（食品科学专业论文）乳铁素的免疫调节作用机理的研究.pdf

摘要牛乳铁素是牛乳铁蛋白在酸性环境下经胃蛋白酶作用n 端释放的一段由2 5 个氨基酸组成的多肽，具有抗菌、抗病毒、抑制肿瘤细胞生长、调控基因表达、调节免疫等功能，其在食品、保健品、医药等行业具有广阔的应用和开发前景。本研究根据免疫调节功能性食品的评价指标对乳铁素的免疫调节作用进行了评价，并进行了分子水平的研究。在体外实验中，采用m t t 法检测乳铁素对外周血单核细胞和脾淋巴细胞的免疫刺激作用，结果显示，9 5 6 纯度乳铁素和4 0 6 纯度粗分离乳铁素都具备促进t 、b 淋巴细胞增殖的作用，但是把9 5 6 纯度乳铁素配成不同浓度时，发现并不是浓度越高起刺激作用越大，而是在1 0 0 l g m l 时达到最大值。通过体内实验，对脾脏、胸腺、细胞免疫，巨噬细胞吞噬功能以及体液免疫的调节作用进行了评价，结果表明，牛乳铁素对免疫低下小鼠脾脏、胸腺均具有保护作用，可明显提高免疫低下小鼠巨噬细胞吞噬功能，可以明显增强免疫低下小鼠抗体分泌细胞分泌功能，提高血清溶血红素的含量，乳铁素具有显著增强细胞免疫、体液免疫的作用。通过分子水平的研究，对i l 2 、i l 一4 、i l 一6 、i l - 1 0 以及t n f q 的调节作用进行了评价，结果显示，乳铁素对也2 具有显著影响，而且是以4 0 p g m l 乳铁素对也2 影响最大。在小鼠免疫低下状态，灌胃三个小时时，乳铁素首先引起炎症因子t n f a 浓度的升高，而此时i l 1 0 作为保护型抗炎因子浓度出现极大的提高从而抑制t n f a 带给机体的影响，而i l 1 0 的极大浓度抑制了同属于t h 2 类细胞因子的i l 4 、i l 6 的分泌。研究表明乳铁素既可以在短期内对机体产生重要影响，也可以在长时期的使用过程中对机体产生重要影响，均可以起到免疫调节功能。关键词：牛乳铁素；免疫调节；体外实验；体内实验；细胞因子a b s t r a c tt h e r ea r ew i d ea p p l i c a t i o na n dd e v e l o p m e n tp r o s p e c t si nf o o d ，h e a l t hp r o d u c t s ，m e d i c i n ea n do t h e ri n d u s t r i e s a c c o r d i n gt ot h es t u d yo fi m m u n er e g u l a t o r yf u n c t i o no ft h ee v a l u a t i o ni n d e xf o rf o o dl a c t o f e r r i c i ni nt h ei m m u n er e g u l a t i o no ft h ee v a l u a t i o n ，c o n d u c t e dt h es t u d yo nt h em o l e c u l a rl e v e l i nv i t r o ，u s i n gm t td e t e c t e dl a c t o f e r r i ni nt h ep e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc e l l sa n ds p l e e nl y m p h o c y t ei m m u n es t i m u l a t i o n ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a t9 5 6p e r c e n to fp u r i t yt h el a c t o f e r r i c i na n d4 0 6p e r c e n tf r o mt h er o u g h - l a c t o f e r r i nh a v et h er o l eo ft h ep r o m o t i o no ft ，bl y m p h o c y t ep r o l i f e r a t i o n ，b u tt h e9 5 6p e r c e n to fl a c t o f e r r i c i nm a t c hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n ，t h eh i g h e rt h ec o n c e n t r a t i o nw a sf o u n dn o ts t i m u l a t eg r e a t e rr o l e ，b u ti nt h e10 0 “g m la c h i e v e da tt h em a x i m u m i nv i v ot h r o u g ht h es p l e e n ，t h y m u s ，t h ei m m u n ec e l l s ，m a c r o p h a g e sa n dh u m o r a li m m u n ef u n c t i o ne n g u l f e dt h er e g u l a t i n gr o l eo ft h ee v a l u a t i o n r e s u l t ss h o wt h a tt h el f c i no nt h el o w e ri m m u n em i c es p l e e n ，t h y m u sh a v eap r o t e c t i v ee f f e c t ，c a ns i g n i f i c a n t l yi m p r o v et h el o w e ri m m u n em i c em a c r o p h a g ep h a g o c y t o s i s ，c a ns i g n i f i c a n t l ye n h a n c et h ei m m u n ea n t i b o d y - p r o d u c i n gc e l l si nm i c el o w e rs e c r e t i o n ，i n c r e a s e ds e r u md i s s o l v e dh e m o g l o b i nc o n t e n to fl a c t o f e r r i nh a ds i g n i f i c a n t l ye n h a n c e dc e l l m e d i a t e di m m u n i t y ，t h er o l eo fh u m o r a li m m u n i t y t h es t u d y ，b yt h em o l e c u l a rl e v e l ，w a sr e l a t e dt ot h ei l 一2 ，i l 4 ，i l 6 ，i l - 10a n dn 订一0 【i nt h er e g u l a t i n gr o l eo ft h ee v a l u a t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tl a c t o f e r r i ni nt h ei l 一2h a ss i g n i f i c a n ti n f l u e n c e ，a n d4 0 i xg m ll a c t o f e r r i na f f e c t e di l 2t h em o s t l o w e ri nm i c ei m m u n es t a t u s ，g a v a g et h r e eh o u r s ，l a c t o f e r r i c i nc a u s e di n f l a m m a t i o no ft h ef i r s tf a c t o rt n f 。ac o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e d ，a n da tt h i st i m ea s t h ep r o t e c t i o no fi l 10 - t y p ea n t i - i n f l a m m a t o r yf a c t o r sg r e a t l yi n c r e a s et h ec o n c e n t r a t i o nt oi n h i b i tt n f ab r i n gt h ei m p a c to ft h eb o d y ，a n dt h ei l 一10i n h i b i t e dt h eg r e a tc o n c e n t r a t i o no ft h es a m et y p eo ft h 2c y t o k i n e si l 一4 ，i l 一6s e c r e t i o n r e s e a r c hs h o w st h a tl a c t o f e r r i c i nb o t hi nt h es h o r tt e r mc a nh a v eam a j o ri m p a c to nt h eb o d y ，c a na l s oh a v eam a j o ri m p a c to nt h eb o d yi nl o n g - t e r mp r o c e s s ，p l a y i n gaf u n c t i o n a li m m u n er e g u l a t i o n k e yw o r d s ：b o v i n el a c t o f e r r i c i n ；r e g u l a t i o no ft h ei m m u n e ；v i t r ot e s t ；v i v ot e s t ：c y t o k i n e s论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权声明论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权声明一、发表论文刘传国，胡志和，李娜含乳铁素酸乳制品对淋巴细把增殖的影响食品科学，2 0 0 7 ，2 4 ( 1 0 ) ：5 0 4 5 0 6 二、参加科研情况研究生期间参与天津市科技支撑项目( 编号：0 7 0 0 6 6 ) “婴幼儿和老年专用免疫调节乳品的研究与开发 。三、学位论文使用授权声明本人同意授权天津商业大学将论文的全部内容或部分内容提供给有关方面，编入中国学位论文全文数据库、中国优秀博硕士学位论文全文数据库、天津商业大学博硕士学位论文全文数据库等有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅或借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。虱s名v冲洲第一章前言第一章前言弟一旱月i j园1 1 课题的研究背景1 1 1 乳铁素( l a c t o f e r r i c i n ) 的发现乳是营养丰富、各成分配比合理、生理功能比较全面的理想食品，是新生哺乳动物的主要食物来源，也是成年人饮食的一个重要组成部分。天然牛初乳富含蛋白质，头乳蛋白质浓度可以达到常乳的4 - - 5 倍，脂肪和糖含量较低，铁含量为普通乳汁的1 0 - - - 1 7 倍，维生素a 和维生素d 分别为成熟乳汁的3 倍和1 0 倍；初乳具有独特生理功能，初乳的蛋白质大多数为免疫球蛋白，它能够形成抗体，与病原微生物及毒素等抗原结合，在哺乳动物新生幼仔滋生免疫系统发育成熟之前，可以保护其免受病原侵袭【l 】。而且初乳中含有大量的纤维连结蛋白和许多功能性组份，如免疫球蛋白( i m m u n o g l o b u l i n ) 、乳铁蛋白( l a e t o f e r r i n ) 、乳过氧化物酶( l a c t o p e r o x i d a s e ) 、溶菌酶( l y s o z y m e ) 、胰岛素样生长因子( i n s u l i n l i k eg r o w t hf a c t o r ) 、转化生长因子( t r a n s f o r m i n g 研o 、砒f a c t o r ) 、富含脯氨酸多肽( p r o l i n e r i c hp o l y p e p t i d e ) 和表皮生长因子( e p i d e m a lg r o w t hf a c t o o 等。它们对婴儿生长发育，增强免疫，预防疾病具有无可替代的作用。其中的牛乳铁蛋( l a c t o f e r r i n ，l f ) 是一种相对分子质量约为8 0 0 0 0 d a 的铁结合性糖蛋白，主要存在于哺乳动物的各种外分泌物中，如乳汁、眼泪、唾液等。乳汁，尤其是初乳中l f 的含量很高，如牛初乳中的l f 质量浓度约为l g l 。l f 具有许多独特的生物学功能：增强铁的传递和吸收；广谱的抗菌性；免疫作用；抗氧化作用；促进肠道菌群的平衡；作为生长因子；抗炎症；抗病毒；抗癌症作用等【2 】。乳铁素( l a c t o f e r r i c i n ，简写为l f c i n ) 是乳铁蛋白在酸性环境下经胃蛋白酶作用n 端释放的一段多肽【玉4 1 ，经过研究发现，l f c i n 与乳铁蛋白的功能密切相关，除了不能结合铁离子之外，l f c i n 具备乳铁蛋白的所有生物学活性。l f c i n 不含稀有氨基酸和外源化学成分，是一种健康安全的产品，而且同其他抗菌肽一样具有广谱杀菌活力，此外可能还有抑制病毒和真菌增殖、抑杀肿瘤细胞等多种生物学功能，而对真核细胞几乎没有毒性【5 1 。目前，在众多的抗菌肽中，牛乳铁素是独一无二的，因为它除了具有抗菌能力以外，还具有强大的生物学功能及安全性等优点，显示了其替代抗生素的巨大潜能，因此，吸引了国内外众多学者对牛乳铁素的研究。l f c i n 首先是由b e l l a m y 6 】在牛乳中发现，此后相继在人、小鼠、山羊、猪【7 矗9 】等动第一章前言物乳铁蛋白中证明存在l f c i n 的同源物。在各种l f c i n 中，牛的l f c i n ( l f c i n b ) 抗菌活性最强，而人的l f c i n ( l f c i n h ) 来源特殊，因此成为主要的研究对象。1 1 2 乳铁素的结构以及理化性质1 1 2 1l f c i n b 的一级结构l f c i n b 来源于牛乳铁蛋白的第1 7 , - - , 4 1 位氨基酸，由2 5 个氨基酸残基组成，氨基酸顺序为：p h e - l y s - - c y s - a r g - a r g - - t r p - - g l n - - t r p a r g m e t - l y s - - l y s - - l e u - - g l y - a l a p r o - s e r - i l e - - t h r - c y s v a l - a rg - a r g a l a - p h e i o i ，包括5 个t r p 、3 个l y s 和多个芳香族氨基酸残基，具有强碱性，p i 8 5 ，分子量3 1 0 0 d a ，其中的2 个c y s 通过形成分子内二硫键使l f c i n b 分子呈不完全的桶状，但研究表明，二硫键在抗菌过程中作用不大，被破坏后l f c i n b 的抗菌活性并不减弱【l l 】。l f c i n h 来源于人乳铁蛋白的1 - 4 5 位氨基酸，1 1 与1 2 位氨基酸残基之间的肽键断裂，两个肽片段靠二者间的二硫键连接成为一个分子。在l f c i n 的一级结构中，1 8 个氨基酸残基靠一个二硫键结合而形成一个环，而且a n d e r s e n 等研究发现，分子的环状结构( 图1 1 ) 对l f c i n 的抗病毒活性十分重要，l f c i n只有保持环状结构才具有抗病毒的活性，二硫键的缺失会对引起其抗病毒活性的丧失。蚴棚矿腿、霉警l f c l nb一嚣曩f k c - , t - a - c v r 眦图1 1l f e i n 的一级结构和二硫键形成的环状结构f i g 1 1l f c i np r i m a r ys t r u c t u r ea n dt h er i n go fd i s u l f i d eb o n df o r m a t i o n2_ g 参s i tt ，kk第一章前言其中的1 1 个氨基酸具有与完整的l f c i n b 相同的抗菌活性，而且这1 1 个氨基酸残基中富含t r p a r g 的区域( r r w q w r ) 是保持抗菌活性所必须的，属于保守氨基酸序列【1 2 1 。1 1 2 2l f e i n b 的空间结构l f c i n b 在乳铁蛋白分子中呈仅螺旋结构，当解离下来后q 螺旋结构消失，转变成以p 折叠为主的两亲性结构，其中几乎所有的亲水性基团排列在l f c i n b p - 折叠的一侧，而另一侧聚集了大部分疏水性基团，这种结构上的改变导致其两性分子更易靠近细胞膜，从而解释了l f c i n b 抗菌活性明显强于乳铁蛋白的原因【1 3 - 1 4 1 。然而，l f c i n b 在溶液中的这种分子结构具有很大的可变性，能够根据其所处的外部环境形成特定的构型，l f c i n b 的这种分子动力学性质可能与其所具有的多种生理功能有关。为了进一步了解l f c i n b 的立体结构，s c h i b l i 等( 19 9 9 ) 通过核磁共振技术对l f c i n b 的活性中心l f c i n b 4 - - 一9 的三维结构进行了研究，结果见图2 。图1 - 2l f c i n b 4 - - 一9 的三维结构( 来源于s c h i b l i ，1 9 9 9 ；黑色代表是t r p 3 和t r p 5 残基；银灰色代表的是a r g l 、a r 9 2 和a r 9 6 残基)f i g 1 - 2l f c i n b 4 9t h r e e - d i m e n s i o n a ls t r u c t u r e由图1 2 显示，碱性的a r g 残基和疏水的t r p 残基充分分离，形成了两性分子结构，a r g 残基在分子的一侧，t r p 残基在分子的另一侧，g i n 在分子的中间。对含有2 5 个氨基酸残基的l f c i n b 的结构分析也表明，l f e i n b 也是两性分子结构；t r p 残基和带正电荷的a r g 和l y s 残基是相互分开的。以上结构特征与l f c i n b 4 - - 一9 和l f c i n b 抗菌抗病毒功能是分不开的。l f c i n b 的立体结构远比完整的乳铁蛋白分子简单的多。天然状态下，l f c i n b 在完整乳铁蛋白分子中呈一段0 【螺旋结构和一段d 折叠结构，当从完整蛋白分子中解离下来后原先的a 螺旋结构消失【”】，在溶液中呈反平行的两段d 折叠结构，并且第3 位和第2 0 位的半胱氨酸之间形成二硫键，起到稳定分子结构的作用。对l f e i n b 的溶液状态进行核磁共振( n m r ) 研究显示在该p 折叠为主的两亲性结构( 图1 3 ) 中，几乎所有的疏水基团( f 卜c 3 、w 6 、w 8 、p 1 6 、1 1 8 、c 2 0 ) 集中于d 。折叠的一侧，而亲水基团集中在另一侧。第一章前言b图1 3l f c i n b 在溶液中的结构模型图中除包括主链结构及二硫键外，还包括a r g ，g y s 侧链( a ) 和芳香族集团( b )f i g 1 - 3l f c i n bs t r u c t u r a lm o d e li nt h es o l u t i o nl f c i n b 的抗菌作用与它的这种p 折叠结构及色氨酸密切相关，p 折叠结构使l f c i n b 易于贴近细胞膜表面，而色氨酸的存在使l f c i n b 分子更易于插入细胞膜的脂质双分子层中，破坏细胞壁的膜结构及膜电位，使细菌内容物泄漏并最终导致细菌死亡。从而解释了l f c i n b抗菌活性明显强于乳铁蛋白的原因【1 6 1 。s t r o m 等用丙氨酸( a l a ) 替换l f c i n b 上的第六位色氨酸( t r p ) ，发现替换后的抗菌活性明显降低。进一步研究证明，增加色氨酸的数量，能增强抗菌肽的活性。因此通过分子改造，增加l f c i n b 中的色氨酸数目而不改变其b 折叠结构来提高其抗菌活性是一种可行的途径。l f c i n h 在完整的人乳铁蛋白分子中也是以0 【螺旋结构存在。目前尚未发现通过实验方法测定l f c i n h 三维结构的报道。f a m a u d 等利用计算机分析软件模拟分析了l f c i n h 的空间结构，发现l f c i n h 与l f c i n b 相似。1 4 位的g i n 至2 6 位的氨基酸残基在入乳铁蛋白分子中形成的a 螺旋结构【1 3 】，当从乳铁蛋白分子解离后，其中1 7 位a l a 与2 3 位t r p 间的结构由a 。螺旋转变为d 折叠链结构，l f c i n h 的c 端结构也发生同样的转变，同l f c i n b 结构相似。关于l f e i n h 中结构序列和抗菌效果之间的关系研究报道较少，只是根据其他抗菌肽的作用机制推测，其中的0 【一螺旋结构对抗菌活性可能起重要作用1 1 2 3l f c i n b 的理化性质m 1( 1 ) 能耐受消化道内蛋白酶或多肽酶的降解作用。( 2 ) i f c i n b 的亲水性也赋予其乳化功能，这对营养物质消化吸收有益( w u 等，1 9 9 9 ) 。( 3 ) l f c i n b 属于小分子活性物质，不会引起动物抗原性反应( s h i m a z a k i 等，1 9 9 6 ) 。1 1 3 乳铁素的免疫调节作用l f c i n 具有调节免疫反应的功能。l f c i n 调节免疫反应的作用可能通过以下几种途径实4梦李等美对蕊p簧第一章前言现。( 1 ) l f c i n 抑制某些细胞因子如白介素，肿瘤坏死因子等的生成，减轻炎症反应。m a t t s b y b a l t z e re ta ( 1 9 9 6 ) 证明，乳铁蛋白和乳铁素两者都可以抑制单核细胞系在脂多糖刺激下所合成的白细胞介素6 的响应。牛乳铁素( b l f c i n ) 在体外都可以抑制单核细胞系( t h p 1 ) 在受到l p s 刺激后的i l 6 响应【1 8 】o内毒素( l p s ) 是革兰氏阴性菌细胞外膜表面的一种稳定成分，在细菌死亡或增殖时被释放出来，脂a 是内毒素产生毒性的部分。美国每年大约有4 0 万人患败血病，其中1 0 万人死于此病，一半病人的病因是革兰氏阴性菌产生的内毒素。革兰氏阴性菌引起败血病应激，主要是导致内毒素引起的免疫细胞炎症因子过度产生。肿瘤生长因子a ( n 吓a ) 是内毒素毒性的主要介导物，因此清除内毒素有重要的临床意义。l f c i n 的第2 8 - - 3 4 段氨基酸序列对内毒素有极强的亲合力，l f b 和l f c i n b 被发现可以抑制内毒素引起的人单核细胞白介素6 反应【1 引。乳铁素就是这样通过与革兰氏阴性菌细胞外膜释放的内毒素的亲合，从而抑制肿瘤坏死因子的生成。( 2 ) l f c i n 与肝素结合【1 9 1 ，抑制肝素的抗凝血功能，使得纤维蛋白原聚集，从而限制炎症反应的扩散。目前，对l f c i n 是如何激活免疫反应还不太清楚，需要迸一步研究。( 3 ) 有研究者认为口o 】，可能是l f c i n 的正电荷表面结构与某些细胞因子相似，能与免疫效应细胞表面的特异细胞因子受体结合，从而激活免疫反应。l f c i n 作为一种阳离子型抗菌肽，带有正电荷。口服乳铁素可增加外周血液和产肿瘤鼠的小肠中n k 细胞、c d 4 + t 细胞和c d 8 + t 细胞的数量。另外，口服乳铁素通过老鼠的小肠上皮细胞可诱导i l 1 8 的分泌2 l2 2 , 2 3 ，从而增强t h l 细胞的功能和增加n k 细胞的活性。细菌d n a 中含有大量未甲基化的c p g 一- - 核苷酸元件，能够激活机体免疫反应，如促进b 细胞c d 8 6 的表达，而l f c i n 可以同含c p g 核苷酸元件的寡核苷酸结合，封闭其抗原性，从而对免疫反应起到下调作用【2 4 】。免疫反应的激活通常需要免疫趋化因子来介导，趋化因子与不同免疫细胞膜上的特异性受体结合，引导免疫细胞到达炎症部位。近来研究表明，一些阳离子型抗菌肽，如嗜中性粒细胞颗粒释放的a 、p 防御素，能够与免疫细胞膜上的趋化因子受体结合，发挥免疫趋化因子的这种趋化作用。防御素与免疫细胞膜上的趋化因子受体结合主要是依靠防御素表第一章前言面的正电荷与受体间的静电作用，而l f c i n b 同样是带有强正电荷的阳离子型抗菌肽，也可能通过趋化性来达到调节免疫反应和消炎的功能【2 5 1 。( 4 ) 还有人认为，可能是l f c i n 能自发穿过细胞膜进入细胞，选择性地同某些与免疫效应有关的基因结合，从而促进或抑制这些基因的表达，调控免疫反应【2 6 1 。l f c i n 区域具有非凡的构象易变性使其在溶液中形成两性分子，从而肽分子可以结合到膜的表面，尤其是带负电荷的膜上，例如细菌细胞膜、癌细胞膜。细胞膜结合l f c i n 后破坏了正常的双层膜结构，可能产生瞬间的通道。对l f c i n 结合膜和抗菌活性尤其重要的是t r p和a r g ，它们引导整个分子结合在界面上，而非渗入到双层膜之内。类推到与富含t r p a r g的肽有关的穿越素允许结合它的蛋白质自然穿过细胞膜并进入细胞，使我们类推出l f c i n 和l f 也能自然的进入细胞，并在那里通过结合d n a 和r n a 分子继续作用。总而言之，l f c i n的各种活性似乎都与其分子的特殊部分一t r p a r g 有关【2 7 1 。大量研究表明，l f c i n 能够进入细胞质或核中，可以作为第二信使启动某一信号转导通路，调控基因表达。蛋白激酶i i ( c k 2 ) 是一种广泛存在于真核细胞中的一种多功能s e r p t h r 蛋白激酶，在d n a 复制与转录过程中起重要作用。l f c i n 能够与c k 2 结合，增强c k 2 活性，特异性磷酸化一些介导或调控因子，影响细胞功能，如促进骨髓细胞增殖、中性淋巴细胞激活、促进细胞分化等【2 8 1 。同时，l f c i n 可以直接作为转录因子，调控基因表达，k a n y s h k o v a 等发现牛乳铁蛋白n 端一段具有抗菌性质的多肽能与d n a 结合【2 9 】，l f c i n也能与r n a 结合，干预细胞功能。1 2 乳铁素免疫调节的研究进展根据目前的文献报道，国外对乳铁蛋白和乳铁素的免疫作用研究较多，而对乳铁蛋白的其他功能区的免疫作用研究较少。c r o u c hs p m ，s l a t e rk jc ta ( 1 9 9 2 ) 证明，牛乳铁素( b l f c i n ) 在体外都可以抑制单核细胞系( t h p - 1 ) 在受到l p s 刺激后的i l - 6 响应。m a t t s b y b a l t z e re ta ( 19 9 6 ) 证明，乳铁蛋白和乳铁素两者都可以抑制单核细胞系在脂多糖刺激下所合成的白细胞介素6 的响应。k a n y s h k o v ae ta l ( 1 9 9 9 ) 证明，l f c i n 可以直接作为转录因子，调控基因表达，干预细胞功能。b r i t i g a nb ee ta l ( 2 0 01 ) 证明，b u r k i t t 淋巴瘤( b u r k i t tl y m p h o m a ) b 细胞系( r a m o sc e l l s )实验证明，l f 和乳铁素( l f c i n ) 两者都可以结合到寡核苷酸上，抑制它们对人的b 细胞的免疫刺激作用。b r i t i g a nbe ，l e w i sts ，w a l d s c h m i d tm ，e ta 1 证明，l f c i n 可以同含c p g 核苷酸元件的寡核苷酸结合，封闭其抗原性，从而对免疫反应起到下调作用。m a e k a w a6第一章前言t ，v u j i h a r am ，o h t s u k ik ( 2 0 0 2 ) 证明，l f b m 能够与c k 2 结合，增强c k 2 活性，特异性磷酸化一些介导或调控因子，影响细胞功能，如促进骨髓细胞增殖、中性淋巴细胞激活、促进细胞分化等。s c h u u r m a nh j ( 2 0 0 3 ) 证明1 3 0 3 , l f c i n 注射后小鼠胸腺内无细胞坏死及组织结构破坏征象。a n d e r s e n ，j h ，j e n s s e n , h ，g u t t e b e r g ，t j ( 2 0 0 4 ) 证明 3 1 3 , l f c i n 可以阻止单纯疱疹病毒1 和2 型感染。张东送等( 2 0 0 5 ) 证明m 1 ，乳铁素对小鼠的脾淋巴t细胞和b 细胞的增殖具有显著的刺激作用。c e n t e n oj m ，b u r g u e t em c 等( 2 0 0 6 ) 证明m 1 ，牛乳铁素在体内和体外实验中可以产生抑制血管紧张转化酶的效应。m a d e rj s ，s m y t hd等( 2 0 0 6 ) 证明口钔，牛乳铁素可以抑制纤维原细胞生长因子和血管内皮细胞生长因子。1 3 免疫系统机体担负免疫功能的物质基础是免疫系统( i m m m u n es y s t e m ) 。免疫系统是由免疫组织与器官、免疫细胞和免疫分子组成。免疫系统可分为天然免疫系统( 即非特异性免疫系统) 和获得性免疫系统( 即特异性免疫系统) 。当入侵物太多时，即由先天免疫系统诱导后天免疫，开启更具专一性和更为强大的防御机制见图4 。免疫细胞是指所有参与免疫应答及与免疫应答有关的细胞。主要参与天然免疫应答的的免疫细胞包括各类吞噬细胞、n k 细胞、肥大细胞、粒细胞等。主要的分子包括补体成分、急性期蛋白和细胞因子，尤其是干扰素。主要参与获得性免疫应答的免疫细胞包括t细胞、b 细胞和抗原提呈细胞。胃肠粘膜系统、i 病原体，有害物质a p c 细胞，d g 细胞吞噬处理i - -信号分子，包括n o 、和过敏性物质等、，c a m p 等第二信使飞、，7抗菌抗病、lt l r sj 一消除毒物质卜 、7其他细胞因子先天性免疫厦眢发炎细胞因子抗炎细胞因子糯煳i生一步彻底涪除获得性免疫应答代谢网络，免疫网络、信号传递网络和脑神经系统图1 - 4 肠粘膜系统对机体健康的控制机制。图中，a p c 细胞：抗原递呈细胞：d c 细胞：树突细胞。f i g 1 - 4i n t e s t i n a ls y s t e mo nt h eh e a l t ho ft h eb o d yc o n t r o lm e c h a n i s m s1 3 1 树突细胞树突细胞是抗原提呈能力最强的a p c 细胞。其特点是：能高水平表达m h c 。i i 类分子；7，第一章前言可表达参与抗原摄取和转运的特殊膜受体；能有效摄取和处理抗原，然后迁移至t 细胞区；能活化未致敏t 细胞；抗原提呈效率高。1 3 2 细胞因子细胞因子( e y t o k i n e ) 是一类由多种细胞产生的非抗体、非补体，但是能调节细胞分化生长、免疫功能、参与炎症反应及创伤愈合的激素样( 微量而高效) 可溶性细胞调节小分子多肽物质，主要包括干扰素、肿瘤坏死因子、白细胞介素、群落刺激因子及其他一些细胞因子，它们组成机体免疫细胞间相互作用的调节信号，并形成巨大的调节网络系统而发挥免疫调节作用。在正常生理条件下，细胞因子在血液中的浓度极低，在疾病或炎症条件浓度及活性得到迅速提高。细胞因子的主要功能是作为免疫细胞之间相互作用的重要调节信号，在体内的细胞免疫和体液免疫的信号传入和传出中发挥作用。其中，在传入中主要是活化淋巴细胞、调整淋巴细胞和其他细胞的生长及分化，以增强或抑制免疫应答：在传出中，细胞因子具有增强炎症细胞的作用，同时具有排出异物的活性。事实上，细胞因子既可以在体内单独发挥代谢调节作用，又可以通过相互之间的诱导形成级联反应，使免疫信号迅速被放大，机体免疫系统被迅速激活，形成细胞因子网络系统，发挥免疫调节作用。由于细胞因子的研究相对而言起步较晚，近年来由于分子生物技术的迅速发展，使得不同的细胞因子得到分离和鉴定，但是细胞因子的分类较为复杂。细胞因子在体内的主要生物学效应是参与免疫调节作用、机体的造血作用、炎症反应、抗病原微生物的增殖效应及神经内分泌效应等。在众多不同的细胞因子中，与日常营养密切相关的有肿瘤坏死因子( 属于经典的细胞因子) 和白细胞介素( 属于免疫调节及促炎症细胞因子) 。炎症反应时产生一系列不同的多肽，早期的研究表明，细胞因子是由吞噬免疫细胞产生的，但是近年来的研究发现，t ，b 淋巴细胞、成纤维细胞和不同的内皮细胞均可产生细胞因子。在感染寄生虫或病原入侵等导致的非特异性免疫及炎症反应时也可产生细胞因子。一些正常的生理状态变化，如过度运动等也可以导致细胞因子的生成。体内不同的细胞因子形成细胞因子系统，共同在机体的免疫反应中发挥作用。目前所了解的发炎细胞因子主要是：i l 1 b 、i l 。6 、i l 8 、i l 1 2 、i n f - r 、t n f a 。如果机体在清除入侵者之后持续发炎，就会造成严重的疾病。已经证明，机体消除炎症主要是通过抗炎细胞因子的作用。抗炎细胞因子是一系列免疫调节分子，这些分子可对发炎细胞因子作出响应。细胞因子、调控人体免疫应答的特异性的抑制因子和可溶性的细胞因子受体相呼应。它们在机体组织炎症和病理状态中的生理作用和病理作用日益被识别出来。主要的抗炎症细胞因子包括：i l 10 【，i l 一4 ，i l 6 ，i l 1 0 ，i l 1 1 ，和i l 1 3 。人类免疫应第一章前言答是一个高度复杂的调节系统和复杂的控制因子网络。在这个复杂的控制网络中，抗炎症细胞因子和特异性细胞因子的抑制因子是其重要的组成部分。在生理条件下，这些细胞因子的抑制因子用作免疫调节的基础，以限定持续的或者过头的炎症反应。在病理条件下，可能正是由于这些抗炎症的介导者没有提供对疾病所产生的炎症足够的控制，或者过度抑制了疾病所引起的发炎活性和免疫应答，从而造成机体抗感染能力的下降，引起反复感染 3 5 】o1 4 开展此课题的依据本课题是在天津市重大科技攻关课题的资助下，分离得到纯度在8 5 以上的公斤级乳铁蛋白( l f ) ，并水解分离纯化获得纯度在9 5 以上的乳铁素( l f c i n b ) 。建立了一整套对乳铁蛋白水解产物分离和纯化的方法。同时对乳铁蛋白和乳铁素的免疫调节作用进行了初步研究，结果表明，乳铁蛋白对小鼠脾淋巴t 细胞和b 细胞的增殖具有显著的抑制作用，而乳铁素对小鼠的脾淋巴t 细胞和b 细胞的增殖具有显著的刺激作用。在上述研究的基础上，对目前所发现和分离得到的乳铁素的免疫调节作用进行系统研究。本课题主要分为五部分内容：( 1 ) 用胃蛋白酶水解乳铁蛋白，分离纯化水解产物乳铁素，建立起乳铁素的分离纯化方法，并进一步检测乳铁素的纯度，通过氨基酸序列组分分析乳铁素的真实性。( 2 ) 用m t t 法进行牛乳铁素对淋巴细胞增殖功能的影响研究。( 3 )利用国家保健品功能评价标准来评价乳铁素的免疫增强功能。( 4 ) 牛乳铁素对炎症和抗炎细胞因子( i l - 2 、i l 4 、i l 6 、i l 1 0 、t n f 伐) 活性的影响。该研究不仅仅在于揭示乳铁素与机体免疫功能之间的关系，而还在于为乳铁素的开发及其在食品、药品等方面的应用提供理论支持。1 5 开展此课题的意义近年来对乳铁素进行了大量的研究工作，使得人们对乳铁素的结构、生物学功能及其分子机制有了一定的认识，但还有很多问题不是完全清楚，例如乳铁素与质膜结合后的构象变化以及调节免疫反应、增强机体抵抗力的分子机制等。这些也是乳铁素研究的热点。与此同时，人们随着对乳铁素认识水平的提高，越来越希望把乳铁素作为一种免疫调节剂来食用或药用。如此一来，乳铁素的市场前景变得越来越光明，这就要求我们作为食品科学的研究者们更加深入地更加系统地来研究乳铁素的免疫调节机制，包括细胞水平的9第一章前言以及分子水平上的。只有把这一基础理论研究透彻，我们才能把乳铁素更好的应用到食品药品领域：只有将乳铁素的免疫调节机理研究透彻，我们才能更好地利用乳铁素开发出免疫调节功能食品。1 0，第二章材料和方法第二章材料和方法2 1 牛乳铁素粗品的制备2 1 1 酶解b l f 制备含l f c i n b 的初始材料2 1 1 1 材料牛乳铁蛋白( 纯度9 2 ，天津商学院食品专业实验室制备) ；胃蛋白酶( 电泳纯，s i g m a 公司，进口分装，中国医学科学院血研所科技公司) ；盐酸( 天津市化学试剂五厂，分析纯) ；氢氧化钠( 天津市凯通化学试剂有限公司，分析纯) 。2 1 1 2 仪器x m t b 数显恒温水浴锅( 天津市中环试验电炉有限公司) ；p h s 9 a 数字p h 计( 天津市盛邦科学仪器技术有限公司) ；w h 8 4 0 1 5 0 型搅拌器( 天津市威华仪器设备有限公司) 。2 1 1 - 3 方法【3 6 】称量一定量b l f 溶于蒸馏水中，然后用l m o l l 的h c i 溶液缓慢调整其p h ，使其等于2 5 3 0 。然后放入3 7 c 恒温水浴锅中恒温，向b l f 溶液中加入新鲜配制的胃蛋白酶水溶液( w ，3 ) ，酶解在3 7 c 下进行4 小时。最后在8 0 c 下灭酶1 5 分钟。酶解过程中由于不断有l f c i n b ( p i 8 5 ) 生成，反应体系的p h 值要上升，所以酶解时要加入l m o l l h c l 溶液以维持体系的p h 在2 5 3 0 的范围内。特别是酶解前的4 0 分钟内，体系的p h 值上升比较明显，所以要不断搅拌并添加l m o l lh c l 以维持体系在胃蛋白酶所需的最适p h 范围内。2 2 牛乳铁素的分离与纯化2 2 1 材料盐酸( 天津市化学试剂五厂，分析纯) ；氢氧化钠( 天津市凯通化学试剂有限公司，分析纯) ；磷酸二氢钠( 天津市科密欧化学试剂开发中心，分析纯) ；柠檬酸( 天津市标准科技公司，分析纯) 。2 2 2 仪器1 1第二章材料和方法k d c 1 6 0 h r 高速冷冻离心机( 科大创维股份有限公司中佳分公司) ：t p10 2 0 超滤试验装置( 天津纺织工学院膜分离工程研究所) ；l g j 一1 0 冷冻干燥机( 军事医学科学院实验仪器厂研制) ；w x j 一9 3 8 8 紫外检测仪( 上海琪特分析仪器有限公司) ；b s 1 6 0 a 自动部分收集器( 上海沪西分析仪器厂) ；x w t - s 小型记录仪( 上海自动化仪表三厂) ；h l 1 恒流泵( 上海沪西分析仪器厂) ；层析柱( 2 5 c m x 5 0 c m ) 。2 2 3 方法2 2 3 1l f c i n b 的粗分离( 1 ) 将最佳酶解条件下酶解得到的酶解液用l m o l l 的n a o h 调p h 到7 o ，使水解出的杂蛋白沉淀，然后在1 5 0 0 0 9 的离心力下离心3 0 分钟，使得不溶解的肽类被分离出去。取上清液，然后用截留分子量( m w c o ) 为1 0 0 0 0 的超滤膜进行超滤，反复超滤3 - 4 次，将分子量大于1 0 0 0 0 和小于1 0 0 0 0 的产品分别收集保存，分子量小于1 0 0 0 0 的产品用截留分子量为6 0 0 0 的膜再次进行超滤，分别收集浓缩液和透过液，分子量低于6 0 0 0 的透过液立即进行冷冻干燥( l f c i n b 分子量为3 1 2 6 d a ) ，于4 保存。( 2 ) 计算产品得率，并用毛细管电泳方法检验其纯度。具体操作见2 4 。2 2 3 2 柱层析分离与纯化l f c i n b如果需要获得少量纯度较高的乳铁素( 毫克级) ，可以通过反向高效液相色谱的方法，这种分析规模的制备方法适合于检测乳铁素的纯度但是并不能用来制备大量( 至少达到克级) 的乳铁素。为了得到纯度较高的大量乳铁素，我们设计了如下的制备工艺：( 1 ) b u t y l - t o y o p e a r l 树脂的处理：取一定量树脂装于烧杯中，加入去离子水，室温浸泡3 0 m i n ，并不断用玻璃棒轻轻搅拌，然后用滤布滤去清洗液，如此反复操作2 3 次，直至清洗液为中性，以洗去保存树脂时吸附在其上面的乙醇；( 2 ) 取含有l f c i n b 的粗品放入烧杯中，加入蒸馏水配制成浓度为5 ( w v ) 的水溶液。将处理过的树脂加入其中，并用搅拌器进行搅拌6 0 m i n ，用滤布将吸附了目的产物的树脂滤出，滤液一并保存：1 2第二章材料和方法( 3 ) 取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上，在柱中注入蒸馏水( 约1 3 柱床高度) ，将树脂浓浆缓慢倾入柱中，待树脂沉积约2 e r a 高度后打开出水口，等树脂完全装入后，静置，用一层润湿的脱脂棉轻轻覆盖在树脂柱的表面，然后接上恒流泵；( 4 ) 将( 2 ) 获得的滤液通过柱子；( 5 ) 用蒸馏水清洗吸附在树脂上的非目的短肽，直至清洗液在2 8 0 n m 下的吸光度小于o 0 6 。清洗液弃去；。( 6 ) 用一定浓度的酸洗脱树脂。直至洗脱液在2 8 0 n m 下的吸光度无变化为止。将此酸洗液与等体积的p n = 7 0 的缓冲液混合；( 7 ) 将上述的混合液通过树脂柱，然后用p h = 7 0 的缓冲液清洗，清洗液弃掉；( 8 ) 用一定p h 值的缓冲液洗脱目的产物，洗脱液保存。( 9 ) 向上述洗脱液中滴加1 m n a o h ，调溶液p h = 7 o ；( 1 0 ) 将溶液通过处理后的树脂柱，然后用去离子水清洗除去缓冲盐；( 1 1 ) 用一定浓度的酸洗脱树脂，并将洗脱液冷冻干燥，保存。2 3 毛细管电泳【3 7 3 8 t3 9 】2 3 1 实验仪器与试剂b e c k m a np a c em d q 毛细管电泳仪( 美国b e c k m a n 公司)