（食品科学专业论文）Nisin抗性乳酸菌的筛选及Nisin启动子的克隆.pdf

摘要 摘要 乳酸菌是应用最为广泛的食品级益生菌。虽然我国的乳酸菌资源十分丰富，但对其研究 还处于初级阶段。这也正是给予我们食品工作者的机遇和挑战，大力推进关于乳酸菌的基础 研究和开发应用，利用当今先进的生物技术( 如蛋白质工程、基因工程细胞工程等) 开发 新的优良工程菌株，必将从根本上改变我国传统的乳酸菌利用方式 增进乳酸菌益生作用的途径之一是使其表达一些同源或异源的目的蛋白，这就需要可靠 的表达系统的协助在这方面。国际上广泛使用的是采用n i s i n 启动子的n i c e ( n i s i n - c o n t r o l l e dg e n ee x p r e s s i o n ) 表达系统。启动子作为控制基因转录起始的第一个必要 元件，在表达系统中占有头等重要的地位。推进启动子的相关研究，不仅为以后表达系统的 构建奠定基础，还将使我们更进一步地理解原核生物基因表达调控的过程。 本课题首先通过基本的形态学观察，从传统乳制品中分离乳酸菌；之后采用两倍稀释法 从分离得到的乳酸菌中筛选对n i s i n 具有一定抗性的菌株，然后利用1 6 sr r n a 基因同源性 分析对部分菌株进行鉴定。 以黄色微球菌为指示菌，研究抗性菌株是否产生抑菌物质。对抑菌物质的理化性质( 对 热、p h 和酶处理的稳定性) 与n i s i n 的理化性质进行对比研究。综合对比研究和菌株的鉴 定结果，确定n i s i n 产生菌。 应用p c r 方法，从n i s i n 产生菌中克隆n s 4 启动子片段，之后将该片段插入到启动子 探针型载体p n z 2 7 3 中，通过组织化学的方法检测卢葡糖苷酸酶活性，对克隆的片段进行功 能验证。 结果如下： 本课题共分离出9 0 株形态学观察为乳酸菌的菌株，其中5 0 株为球菌。 采用m r s 固体培养基当n i s i n 的添加量为0 0 0 0 3g m l l 时，5 0 株球菌中有1 5 株能 正常生长。用两倍稀释法对这些菌株的n i s i n 抗性进行的检测表明，大部分菌株对n i s i n 的 抗性不超过0 0 0 1 2 5g m l l 1 5 株能在n i s i n 环境中正常生长的苗中有4 株能产生抑菌物质，并且其中s 7 菌株产生 的抑菌物质在高温处理( 1 2 1 ，1 5r a i n ) 时具有良好的稳定性：酸性条件( p h = 2 ) 下，抑 菌物质的稳定性要好于中性条件( p h - - 7 ) 下：抑菌物质能被a 胰凝乳蛋白酶降解。这些性 质与n i s i n 的理化性质一致。 采用1 6 sr r n a 序列同源性分析将s 7 菌株进行了鉴定，鉴定结果为乳酸乳球菌。 用p c r 方法从s 7 菌株中克隆n i s a 启动子。获得了大小为2 1 4b p 的片段。测序结果表 明该片段与已经公布的n i s i n 启动子序列具有一致性。 将获得的序列连入启动子探针型载体p n z 2 7 3 中，构建了重组质粒p d u 2 7 3 。 将p d u 2 7 3 转化l f 啦n z 9 0 0 0 之后，用2 0 n g m l 。的n i s i n 诱导时，g 4 基因获得 了表达。 本课题主要得出以下结论： 采用两倍稀释法，通过逐步提高环境中n i s i n 的含量来筛选n i s i n 抗性菌株的方法切实 可行 1 6 sr r n a 序列用于细菌鉴定已经成为一项常规的实验技术，随着g e l l b a l l l 【中1 6 sr r n a 序列数据的爆炸式增长，这一技术对细菌的鉴定更加具有快速准确的特点。 本课题中克隆获得的启动子片段能够启动启动子探针型载体p n z 2 7 3 下游报告基因 g u s a 的表达，证明克隆片段具有诱导型启动子的作用，可以作为n i s a 启动子使用。 关键词：乳酸菌；n i s a 启动子；n i c e 表达系统；启动子探针型载体 a b s t r a e t s e l e c t i o no f n i s i nr e s i s t a n ts t r a i n sa n d a m p l i f i c a t i o n o f t h en i s i np r o m o t e rs e q u e n c e a b s t r a c t l a c t i ca c i db a c t e r i a ( l a b ) a r en od o u rt h em o s tw i d e l yu s e dp r o b i o t i c sw i t hf o o dg r a d es t a t u s t h o u g hc h i n aa b o u n d si nt h ei - , e s o u l e e so fl a b t h e i rr e s e a r c hi ss t i l l 越t h ep r i m a r ys t a g e , e x p e e i a l l yo nb a c t e r i o c i u sp r o d u c e db yt h e m ，s u c h 罄n i s i n f u e l e du pb yt h eb a s i cr e s e a r c h e sa n d c o m m e r c i a l l yn s e a g e so f l a b t h ec o n s t r u c t i o no f n e wi n d u s t r i a ls t r a i n sw i t he x c e l l e n tp r o p e r t i e s , s p e c i f i c a l l ye m p l o y i n gt h e a d v a n c e d b i o t e c h n o l o g y ( s u c h a sp r o t e i ne n g i n e e r i n g , g e n a e n g i n e e r i n ga n dc e l le n g i n e e r i n ge t 以) ，n o to n l yc o n f e r sf o o ds c i e n t i s t s g o o do p p o r t u n i t y 龉 w e l la rb i gc h a l l e n g e ，b u ta l s ow i l lf u n d a m e n t a l l yc h a n g et h e n a d i t i o n a la p p l y i n go fl a bi n c h i n a ar e l i a b l e e x p r e s s i o ns y s t e m , l i k ew o r l d w i d ep o p u l a rn i c e ( n i s i n - c o n t r o l l e dg e n e e x p r e s s i o n ) u s i n gt h en i s i np r o m o t e r , i se s s e n t i a li nt r y i n gt oe n h a n c et h eb e n e f i c i a lf u n c t i o n so f l a bw h e ne m p l o y i n gt h e mt oe x p r e s sc c n a i nh o m o - o rh e t e r o l o g o u sp r o t e i n s r e s e a r c h e sr e l a t e d t op r o m o t e r , l n ef o rt h ef o l l o w i n gc o n s t r u c t i o no fg e n ee x p r e s s i o ns y s t e m , a n da l s ol e a d 惜 n e 删t ot h eu n d e r s t a n d i n go ft h ep r o k a r y o t i c e x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o np r c i c l 髂s b e c a u s e p r o m o t e r , 豳t h ef i r s tn e c e s s a r ye l e m e n tt h a te o f i t r e l si n i t i a t i o no fg e n et r a m c d p t i o n p l a y s 吐婚 m o s ti m p o r t a n tr o l ei na l le x p r e s s i o ns y s t e m l a b sw e f ef i r s ti s o l a t e df r o mt r a d i t i o n a l d a i 叮p r o d u c t at h r o u g hb a s i cm o r p h o l o g i c a l o b s e r v a t i o n t h e nt h ei s o l a t e sr e s i s t e dt oc e r t a i na m o u n to fn i s i nw o r es e l e c t e du s i n gt w o f o l d d i l u t i o nm e t h o da n ds o m eo f t h e mw e r ei d e n t i f i e db yt h e1 6 sr r n as e q u e n c i n gm e t h o d t h e s en i s i n - r e s i s t e ds t a i mw r r es c r e e n e da b o u tt h e i ri n h i b i t i n gs u b s t a n c e sp r o d u c t i o nu s i n g m e r o c o c e u s f l a t u s 嬲a ni n d i c a t o r a n dc o m p a r a t i v es t u d i e so nt h ep h y s i e o - e h e m i c a lp r o r x m i e s ( s t a b i l i t yw h e nt r e a t e db yh e a t , p ha n de n z y m e s ) w e 犯c o n d u c t e db e t w e e nt h ei n h i b i t i n g s u b s t a n c e sa n dn i s i n t h en i s i n - p r o d u c i n gs t r a i nw a sd e t e r m i n e db yc o m b i n i n gt h et w or e s u l t so f t h e1 6 sr r n ac h a r a c t e r i z a t i o na n dt h ec o m p a r a t i v es t u d i e s t h en i s ap r o m o t e rf r a g m e n tw a ra m p l i f i e df r o mn i s i n - p r o d u c i n gs t r a i nb yi c ra n di n s e r t e d i n t o p r o m o t e r - p r o b ev e c t o rp n z 2 7 3 。f o l l o w e db yh i s t o c h e m i c a le x p e r i m e n tt o c h e c kt h e 卢g i u c u r o n i d a s ea c t i v i t y , a i m i n ga tv e d f y i n gt h ef u n c t i o no f t h ec l o n e df r a g m e n t t h el e s n i t sw e l ea sf o l l o w s ： f i r s t , 9 0t 出 a l n so fl a bw e t em o r p h o l o g i c a l l ys e l e c t e df r o mt r a d i t i o n a ld a i f yp r o d u c t s c o l l e c t e df r o mi n n e rm o n g o l i a , o f w h i c h ，5 0s t r a i n sw e r ec o c x , o b a c t e r i a s e c o n d , 1 5o u to f 5 0s t r a i n sg r e ww e l lo i lm r sa g a rw h e nt h en i s i nc o n c e r a t i o nw i l l s0 。3 1 0 - 3 9 m l - 1 m o s t o f t h e n i s i n - r e s b t e d s t ：l 面n s d i dn o t g r o wa t t h e n i s i n c o n c e r a t i o n o f l 2 5 x 1 0 - 3 g m l 1 ，a se a s i l ys e e nf r o mt h et w o f o l dd i l u t i o nm e t h o dd e t e c t i o ne x p e r i m e n t i l l 东北农业大学工学硕十学位论文 1 1 1 i r d , 4o u to ft h e1 5n i s i n - r e s i s t e ds b a l n $ p r o d u c e ds o m ek i n do fa n t i m i c r o b i a ls u b s t a n c e s i n h i b i t i n gt h eg r o w t ho fm i c r o c o c c u a 静口吼s a n dt h ei n h i b i t i n gs u b s t a n c ep r o d u c e db yas t r a i n d 蝴a t o ds 7w a ss t a b l ew h e nt r e a t e db yh e a t ( 1 2 1 ，1 5m i n ) t h es u b s t a n c ew a sm o r es t a b l e i na c i de n v i r o n m e n t ( p h = 2 ) t h a ni nn e u t r a l i z e dc o n d i t i o n ( p h = 7 ) a n da - c h y m o t r y p s i n 啪 d e g r a d et h es u b s t a n c e a l lo f t h e s ec h a r a t e r e sw e r et h es a n l e 笛n i s i n f o u r t h t h es 7s t r a i n sm e n t i o n e da b o v ew e r ei d e n t i f i e dt ob el a c t o c o c c u a 1 a c t 括b y1 6 sr r n a s e q u e n c i n g f i s h , a2 1 4b pf r a g m e n te x a c t l yt h es a m et ot h ep u b l i s h e dn i s i np r o m o t e rs e q u e n c ew a s a m p l i f i e df r o ms 7b yp c r s i x t h ，ar e e o m b i n e dp t a s m i dp d u 2 7 3w a se o n s t r u c l e db yi n s e r t i n gt h ec l o n e df r a g m e n ti n t o p r o m o t e r - p r o b ev e c t o rp n z 2 7 3 s e v e n t h ，a f t e rn a n s f o r m e dp d u 2 7 3i n t ol 1 a c t i sn z 9 0 0 0 ，t h eg u s ag e n ew a se x p r e s s e d w h e ni n d u c e db yn i s i na tt h ee o n c e r a t i o no f 2 0n g 。m l f r o mt h i ss t u d y , i tw a sc o n c l u d e d ： f i r s t , t h et w o f o l dd i l u t i o nm e t h o dw a sf e a s i b l ei ns e l e c t i n gn i s i n - r e s i s t e ds t r a i n sb yg r e d i i a i i y i n c r e a s i n gt h en i s i nc o n c e r a t i o n 一 s e c o n d , t h e1 6 sr r n as e q u e n c ei d e n t i f i c a t i o nh a sb e c o m eac o n v e n t i o n a lt e c h n o l o g yi n b a c t e r i ai d e n t i f i c a t i o n a n dw i t ht h e e x p l o s i v ei n c r e a s i n go f1 6 sr r n as e q u e n c e ss u b m i t t e dt ot h e g e n b a n k , t h i st e c h n o l o g yw i l lb em o r ea n di l t o r ep r e v a l e n tw i t hi t sf a s ta n dp r e c i s ec h a r a c t e r t h i r d , i tw a sv e r i f i e dt h a tt h ec l o n e df r a g m e n tc o u l di n d u c ee x p r e s s i o no ft h er e p o r t e rg 别 g e n ei np n z 2 7 3 i n d i c a t i n gs u i t a b l eo s e g ea san b ap r o m o t e r k e yw o r d s ：l a c t i ca c i db a c t e r i a ；n i s ap r o m o t e r ；, n i s i n - c o n t r o l l e dg e n ee x p r e s s i o ns y s t e m ； p r o m o m r - p r o b ev e c t o r i v c a n d i d a t e ：d ul i h u i s p e c i a l i t y ：f o o ds c i e n c e s u p e r v i s o r ：p r o f h u og u i c h e n g 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ! 注! 壅旦遗直墓丝盏塞挂别直明数：奎拦互窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我二同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 、 学位论文作者签名：新主缸争日期：叩年乒月矽日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅a 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文 在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名街互潍日期d 7 年争肌日 导师签名： v 吼垆归切日 前言 1 前言 1 1 课题背景与文献综述 益生菌的定义为：当摄入足量时会对宿主产生有益作用的一类微生物( f a o w h o ， 2 0 0 1 ) 。乳酸菌作为一般认为安全( g e n e r a l l yr e g a r d e d a ss a f e 。g r a s ) 的一类微生物，构成 了益生菌的一个重要组成部分 乳酸菌具有的益生作用包括；降低乳糖不耐症和乳蛋白不耐症的发生( k i m 等1 9 8 3 5 m u s t a p h a 等，1 9 9 7 ) ：降低血液胆同醇( l a l i s a 等，2 0 0 1 ；k h e d k a r 等，1 9 9 3 ) ；改善肠道菌 群平衡和抑制病原菌( b h n n 等，1 9 9 9 ) 以及刺激免疫系统。提高抗癌能力( u l r i c h 等，2 0 0 55 h i d e a k i 等2 0 0 6 ) 等。 1 1 1 抗微生物物质的产生作为一个益生功能 乳酸菌的有益功能之一即其产生细菌素类抗微生物物质的能力，这一功能为其在消化道 中的生存和竞争提供了竞争潜力。细菌素的一般定义为由细菌产生的具有拮抗或杀灭相关或 不相关微生物的肽类物质。n i s i n 是其中最广为人知的例子，它是由乳酸乳球菌乳酸亚种产 生的一种广宿主范围的细菌素，被认为是乳酸菌细菌素的原型( r o g e r s 等，1 9 2 8 1 。从那以 后，n i s i n 被广泛研究并于1 9 6 9 年获得f a o w h o 的批准，作为许多加工食品中的生物防腐 剂使用，其在欧盟的食品添加剂编号为e 2 3 4 ( t w o m e y 等，2 0 0 2 # j d e l v e s 等，2 0 0 5 ) 。这 一批准，加上n i s i n 是第一个被发现的细菌素，使之获得了广泛的商业应用，并引起了人们 对公认安全的微生物产生的细菌素的极大兴趣。因此，这一领域获得了极大增长，并导致了 许多乳酸菌细菌素的发现和详细性质的鉴定。 图1 1 肠道乳酸菌产生细菌素的图示 f i g 1 一lp r o d u c t i o no f b a c t e r i o c i n sb yi n t e s t i n a ll a b 与此同时，研究显示一些肠道和，或益生菌株也有产生抗菌肽的能力( 图1 1 ) 。因此， 许多益生菌细菌素是乳杆菌来源的。尽管菌株在体内的优势与其细菌素的产量相关，但由于 目前很少有体内的研究报道，其竞争优势还不能确定。然而从动物实验可以看出他们对肠道 微生物区系的影响。这些抗微生物物质的代谢将减少肠杆菌科细菌的数量( g a r d i n e r 等， 2 0 0 4 ) 。临床实验也证实，人类饮用l a c t o b a c i l l u s j o h n s o n i i 发酵的酸奶将显著减少幽门螺旋 东北农业大学t 学硕 二学位论文 杆菌( h e l i c o b a c t e r p y l o r i ) 的数量，后者是与胃癌相关的一种病原菌( f e l l y 等，2 0 0 1 ) 。假 如这些抑制物能够消除那些不利微生物，将为其它微生物的存活和繁殖提供明显的机会。 细菌素对复杂微生物区系的影响是非常重要的。其中蛀牙是很好的一个例子，产细菌素 m u t a c i n 的变形链球菌具有替代天然变形链球菌的竞争优势( h i l l m a n ，2 0 0 2 ：1 9 8 5 ；1 9 8 7 ) 。 经过用重组的不产m u t a c i n 的非酸化变形链球菌的浓缩菌悬液处理1 4 年之后。发现使产 m u t a c i n 菌株繁殖的那些物质仍然存在，并且无其他的变形链球菌检出。这一例子清楚地表 明了细菌素在复杂生态系统中的重要潜力。而且，在食品发酵过程中，细菌素对其他微生物 扮演了支配角色。当用产细菌素的植物乳杆菌发酵绿橄榄时，1 2 周的发酵过程中，产细菌 素的菌株数目超过所有其他自然产生的杆菌数目( r u i z - b a r b a 和j i m e n e z - d i a z ，1 9 9 4 ) 相 反，7 周之后就己检测不到细菌素阴性菌株了。这些证据表明细菌素在影响复杂微生物群体 的过程中扮演着晟重要的角色。筛选新奇的且对其他微生物有选择优势的产细菌素菌株的工 作每天都在进行。所以。挖掘肠道微生物区系的宏基因组中新奇细菌素和抗微生物物质的信 息可为益生菌的筛选提供一个比较理想的方法。 1 1 2 细菌素分类 一般而言，细菌素是由核糖体合成的多肽，产生细菌素的微生物自身具有免疫性，它们 正常情况下都会经过一定程度的转录后修饰成熟的分泌肽常常含有2 0 到6 0 个氨基酸具 有微生物活性( j o e r g e r 和k l a e n h a m m e r ，1 9 8 6 ) 几乎所有的细菌素肽类在中性或微酸性条 件下都会带有一定量的净电荷，它们常常包含较长序列的疏水基团或两性基团( e i j s i n k 等， 2 0 0 2 ) 。随着细菌素种类的不断增多，它们之间在结构和活性方面的重要不同越来越明显， 这也意味着对其分类也将持续更新。目前的分类方法将细菌素主要分为3 类( 见表i - li t a m i m e ，2 0 0 5 ) 。 1 1 2 1c l a s si 羊毛硫胺素 羊毛硫胺素是一类小分子的修饰肽。含2 0 5 0 个以上的氨基酸分子，活性部分有羊毛 硫氨酸、b - 甲基羊毛硫氨酸和脱氢丙氨酸等非编码氨基酸。最近，t w o m e y 等( 2 0 0 2 ) 根据 初级序列的比对将羊毛硫胺素进一步细分为6 个亚组( 表1 1 ) 。他们含有一系列独特的性质， 包括复杂性，转录后修饰的肽段中含有非常见氨基酸羊毛硫胺酸和甲基羊毛硫胺酸，后 者构成了分子内的环状结构( 硫醚) ( m e a u l i f f e 等，2 0 0 0 ) 。许多羊毛硫胺索也包含其他的 修饰残基，例如脱水氨基酸，胁丙氨酸残基( s k a u g e n 等，1 9 9 4 ；r y a n 等，1 9 9 9 ) ，以及n 末端的a 酮胺结构( k e l l n e r 等，1 9 9 1 ) 。大部分已鉴定的羊毛硫胺素似乎具有一个相同的作 用模式，即在目标微生物质膜上形成孔洞，造成细胞内物质的外流，进而使质子驱动力消失 ( g a r c i a 等1 9 9 3 ；m o n t v i l l e 和b r u n o ，1 9 9 4 ；m o l l 等，1 9 9 6 ) 。有趣的是，有些这类细菌 索还采用结合到细胞壁型脂蛋白上的机制。因此。它们具有包括抑制细胞壁合成的双重机 制( b r o t 7 等，1 9 9 8 a ；1 9 9 8 b ) 。明确的是，许多羊毛硫胺素，如m e r s a c i d i n 和l a c t i c i n31 4 7 ， 具有一个相同的模块，在m e r s a z i d i n 已经证明可以参与与n 型脂蛋白的交互作用( b r o t z 等， 1 9 9 8 a ) 。 2 前言 9 i i i i 表1 一l 乳酸菌产生的细菌素的类型 t a b 1 - ic l a s s i f i c a t i o no f b a c t e r i o c i n sf o rl a c t i ea c i db a c t e r i a 类型亚型名称乳酸菌 c l a s sl ；羊毛硫胺素 s u b g r o u pl - n i s i n n i s i n l ，a c a s b 印a c t l i s u b g r o u pi l - l a c t i c i n4 8 1p l a n t a r c i nc l b p l a n t a r u m s u b g r o u pl l l - - m e r s a c i d i n p l a n t a r c i np l w a l b p l a n t a r u m s u b g r o u pi v - l m a 2 p l t a r d n # w bl b p l a n t a r u r a s u b g r o u pv - c y t o l y s i sg r o u p c y t o l y s i nc y i l l e f a e c a l i s s u b 踟o c i nsb 椭s l b s a k e c l a s s l h 细菌素s u b c l a s s l l a - 类片球菌素a c i d o c i n a l b a c i d o p t u l u s t k g o i s a c i d o c i nc h 5 l b a e i d o p h i h c h 5 b a v a r i c i n al 6 fs a k em 1 4 0 l b i f i d o c i n1 4 5 4 最b i # t u m c i i r v l i n al b e u r v a t u a 删1 1 7 4 b a v a r i c i nm n6 s a k em n s u b c l a s si i b _ 两肽 s a k a c i l l ta s a k a c i ng s a k a c i np a b p 1 1 8 a c i d o c i nl f 2 2 1 a c i d o c i ni l l 3 2 l a c t a c i nf l a c t o b i n a l a c i o c i n7 0 5 p l a m a r c i ne f p l a n l a r c i n j k p l m t a t c i nn c 8 p l a m a r c i ns a c i d o c i nb g a s s e c i n a l b & 妇l b 7 0 6 l b j 鲥唯2 5 1 2 l b s a k el b 6 7 4 l b u d l v a n t a b 舡 s a l i v a r i u su c c l l 8 l b g a s s e r i l f 2 2 1 l b a c u o p h j c m1 1 3 2 l b , j o h n s o n i i 1 1 0 8 8 l b a m y l o v o r u sl m g p 1 3 1 3 9 l b c a s e i c r l 7 0 5 l b p l a n m u mc i i p l a n t a r u mc 1 1 l b p l w m w u m n c 8 l b p l a n t a r u ml p c o i o l b a c i d o p h i l u am 4 6 l b g a a s e r i l a 3 9 c l a s s l l l ；细菌素c l a s s h ih e l v e t i c i njl b l v e t i c u s 4 8 1 h e l v e t i c i nv 1 8 2 9 laetaeinb l b a c i d o p h i l u s n 2 乳酸菌的几种羊毛硫胺素的基因元件已经鉴定出来，其中有n i s i n ( k a l e t t a 和e n t i a n ， 1 9 8 9 ：k u i p e r s 等，1 9 9 3 ) ，l a c t i c i n3 1 4 7 ( r y a n 等，1 9 9 9 ) ，c y t o l y s i n ( g i l m o r e 等，1 9 9 4 ) ， 东北农业大学丁学硕t 学位论文 ri 量量皇量量曼皇量曼量曼量曼曼皇曩 l a c w c i ns ( s l a u g 等，1 9 9 4 ) ，l a e t i c i n4 8 1 ( v a nd e n h o o v e n 等，1 9 9 6 a ) 和p l a n t a r a e i n w ( h o l o 等，2 0 0 1 ) 。同时，也有一些羊毛硫胺素的高解析度性质得以阐明包括n i s i n ( v a nd e n h o o v e n 等，1 9 9 6 b ) ，m e r s a e i d i n ( p r a s c h 等，1 9 9 7 ) 和 a e t i c i n3 1 4 7 ( m a t t i n 等，2 0 0 4 ) 。为了揭示 参与免疫，转录后修饰作用的模式以及结构与功能之间更精确的机制，进一步的投入是很重 要的。从益生的角度看，羊毛硫胺素族细菌素因其抑菌谱非常之宽，从中等到相当广泛，因 此是最令人感兴趣的细菌素。 1 1 2 2c l a s si i 细菌素 c l a s si i 细菌素的相对分子量较小( 1 0k d a ) ，是非修饰的热稳定细菌素，包括三个亚 组( 见表1 1 ) 。 l 亚组i i a 亚组i i a 中最著名的成员是p e d i o c i n 样细菌素。他们以n 末端的一致序列模块 y g n g v x c x x x x c x v 为特征，其中含有两个半胱氨酸，可以形成二硫键桥( e i j s i n k 等 2 0 0 2 ) 。这一亚组由于其强大的抗李斯特菌活性而引起人们的很多注意。b i f i d o c i nb 是这一 亚组的成员，由且b j f i d u mn c f b1 4 5 4 产生，是目前唯一经完全鉴定的双歧杆菌细菌素 ( y i l d i r i m 等。1 9 9 9 ) 。b i f i d o e i nb 对许多食品病原菌和食品腐败菌都有活性。例如李斯特菌 属，肠球菌属，芽胞杆菌属，乳杆菌属，明串珠菌属和片球菌属。质粒消除试验显示b i f i d o c i n b 的基因决定簇位于一个8k b 的质粒上。 2 亚组i i b 这是一族需要两个肽段同时存在才能表现其完全活性的双组分细菌素( 见表1 1 ) 。 l a c t a c i nf 和p l a n t a r i c i nn c 8 是这一亚组的成员，两者都需要两个肽段来表现其完全活 性。由l b j o h n s o n i iv p i1 1 0 8 8 产生的l a c t a c i nf 具有相对较窄的抑菌谱，只对亲缘关系很 近的细菌表现活性( a b e e 等，1 9 9 4 ) 。另一个例子是由植物乳杆菌n c 8 产生的p l a n t a r i c i nn c 8 ， 只在与其他革兰氏阳性菌如片球菌属，乳球菌属和李斯特菌属共培养时才产生( m a l d o n a d o 等，2 0 0 4 ) 。最近，一种由l a c t o b a c i l l u s s a l i v a r i u ss u b s p s a l i v a r i u su c c l l 8 产生的新的双组 分细菌素a b p 1 1 8 被分离并鉴定出来( f l y n n 等，2 0 0 2 ) 。这株菌是从人类肠道中分离得到 的，编码a b p - l1 8 的基因位于其染色体上。它表现出广泛的抑菌谱，并能抑制医学上的重 要病原菌如芽胞杆菌属，李斯特菌属，肠球菌属和葡萄球菌属。尽管这一产细菌素菌株对人 类健康的作用仍待评估，但其宽的抑菌谱应该可为该菌在消化道中的复杂微生物环境中提供 竞争优势。 3 亚组i i c 所有非羊毛硫胺素细菌素中不属于前两组的部分构成了这一亚组细菌素，包括分泌依赖 型细菌素。表1 - 1 中包括两种这类细菌素，其一是g a s s e r c i n a ，由分离自人类婴儿粪便中的 l b g a s s e r il a 3 9 菌株产生( k a w a i 等，1 9 9 4 ) 由染色体编码，具有非常见的循环结构，对 于许多食品病原菌都有抑制活性，包括李斯特菌，蜡样芽胞杆菌和金黄色葡萄球菌。 1 1 2 3c l a s sh i 细菌素 ， c l a s sh i 细菌素是大的热不稳定蛋白。其中只有很少的几种由乳杆菌和双歧杆菌产生的 4 前言 细菌素有所报道。这类细菌素的鉴定较少，其中的例子有由l b h e l v e t i c u s4 8 1 产生的 h e l v e t i c i nj ( j o e r g e r 和k l a e n h a m m e r ，1 9 8 6 ) ，l b h e l v e t i c u s1 8 2 9 产生的l i e i v e t i c i nv v a u 曲a n 等，1 9 9 2 ) 和l b a c i d o p h i l u 日n 2 产生的l a c t a c i nb ( b a r e f o o t 和k l a e n h a m m e r ，1 9 8 4 ) 。它们 都有一个较窄的抑菌谱，并只拮抗亲缘关系很近的菌属。 1 1 3n i s i n 以及n i s i n 合成的调控 n i s i n 是c l a s si 羊毛硫胺素中的一员，它是一个由3 4 个氨基酸组成的具有抗菌作用的 小肽，包含有多种稀有氨基酸和5 个环结构。n i s i n 首先与型脂蛋白结合后在细胞质膜上 形成孔洞，造成细胞内包括a t p 在内的小分子泄漏，最终导致细胞死亡( h a s p e r 等，2 0 0 4 ) 。 由于其杀菌谱广，因而n i s i n 作为防腐剂而在食品工业上广泛应用。n i s i n 最初在核糖体上形 成n i s i n 前体，然后该前体分子经过酶的作用进行特定的化学和结构修饰，最后，经过修饰 的分子定位到细胞膜上并分泌到胞外，形成成熬的分子( k l e e r e b e z e m 等1 9 9 7 b ) 。n i s i n 的 生物合成是由一个1 1 个基因组成的基因簇控制的( 图i - 2 ) ，在这1 1 个基因中的第一个基因 n i x 4 。编码n i s i n 的前体，其他基因参与该蛋白合成过程中的修饰，转运及外泌( n i s b ，n i s c ， n i s p ，h i s d 以及对n i s i n 的免疫( n i s l , n i s f , n i s e ，n i s g ) 和n i s i n 基因的表达调控( n i s r ， n i s k ) ( k l e e r e b e z e m 等，1 9 9 9 ：k u i p e r s 等，1 9 9 5 ) 。n i s r 和n i s k 属于细菌中的双组分信号 传导系统家族，n i s k 是位于细胞膜上的组蛋白激酶，被认为起成熟n i s i n 受体的作用，当 n i s i n 与n i s k 结合时，n i s k 蛋白自动磷酸化，然后将磷酸基团转移给n i s r ，磷酸化的n i s r 扮演了反应调节蛋白的角色该活化的n i s r 诱导n i s i n 基因簇中三个启动子中的两个起始 转录：b m 和r 。而启动n i s r 和n i s k 表达的启动子不受影响( i o a i p e r s 等，1 9 9 8 ；k l e e r e b e z e m 等，1 9 9 9 ；d er u y t e r 等，1 9 9 6 ) 。 p 牢n i s ap n i s r kp n i s f a btczpr xf嚣g 图1 2n i s i n 基因簇的图示 f i g 1 - 2s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f t h en i s i ng o n ec l u s t e r 注：黑色箭头表示基因簇中的三个启动子赡d 表示n s a 启动子。：n i s i n a 的结构基因；口，nc 和 参与n i s i n 修饰，转运和外泌的基因；，只e 和g # 参与对n i s i n 的免疫；r 和k ：参与对n i s i n 基 因簇的表达调节 1 1 4n i s i n 控制的基因表达系统 n s a 启动子的转录起始依赖于n i