（食品科学专业论文）乳酸菌抗氧化活性的研究.pdf

独创性声明 9 2 8 9 2 8 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 兰竺笙奎堡耋竺鱼! l 幺! 菇臣竺三里塑! ! ! ! 竺! 型! 里 学位论文版权使用授权书 本论文作者完全了解壹璺娄堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权壹墨圭堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 一一繇；j 魄翎签名：嘞】3 易 签字同期：z ，够咱ce r 签字日期：年二月名目 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 电话： 通讯地址： 邮编： 摘要 氧化作用对有机体来说是一个必要的过程，但过多的氧化作用会引起生物大 分子的损伤。生命活动的氧化代谢过程中不断产生各种活性氧自由基，如羟自由 基( h o ) 、超氧阴离子自由基( 0 2 。) 、过氧化氢( h 2 0 2 ) 等等，这些自由基会对 d n a ，脂质及蛋白质造成损伤，并引发一些疾病，如肺气肿、关节炎、动脉粥样 硬化、心血管疾病、癌症等。尽管人的机体有抗氧化防御系统，但是这些系统并 不能完全有效地抵御或修复氧化作用带来的损伤。这时外加一些抗氧化剂对协助 体内氧代谢的平衡是很有帮助的，但由于许多化学合成的抗氧化物存在安全问 题，所以具有抗氧化活性的天然产物就越来越受到人们的青睐。 作为益生菌乳酸菌已经广泛地应用到食品和医药中。近年来，国i 匈# 1 - 对乳 酸菌的生理活性有大量的研究报道。乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持 微生念平衡，降低血清胆固醇、抗肿瘤和免疫赋活作用。近年来，欧美、韩国、 日本等一些学者对乳酸菌的防癌、抗癌、抗突变活性进行了大量的研究，并取得 了显著的进展。但对乳酸菌抗氧化活性的报道较少。 本研究通过对3 0 株乳酸菌清除d p p h 自由基和抗亚油酸过氧化能力的实 验，筛选出了抗氧化活性较i 虽i i 孚l 酸菌l 3 和l 4 。从得到的两株乳酸菌分别制备 无细胞提取物( 菌数为1 0 1 0 m l 。1 ) ，利用4 种方法对这两株乳酸菌无细胞提取 物的抗氧化性能进行了检测分析，发现乳酸菌l 3 和l 4 可螯合f e “，分别为5 4 3 p p m 和4 1 ，3p p m ，清除超氧自由基分别为1 4 9 和8 7 0 ，清除羟自由基分别 为8 3 5 ；i u4 5 _ 7 ，还原活性分别相当于2 0 0 和1 8 7 p m o l l 的l - 半胱氨酸。并 发现乳酸菌l 4 的抗h 2 0 2 的能力明显要高于乳酸菌l 3 和保加利亚乳杆菌。 d 进一步研究发现乳酸菌l 4 的无细胞提取物s o d 活性为7 3 7 0 + 1 7 7u m g p r o t e i n ，但这2 株乳酸菌均未检测到g s h - p x 活性。利用p c r 技术扩增了乳酸 菌l 4 的s o d 基因，通过d n a 序列测定，发现乳酸菌l 4 的s o d 基因与ec o i l 的m n s o d 基因有高度的同源性( 9 8 ) 。对乳酸菌l 4 发酵乳抗氧化活性进行 检测发现，乳酸菌l 4 发酵乳还原活性和螯合f e 2 + 作用均明显高于未发酵乳，也 高于其他对照乳酸菌发酵乳。 关键词：乳酸菌；抗氧化活性；自由基；超氧化物歧化酶：发酵乳 5 a b s t r a c t i ti sn e c e s s a r yf o rm a n yl i v i n go r g a n i s m st oc a r r yo u tt h eo x i d a t i o n 仃v i v o a l t h o u g ho x i d a t i v es t r e s sc a nd a m a g eb i o l o g i c a l m o l e c u l e s t h eo x i d a t i v e s t r e s so c c u r sw h e na b n o r m a l l yh i g hl e v e l so fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) ， s u c ha ss u p e r o x i d er a d i c a la n i o n ( 0 2 。) ，h y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) ，a n d h y d r o x y lr a d i c a l ( h o ) w e r eg e n e r a t e d 。w h i c hc a nr e s u l t i nt h ed a m a g e so f d n a ，p r o t e i na n dl i p i d o x i d a t i v ed a m a g ep l a y sas i g n i f i c a n tp a t h o l o g i c a lr o l e i nh u m a nd i s e a s e ，s u c ha s e m p h y s e m a ，a r t h r i t i s ，a t h e r o s c l e r o s i s ， c a r d i o v a s c u l a rd i s e a s e sa n dc a n c e r t h en a t i v ea n t i o x i d d t i v es y s t e m si n o r g a n i s m sa r en o te n o u g ht op r e v e n tt h e mf r o mt h eo x i d a t i v ed a m a g e t h e a d d i t i o no fa n t i o x i d a n tm a yb eas u i t a b l ec h o i c et oh e l pr e d u c t i o no fo x i d a t i v e d a m a g e a m o n gm a n yk i n d so fa n t i o x i d a n t s n a t u r a la n t i o x i d a n t sd e r i v e df r o m m i c r o b e s ，p l a n t s ，a n da n m a l sa r em o r ed e s i r a b l e ，s i n c et h e r ea r ed o u b t sa b o u t t h es a f e t yo fs y n t h e t i cc h e m i c a la n t i o x i d a n t s l a c t i ca c i db a c t e r i a ( l a b ) a r ef o o dg r a d eb a c t e r i aw i t hag r a s ( g e n e r a l l y r e g a r d e da ss a f e ) s t a t u s ，w h i c ha r ew i d e l yu s e di nf o o df e r m e n t a t i o n t h e p o t e n t i a lb e n e f i t so fl a bf o rh u m a nh e a l t hi n c l u d es t i m u l a t i o no ft h ei m m u n e p r e v e n t i o n o fi n t e s t i n a li n f e c t i o n ，r e d u c t i o no fs e r u mc h o l e s t e r o la n d a n t i m u t a g e n i ce f f e c t s r e s e n t l y , t h e r ea r ep l e n t yo fr e s e a r c h e s o nt h e a n t i c a n c e ra n da n t i m u t a g e n i ca c t i v i t yo fl a b h o w e v e r , t h er e s e a r c h e so nt h e a n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yo fl a ba r er e p o r t e do n l yi nr e c e n ty e a r s i nt h ep r e s e n ts t u d y , t h el a bs t r a i nl 3a n ds t r a i nl 4w e r es c r e e n e df r o m 3 0i s o l a t e so fl a ba c c o r d i n gt ot h ea b i l i t yt oi n h a b i t el i n o l e i ca c i dp e r o x i d a t i o n a n ds c a v e n g e1 ，1 - d i p h e n y l 一2 - p i c r y l h y d r a z l ( d p p h ) f r e er a d i c a l t h ec e l l - f r e e e x t r a c t sd e r i v e df r o mt h ec u l t u r e so fl 3a n dl 4s h o w e ds t r o n ga n t i o x i d a t i v e p r o p e r t i e s w i t hc h e l a t eo f f e “b y5 4 3 xl0 一a n d4 1 3 x l0 一s c a v e n g eo f s u p e r o x i d er a d i c a lb y1 4 。9 a n d8 7 o s c a v e n g eo fh y d r o x y lr a d i c a lb y 8 3 5 a n d4 5 7 a n dr e d u c i n ga c t i v i t yw a se q u i v a l e n tt o2 0 0a n d18 7p m o l l 6 l - c y s t e i n e ，r e s p e c t i v e l y t h es t r a i nl 4w a sl e s ss e n s i t i v et oh 2 0 2t h a no t h e r s t h eh i g h e rs u p e r o x i d ed i s m u t a s ea c t i v i t yw a sf o u n di nt h ec e l l f r e e e x t r a c t so fl 4 ( 7 3 7 0 + 1 7 7u r r i gp r o t e i n ) ，w h i l et h eg l u t a t h i o n ep e r o x i d a s ew a s n o tf o u n di nb o t hl 3a n dl 4 t h es o d g e n ew a sa m p l i f i e dw i t hp c r f r o mt h e g e n o m i cd n ao fs t r a i nl 4 ，t h e nt h ep c rp r o d u c tw a ss e q u e n c e da n d c o m p a r e dw i t ht h es e q u e n c e so fs o dg e n ei ng e n e b a n k t h er e s u l ti n d i c a t e d t h a tt h es e q u e n c eo fs o dg e n ef r o ml 4i sh i g h l yh o m o l o g yw i t ht h es e q u e n c e o fm n - s o dg e n eo fec o l i ( 9 8 ) t h em i l kf e r m e n t e db yl 4e x h i b i t e db e t t e r f e 2 + c h e l a t i n ga b i l i t ya n d r e d u c i n ga c t i v i t yt h a no t h e ru n f e r m e n t e dm i l ka n dt h ec o m m e r c i a ly o g h u r t s o b t a i n e df r o ms u p e r m a r k e t k e yw o r d s ：l a c t i c a c i d b a c t e r i a ；a n t i o x i d a t i v ea c t i v i t y ；f r e er a d i c a l s s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ；f e r m e n t e dm i l k 7 缩略语 u 、b a t c c i e r o s d p p h b h t t b a t b a r s d t t t a c m d a l a e d t a s o d g s h p x e b p c r c 1 - a b o d d n t p s d s p b s 缩略语表 英文名 l a c t j ca c i db a c t t e d a a m e r i c at y p ec u l t u r ec o l l e c t i o n c e l l - - f r e ee x t r a ( c t r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s 1 1 - d i p h e n y l 一2 一p i c r y l h y d m z l b u l b , l a t e dh y d r o x y t ( ：o l u e n e t h i o b a r b t ur l ca c i d t h i o b a r b i t u r l ca c i ds u b s t a n c e s d i t h i o t h r e i t o l t r i c h l o r o a c e t i ca c i d m a i o n d i a l d e h y d e u n o l e n i ca c i d e t ：h l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d s u p e r o x i d ed i s m u t a s e g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e e t h i d i u mb r o m i d e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n c e t y t r i m e t h y i a m m o n i u mb r o m i d e o p t i c a ld e n s i t y d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e s o d i u md o d e c y ls u f f a t e p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e 8 中文名 乳酸菌 美国标准菌种保藏中心 无细胞提取物 活性氧 二苯代苦味肼基自由基 丁基化羟基甲苯 硫代巴比妥酸 硫代巴比妥酸反应物 二硫苏糖醇 三氯乙酸 丙二醛 亚油酸 7 , - - 胺四乙酸 超氧化物歧化酶 谷胱甘肽过氧化物酶 溴化乙锭 聚合酶链式反应 十六烷基三甲基溴化铵 光密度 脱氧核苷三磷酸 十二烷基磺酸钠 磷酸盐缓冲液 1 抗氧化与自由基 第一章文献综述 人类需要氧气才能维持生命，氧化作用对有机体来说也是一个必要的过程。 但是在吸收氧气、消耗热量或者分解葡萄糖的时候，在正常的代谢过程中必定会 产生自由基( 也叫活性氧或游离基) 。适量的自由基与稳定的氧分子维持着巧妙的 生理平衡，使得人类的生理系统运作良好。例如当有害的细胞侵入人体时，白血 球会释放出自由基，摧毁入侵者，这是自由基有利的一面。当自由基一旦不受控 制时，可能会损害细胞的遗传物质d n a ，有时甚至于彻底将它们摧毁，这是自由 基有害的一面。这种损害使得人体的机能下降，加速机体老化，并引起各种慢性 病、甚至发生癌症。 1 1 自由基的定义【1 1 自由基( f r e er a d i c a l s ) ，化学上也称为“游离基”，是含有一个不成对电子 的的原子或原子团。自由基有三个明显特点：1 ) 反应性强：2 ) 具有顺磁性；3 ) 寿命短。我们生物体系主要遇到的是氧自由基，例如超氧阴离子自由基( 0 2 。) 、 羟自由基( h o - ) 、脂氧自由基、二氧化氮和一氧化氮( n o ) 自由基，加上过氧 化氢、单线态氧和臭氧，通称活性氧。 1 。2 自由基对重要生物大分子的损害2 】 由于自由基高度的活泼性与极强的氧化反应能力，能通过氧化作用来攻击所 遇到的任何分子，使机体内大分子物质产生过氧化变性，交联或断裂，从而引起 细胞结构和功能的破坏，导致机体组织损害和器官退行性变化。 1 2 1 自由基对核酸类物质的损害 自由基作用于核酸类物质会引起一系列的化学变化，诸如氨基或羟基的脱 除、碱基与核糖连接键的断裂、核糖的氧化和磷酸酯键的断裂等。在体内以水分 为介质环境中通过电离辐射诱导自由基的研究表明，大剂量辐射可直接使d n a 断裂，4 , n 量辐射可使d n a 主链断裂。 9 1 2 2 自由基对蛋白质的损害 自由基可直接作用于蛋白质，或者通过脂质过氧化物间接作用于蛋白质，使 蛋白质的多肽链断裂或个别氨基酸发生变化或使蛋白质交联而发生聚合作用，从 而使蛋白质的结构发生变化，导致细胞功能紊乱。 1 2 3 自由基对糖类的损害 自由基通过氧化性降解使多糖断裂，如影响脑脊液中的多糖，从而影响大脑 的正常功能。自由基使核糖、脱氧核糖形成脱氢自由基，导致d n a 主链断裂或 碱基破坏，还可使细胞膜寡糖链中糖分子羟基氧化生成不饱和的羰基或聚合成双 聚物，从而破坏细胞膜上的多糖结构，影响细胞免疫功能的发挥。 1 2 4 自由基对脂质的损害 脂质中的多不饱和脂肪酸由于含有多个双键而化学性质活泼，最易受自由基 的破坏发生氧化反应。磷脂是构成生物膜的重要部分，因富含多不饱和的脂肪酸 故极易受自由基所破坏。这将严重影响膜的各种生理功能，自由基对生物膜组织 的破坏很严重，会引起细胞功能的极大紊乱。 1 3 自由基与疾病的关系 自由基具有高度的氧化活性，它们极不稳定，活性极高，它们攻击细胞膜、 线粒体膜，与膜中的不饱和脂肪酸反应，造成脂质过氧化增强。脂质过氧化产物 又可分解为更多的自由基，引起连锁反应。这样，膜结构的完整性受到破坏，引 起肌肉、肝细胞、线粒体、d n a 、r n a 等广泛损伤从而引起各种疾病，如扩张 性心肌病，老年性白内障，哮喘等疾患。故自由基是人体疾病、衰老和死亡的直 接参与和制造者。 1 。3 1 自由基与衰老【1 4 1 人们提出很多关于衰老的假设和理论。但自由基衰老学已为研究者所普遍接 受。英国h a r m a n 于1 9 5 6 年率先提出自由基与机体衰老和疾病有关，接着在1 9 5 7 1 0 年发表了第一篇研究报告，阐述用含0 5 1 自由基清除剂的的饲料喂养可延 长小鼠寿命。 自由基衰老理论的中心观点认为：当人体细胞受到一种叫氧自由基的化学粒 子的不断的破坏性冲击时，衰老便发生了，维持体内适当水平的抗氧化剂和自由 基清除剂可以延长寿命和推迟衰老。自由基作用于肌体的每一个细胞，破坏细胞 壁上的脂质( 特别是不饱和脂肪酸) 、蛋白质、遗传物质等，形成过氧化的脂质、 蛋白质等。这种过氧化物质不能被肌体正常代谢，日积月累，沉积在细胞中，加 速了细胞的老化和死亡，从而使机体衰老。 1 3 2 自由基与癌症 s - r j 长期以来，人们一直致力于对癌变原因不同角度的探索。研究者认为不少致 癌物必须在体内经过代谢活化形成自由基并攻击d n a 才能致癌，而许多抗癌剂 也是通过自由基形成去杀死癌细胞。 正常细胞发生癌变包括诱发和促进两个阶段，这就是两步致癌说。大量的研 究表明，致癌的这两个阶段都与自由基有关。在诱发阶段，活性氧如超氧自由基 和羟自由基，既可直接损伤d n a ，也可通过腊类过氧化而间接损伤d n a ，而 腊类过氧化作用的产物既能致癌，也能致突变。在促癌阶段，促癌剂能间接地使 d n a 损伤，因此促癌剂能使细胞产生包括和有机过氧化物等活性氧，然后通过 这些活性氧去攻击d n a 。自由基与脂质过氧化物很容易和d n a 在碱基位置上形 成共价结合，对碱基进行修饰，使核糖氧化、碱基丢失、d n a 链断裂、与蛋白 质交联等。如羟自由基能夺取d n a 分子中碱基上的氢原子，具有脱嘌呤和脱嘧 啶的作用，使d n a 断裂或交联，从而诱发基因突变或癌变。 1 3 3 自由基与糖尿病1 1 糖尿病是一种常见的有遗传倾向的代谢内分泌疾病，特征多为血糖过高和尿 糖，临床表现多为多尿、多饮、多食和疲乏消瘦等症状。 机体内产生的多余的“自由基”直接影响胰岛8 细胞的活性，胰岛细胞血液 循环发生阻碍，胰岛功能受损，胰岛素分泌减少，从而引发血糖、尿糖增高。体 内自由基还直接破坏胰岛素受体与胰岛素的亲和力，致使葡萄糖、脂肪和蛋白质 的代谢紊乱。高血糖导致糖基化血红蛋白上升，自由基产生增加，血中和组织中 抗氧化酶的活性下降，引发糖尿病及糖尿病并发症的产生，甚至危及生命。 1 。3 4 自由基与心血管疾病碑。9 】 随着自由基及其介导的脂质过氧化反应在疾病中的作用研究的日趋深入，自 由基与冠心病、心肌缺血、心律失常、充血性心律衰竭、动脉粥样硬化发生、发 展相关的事实正在不断增加，对其损伤机制的认识亦更趋深化。 研究表明，高血脂时体内自由基产生和清除平衡被破坏，许多自由基清除剂 活性降低，如超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 、过氧化氢酶 ( c a t a l a s e ，c a t ) 等，产生大量的脂质过氧化物( 1 i p i dp e r o x i d e ，l p o ) ，这些 l p o 与动脉粥样硬化的形成密切相关。其机制表现为l p o 直接损伤内皮细胞，导 致内皮细胞的退行性变化和通透性改变，l p o 的产物丙二醛( m a i o n d i a i d e h y d e ， m d a ) 极易修饰低密度脂蛋白( 1 0 w d e n s i t yl i p o p r o t e i n ，l d l ) ，成为m d a - l d l 后，能为单核巨噬细胞受体所辨认、内饮，而形成泡沫细胞；炎性细胞浸润并释 放各种生长因子，刺激中膜平滑肌细胞移于内膜增生，吞噬及分泌大量间质成分， 形成动脉粥样硬化。现有资料提示，提高女i s o d 等清除自由基酶类的水平，应 用药物阻滞l d l 的氧化可抑制动脉粥样硬化的发生并改变病损的进展。膳食中的 抗氧化剂如v e 与v c 具有潜在的辅助治疗作用，能保护体内l d l 免遭氧化修饰，从 而阻止或延缓动脉粥样硬化的发生发展。 1 。3 5 自由基与其他疾病仲1 3 】 自由基除了能引发上述几种疾病外，还和其他的一些疾病也密切相关。如炎 症、心肌梗塞、休克、中毒、肿瘤、突变、帕金森病、阿尔茨海默病、肺疾病、 眼疾病等等。近年来的研究证实越来越多的疾病起因均与自由基有关，因而自由 基与疾病的关系已成为与人类健康密切相关的重要问题。随着对自由基研究的 不断深入，自由基与疾病关系的探讨也在不断的深入和扩展。 1 3 6 抗氧化食品可控制禽流感发病n 4 】 最近的研究表明，禽流感病毒入侵人体时，会引起体内迅速产生大量自由基， 而通过营养干预阻断这一过程，既能提高个人的免疫力，又能控制病毒在体内的 1 2 变异和致病过程。中科院上海生科院营养所所长史香林教授表示，禽流感病毒入 侵人体时，短时间内会产生大量自由基。自由基在杀死病毒的同时，也有可能损 伤周围的正常细胞，降低人体的免疫力。如果能解决病毒初步入侵人体第一道防 护屏障的问题，即阻断自由基的产生以及减缓自由基导致的细胞损伤，就会大大 减轻症状甚至降低发病率。 1 4 抗氧化物质1 5 。1 9 】 人类每天都遭到自由基成千上万次的攻击。因此，科学家自五十年代以来一 直致力于在人体内构筑一道抗自由基氧化、抗衰老的防线。这就是利用抗氧化剂 给自由基提供一个电子，而自身不会形成有害的能引起链反应的危险物质，氧自 由基被中和，有害的链反应被终止。有关抗氧化剂如何在人体消除自由基及起抗 氧化作用的研究已在新世纪医学保健领域中占有重要的地位。 抗氧化剂的工作原理如图1 1 所示。正常氧原子具有4 对电子，机体正常代 谢可使原子失去一个电子形成了自由基，自由基主要通过抢夺其它他分子上的电 子而使自己配对。当自由基从细胞膜上夺取一个电子后，便产生了另一个新的自 由基，并开始了链反应。电子夺取链反应侵蚀细胞膜，导致细胞完整性的丧失为 癌症及其它疾病打开了方便之门。由于其特殊的分子结构，抗氧化剂能给出一个 电子给自由基而自身不会形成有害的能引发链反应的危险物质。 图1 1 抗氧化剂的工作原理 1 3 抗氧化剂是指防止或延缓食品成分氧化变质的一类食品添加剂。抗氧化性按 其溶解性可分为油溶性和水溶性两类：油溶性的有二丁基羟基甲苯( b u t y l a t e d h y d r o x y t o l u e n e ，b h t ) ，丁基羟基茴香醚，特丁基对苯二酚，没食子酸丙脂等， 水溶性的有抗坏血酸及其盐类，异抗坏血酸及其盐类等。按来源可分为天然和人 工合成的两类：天然的有脑磷脂，茶多脂等；人工合成的有二丁基羟基甲苯等。 抗氧化剂按其作用性质可分为预防型和阻断型。预防型抗氧化物质可以消除 自由基链反应引发阶段的自由基及其他引发剂，如s o d ，c a t ，谷胱甘肽过氧 化物酶( g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e ，g s h p x ) 以及一些金属离子螯合剂等。阻断型 抗氧化物质可以捕捉和消除自由基链反应产生的自由基，中断或延缓链反应的进 行，如维生素e 、维生素c 、8 一胡萝h 素等。 1 4 1 维生素e 和维生素c 维生素e 是抗氧化剂中最好的一种维生素。它失去一个电子后，可以从维 生素c 中获得补充。维生素c 一般在人体内不能保存很长时间，它可以使维生 素e 循环再生，因此人们在吃维生素e 的同时，兼吃维生素c ，可以加强和维 持维生素e 的抗氧化作用。 1 4 2 硒 硒是机体抗氧化系统组成成分谷胱甘肽过氧化物酶的必需成分，适当补硒可 提高谷胱甘肽过氧化物酶活力，从而提高机体的抗氧化能力。 1 4 3b 一胡萝i - 素 b 一胡萝h 素是维生素a 的前体，具有清除自由基的功能，所以b 一胡萝t - 素对运动时的氧化应激有保护作用。 1 4 4 番茄红素 番茄红素是近几年国际上最新发现的一种更强有力的抗氧化剂。它如同b 一 胡萝i - 素，属胡萝h 素类物质，在大多数水果和蔬菜中可以找到，是一种天然的 生物色素。由于它具有独特的化学结构，所以可以消除自由基，尤其是氧自由基。 据报道番茄红素提高机体免疫机能的作用比维生素e 强1 0 0 倍。 1 4 5 酶类抗氧化物质 1 4 超氧化物歧化酶是消除过超氧阴离子自由基的酶。过氧化氢酶是消除过氧化 氢和羟自由基的酶。谷胱甘肽过氧化酶是消除过氧化氢和羟自由基的酶。 1 4 6 植物中的抗氧化物质 在可食植物中既含有营养素等食物成分、又含有抗氧化剂或与抗氧化剂有关 的、有益健康的、可延缓衰老的、或对某些疾病防治有效的化学成分如植化合物。 已知很多的天然抗氧化剂就是植化合物。如绿茶叶提取物中的茶多酚有四种儿茶 素。茶多酚是很好的抗氧化剂。 还有许多人工合成的化学物质具有抗氧化作用。但有些人工合成的具有一定 的毒性。从天然物质中提取无毒、安全的抗氧化活性物质是人们在回归大自然的 绿色保健浪潮下的必然选择，所以研究开发天然抗氧化物就成为人们感兴趣的热 点。 2 乳酸菌及其主要生理功能 2 1 - 3 0 1 乳酸菌是指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的 总称。大多数不运动，少数以周毛运动。在其发酵产物中只有乳酸的称为同型乳 酸发酵，而产物中除乳酸外还有较多乙酸、乙醇、c o ：等物质的称为异型乳酸发 酵。有微好氧菌和专性厌氧菌。根据细胞为球状或杆状，可分为两大类，即乳酸 链球菌族( 脚幻c o c c e a e ) 和乳酸杆菌族( l a c t o b a c i l l e a e ) 。乳酸链球菌族， 菌体球状，通常成对或成链，在固体培养基上菌落较小，生长缓慢。多数为同型 发酵，如链球菌属( s t r e p t l c o c c u s ) ，是与人类关系密切的重要菌群。有些菌是 人和温血动物的致病菌；有些是人体的正常菌群存在于口腔和肠道；有些是乳制 品及植物发酵食品中的常用菌，常在食品工业中使用，如乳链球苗( s 1 a c t i s ) 。 少数为异型发酵。乳酸杆菌族，菌体杆状，单个或成链，有时成丝状、产生假分 枝。根据其利用葡萄糖后的产物不同，分为同型发酵群和异型发酵群。多数种可 发酵乳糖，而不利用乳酸、发酵后可将p h 下降至6 o 以下。本族中以乳酸杆菌 属( l a c t o b a c i l l u s ) 最为重要，大多是工业上尤其是食品工业上的常用菌种。存 在于乳制品，发酵植物食品如泡菜、酸菜，青贮饲料，及人的肠道、尤其是乳儿 1 5 肠道中。工业生产乳酸常用高温发酵菌。 乳酸菌不仅具有提高食品营养价值，改善食品风味，延长保存时间，可提高 食品附加值的功能，而且，近年来乳酸菌的特殊生理活性和营养功能，正日益引 起人们的重视。大量研究表明，乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生 态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制内毒素，抑制肠道内 腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体 的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、 衰老过程和突然的应急反应等产生作用。由此可见，乳酸菌的生理功能与机体的 生命活动息息相关。因此，乳酸菌被广泛用于轻工业、食品、医药及饲料工业等 许多行业上。 乳酸菌有维持肠道菌群平衡作用。人体肠道内有数百种细菌，包括有益菌和 有害菌两大类，它们分别集中在肠道的某个部位形成菌群。在机体正常的情况下， 有益菌占优势，此时称为肠道菌群平衡。当宿主机体抵抗力较弱时，有害菌会引 起机体发病。乳酸菌耐酸，适应肠道的生态环境，便于在人体肠道内繁衍增殖， 乳酸菌通过代谢产酸、降低肠内p h 值，或产生抗菌的细菌素，抑制有害菌生长 繁殖，维持生态平衡和正常机能。长期食用含有乳酸菌活菌的食物，可使体内菌 群的协调性增强，提高免疫力。 乳酸菌有增强免疫功能。乳酸菌及其产物拮抗致病菌作用的机理可能与免疫 有关，其作用与佐剂相似，就是通过诱导干扰素，促进细胞分裂，产生抗体，产 生体液及细胞免疫，在许多的乳酸杆菌和双歧杆菌中均有证实。乳酸菌之所以具 有刺激机体产生抗体的作用，可能是由于菌体通过淋巴结、粘膜刺激淋巴细胞， 接受刺激的淋巴细胞再通过肠系膜淋巴结循环到血流中，并分布全身，从而调节 机体的免疫应答作用。 乳酸菌有降低血清胆固醇活性。m a n n 矛! s p e r r y 发现，东非m a s s a i 族人大量 饮用由乳杆菌发酵的乳制品，其体内血清胆固醇含量普遍较低。把嗜酸乳杆菌和 保加利亚乳杆菌混合制成片剂，实验者服用三周后，实验者的血清胆固醇含量下 降，六周后下降显著，对于食用高脂肪者效果更显著。用人粪便中分离的嗜酸乳 杆菌在加有胆固醇的培养基中进行培养，结果随着胆汁酸的生成，培养基中的胆 1 6 固醇含量大大下降，而菌体内的胆固醇含量却显著增加，说明乳杆菌细胞能较好 地吸收胆困醇，通过菌体的新陈代谢，转化成胆汁酸排出体外。 乳酸菌有抗肿瘤活。关于乳酸菌及发酵乳的抗肿瘤活性的研究，始于8 0 年代 初期，研究者们认为，这种活性是由于乳酸菌菌体本身及其代谢产物所致。目前 这一研究已从推测进入实验论证和机理阐明阶段。许多学者正在研究乳酸菌对肿 瘤细胞的拮抗作用、巨噬细胞的激活作用、细胞障碍作用以及干扰素的诱导、菌 落刺激素的诱导和抗病毒等作用及其机理。 乳酸菌有抗突变活性。苏伟等利用a m e s 实验及h p l c 法对3 6 株乳酸菌发酵 上清液进行抗突变活性筛选，筛选出了活性较强的菌株乳杆菌l 2 ，乳杆菌l 2 发酵 上清液经d e a e - s e p h a r o s e 分离纯化，超滤离心以除盐、浓缩，然后对收集样品 进行抗突变活性鉴定，结果其中三管具有较高抗突变活性，活性成分经 s d s p a g e 分析，证明该活性物质为糖蛋白。该糖蛋白中糖组成为4 1 3 卢g m l ， 蛋白质含量约为8 7 2 p g m l ，两者的含量比约为1 ：2 0 。用氨基酸分析仪对各氨 基酸组成进行分析，总氨基酸含量为3 5 9 1 ，其中含量较高的氨基酸为苯丙氨 酸( p h e ) ，其次为精氨酸( a r g ) 。该糖蛋白分子量约为1 0 k d a ，抗突变作用温度 范围2 0 。c 6 0 。0 ，最适温度为3 7 。c ，作用p h 范围是5 9 ，最适p h 为7 0 ， 1 0 m m 5 0 m m 的k + 对糖蛋白活性基本无影响，对活性影响最大的是f e “。 3 乳酸菌的抗氧化活性 对乳酸菌的抗氧化活性的研究，国内外的报道不多，主要集中在日本、美国、 澳太利亚等国家。研究的方向大致可以分为三方面： ( 1 ) 利用化学、物理等方法在体外产生自由基发生体系，加入乳酸菌菌体 或乳酸菌的无细胞提取物，测定它们对自由基的清除能力。 ( 2 ) 利用动物实验，用乳酸菌发酵液喂养动物，测得其血液和肝脏组织匀 浆的一些指标的变化来说明乳酸菌的抗氧化活性。 ( 3 ) 对乳酸菌发酵乳制品的抗氧化活性进行测定研究。 下面就乳酸菌的抗氧化活性这三方面的研究进展以及报道的乳酸菌抗氧化 活性的可能机制做一介绍。 1 7 3 1 乳酸菌的抗氧化活性的体外实验 l j n 等【3 1 1 研究中报道，在对1 9 株乳酸菌包括嗜酸乳杆菌儿a c i d o p h i l u s ) ，保 加利亚乳杆菌( l b u l g a r i c u s ) ，嗜热链球菌( s t t h e r m o p h i l u s ) ，长双歧杆菌 ( 8 i o n g u m ) 的一些菌株的无细胞提取物进行抗氧化实验发现，所有的被研究 菌株对抗坏血酸的自动氧化具有抑制作用，抑制的范围在7 12 ；在金属 离子螯合能力方面，10 1 0 个活乳酸菌的无细胞提取物可螯合f e 2 + 的量为( 2 5 7 2 - 7 ) x 1 0 - e m g l ，其中嗜热链球菌8 2 1 为7 2 7 x 1 0 一m g l 。在清 除h o 实验中发现，1 0 1 0 个活乳酸菌的无细胞提取物清除h o 能力相当于尿酸的 量为0 5 3 3 1m m o l l ，其中嗜酸乳杆菌e 为3 3 1m m o i l 。这19 株乳酸菌都具有 还原能力，但均没有发现s o d 酶的活性。 u n 等【3 23 3 】还在抗脂质过氧化实验中发现，嗜酸乳杆菌与长双歧杆菌的无 细胞提取物对亚油酸过氧化反应的抑制率为3 3 4 6 ；对造骨细胞膜脂质过氧 化反应的抑制率为2 2 3 7 ，对荧光组织色素积累的抑制率为2 0 3 9 ；1m l 无细胞提取物的抗氧化活性的效果相当( 1 0 4 1 7 2 ) x 1 0 。6m g l 丁基化羟基甲苯 ( b h t ) 。嗜酸乳杆菌与长双歧杆菌的无细胞提取物都具有清除膜脂质过氧化反 应产物m d a 的能力，但对叔丁基过氧化氢并无清除能力。进一步研究发现刚， 长双歧杆菌a t c c15 7 0 8 和嗜酸乳杆菌a t c c4 3 5 6 的细胞对亚油酸过氧化反应 的抑制率为2 8 一4 8 ；对d p p h 的清除率为2 1 一5 2 ，对4 一硝基喹啉1 一氧化物 ( 4 n q o ) 细胞毒性的抑制作用分别为9 0 3 1 3 5 0 ，对老鼠血浆脂质过氧化反应 的抑制率为11 2 9 。但这两个菌株的无细胞提取物对4 n q o 的细胞毒性没有 抑制作用。 k u l l i s a a r 等【3 5 】石开究发现，发酵乳杆菌( l ，f e r m e n t u m ) e 3 和e 一8 菌株的细胞 在浓度为1m m o l l 的h 2 0 2 中存活的时间分别为1 8 0m i n 4 r 1 1 5 0r a i n ，而无抗氧化 活性的发酵乳杆菌e - 3 3 8 1 1 的存活时间为9 0m i n 。这两个菌株的无细胞提取物 能抑制对苯二酸加合物( t h a a d d u c t s ) 的形成，抑制率分别为2 7 5 和 2 3 4 2 ，而浓度为15 0m m o l l 还原性谷胱甘肽( g s h ) 的抑 制率为8 4 + - 4 6 ，两菌株细胞裂解物的s o d 酶活性分别为0 8 9 5 0 3 0 9 并n 1 8 0 7 1 6 _ + 0 0 1 4u m g 的p r o t e i n ，经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳证实为m n s o d 。 t a l w a l k a r 等【36 】报道了，双歧杆菌有抗过氧化氢的能力，并发现双歧杆菌的 无细胞提取物有s o d 活性，n a d h 过氧化酶年d n a d h 氧化酶活性。s a i d e 等【3 7 】发 现，乳酸菌有还原活性和抗氧化活性。s o n g i s e p p 等【3 田证实，发酵乳杆菌m e 一3 具有抗氧化和抗微生物活性。 一 a m a n a t i d o u 等【39 】发现，米酒乳杆菌( ls a k e ) 具有抗抗过氧化氢的能力， 并发现米酒乳杆菌的无细胞提取物具有清除羟自由基能力，能螯合亚铁离子，具 有还原活性。表1 1 列举了部分具有抗氧化活性的乳酸菌。 表1 1 有抗氧化活性的乳酸菌 注：+ 已经过体内实验证实。 1 9 3 2 乳酸菌抗氧化活性的体内实验 k a i z u 等【4 0 】利用动物实验检查了乳酸菌的抗氧化活性。两组缺乏维生素e 的大鼠，一组饲喂乳杆菌s b t 2 0 2 8 的无细胞提取物和水：另一组饲喂维生素e ( 4 m g d ) 。结果发现，喂养无细胞提取物和水的大鼠对血红细胞溶血作用的抑制 率分别为9 1 和3 0 ( 维生素e 组视为1 0 0 ) ；肝脏中m d a 的浓度分别为2 5 0 n m o l g 和3 2 0n m o l g ( 维生素e 组为2 0 0n m o l g ) ，血浆中维生素e 的质量浓度分 别为1 4p g m l 年1 1 0p g m l ( 维生素e 组为2 4p g m l ) 。这说明乳杆菌s b t 2 0 2 8 有抗氧化活性，抗氧化效果和维生素e 相近。 i t o 等【4 1 】认为，过量f e 2 + 的摄入会给雄性大鼠( 6 周龄) 的结肠膜造成氧化 压力并引发结肠癌和溃疡性结肠炎。给过量摄2 k f e 2 + ( 饲料中f e 2 + 质量分数为 0 0 7 ) 的老鼠喂食两歧双歧杆菌( b b i f i d u m ) 酸奶( 饲料中质量分数为0 4 ) 。 2 周后，发现老鼠结肠膜上的脂质过氧化程度明显减少，其脂质体中t b a r s 的浓 度为0 4n m o l m g 的p r o t e i n ，而f e “摄入过量的老鼠为0 6 8n m o l m gi 拘p r o t e i n 。 i t o 等 4 2 】在2 0 0 3 年又报道，嗜热链球菌y i t2 0 0 1 釉f e 2 + 引起脂质体中脂质过氧 化有很好的抑制作用。给过量摄入f e 2 + ( 饮食中f e 2 + 质量分数为0 0 7 ) 的大鼠 喂食嗜热链球菌y i t2 0 0 0 ( 2 x 1 0 8 d 1 ) ，2 周后脂质体中t b a r s 的含量明显降低。 t e r a h a r a 等【43 】给雄性大鼠饲料中加入质量分数为1 3 的氧化大豆油和7 新鲜大豆油，再加入质量分数为1 0 的德氏乳杆菌保加利亚亚种( l d e l b r u e c k i i s s p b u l g a r i c u s ) 2 0 3 8 的培养物的冻干粉末( 正常喂养的食物为脱脂奶粉) ，喂 养4 周后发现