（食品科学专业论文）具有粘附性双歧杆菌的筛选及相关特性研究.pdf

摘要本课题以双歧杆菌作为研究对象，就粘附性菌株的筛选、生长特性、粘附特性、抑菌性能及其耐药性与质粒嚣方面进行了较为系统的研究，以期为优良、安全、高效的食品级双歧杆菌发酵剂及微生态肯4 剂的研制及开发提供理论依据及技术支持。1 测定了2 3 株双歧杆菌的表面疏水性及对人肠道上皮c a c o - 2 细胞的粘跗性，发现同一菌株在疏水性及粘附性上存在着一定的对应关系，说明测定菌株的表面疏水性可作为筛选粘附性双歧杆菌的初筛标准之一。其中菌株h 1 0 、i - 6 具有较强的粘附性。2 菌株h 1 0 、i - 6 经鉴定分别为星状双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i u ma s t e r o i d e s ) 及假小链双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i u mp s e u d o c a t e n u l a t u m ) 。其生长状况均以改良m r s 培养基为最佳，最适生长温度为3 7 ，最适起始p h 值为7 0 ，培养2 小时后进入对数期，1 2 小时进入稳定期，最适接种量分别为3 和2 。3 受试菌h - l o 、卜6 的粘附作用均受细菌浓度、粘附作用时间的影响。处于稳定期的细菌与c a c o - 2 细胞的粘附作用晟强，偏酸性的环境条件能够促进粘附的进行。胰蛋白酶及牛血清白蛋白分d 处理双歧杆菌h 1 0 、1 - 6 可导致粘附尔平的下降，说明受试菌体表面蛋白质可能是粘附素的主要组成，且粘附过程中有脂磷壁酸的参与。胞外多糖处理菌体后无显著影响。使用胰蛋白酶、过碘酸钠及各种耱对c a c o 2 细胞处理后，发现c a c o - 2 细胞的粘附素受体可能为糖蛋白结构。乳糖、鼠李糖及甘露糖能显著地降低受试菌株h 1 0 、1 - 6 的粘附，提示了粘附素受体中可能有与上述三种糖结构相似的糖结构。受试菌经8 0 c 水浴加热3 0 m i n 及2 0 w紫外线照射3 0 r a i n 分别灭活后，其粘附作用均显著下降，证明粘附素不耐热且对射线具有敏感性。4 通过与致病菌的共培养试验以及抑苗试验发现，双歧杆菌h 一1 0 、i - 6 对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌均具有显著的抑制性，主要通过其代谢产物中的有机酸来发挥其抑菌性能。通过测定乳酸脱氢酶以衡量细胞膜的受损程度，初步证明受试菌与致病菌对细胞的作用具有本质上的区别，能减缓金黄色葡萄球菌及大肠杆菌对细胞造成的损害。5 ，以金黄色葡钧球菌a t c c2 5 9 2 3 为质控菌，检测了戏歧秆菌h 1 9 、i - 6 对3 8 种抗菌药物的药敏性。结果显示，受试菌h 1 0 对青霉素类、喹诺酮类、氨基糖甙类、多肽类、磺胺类、四环素类、呋喃类抗菌药物表现出耐药性，对头孢类、大环内酯类、氯霉素、利福乎、克林霉素、磷霉素则表现出敏感性或中度药敏性。i - 6 对青霉素类、喹诺酮类、氨基糖甙类、多肽类抗菌药物基本上表现为耐药性对头孢类、大环内酯类、四环素类、呋喃类、氯霉素、利福平、克林霉素、磷霉素主要表现为敏感性或中度敏感性，对磺胺类则表现出不同的药敏性。受试菌h - 1 0 、1 - 6 中束发现有质粒存在，其药敏性不为质粒所编码。关键词：驮歧杆菌c a c o - 2 细胞，粘附性，筛选，相关特性a b s t r a c ti nt h i sp a p e r , w es c r e e n e db i f i d o b a c t e r i ap o s s e s s i n gt h ea b i l i t yt oa d h e r et oi n t e s t i n a le p i t h e l i a lc e l l sa st h et e s t e ds t r a i n s t h e i rb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，a d h e r e n c ef u n c t i o n s ，a n t i m i c r o b i a lp r o p e r t i e s ，a n t i b i o t i cs u s c e p t i b i l i t ya n dp l a s m i dd n aw e r ea l s op r e l i m i n a r i l yi n v e s t i g a t e di nt h eh o p eo fo b t a i n i n gs o m ev a l u a b l ek n o w l e d g et h a tc a l lb er e f e r r e dt oi nt h ed e v e l o p m e n to ff o o d - g r a d eb i f i d o b a c t e r i as t a r t e ra n dm i c r o e c o l o g i c s t h i sp a p e rm a i n l yf o c u s e do nt h ef o l l o w i n ga s p e c t s ：1 t w e n t y t h r e eb i f i d o b a c t e r i a ls t r a i n sw e r et e s t e df o rs u r f a c eh y d r o p h o b i c i t yw i t hm a t hm e t h o d ，t h i sp a p e ra l s oi n v o l v e dt e s t i n go nt h ea d h e r e n c eo f t h eb a c t e r i at oi n t e s t i n a le p i t h e l i a lc e l l sc a c o - 2i nv i t r oa tt h es a l n et i m e c e r t a i nc o r r e l a t i o nw a so b s e r v e db e t w e e ns u r f a c eh y d r o p h o b i c i t ya n da d h e r e n c ea b i l i t y s t r a i nh 1 0a n d1 - 6s h o w e dh i g ha d h e r e l l c et ot h ee p i t h e l i a lc e l l s t h ep r e s e n ts t u d yp r o v i d e dam e t h o df o rp r e l i m i n a r ys c r e e n i n go fb i f i d o b a c t e r i ap o s s e s s i n gh i g ha d h e r e n c et oi n t e s t i n a le p i t h e l i a lc e l l s 2 a c c o r d i n gt oi t sm o r p h o l o g y , t o g e t h e rw i t hp h y s i o l o g i ca n db i o c h e m i c a lt e s t s ，t h es t r a i nh - 1 0a n di - 6w e r ei d e n t i f i e da sb i f i d o b a c t e r i u ma s t e r o i d e sa n db i f i d o b a c t e r i u mp s e u d o c a t e n u l a t u mr e s p e c t i v e l y b a s t e r o i d e sh - 1 0a n db p s e u d o c a t e m d a t w ni - 6b o t hg r o w e db e t t e ri nm o d i f i e dm r sb r o t ht h a nm r sa n dp t y gb r o t h t h e i ro p t i m a lt e m p e r a t u r ea n di n i t i a lp hw e r e3 7 。ca n d7 0 t h e ye n t e r e dl o g a r i t h mp h a s ea f t e r 2h o u r so fi n o c u l a t i o n ，a n ds t a b i l i t yp h a s ea f t e r1 2h o u r s t h e i ro p t i m a li n o c u l a t i o nq u a n t i t yf o rg r o w t hw e r e3 m a d2 r e s p e c t i v e l y 3 t h ea d h e r e n c ec h a r a c t e r i s t i c s ，a d h e s i n ，r e c e p t o ra n dt h ee f f e c to fd i f f e r e n t l y - k i l l e db a c t e r i ao na d h e s i o nw e r es t u d i e di nt h i sp a p e nt h i sa d h e s i o no f s t r a i nh 一1 0a n d1 - 6t ot oc e l l l i n ec a e o - 2w e r ei n f l u e n c e db yb a c t e r i ac o n c e n t r a t i o na n dt h et i m et h a ti ti n t e r a c t e dw i t hc a c o - 2c e l l s b a c t e r i ao f t h es t a b i l i t yp h a s ea n dl o wp ha l s oh e l pt oi m p r o v et h ea d h e r e n c e t h ea d h e s i nm a i n l ye x i s t e di nt h es u p e m a t a n to ft h ec u l t u r e s w h e nb a c t e r i at e s t e dw e r et r e a t e dw i t ht r y p s i no rb s a ，t h e i rp e r f o r m a n c ed e s c e n d e dg r e a t l y t h i si n d i c a t e dt h a tt h ep r o t e i ns e c r e t e da n dt r a n s p o r t e dt oi t sc e l ls u r f a c eb yt h e s et w os t r a i n sm i g h tb et h em a i ni n g r e d i e n to f a d h e s i n ，a n dl t am a yb ei n v o l v e dw i t ht h i si n t e r a c t i o n n os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ew a so b s e r v e dw h e nt r e a t e dw i t he p s w h e nc a c o - 2c e i l sw e r et r e a t e dw i t ht r y p s i na n ds o d i u mp e r i o d a t eb e f o r ei n t e r a c t i o nw i t ht h eb i f i d o b a c t e r i a ，t h ea d h e r e n c ei n d e xs i g n i f i c a n t l yw e n td o w n ，s h o w i n gt h ea d h e s i nr e c e p t o ro fc e l ll i n ec a c o - 2m a yb ec o m p o s e db yg l y c o p r o t e i n s e v e r a ls a c c h a r i d e sw e r ea d d e dd u r i n gt h ei n t e r a c t i o n ，l a c t o s e ，r h a m n o s ea n dm a n n o s ec o u l dd e p r e s st h ea d h e s i o np e r f o r m a n c e s i ti n d i c a t e dt h a tt h ec o m p o s i t i o no ft h er e c e p t o rf o rb a c t e r i at e s t e dm a yb ei n v o l v e dw i t ht h e s et h r e es a c c h a r i d e sw h e n2 4 一h o u rc u l t u r eo f s t r a i nh - 1 0a n d1 - 6w e r ek i l l e db yh e a t i n ga t8 0 cf o r3 0 r a i na n de x p o s i t i o ni nu l t r a v i o l e tr a d i a t i o nf o r3 0 m i nr e s p e c t i v e l yb e f o r ea c t i n gw i t ht h ec e l l s ，t h e i ra d h e r e n c es i g n i f i c a n t l yd e s c e n d e d ，s i n d i c a t i n gt h a tt h ea d h e s i no ft h e s et w os t r a i n sw e r eh e a t s e n s i t i v ea n dr a d i a t i o n s e n s i t i v e 1 145t h ei n h i b i t o r ye f f e c t so fs t r a i nh 一1 0a n di - 6o ne n t e r o p a t h o g e ns t a p h y l o c o c c u sc l v 2 ”e u sa n de s c h e r i c h i ac o l iw e r ed e m o n s t r a t e db ys i m u l t a n e o u si n c u b a t i o na n da n t i m i c r o b i a lt e s t i n g t h e s ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e sw e r em a i n l yi n d u c e db yo r g a n i ca c i d sp r o d u c e db yb i f i d o b a c t e r i a t h er e l e a s eo fl d ho f c a c o - 2c e l l sw h i c hw e r ed i f f e r e n t l yt r e a t e dw i t hb i f i d o b a c t e r i aa n de n t e r o p a t h o g e n ，s u g g e s t e dt h a tt h ea d h e r e n c eo f b i f i d o b a c t e r i aw e r ee s s e n t i a l l yd i f f e r e n tw i t ht h o s eo fe n t e r o p a t h o g e n ，a n dt h ea d h e s i o no fs t r a i nh 一1 0a n d1 - 6c o u l dp r e v e n tt h eh a r m f u le f f e c to fs t a p h y l o c o c c u so u r e u sa n de s c h e r i c h i ac o i lo nc a c o - 2c e l l s w i t hs t a p h y l o c o c c u sa l 口e u sa t c c2 5 9 2 3a st h ec o n t r o lb a c t e r i u m ，t h ea n t i b i o t i cs u s c e p t i b i l i t yo f1 0a d h e s i v es t r a i n sw e r et e s t e db yt h ea g a rd i f f u s i o nm e t h o d t w e l v eg r o u p so fa n t i b i o t i c s ，t h i r t y - e i g h tk i n d si nt o t a l ，w e r ei n v o l v e di nt h et e s t i n g s t r a i nh 一1 0s h o w e di t sa n t i b i o t i cs u s c e p t i b i l i t ya s ：r e s i s t a n tt op e n i c i l t i ng r o u p ，q o i n o i i n eg r o u p , a m i n o g i y c o s i d eg r o u pp e p f i d eg r o u p ，s u l p h o n a m i d eg r o u p ，e t m c y c l i n eg r o u pa n df u r a ng r o u p ，w h i l es h o w i n gs e n s i t i v i t yo rm o d e r a t es e n s i t i v i t yt oc e p h a l o s p o f i ng r o u p ，m a c r o l i d eg r o u p ，c h l o r a m p h e n i c o l ，r i f a m p i n ，c l i n d a m y c i na n df o s f o m y c i n s t r a i n1 - 6s h o w e di t sa n t i b i o t i cs u s c e l o t i b i l i t ya s ：b a s i c a l l yr e s i s t a n tt op e n i c i l l i ng r o u p ，q u i n o l i n eg r o u p ，a m i n o g l y c o s i d eg r o u pa n dp e p t i d eg r o u p ，w h i l es h o w i n gs e n s i t i v i t yo rm o d e r a t es e n s i t i v i t yt oc e p h a l o s p o r i ng r o u p ，m a c r o l i d eg r o u p ，t e t r a c y c l i n eg r o u p ，f u r a ng r o u p ，c h l o r a m p h e n i c o l ，r i f a m p i n ，c l i n d a m y c i na n df o s f o m y c i n ，a n dd i f f e r e n ts h s c e p t i b i l i t yt os u l p h o n a m i d eg r o u p ，n op l a s m i dd n aw a sf o u n di nb i f i d o b a e t e r i ah 一1 0a n di - 6 i ti n d i c a t e dt h a tt h er e s i s t a n c et ot h ea n t i b i o t i c sw a s n te n c o d e db yp l a s m i d sa n dt h ep o s s i b i l i t yo fi n t e r c e l l u l a rt r a n s f e r r i n go f r e s i s t a n c eg e n e sw b se x c l u d e d k e y w o r d s ：b i f i d o b a c t e r i a , c a c o - 2c e l ll i n e ，a d h e r e n c e , s c r e e n i n g , r e l a t e dc h a r a c t e r i s t i c sl l ib b s ac f ue d t ae p sl a bl d hl 1 ap b sr p m英文缩写表a b b r e v i a t i o nb i f i d o b a c t e r i u mb o v i n es e 2 1 ma l b u r a i nc o l o n y - f o r m i n gu n i te t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i de x o p o l y s a c c h a r i d el a c t i ca c i db a c t e r i al a c t i cd e h y d r o g e n a s el i p o t e i c h o i ca c i dp h o s p h a t eb u f e r e ds a l i n er e v o l u t i o n sp e rm i n u t e烈歧杆菌牛血清白蛋白菌落形成单位乙二胺四乙酸胞外多糖乳酸菌乳酸脱氢酶脂磷壁酸磷酸盐缓冲液每分钟转速( 转分)独创性声明f7 7 4 4 0 0本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名灞伟重于时间：j 甲上年占月f 4 日关于论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名溉苇重手导师繇务季互时间：一上年月f 4e 1鼬试：；6b ? 谩第一章绪论1 1 研究的目的和意义随着国民经济的快速发展以及国民生活水平的提高，人们追求的不仅是基本层次的饮食，而开始拥有着更加成熟的消费观，思考如何更好地通过科学地摄取生物活性制品来提高自身机体的健康水平，从而达到更好地治病防病的目标。双歧杆菌作为存在于正常人及动物消化道内的正常菌群中的一类重要生理性细菌，它与人终生相伴，但呈动态变化，双歧杆菌的存在和含量是人体健康的标志之一，具有多种显著的保健作用，与人体及动物体的健康水平息息相关。作为一种优怠的菌种，双歧杆菌是相关学者开展研究比较早的一种活菌制剂，也是当今国内外研究最热门的益生菌制剂之一。双歧杆菌是人体内的正常菌群，可以拈抗有害菌的入侵，调节消化道内菌群的平衡，从而达到治疗与保健的目的。细菌对肠道上皮细胞的粘附正是定植及增生的第一步。双歧杆菌在肠道中的粘附与定植对进一步维持肠道菌群的微生态平衡起着主导作用，外源双歧杆菌能否在肠道中粘附及定植亦是评价益生菌制剂效果的重要指标之一。现代研究表明，大部分病原菌的粘附机制较为清楚，与之相对应的却是益生菌粘附机制的不明确，而对双歧杆菌的粘附机理的研究还处于起步阶段，包括其粘附素、粘附素受体、粘附的具体过程以及粘附后如何发挥对致病菌的拮抗作用仍然不甚清楚。而菌株在肠道内对抗菌药物所反映出的敏感性也在一定程度上影响着肠道内的微生态平衡。本研究正是在这种背景f 开展t 作的。本研究的目的立足于对双歧杆菌在肠道内的粘附特性、粘附初步机制、对致病菌的拈抗作用以及受试苗对i 临床常用抗菌药物的药物敏感性进行了探讨，另外，还检测分析了受试菌的质粒d n a 。这将为阐明双歧杆菌在肠道内的作用机制及其进一步应用于微生态制剂提供理论依据，对促进我国微生态制荆事业的发展具有着重要的意义。1 2 研究现状及进展1 2 1 双歧杆菌的生物学特性及其生理功能双歧杆菌为一种革兰氏阳性杆菌，于1 8 9 9 年由t i s s i e r 首次分离，迄今已近一个世纪。在这近一百年的历史进程中，坝歧杆菌的研究历经了发现、认识、应用三个阶段。它是人体肠道内的正常菌群之一，具有多种对人体有益的生理功能。双歧杆菌是人类的生理性细菌，它与人终生相伴，但呈动态变化，双歧杆菌的存在和含量是人体健康的一个标志。唰歧杆菌具有多方面的生理效应，各种临床资料表明；它可以调整肠功能的紊乱，调整腹泻与便秘；可起磁向调节功能，降低血内毒素，降低胆固醇浓度，对防止动脉硬化和高缸压起一定作用；抗肿瘤作崩，提供机体免疫功能和延年益寿作用。双歧杆菌具有有病治病、未病防病、无病保健三重效应，其制品在国内外越来越受到消费者的青睐( 汤钦林等，1 9 9 7 ) 。也正因为如此，双歧杆菌被广泛地作为微生态制荆投入市场，同时，它在发酵食品中的应用也不胜枚举。中国农业大学硕士学位论文第一章绪论1 2 2 双歧杆菌对肠道细胞的粘附特性研究粘附( a d h e s i o n ) 是指细菌与机体肠上皮细胞通过生物化学作用产生的特异性粘连。粘附是定植的第一步，不能粘附于肠道上皮细胞表面的细菌，只能作为过路菌，而不能在肠道内定植并进一步增生。粘附具有增加定植抗力和防止易位的重要生理意义。此外，益生菌的定植还使宿主具有调整菌群平衡、控制内毒索血症、抗肿瘤、抗衰老、免疫和营养等生理功能( 康白，1 9 9 8 ) 。1 2 2 1 细菌表面特性与粘附作用的关系粘附是细菌与宿主细胞相互作用的第一步，双歧杆菌在肠道中的粘附及定植，对维持肠道菌群的结构及功能起主导作用。而外源的双歧杆菌能否在肠道粘附和定植是评定益生菌制剂效果的主要指标之一。疏水作用被认为是影响细菌一宿主间反应的因素之一，与多种粘附现象如组织表面的粘附、塑料表面的粘附、细菌间的集聚等均有关( j o n e sd s e t a l ，1 9 9 1 ) 。细菌的疏水性源于菌体表面静电荷、极性和非极性残基的相对分布。非极性残基能够增强细菌对非极性溶剂的亲和力。测定细菌在恒定电场下的电泳迁移率则可以反映细菌表面净电荷的分布。将不同种双歧杆菌菌悬液分别与十六烷或二甲苯混合，测定其水相的吸光度，可以反映其与粘附力密切相关的疏水性大小( 蓝景刚等，2 0 0 2 ) 。部分研究提示，可经过测试菌株的疏水能力的人小以初步推断其粘附能力的高低。p e r e z 等检测了从婴儿粪便及市售发酵乳制品中分离得到的双歧杆菌菌株的表面性质，试验结果证明了疏水性在细菌发挥粘附作用和自凝集反应中均起着重要的作用，相应地。疏水性高的菌株对肠道上皮细胞也具有着较高的粘附能力，并且这种关联呈现出一定的依赖性，即双歧杆菌的疏水性与其对肠道上皮细胞的粘附力成正比。由此，首次肯定了检测菌株的疏水性可作为筛选高牯附力的双歧杆菌菌株的一项初筛指标( p a b l o f p e r e ze t a l ，1 9 9 8 ) 。w a d s t r o m 等从新鲜屠宰的六月龄的猪的小肠中分离得到野生型的乳杆菌菌株并测定了其疏水性以及对肠道上皮细胞的粘附力，发现疏水性强的菌株对猪源肠道上皮细胞有强的粘附力，相比之下，亲水性的菌株其粘附水平表现较低。此结果也验证了利用疏水性来筛选具粘附力的菌株的有效性( t w a d s t r o me la l ，1 9 8 7 ) 。近年来o c a n a 和c g u s i l s 等人的研究报告( o c a n avs e a ，1 9 9 9 ；c g u s i l se a l ，2 0 0 2 ) 亦有力地证明了从动物体内分离得的定植于体内的乳酸杆i 窘菌株具有较高的疏水性。但是，在验证菌株疏水性与其粘附力的研究中，也有与此不一致的意见。张振玲等分别检测了人粪便中分离得到的双歧杆菌的疏水性及其对肠道上皮细胞的粘附能力，发现部分菌株的疏水性与其粘附细胞的能力无直接相关性，但却与糖源有关，且其疏水能力可随温度的升高而下降。但其他菌株却在表现出极强的疏水性的同时义表现出对肠上皮细胞的高度枯附力( 张幼玲等，1 9 9 9 ) 。r e i d 等在1 9 9 9 年的研究报告也提示了在选择对泌尿生殖道细胞具粘附性的细胞时，亲水性的乳杆菌具有一定的优势( g r e g o r r e i de t a l ，1 9 9 9 ) 。双歧秆菌的疏水性可能具有一定的菌株特异性。p e l l e f i e r 等在1 9 9 7 年研究微生物对溶剂的粘附作用时，证明了在一一定稗度上或者在特定的实验条1 ：i ：下，乳杆菌菌体细胞的表面物化特性具有一定的种属相关性，而此相关性可能由细胞壁的化学组成上的差异造成( c h r i s t o p h e p e l l e t i e re l a l ，1 9 9 7 ) 。而关于双歧杆菌的相关研究涉及较少。1 2 2 2 双歧杆菌粘附肠道上皮细胞的相关特性双歧杆菌对肠道上皮细胞的粘附具有以一f j l 个特点：时间及浓度的依赖性( o pd e nc a m phj m2酣以，1 9 8 5 ；郭骏，1 9 9 8 ；陈军等，2 0 0 2 ) ；菌株差异性及种属依赖性( m a r i e - f r a n c o i s eb e m e te ta l 。1 9 9 3 ) ；宿主特异性( gw t a n n o c ke t a l ，1 9 8 2 ) 和可逆性( h u u bj m ，1 9 8 5 ) 。学者们采用了不同的菌株和细胞模型，对双歧杆菌与肠道上皮细胞间的粘附开展了研究( h u u bj m 1 9 8 5 ：e l os m 1 9 9 1 ；t u s m o l ae m ，1 9 9 9 ) ，发现不同双歧杆菌菌株对肠道的粘附情况差异较大；丽有牯附特性的双歧杆菌黏掰 能力与所作用的肠段有关；证明了粘附作用与益生菌能否正常发挥生理作用是密切相关的，菌株粘附能力的强弱能直接影响其作为活苗制剂在肠道内的存活时间、能否定植、是否能进一步发生增殖、以及如何发挥应有的积极作_ h j 。国内对双歧杆菌粘附作用研究较多的是郑跃杰等人，他们在1 9 9 7 年对青春双歧杆菌1 0 2 7 、1 1 2 4 和体外肠上皮细胞系l o v o 细胞间的粘附进行研究，用激光共聚式细胞仪研究了f 1 t c 标记的双歧杆菌( 青春双歧杆菌) 对体外培养肠上皮细胞的粘附，对双歧杆菌的粘附机制进行了初步的探讨( 郑跃杰等，1 9 9 7 a 。b ) 。为追求试验结果在体内外的效果基本一致，用于研究细菌粘附作用的体外模酗应具有典型代表性，除了肠道上皮细胞系以外，近年来已有所创新。l a u x 等建立的固定化肠粘液模型具有灵敏度高、重现性好、操作技术简单等特点( l a u x d c e t a l ，1 9 8 4 ) 。j i n 等亦采用此方法进行了屎肠球菌( e r l e r o c o c c u sf a e c i u m ) 对人肠杆菌1 ( 8 8 的附着抑制试验( j i nl z e l 以，2 0 0 0 ) 。s a t uv e s t e r l u n d 等则采用了c l s m ( c o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y ) 技术首次实现了对肠道细菌的实时三维观察( s a r av e s t e r l u n d ，e ta l 2 0 0 5 ) 。1 2 2 2 1 对双歧杆菌的粘附作用造成影响的几种因素粘附这特异性结合的完成需要粘附的双方都处于生物活性状态。粘附需要一定的菌浓度、温度及时间。细菌所处的不同生长阶段、细菌培养基的p h 值与培养基本身的成分对粘附也具有一定的影响。胰蛋白酶和过碘酸氧化物处理菌体表面，会对菌株的粘附能力产生影响( 郭骏，1 9 9 8 ：葛常辉等，】9 9 7 ) 。抗菌药物作为影响肠道微生态平衡的一个主要因素己得到广泛的认识。郑跃杰等观察了八种抗生素在次晟低抑菌浓度下对烈歧杆菌和体外培养肠上皮细胞问粘附的影响，发现均能显著地抑制双歧杆菌对肠道上皮细胞的粘附，此结果提示了抗生素抑制双歧杆菌的粘附可能是其引起肠道微生态失衡的一条重要途径( 郑跃杰等，1 9 9 6 ) 。1 2 2 2 2 双歧杆菌的粘附索及粘附受体的观察目前人们对乳酸菌，特别是双歧孝；1 = 菌的粘附机制的研究仍处于起步阶段，绝大多数采用了体外细胞培养方法，常用的细胞株包括：c a c o 2 细胞、大肠癌细胞系c c l 1 8 7 细胞、h e p 2 细胞、h t - 2 9 细胞和l o v o 细胞。目前被广泛接受的是粘附素一受体理论，此理论被用丁解释双歧杆菌及其他乳酸菌对于肠道上皮细胞的粘附作用。借鉴下对病原菌粘附机制的研究，许多研究结果表明，细胞表面的碳水化合物或者碳水化合物成分在细菌识别、粘附、结合、定植等一系列的过程中具有决定性的作用，即细菌的粘附作用被认为是通过牯附素来具体实现的。同时，牯附现象义涉及了细胞的疏水性与亲水性、静电的相吸及相斥、特异性的受体成分等。在粘附这一过程中，细菌的粘附素进一步与细胞上相应的特异性受体结合- 细菌籍此定植f 米后便开始不断的增殖，并继而对宿主产生影响。革兰氏阳性细菌细胞壁中含有丰富的脂磷壁酸( l t a ) 。双歧杆菌作为一种革兰氏阳性细菌，对它的粘附素的研究绝大多数集中在脂磷壁酸上。最初认为双歧杆菌是通过脂磷壁酸与肠粘膜上中国农业大学硕士学位论文第一章绪论皮细胞结合。h u u bl m 等人提出u a 中的脂肪酸部分是双歧杆菌粘附于肠上皮细胞的主要介导物质( h u u bj m ，1 9 8 5 ) 。但b e m e t 等人用胰蛋向酶对双歧杆菌或其耗尽培养液上清进行处理后，发现双歧杆菌的粘附力几乎丧失，进一步研究显示高温能降低其粘附力，由此认为烈歧杆菌的粘附素可能为一种不耐热的蛋白质样物质，此种物质存在于细菌细胞壁及耗尽培养液中( m a r i e f r a n c o i s eb e r n e te la 1 ，1 9 9 3 ) 。在以后的研究中亦得到了进步的证实，郑跃杰等用激光共聚式细胞仪研究了f i t c 标记的双歧杆菌对体外培养的肠上皮细胞的粘附时发现，双歧杆菌的粘附素可能是一种蛋白质，由细菌分泌至培养液中，主要存在于耗尽培养液上清中( 郑跃杰等，1 9 9 7 a ) 。通过对双歧杆菌粘附素的提取、纯化、鉴定可得到进一步的证实，邦跃杰等首次采用硫酸铵沉淀，凝胶过滤和离子交换色谱法，从双歧杆菌耗尽培养液上清中纯化出一种相对分子量为1 6 1 0 3 d a l 的蛋白质，为进步研究双歧杆菌粘附素提供了初步资料( 郑跃杰等，1 9 9 9 ) 。日本学者f u j i w a r a 等也于1 9 9 9 年从双歧杆菌培养上清中分离出一种相对分子质量为5 2 0 0 0 d a l 的蛋白质( f u j i w a r as e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。以上的研究结果均提示双歧杆菌存在分泌型的蛋白质样粘附索成分，但该成分对肠道上皮细胞生物学活性的影响尚不清楚。因此，钟世顺等使用了3 h t d r 掺入法、流式细胞仪和荧光染色等方法观察了双歧杆菌分泌型粘附素对脂多糖和h 2 0 2 体外调节肠上皮细胞增殖和凋亡的影响，证实了粘附素能抑制脂多糖和h ：0 2 对肠上皮细胞的损害作用，有利于维持肠上皮细胞增殖与凋亡的平衡( 钟世顺等，2 0 0 4 ) 。细菌除具有粘附素外宿主细胞必须具各相应的粘附素受体才能完成两者间的特异的粘附过程。郑跃杰等人通过实验证实，l o v o 细胞经胰蛋白酶和过碘酸钠处理后，与双歧杆菌的粘附明显降低，因为过碘酸钠能裂解糖的羟基基团间的c c 键，可能破坏粘附素受体。可以证实双歧杆菌粘附索能识别肠上皮细胞上特异的糖蛋白。用各种糖类进行抑制实验的结果进一步表明，双歧杆菌粘附素的受体可能与d 一甘露糖有关。这一结果与多数病原菌粘附素受体的研究结果一致，即细菌粘附素主要识别肠上皮细胞或粘液中的特异糖类或糖蛋白，由此推断肠上皮细胞双歧杆菌粘附素受体为糖蛋白，可能与甘露糖有关，因为d 一甘露糖能抑制两者的粘附，葡虢糖、乳糖、山梨糖、蔗糖及d 果糖不能抑制粘附( 郑跃杰等，1 9 9 7 c ) 。1 2 2 2 3 灭活的双歧杆菌的粘附作用传统观点认为只有活菌才具有粘附能力，但是经过试验发现有着不一致的意见。伦永志等研究了用不同方法如紫外线照射、加热等使之灭活的益生菌对肠粘液的粘附性，结果显示出被灭活的益生菌仍具有粘附能力，甚至对粘附于人大肠癌c c l 2 2 9 细胞后对肠致病性大肠埃希菌e p e c的粘附仍然具有抑制作用，但机理如何尚未揭晓( 伦永志等，2 0 0 3 ) 。邢咏梅等研究了活菌和灭活菌两种生物状态的肠道主要益生菌德氏乳杆菌、双歧杆菌和肠球菌对肠粘膜上皮细胞粘附性及其对肠道几种常见病原菌的粘附拮抗效应。通过排除实验、竞争实验和替代实验研究了两种生物状态益生菌对侵袭性人肠埃希菌、产毒性人肠埃希菌和痢疾志贺苗的粘附拮抗效应，应用平板扩散法观察了益生菌的代谢乏液对上述肠道病原菌的抑制能力。结果显示双歧杆菌经灭活后对细胞的粘附性与活菌相比无显著性差异，但在两种生物状态下对肠道致病菌均具有粘附拮抗作用。过滤后的双歧杆菌代谢乏液对受试致病菌均具有较明显的抑制作用，经4 2 、6 5 。c ；f n1 0 0加热不影响其抑菌活性( 邢咏梅等，2 0 0 4 ) 。由此可见，蛾歧杆菌与肠道上皮细胞之间的粘附作用是其粘附素与细胞的祜附索受体特异性结合的过程。粘附作用可引起宿主细胞发挥一系列的生物学效应，例如针对致病菌的生物屏障作4用，亦可以用于解释不同的双歧菌株在体内停留时间及功效的差异性。希望在进一步的研究中，能够阐清粘附的机制，明确参与成分，从而可以人为地制各出具有高粘附性的菌株而造福人类。1 2 3 双歧杆菌对致病菌的拮抗作用大肠是各种细菌的理想居住她，大肠下端约有1 0 0 多种细菌菌群，其浓度可达l o “个穗大便。在这些细菌的组成中，有些是有益菌，有些则是病原菌，它们按照一定的菌群比例定植于肠壁上。正常情况下，有益菌尤其是双歧杆菌在数量上占着明显的优势，使菌群间保持着一种共生的生态学动态平衡。若菌群比例失调如双歧杆菌数量减少则会导致人体出现相应的病变，同样的，当人体健康状况发生变化，如大量使用抗菌类药物时将导致肠道菌群的平衡被打破，其种类及数量均会发生明显变化，从而对机体有着不利影响。作为微生态制剂所起的主要作用，也就是扶植正常微生物菌群、发挥生物拮抗作堵、维持肠道内的生态平衡。目前双歧杆菌作为活菌制剂在国内外的应用非常普遍，因此研究双歧杆菌对致病菌的生物拮抗作用对于其相关制剂的开发应用及安全性有着重要的指导意义和价值。研究表明，双歧杆菌作为肠道中主要的生理性细菌，对人体生理功能的调节是通过生物屏障与化学屏障来阻l e 并医治各种致病菌与条件致病菌在肠道的定植、入侵及生长繁殖( 康白，1 9 9 8 ) 。致病菌其致病过程首先需要细菌附着在致病区域的活细胞上，而这一附着过程主要是通过其表面的凝集素特异性地识别活细胞上的糖或糖蛋自来完成的此作用被称为凝集素介导作用( s h a r o nn ，1 9 8 7 ) 。双歧杆菌通过粘附素与肠牯膜上皮细胞受体发生粘附作用，定植于肠道上皮细胞表面后，与其它厌氧菌起构成膜菌群，一方面起占位性保护作用，通过分泌粘附素一类的物质以阻止致病苗与肠粘膜受体结合，保护肠粘膜免受病原菌的粘附入侵；另一方面，通过产生有机酸、过氧化氢或细菌素抑制病原菌的生长繁殖，从而发挥生物学屏障作用，即“竞争性排斥作用”( c o m p e t i t i v e e x c l u s i o n ) ( p i v n i c k h e l a l ，1 9 8 2 ) 或“位阻效应”( j i n l z e l a 。，2 0 0 0 ) 。双歧杆菌粘附丁= 二肠道上皮细胞表面，竞争性地抑制病原菌的进一步粘附及定植是其发挥生物学屏障功能的重要机制之一，也是其能够作为益生菌能有效地维持肠道菌群平衡的原因之一( f u l l e rr ，1 9 8 9 ) 。具有抑菌特性的双歧杆菌菌株可作为微生态制剂，应用于治疗因肠道致病菌所引起的肠道紊乱( s a l m i n e ns e l a l ，1 9 9 6 a , b ；a l v a r e z - o l m o s m ，2 0 0 1 ) 。国内外研究均表明具有粘附性的乳酸菌可有效地抑制病原菌对肠道的粘附作用，从而加速把致病菌排山体内的过程( l e e yk p fa ，2 0 0 0 ) 。通过研究两歧双歧杆菌、鸡自痢沙门氏苗和鼠伤寒沙门氏菌与肉