（食品科学专业论文）内蒙古酸粥中乳酸菌生物学特性及功能性研究.pdf

摘要 从内蒙古地区的传统谷物发酵食品一酸粥中分离并鉴定了1 3 株乳酸菌，这1 3 株乳酸菌均为乳杆菌属，其中菌株n s z l 一2 ，n s z l 1 2 为鼠李糖乳杆菌，菌株n s z l - i i 为干酪乳杆菌。 在体外测试了这1 3 株乳杆菌耐酸、耐胆汁、耐胆盐、抑茵能力及降胆固醇能力。 结果表明，菌株n s z l 一2 、n s z l 一3 、n s z l 一5 、n s z l 一8 、n s z l 1 0 、n s z l l l 和n s z l 一1 2 在p h 3 0 的条件下存活率在5 0 以上；菌株n s z l - i 、n s z l - 2 、n s z l - 4 、n s z l - 7 、 n s z l - i o 、n s z l - i i 、n s z l - 1 2 对胆固醇的降解率在5 0 以上；这1 3 株菌的代谢产物对 伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均有良好的抑制效果，对金黄色葡萄球菌的 抑制效果稍差。结合这些菌株的耐胆汁、耐胆盐试验中的结果，菌株n s z l - 2 、 n s z l - i1 、n s z l - 1 2 具有良好的生物学特性，有可能成为潜在功能性菌株。 对潜在功能性菌株n s z l - 2 、n s z l 一1 1 和n s z l 1 2 的乳中发酵特性，凝乳前及凝 乳后4 。c 储藏期间的产酸特性，活菌数变化，脱水特性，吸光值变化及黏度变化等进 行研究。发现分别接入这三株菌的发酵乳在1 2 h 时均出现凝乳现象，此时酸度接近工 业生产要求酸度，4 。c 冷藏2 8 d 时活菌数可达i 0 7 c f u m l ，可见它们都有较高的耐冷藏 性。接入这三株菌的发酵乳在冷藏期间有少量乳清析出，属于正常现象。 关键词：乳杆菌：耐酸：耐胆汁；耐胆盐；抑菌；降胆固醇 s t u d yo nb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i ca n df u n c t i o n a l i t yo f t h el a c t i c a c i db a c t e r i as e p a r a t e df r o ma c i d g r u e li ni n n e rm o n g o l i a a b s t r a c t 13l a c t i ca c i db a c t e r i a sw e r es e p a r a t e df r o mt r a d i t i o n a lf e r m e n t a t i o nf o o da c i d g r u e l i ni n n e rm o n g o l i aa n di d e n t i f i e d t h e yw e r ea l ll a c t o b a c i l l u s a n dn s z l - 2a n dn s z l 一12 b e l o n gt ol a c t o b a c i l l u sr h a m n o s u s ，n s z l - 1 1b e l o n g st ol a c t o b a c i l l u se a s e l t h ec h a r a c t e r i s t i c so ft h e s es t r a i n s ，i n c l u d i n ga c i dr e s i s t a n c e ，b i l et o l e r a n c e ，c h o l a t e t o l e r a n c e ，b a c t e r i o s t a s i s a c t i v i t i e sa n d c h o l e s t e r o l - r e d u c i n ga b i l i t yw e r ed e t e r m i n e d t h r o u g hv i t r ot e s t t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h es u r v i v a lr a t eo fs o m es t r a i n s ，s u c ha sn s z l 一2 ， n s z l 3 ，n s z l - 5 ，n s z l - 8 ，n s z l 1 0 ，n s z l - 1 1a n dn s z l 一1 2 ，c o u l db ee x c e e d i n g5 0 a tp h 3 0 a n dd e c o m p o s i t i o nr a t eo fc h o l e s t e r o lo fs o m es t r a i n s ，n s z l 1 ，n s z l 一2 ， n s z l - 4 ，n s z l 一7 ，n s z l 1 0 ，n s z l 11a n dn s z l - 1 2 ，c a l lb eu pt o5 0 t h em e t a b o l i t e s o ft h e13l a c t o b a c i l l u sc o u l dg r e a ti n h i b i tt h eg r o w i n go fs a l m o n e l l at y p h le s c h e r i c h & c o l i ， b a c i l l u ss u b t i l i sa n dh a dt h ep o o ri n h i b i t o r ya c t i o no ns t a p h y l o c o c c u sa u r e u s i naw o r d ， l a c t o b a c i l l u sn s z l - 2 ，n s z l 一11a n dn s z l - 12w e r eo fg o o db i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n d m a 、b et h ep o t e n t i a lf u n c t i o n a l i t ys t r a i n s m o r e o v e r , t h ep o t e n t i a lf u n c t i o n a l i t ys t r a i n sw e r es t u d i e dd e e p l yo nt h ef e r m e n t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s ，a c i dp r o d u c i n ga b i l i t y , t h ec h a n g eo fv i a b l ec o u n t , s y n e r e s i sc h a r a c t e r i s t i c s ， t h ec h a n g eo fo da n dt h ec h a n g eo fv i s c o s i t yi nf e r m e n t a t i o nm i l k a f t e rb e i n gi n o c u l a t e d w i t ht h e s el a c t o b a c i l l u s ，t h ef e r m e n t a t i o nm i l kc o u l dc u r d e di n12 h ，a n dt h ea c i d i t ) ，c l o s e d t or e q u i r e m e n t so fi n d u s t r a lp r o d u c t i o na tt h i sm o m e n t d u r i n gt h ec o l ds t o r a g e ，t h e r ew e r e 1 0 。c f u m ll i v i n gb a c t e r i a si nf e r m e n t a t i o nm i l ka f t e r2 8 d , a n dal i t t l ew h e yp r e c i p i t a t i o n a p p e a r e d k e yw ords ：l a c t o b a c i l l u s ；a c i dr e s i s t a n c e ；b f 彪t o l e r a n c e ；c h o l a t et o l e r a n c e ； b a c t e r i o s t a s i sa c t i v i t y ；c h o l e s t e r o l - l o w e r i n g dir e c t e d b y ：p r o f t h e nz h o n g j u n a p pi ic a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：w a n gxia n g z h u ( f o o ds c i e n c e ) ( c o l l e g eo f f o o ds c i e n c ea n de n g i n e e r i n g , ，i n n e rm o n g o l i a a g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y ，h u h h o t0 1 0 0 1 8 ，c h i n a ) 1 表1 2 表2 3 表3 4 表4 5 表5 6 表6 7 表7 8 表8 9 表9 1 0 表1 0 1 1 表1 1 1 2 表1 2 1 3 表1 3 1 4 表1 4 插图和附表清单 糖发酵试验各种糖类一览表7 在p h3 0 的m r s 液体培养基中菌株o h 及2 h 活菌数1 8 在p h3 0 的m r s 液体培养基中各乳杆菌菌株的生长情况1 9 菌株在不同培养基中0 d 啪值随时间变化表2 0 菌株在不同培养基中0 d 值增长0 3 个单位所需时间及l t 2 0 各菌株在不同培养基中4 h 后的活菌数及菌悬液浓度2 2 各活菌数统计后结果2 3 各菌株对胆固醇的降解率2 4 指示菌的浓度及能出现明显抑菌圈时的浓度2 6 各抑菌圈直径2 7 乳杆菌在发酵乳中的产酸能力2 7 乳杆菌在发酵乳中活菌数及o d 值的变化3 0 发酵乳不同时期的粘度变化。3 7 乳杆菌所在发酵乳脱水收缩力变化3 8 1 5 图l牛津杯放置示意图1 2 1 6 图2m r s 培养基上的菌落形态图3 改良m c 培养基上的菌落形态。1 4 1 7 图4菌株生长曲线图。1 7 l8 图5 在p h3 0 的m r s 液体培养基中菌株2 后的存活率图1 9 1 9 图6 菌株o d 6 0 0 增长o 3 个单位所需时间示意图2 l 2 0 图7各菌株l t 对比图21 2 1 图8各菌株对胆固醇的降解率示意图。2 5 2 2 图9供试乳杆菌在发酵乳中产酸动态变化曲线。2 9 2 3 图1 0g o m p e r t zm o d e l 拟合的凝乳前发酵乳中菌株n s z l - 2 的生长模型3 3 2 4 图11 l o g i s t i cm o d e l 拟合的凝乳前发酵乳中菌株n s z l 3 的生长模型3 3 2 5 图1 2r i c h a r d sm o d e l 拟合的凝乳前发酵乳中菌株n s z l 5 的生长模型3 4 2 6 图1 3l o g i s t i cm o d e l 拟合的凝乳前发酵乳中菌株n s z i , 1 0 的生长模型3 4 2 7 图1 4g o m p e r t zm o d e l 拟合的凝乳前发酵乳中菌株n s z l 1 l 的生长模型3 5 2 8 图1 5l o g i s t i cm o d e l 拟合的凝乳前发酵乳中菌株n s z l 1 2 的生长模型3 5 2 9 图1 6 冷藏期间浊度的变化随线。3 6 3 0 图17 发酵乳粘度变化( a ) 3 7 31 图l8 发酵乳粘度变化( b ) 。3 7 3 2 图1 9 脱水收缩力变化图。3 9 内蒙古农业大学研究生学位论文独创声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 括为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：， 至邂笙1 日 期：也乏：! 笙 导师指导研究生学位论文的承诺 本人承诺：我的研究生至塑塑 所呈交的学位论文是在 我指导下独立开展研究工作及取得的研究结果，属于我现任岗位职务 工作的结果，并严格按照国家及学校有关学术道德规范的规定要求而 获得的研究结果。如果违反，我必须接受按国家及学校有关规定的处 罚处理并承担相应导师连带责任。 指导教师签名：匦垒璺 日 期： 五盟：! 内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，即：研 究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学。本 人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙 古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业 大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电 子文档，允许论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部 分内容( 保密内容除外) ，采用影印、缩印或其他手段保存论文 论文作者签名：至塑笪 指导教师签名：堕堕至 日 期：加z 墨、盥 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 1 引言 1 1 研究背景 乳酸菌是一类能利用可发酵的糖产生大量乳酸的细菌通称。广泛存在于人和动物 肠道及其它器官内，在许多人类食品、动物饲料、自然界的河水湖泊中也有大量乳酸 菌存在。 人类利用乳酸菌的历史由来已久，最初人们只是无意识地利用天然乳酸菌代谢产 生的酸作为保藏食品的一种手段。2 0 世纪6 0 年代，随着微生物学、营养学、医学等 学科的迅速发展，人们对乳酸菌的应用与开发研究也越来越深入。乳酸菌不但能发酵 产酸使制品p h 值下降，延长保质期，同时能产生特有的风味物质，赋予制品良好的 组织质地与风味；另外还能产生一些特殊抗菌物质，使制品具有良好的保健和医疗作 用。当其存在于人体肠道中的数量达到一定量后，具有能够改善、调整人体肠道中菌 群平衡，缓解乳糖不忍耐症的发生，改善便秘，增强机体免疫力，降低胆固醇水平等 医疗保健作用。目前，乳酸菌已被广泛地运用于食品、保健以及医疗制品的许多方面。 科学家们不断的对乳酸菌进行研究，包括分离、培养、鉴定、命名、分类、生理、生 态、遗传、应用和机理等方面。 随着科技发展，临床医学、悉生生物学、微生物学和食品科学相互渗透，使有关 方面的研究有了更加深入的发展，世界各国对乳酸菌及其制品，特别是精选肠道乳酸 菌的研究开发由为重视，仅日本就有各种乳酸菌发酵乳制品及医药制剂近百种。 随着改革开放的发展，我国乳酸菌及其发酵制品的研究开发也得到了很大的发 展。随着我国人民生活水平的提高，消费意识和观念的转变，人们的饮食结构逐渐从 温饱型向营养型转变，越来越多的人们要求食品具有保健作用，而乳酸菌制品则是能 够满足人们保健作用愿望的食品群之一。 1 2 乳酸菌的生理功能 1 2 1 增强机体免疫力 简单说来，免疫就是机体抗感染的防御功能。过去概念认为免疫是机体对病原生 物( 微生物、寄生虫) 以及其有害产物( 如毒素) 的不同程度的抵抗力。随着免疫学 的发展，免疫的范围越来越广，目前认为免疫对机体有三种功能： ( 1 ) 防御功能：抗感染或防止其它抗原异物入侵。 ( 2 ) 自我稳定：清除衰老、死亡或损伤的细胞。 ( 3 ) 免疫监视：消灭突变的细胞。 由此可见，免疫是机体的一种保护性生理反应，即通过自身调节排除抗原性异物 ( 病原生物及其它物质、衰老的自身细胞、突变生成的异常细胞等) ，以维持机体内 环境的平衡和健康的作用。 如果机体免疫机能降低，则对外界环境和疾病的抵御能力减弱，容易产生疾病， 2 内蒙古酸粥中乳酸菌生物学特性及功能性研究 特别是容易受感染，出现免疫综合症，容易发生肿瘤等。 有关乳酸菌或含有乳酸菌的发酵乳制品进行免疫调节和免疫刺激的研究目前越 来越受到人们关注。y a m a z k i n 3 对长双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i u ml o n g u m ) 预防细菌侵入 机体进行研究，p e r d i g o n 心3 分别对干酪乳杆菌( 1 a c t o b a c i l l u sc a s e i ) 、保加利亚乳杆菌 ( 1 a c t o b a c i l l u sb u l g a r i c u s ) 、嗜酸乳杆菌( 1 a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ) 及嗜热链球菌 ( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ) 刺激机体免疫系统的作用进行了研究。研究结果表明， 服用含有活性乳酸菌发酵乳( 1 0 9 c f u m l ) 的小白鼠，其巨噬细胞和淋巴细胞都被激 活；与对照相比，给感染鼠伤寒沙门氏茵的小白鼠服用嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌混和 制剂后，小白鼠在2 1 d 中的存活率为1 0 0 。k i t a z o 口1 用嗜酸乳杆菌诱导淋巴细胞，结 果表明，无数巨噬细胞被激活，而且从根本上增强了巨噬细胞抑制癌细胞增殖的作用。 m e s t e c k y h l 、p o u w e l s 、v a nd a m m e 嫡1 研究表明，口服乳酸菌疫苗可以直接诱导免疫 系统，使抗原抗体结合，增强机体免疫能力。 乳酸菌和双歧杆菌除抑制肠道内病原菌和其它有害细胞繁殖外，还能促进消化酶 分泌和肠道蠕动。乳酸死菌被分解后，其有效成分被机体吸收，能增强人体免疫力。 同时，乳酸菌及其代谢产物能通过诱导产生干扰素和促进细胞分裂剂，活化n k 细胞 并促使免疫球蛋白抗体的产生，从而活化巨噬细胞的功能，提高机体免疫力，增强对 癌症的抵抗能力。 故乳酸菌能够增强机体免疫力，表现在两方面：一是影响非特异性免疫应答， 增强单核吞噬细胞( 单核细胞和巨噬细胞) 、多形核白细胞的活力，刺激活性氧、溶酶 体酶和单核因子的分泌；二是刺激特异性免疫应答，如加强黏膜表面和血清中i g a 、 i g m 、i g g 水平，促进t 、b 淋巴细胞的增殖，加强机体的免疫力。 1 2 2 缓解乳糖不耐症 乳制品中乳糖含量很高，如牛奶含有丰富的乳糖，一般在4 5 5 2 之间，因 地区、饲料、品种不同而异。乳糖在消化道中须经乳糖酶的作用，水解为葡萄糖和半 乳糖后被吸收。当乳糖酶因先天性、原发性、或续发性等原因而导致活性降低或缺乏 时，乳糖无法被水解，从而产生渗透压的影响效应。一方面，这使消化道中液体负载 增加，加速肠道蠕动，导致水样腹泻。另一方面，乳糖在肠道中亦可能被细菌发酵产 生乳酸和二氧化碳，前者会使肠道中液体载负量增加，使肠壁扩张与加速蠕动，而二 氧化碳等气体的产生，则会有腹胀、腹痛或放屁等现象。上述因乳糖不能被消化吸收 所导致的种种影响，称为乳糖不耐症。 k i m 和g i l l i l a n d 1 研究表明，服用接入嗜酸乳杆菌而未发酵奶( 活菌数达到2 x i 0 8 c f u m l ) ，7 d 后乳糖的利用率明显增加。 饮用酸奶也可以缓解乳糖不耐症，因为酸奶在加工过程中，在乳酸菌的作用下， 也有一部分乳糖被转化。p o c h a r t 口1 等观察到8 名具有非常抑郁及腹泻的乳糖不耐症 内蒙古农业大学硕士学位论文 3 者饮用酸奶后，症状消失。 1 2 3 抑制肠道腹泻和病原菌 研究资料表明，乳酸菌对一些腐败菌和低温细菌有较好的抑制作用，可用于防治 腹泻、下痢、肠炎、便秘和由于肠道功能紊乱引起的多种疾病【8 】。其抗菌机制主要表 现在以下几个方面：产生的乳酸等有机酸能显著降低环境p h 值和e h ( 氧化还 原电位) 值，使肠内处于酸性环境，对于致病菌如痢疾杆菌( d y s e n t e r yb a c i l l o 、伤寒杆 菌( s a l m o n e l l a 卯乃力、副伤寒杆菌( p a r a t y p h o i db a c i l l i ) 、弯曲杆菌o q e c t o b a c i l l u s ) 、葡萄 球菌( a u r e u s ) 等有拮抗作用。产生的过氧化氢能够激活牛乳中的过氧化氢酶硫氰 酸系统，抑制和杀灭革兰氏阴性茵、过氧化氢酶阳性细菌( 如假单孢菌属) 、大肠杆 菌类和沙门氏菌属等。产生类似细菌素的细小蛋白质或肽类，如各种乳酸杆菌素 和双歧菌素，对葡萄球菌、梭状芽孢杆菌( c l o s t r i d i u m ) 、沙门氏菌( s a l m o n e l l a ) 和志贺 氏菌( s h i g e l l a ) 有拮抗作用。 1 2 4 降低胆固醇水平 大量临床试验证实，服用乳酸菌及相关制品可减少人体血清胆固醇含量，降低 心脑血管疾病发病率。但是有关乳酸菌降低胆固醇水平的作用机理还不十分清楚，目 前存在的看法有： ( 1 ) 吸收( 包埋) 理论 研究表明，在厌氧条件下，益生乳酸菌菌体细胞会吸收( 包埋) 介质中的胆固醇， 从而降低其胆固醇含量嘲。2 0 世纪8 0 年代初，g i l l i l a n d n 町等对分离自猪肠道的 上a c i d o p h i l u s p 4 7 进行了体外和体内的降低胆固醇含量的研究，以 p p l o ( p 1 e u r o p n e u m o n i a l i k eo r g a n i s m ，类胸膜炎体) 血清提取物作为培养基中胆固 醇的来源，同时准备了不同胆盐浓度的培养基，接种后厌氧培养，离心测定发现上清 液胆固醇含量明显降低，而菌体细胞中的胆固醇含量明显增加，从而证实了菌体对胆 固醇具有吸收( 包埋) 作用。 ( 2 ) 共沉淀理论 研究发现，乳酸菌在生长过程中降解介质中的结合胆盐释放出游离胆酸，在p h 值不高于6 0 时，后者的溶解度比结合胆盐的溶解度小，与胆固醇形成复合物共沉淀 下来，达到降低介质中胆固醇含量的目的n 1 。1 3 1 。 这种共沉淀去除胆固醇可能的机理有两个：胆固醇的溶解度取决于胆盐的溶 解度。胆盐转化成游离胆酸后，溶液吸附到膳食成分和菌体上，由于溶解度下降，从 而致使胆固醇共沉淀析出。在体内，游离胆酸不被人体重新吸收而随粪便排出， 减少了其在肠肝的循环次数，从而增加了胆酸的生物合成。由于胆固醇是合成胆酸的 前体，部分胆固醇转化成胆酸，补足被排出体外而损失的胆酸部分，加速了胆固醇的 4 内蒙古酸粥中乳酸菌生物学特性及功能性研究 代谢，引起胆固醇浓度的降低。因此，一些研究人员认为口服高胆盐水解酶活力菌株 可以减少肠道胆汁酸的重复吸收，加速胆汁酸的排泄，从而达到降低血清胆固醇浓度 的目的。 ( 3 ) 其它理论 鉴于乳酸菌降低胆固醇的效果受多种因素的影响，其作用方式随所采用的菌种和 测试对象有很大的差别。对于嗜酸乳杆菌降低胆固醇的作用，部分研究人员倾向于菌 体吸收和胆固醇共沉淀协同作用的观点，而且不同条件下乳酸菌会表现出以某种方式 ( 吸收或共沉淀) 为主的能力。 此外，对双歧杆菌的研究还发现，双歧杆菌通过抑制人体内活化的t 细胞，可以 控制新形成的低密度脂蛋白接受器，可以降低血清胆固醇水平n4 l 。利用小鼠作为模型 的试验结果表明，嗜酸乳杆菌和双歧杆菌可以影响胆固醇合成途径中的b 一羟基一b 一 甲基戊二酸单酰辅酶a 还原酶的活性，从而降低血清胆固醇含量j 引。 上述研究表明，乳酸菌降低胆固醇水平的机制是复杂的，或许还存在其它的作用 机制。 1 2 5 抗癌效应 乳酸菌具有抗癌效应，是因为具有以下作用：( 1 ) 能使肠道内的致癌前身物质， 成为非活性状态或抑制状态，使之不能转化为致癌物质；( 2 ) 增强对肿瘤增长的抑制 作用；( 3 ) 增强机体的免疫力。 1 2 6 缓解便秘 乳酸菌可促进消化吸收，合成多种维生素类，促进肠蠕动，分泌乳酸，增加粪便 湿润度，对缓解便秘有较好效果。 1 2 7 延缓衰老 敬思群口司等人发现乳酸菌能够产生超氧化物歧化酶( s o d ) 。s o d 是一种含有金属 离子的酶，是一种源于生命体的活性物质，具有特殊的生理活性，能消除生物体在 新陈代谢过程中产生的有害物质，是生物体内清除自由基的首要物质。对人体不断 地补充s o d 具有抗衰老的特殊效果。而且乳酸菌产生的乳酸，可以抑制肠道腐败细 菌的生长，从而减少了这些细菌所产生的毒胺、靛基质、氨、h ：s 等致癌物质和其它 毒性物质，使机体衰老过程变得缓慢u 6 j 。 1 2 8 维持肠道菌群的生态平衡 乳酸菌分布广泛，人畜肠道中存在多种乳酸菌。日本学者小林六造将肠道微生物 分为耐酸的g + 菌和不耐酸的g 一菌两大类，这些微生物的种类、数量和定居部位都是相 内蒙古农业大学硕士学位论文 5 对稳定的，它们互相协调，共同形成一个微生态系。乳酸菌耐酸，适应肠道的生态环 境，可以在人体肠道内繁衍增殖。如果因抗生素、化疗、年龄、饮食等因素引起体内 菌群失调j 通过口服含有益菌的活菌制剂，或长期食用含有乳酸菌活菌的食物，可使 体内菌群的协调性增强，提高免疫力c 1 7 3 。 1 2 9 其它作用 2 0 0 7 年，李咏梅n 羽通过临床观察指出，金双歧( 含有长双歧杆菌、保加利亚乳杆 菌、嗜热链球菌) 能够辅助治疗重症急性胰腺炎( s a p ) 。卜淑蕊、戴鹏n 等通过大鼠 肝硬化模型，及7 0 例肝硬化c h i i d - p u g h 分级为b 级的患者临床用药，指出培菲康( 含 双歧杆菌、乳酸杆菌和肠球菌) 能明显降低肝硬化患者的血氨水平，可作为肝硬化患 者的辅助用药。 乳酸菌还具有降血压、治疗烧伤、皮肤疾患旧、溃疡性结肠炎( u l c e r a t i v e c o l i t i s ) 、防治复发性口疮等作用隆h 嚣3 。 1 3 国内外研究现状 细菌的分类学可分为三个大部分，即分类、命名和鉴定。鉴定一发现的未知菌， 可通过表征特征和基因特征与已知菌相比较，鉴别它属于细菌分类体系中的哪一类， 哪一种菌。 常规的鉴定方法是首先通过“检索表”所述的各项鉴定方法逐条进行，可将未知 菌株鉴定到属。然后再通过各项生化试验，可以将其鉴定到种的水平3 。 随着科学技术的发展，特别是细胞生物学、分子生物学、分子遗传学等学科的各 项技术对细菌分类学的渗入，使细菌分类学提高到了一个新的水平。从2 0 世纪6 0 年代以后，细菌分类学已经进入分子生物学时代，出现了一系列新的鉴定方法，如 1 6 sr r n a 寡核苷酸序列分析法，细菌的核酸探针鉴定技术，p c r 技术等。这些先进的 技术加快了细菌分类工作在研究自然界各类细菌种类及其相互间的亲缘关系、探索建 立自然分类系统方面的前进步伐。 迄今为止，人们从各种发酵乳制品和发酵食品中分离到多株乳酸菌，经过研究发 现，不同的菌株其代谢产物及产酸能力各不相同。由于菌种的种类不同，发酵温度和 时间不同，而赋予发酵食品独特的风味。且不同地区各种发酵产品中的乳酸菌种类 也不同，生物学特性也有差异。因此，各国科研工作者纷纷从发酵食品中分离乳酸菌 并加以深入的研究一1 。 李少英老师、贺银风老师等从内蒙古传统乳制品中分离鉴定上百株乳酸菌并进行 研究，发现许多产酸、产芳香物质等性能好的菌株。张和平老师和孟和毕力格老师等 从内蒙古传统酸马奶酒中筛选出多株具有降解胆固醇特性并能够耐受人的上消化道 不良环境，以高活力进入大肠，能黏附并定植的潜在益生乳酸菌。 6内蒙古酸粥中乳酸菌生物学特性及功能性研究 近年来国内外广为重视乳酸发酵谷物制品，并对其营养价值的提高做了大量研 究。研究发现经乳酸菌发酵后的小麦、大麦、小米、稻米的营养价值有所提高乜引。 1 4 选题目的及意义 当今食品发展的潮流是营养保健食品，而从乳酸菌的益生作用来看，乳酸发酵食 品属于营养保健食品，发展乳酸发酵产品具有强大的生命力和广阔的前景。进一步发 现新的菌株，开发乳酸菌发酵剂意义重大，同时开发和研制地方特色食品是一个新的 发展方向。 对于内蒙古地区，乳制品是占据相当地位的一大类地方食品，人们对其进行了大 量的研究工作。而对于内蒙古地区的谷物传统发酵食品一酸粥却研究甚少。当地人认 为酸粥可以促进消化吸收，促进肠蠕动，防止便秘，益寿延年。但到目前为止，人们 还是利用自然发酵的方式进行生产，且对于其生产过程中的主要微生物一乳酸菌的种 类、生物学特性、功能及工业化生产方法等研究工作做的很少。 本课题的目的在于通过科学的试验方法，从民间广泛采集酸粥样品，对从中分离 的优势微生物菌群一乳酸菌进行鉴定，并对其生物学特性及功能性进行研究，筛选出 能够耐受人体胃肠环境并具有高效降胆固醇性能的菌株，并测试其发酵特性。挖掘具 有开发潜力的功能性菌株，为开发不同类型和不同功能的乳酸菌发酵剂和发酵食品奠 定基础。 2 材料与方法 2 1 试验材料与仪器设备 2 1 1 试验材料 2 1 1 1 菌种 乳酸菌：从内蒙古不同地区和不同家庭采集谷物发酵食品一酸粥样品，进行菌种 分离及纯化。 l b ( l a c t o b a c i l l u sb u l g a r i c u s ) 标准菌株：由内蒙古农业大学微生物试验室保存。 金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 、伤寒沙门氏菌( s a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m ) 、大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 、枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 标准菌株： 由内蒙古农业大学微生物试验室保存。 2 1 1 2 培养基 m r s 液体、固体、半固体培养基，脱脂乳培养基，麦芽汁培养基，牛肉膏汤培养 基，营养琼脂培养基，其配制参照文献b 。 改良m c ( m o d i f i e dc h a l m e r s ) 固体培养基配制参照文献口刭。 内蒙古农业大学硕士学位论文 7 2 1 1 3 主要药品与试剂 ( 1 ) 糖发酵试验所用糖如表l 所示。 表1糖发酵试验各种糖类一览表 t a b 1t h ev a r i o u sc a r b o h y d r a t ef o rc a r b o h y d r a t ef e r m e n t a t i o nt e s t 以上细菌微量生化鉴定管购自北京陆桥技术有限责任公司 ( 2 ) 药品 牛胆汁 硫代乙醇酸钠、邻苯二胺 胆固醇 牛胆酸钠、牛胆盐 乙二胺四乙酸二钠、冰乙酸、正已烷 蛋白胨 琼脂 2 1 2 仪器设备 h p s - 2 5 0 生化培养箱 h z q x 1 0 0 振荡培养箱 s k - 1 快速混匀器 b c n - 1 3 6 0 微生物洁净工作台 t 6 - 新悦可见分光光度计 万用电热器 自提 北京化学试剂公司 北京s o l a r b i o 科技有限公司 北京奥博星生物技术有限责任公司 天津市化学试剂三厂 北京陆桥技术有限责任公司 天津市英博生化试剂有限公司 哈尔滨市东明医疗仪器厂 哈东联电子技术开发有限公司 常州国华电器有限公司 哈东联电子技术开发有限公司 北京普析通用仪器有限责任公司 浙江加兴风桥电热器厂 8 内蒙古酸粥中乳酸菌生物学特性及功能性研究 h i r a y a m a 高压锅 l g l 0 - 2 4 a 离心机 台式离心机 b c d - 2 2 1 b s y 冰箱 双列四孔电热恒温水浴箱 p b 一1 0 型p h 计 游标卡尺 d v 一2 + p r o 数字式粘度计 华粤企业集团有限公司 北京医用离心机厂 上海安亭科学仪器厂 青岛海尔股份有限公司 h u ab e ie x p e r m e n t i n gc o l t d 上海天呈科技有限公司 青海量具刃具有限责任公司 上海尼润智能科技有限公司 2 2 试验方法 2 2 1 厌氧培养法 采用连二亚硫酸钠( n a 。s ：0 。，俗称保险粉) 碳酸氢钠法。将培养物置于厌氧罐内， 取碳酸氢钠和保险粉各l o g 于平皿中混匀后同样置于厌氧罐中，加少许水令其反应， 然后迅速盖上厌氧罐的盖。将厌氧罐置于3 7 培养箱中培养2 4 - - - 4 8 h 。 2 2 2 乳杆菌的分离鉴定 。 2 2 2 1 形态学观察 将酸粥按1 ( v v ) 接种量接种于麦芽汁培养基中富集培养2 3 代后疆3 】，于微生 物洁净工作台内划线于改良m c 固体培养基及m r s 固体培养基上( 根据文献2 ：知，在 分离乳酸菌时改良m c 培养基较m r s 培养基检出率高，故在分离乳酸菌时采用改良m c 培养基和m r s 培养基同时分离) ，3 7 厌氧培养2 4 - - 4 8 h ，观察其菌落特征。 找到单个菌落，革兰氏染色后镜检，观察其微观形态。 2 2 2 2 菌株属的鉴定 将分离到的革兰氏染色呈阳性的杆菌，做过氧化氢酶试验，找出此试验为阴性的 菌株，初步将其鉴定为乳酸杆菌引。 将初步鉴定为乳酸杆菌的菌株，制成供试菌液，做硝酸盐还原、明胶液化、p h 4 5 生长、p h 9 6 生长、h 。s 产生、吲哚产生、运动性、石蕊牛乳试验、温度试验( 4 c 、 1 5 、4 0 、4 5 、5 3 ) 、联苯胺试验、葡萄糖产气试验( 试验方法及各试剂配制 参照文献3 ) ，观察并记录试验结果，从而进一步确定试验菌株是否为乳杆菌属涵一引。 2 2 2 3 菌株种的鉴定 将属于乳杆菌属的菌株活化后，用灭菌生理盐水制成供试菌悬液，在超净台中用 无菌枪头分别向相应细菌微量生化鉴定管中滴2 3 滴，做糖发酵试验。 细菌微量生化鉴定管包括以下各类糖：鼠李糖、阿拉伯糖、核糖、果糖、半乳糖、 内蒙古农业大学硕士学位论文 9 纤维二糖、蜜二糖、松三糖、山梨醇、甘露糖、水杨苷、棉籽糖、苦杏仁苷、葡萄糖、 蔗糖、乳糖、麦芽糖、木糖、七叶苷、甘露醇、葡萄糖酸盐共2 1 种糖。 观察并记录试验结果，根据文献1 进行种的判断。 2 2 3 菌种保存 ( 1 ) 斜面划线临时保存( 4 ，1 3 个月) 。 ( 2 ) 半固体穿刺短期保存。 ( 3 ) - 8 0 冷冻保存。 ( 4 ) 冷冻干燥保存( 4 或常温，数月数年) 。 2 2 4 供试菌悬液的配制 将半固体保存的菌株接种到脱脂乳培养基中活化两代( 3 7 ，以有凝乳现象出现 为判断标准) ，然后接种到m r s 液体培养基内传代培养，如此传到第三代。将第三代 培养物离心( 3 0 0 0 r m i n ，8 1 0 m i n ) ，弃上清液，沉淀用0 8 5 的灭菌生理盐水清洗， 用快速混匀器混匀后再离心，如此离心三次，将沉淀的菌泥用0 8 5 的灭菌生理盐水 振起即得到供试菌悬液，并用灭菌生理盐水调整菌数至所需菌数。 2 2 5 各菌株生长曲线的测定 各供试菌株分别于m r s 液体培养基中3 7 培养1 8 h ，按1 ( v v ) 接种量接种至 装于三角瓶中的m r s 液体培养基，摇匀后在超净台中分别分装于灭菌试管中，用记号 笔标记培养时间为：0 、2 、4 、6 、8 、1 0 、1 2 、1 4 、1 6 、1 8 、2 0 、2 2 、2 4 、4 8 h 。 对照的试管不加入菌液，于4 的冰箱内保存，其余的试管放到恒温振荡培养箱 内培养( 3 7 ，2 0 0 r m i n ) 。 到标记时间时将对应试管取出，摇匀后倒入比色皿内用t 6 - 新悦可见分光光度计 测其o d 值( 光密度值) 。( 波长：6 0 0 n m ，分光光度计用对照试管内的空白培养基调零) 据所测数据，以时间为横坐标，o d 咖值为纵坐标，做生长曲线图。 2 2 6 耐酸试验 活化后的供试菌用灭菌生理盐水制成供试菌悬液。按5 ( v v ) 的比例分别接种于 p h 3 0 和正常p h ( 对照组) 的m r s 液体培养基中，混匀，立即取出一份做1 0 倍比稀 释，取2 个合适的稀释度倾注m r s 琼脂平板( 共取三个平行样) ：而后将接种后的试 管于3 7 c 下培养2 h 后，同样分别取出一份做1 0 倍比稀释，取2 个合适的稀释度倾 注m r s 琼脂平板( 共取三个平行样) ，3 7 培养2 4 - 4 8 h ，进行菌落计数，按公式( 1 ) 计算存活率。 选取在p h 3 0 的m r s 液体培养基中存活率 1 5 0 的菌株，接种到p h 3 0 的m r s 液 10 内蒙古酸粥中乳酸菌生物学特性及功能性研究 体培养基中，3 7 c 培养2 4 9 6 h ，若液体培养基变混浊，则该菌株耐酸口7 哪3 。 菌株接入p h 3 o 的培养基于3 7 培养2 h 后的活菌数 存活率2 吾砑孺可5 雨活豇磊匿虱百五丽丽萌焉面孺丽丽1 0 0 ( 1 ) 2 2 7 耐胆汁试验 从斜面上挑取一环供试菌至m r s 液体培养基中，活化后，经离心用灭菌生理盐水 配制为含菌数为1 0 8c f u m l 的供试菌悬液一1 ( v v ) 接种于含胆汁的m r s 液体培养基， 同时1 ( v v ) 接种于不含胆汁的m r s 液体培养基( 对照组) - * 3 7 培养，每小时测一 次吸光值( o d 啪) - - o d 值增加o 3 个单位以上后停止培养一以时间为横坐标，以o d 值为纵坐标作生长曲线，分别找出供试菌在含胆汁和不含胆汁培养基中生长时o d 鲫 增加o 3 个单位所需的时间，以两者时间差( 称为延迟时间，l t ) 的大小来判断该菌对 胆汁的耐受能力。l t 为正数意味着生长延迟，负数意味着生长促进h 们。 含胆汁的m r s 液体培养基：m r s 液体培养基中添加o 2 ( m v ) 硫代乙醇酸钠， 0 3 ( v v ) 牛胆汁。 2 2 8 耐胆盐试验 。 从斜面上挑取一环供试菌至m r s 液体培养基中，活化后，经离心用灭菌生理盐水 配制供试菌悬液( 此时的菌悬液做活菌计数) 一1 0 ( v v ) 接种于含牛胆酸钠的m r s 液体培养基，同时以相同比例接种于普通m r s 液体培养基( 对照组) - - 3 7 培养4 h 后， 做1 0 倍比稀释，取两个合适的稀释度做活菌计数。 含牛胆酸钠的m r s 液体培养基：m r s 液体培养基中添加0 3 ( m v ) 牛胆酸钠。 2 2 9 降胆固醇试验 2 2 9 1 胆固醇标准曲线的绘制 配制胆固醇标准液。准确称取5 0 m g 胆固醇溶于正己烷中，并定容至5 0 m l ，使其 浓度为l m g m l 。用5 m l 移液管移取5 m l 该液于5 0 m l 容量瓶中定容至5 0 m l ，使其浓度 为0 1 m g m l ( 1 0 0 ug m l ) 。 吸取胆固醇标准液om l 、0 1i i l l 、0 21 1 1 l 、0 3 m l 、0 4m l 、0 5 m l 分别置于l o m l 试管中，6 0 干燥箱中挥发尽溶剂后，加入2 m l 显色剂，室温静置l o m i n 后，将1 l l 浓硫酸缓慢加入，混匀，于l o - - 9 0 m i n 内，用t 6 一新悦可见分光光度计测定在5 5 0 h m 波长下的o d 值。以o d 值为横坐标，胆固醇标准浓度为纵坐标做标准曲线。 显色剂：0 5 m g 邻苯二甲醛溶于l m l 冰醋酸中。 2 2 9 2 样品中胆固醇的测定 将m r s 液体培养基中活化三代的菌株按1 ( v v ) 接种于高胆固醇培养基中，3 7 c 内蒙古农业大学硕士学位论文1 1 厌氧培养( g i l l i l a n d 4 1 1 、l i n 嘲、t h o m p s o n m l 指出在厌氧和胆汁盐存在的条件下， 乳杆菌对培养介质中胆固醇含量的降低效果明显) 2 4 h 后，1 2 0 0 0 r m i n 离心1 0 r a i n ， 取上清液作为样品，测定其胆固醇含量，测定方法采用邻苯二甲醛法( o p a 法) ，然后 按公式( 2 ) 计算胆固醇降解率。 高胆固醇培养基：m r s 培养基中添加0