诱导的儿一6 的分泌起重要作用“，i l 一6 分 泌的上调在d o n 诱导的i g a 分泌的增加起关健作用”1 ”。j i a 等( 2 0 0 5 ) 用c o x 一2 缺失型和野生型小鼠进行试验，验证c o x 一2 在d o n 诱导的i g a 分泌及i g a 肾病 中所超的作用。结果口服d o n 后血清中i g a 、i g a 免疫复合物增加，i g a 在肾脏 的沉积也增多，但c o x 一2 缺失型小鼠，或经c o x 一2 抑制剂处理小鼠的i g a 分泌 及i g a 在肾脏的沉积并未改变；另一项实验结果表明c o x 2 抑制剂r o f e c o x i b 也不能阻断d o n 诱导的i g a 分泌的增加及i g a 在肾脏的沉积，相反促进i g a 的 分泌。这些实验结果证明c o x 一2 并不是d o n 诱导i g a 分泌的增加及i g a 肾病必 需前提“”。 大量研究表明d o n 能使鼠类的 g a 分泌增加，致使血清中i g a 免疫复合物 含量增加，并导致i g a 在l 肾脏的沉积增加继而彤成类似人类的i g a 肾病，但到 目前为止，人们还未完全清楚其免疫致病机理。p e s t k a ( 2 0 0 3 ) 提出了d o n 刺 激机体t g a 的分泌增加并导致i g a 肾病的细胞机理( 图1 4 ) “”。 名。 平i g a p g e 2l l 占 ， 吣一、感驴懈” ：州茎一igacte i i 图l 一4 d o n 诱导i g a 分泌及i g a 肾病的细胞机理 f i g 1 - 4 c e l l u l a rm e c h a n i s m si n v o l v e di nd o n i n d u c e dl g a p r o d u c t i o n a n di g an e p h r o p a t h y 由i g a 在肾脏的沉积导至人类常见的血管球性肾炎( i g a 肾病) 可通过在饮食 中增加不饱和脂肪酸( p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s ，p u f a s ) 抑制，早期的 j g a 肾病可利用脱氧雪腐镰刀菌烯醇饲喂小鼠建立动物模型，利用这一动物i g a 肾病模型可发现用于预防或控制i g a l 肾病的物质。m o o n 等( 2 0 0 3 ) 发现含6 鱼油 ( f is ho i l ) 的饲料喂小鼠8 周可抑制i ) o n 引起的t l 一6 表达的增加，脾脏中c o x 一2 m r n a 的表达也显著降低，通过体外细胞培养试验表明二十二碳六烯酸 ( d o c o s a h e x a e n o i ca c ld ，d h a ) 、二十碳五烯酸( e i c o s a p e n t a e n o i ca c i d ， 南昌大学2 0 0 2 级博士研究生毕业论文 e p a ) 在体外抑伟u d o n 诱导的细胞i l 一6 分泌的增加“”。j i a 等( 2 0 0 4 ) 进步研 究了一亚麻酸( a 一1 i n o l e n i ca c i d ，a l a ) 、二十二碳六烯酸( d h a ) 、二十碳五 烯酸( e p a ) 对d o n 诱导小鼠i g a 分泌增加、i g a l 肾病的抑制效果。小鼠饲料中添加 d h a 、e p a 或d i a + e p a 可削弱口服d o n ( 1 0 m g k g 体重) 引起的小鼠血清中i g a 、i g a 免疫复合物的增加及i g a 在l 肾脏的沉积，体外脾细胞培养也得到了相同的结果。 连续饲喂8 周d h a + e p a ，可消除d o n 引起的i l 一6 基因的表达( i l 一6 在i g a 肾病形 成中起重要作用的细胞因子) 。但饲料中添加a 一亚麻酸( 6 0g k g ) 却未能削弱 d o n 诱导的小鼠i g a 分泌增加。结果表明d h a 和e p a ，而不是a l a ，能改善早期 i g a 肾病，作用机理可能是通过降低了i l 一6 的产生“”。p e s t k a 等( 2 0 0 6 ) 研究 了不同剂量的二十碳五烯酸( e p a ) 在预防早期i g a 肾病的效果及i l 一6 的变化情况。 在小鼠饲料中添力n 2 0