（食品科学与工程专业论文）大豆脂肪氧合酶纯化及同工酶特性比较研究.pdf

上海海洋大学硕士学位论文 大豆脂肪氧合酶纯化及其同工酶特性比较 摘要 脂肪氧合酶( l i p o x y g e n a s e ，简称l o x ：e c1 1 3 1 1 1 2 ) 是影响食品风味和色泽 最重要的酶之一。本文对大豆种子中脂肪氧合酶的提取最适条件，如酶提取液的p h ， 表面活性剂t r i t o n 的浓度以及硫酸铵分步沉淀的饱和度等进行了摸索；采用凝胶 层析技术对l o x 进行纯化，分离得到大豆l o x 的两种同工酶，并对它们的特性，包 括最适温度和p h ，热稳定性和酸碱稳定性，米氏常数l ( i i i 值，金属离子和有机试剂 对酶活性的影响等进行了较为系统的比较研究。本文还对大豆脂肪氧合酶的抑制 剂进行了筛选，包括b h a 、b h t 、儿茶酸、v c 等，同时选取了其中抑制效果较好的 抑制剂应用于豆浆的制作，并通过感官评定方法评定它们对大豆腥味的消除作用。 采用浓度为5 0 m m o l l 不同p h 的磷酸缓冲液作为提取液提取大豆l o x 的结果显 示，p h 6 8 提取液的提取效果较为理想，l o x 酶活力和比活力都达到最高，并且通 过在4 下的贮藏实验，该酶在3 天内表现高度的稳定性。采用5 0 m m o l l ，p h 6 8 的磷酸缓冲液，添加不同浓度的t t i t o nx - 1 0 0 进行大豆l o x 的提取试验，实验结 果表明，当t r i t o n 浓度达到2 时，提取液的l o x 酶活力和比活力都有很大的提高。 当继续增加t r i t o n 浓度时，酶活力上升幅度减小，比活力反而下降。 采用含2 t t i t o nx - 1 0 0 的5 0 m m o l lp h 6 8 磷酸缓冲液所提取的粗酶液，以 不同饱和度的硫酸铵进行沉淀实验，发现采用饱和度为2 0 和4 0 的硫酸铵对酶液 进行分步沉淀后得到的浓缩酶液，l o x 的比活性较粗酶液提高了将近3 倍。 粗酶液经过硫酸铵分步沉淀后，进一步用s e p h a d e xg 一2 0 0 柱层析纯化，分离 到两个具有l o x 活力洗脱峰，并收集对应的洗脱液，分别记为l o x - i 和l o x - 2 。l o x - i 的比活力比粗酶液提高了5 2 1 倍，l o x 一2 的比活力比粗酶液提高了4 8 6 倍。 同工酶特性研究表明，同工酶l o x - i 和l o x - 2 的最适p h 分别为7 0 和9 o 。 l o x 一1 和l o x 一2 的最适温度均为2 5 。l o x - i 和l o x 一2 在0 - 3 0 间均表现出高 的热稳定性。l o x 一1 和l o x - 2 的米氏常数( 1 ( ) 分别为8 2 m m o l l 和1 2 2 m m o l l 。 同工酶l o x 一1 和l o x 一2 对金属离子的敏感性也不同。f e 3 + 对l o x l 具有抑制作 用，而对l o x 一2 不起作用。m n 2 + 和n a + 对l o x - i 和l o x 一2 均有抑制作用。c a 2 + 对l o x - 1 具有激活作用，而对l o x 一2 却具有抑制作用。c u 2 + 对l o x 一1 有激活作用，而对l o x 一2 没有作用。 t 上海海洋大学硕士学位论文 实验结果表明，巯基乙醇( m e ) 和表面活性剂s d s 对l o x - 1 和l o x 一2 的酶活性 都有较强的抑制作用。 大豆l o x 的抑制剂筛选结果显示，丁羟基茴香醚( b h a ) 、b h t 、正二氢愈创木 酸( n d g a ) 、6 ，7 一二羟香豆素( e s c u l e i t i n ) 、二羟肉桂酸( c a f f e i ca c i d ) 、 儿茶酸( c a t e c h i n ) 和表儿茶酸( e p i c a t e c h i n ) 对l o x 有很强的抑制作用，浓度 在l m m o l l 时即可抑制l o x 一1 、l o x 一2 和l o x 的全部酶活力。v c 、没食子酸 ( g a l l o y l g a l l i ca c i d ) 、生育酚( v 。) 、氯化钠( n a c l ) 对l o x 同工酶也有不同 程度的抑制作用。儿茶酸和表儿茶酸对l o x 的抑制作用最为显著，在0 1 m m o l l 时即可抑制l o x 一1 、l o x 一2 和l o x9 0 以上的活力。 考虑食品安全的因素，选择抑制剂n g d a 和儿茶酸等进行大豆豆浆豆腥味消除 实验。感官评定结果表明，采用经过抑制剂溶液处理后的大豆样品制作的豆浆在 风味和色泽方面都有很大的改善。 关键词：大豆脂肪氧合酶，同工酶，纯化，特性 i i 上海海洋大学硕士学位论文 p u r i f i c a t i o no fs o y b e a n l i p o x y g e n a s ea n dc o m p a r i s o n so ft h e p r o p e r t i e so fi t si s o e n z y m e s a bs t r a c t l i p o x y g e n a s e ( l o x ，e c 1 13 1 1 12 ) i so n eo ft h em o s ti m p o r t a n te n z y m e st h a te f f e c t t h ef l a v o ra n dc o l o ro ff o o d s i nt h ep a p e r , t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o ri s o l a t i n g l i p o x y g e n a s ef r o ms o y b e a r ls e e d s ，i n c l u d i n gt h ep ha n dt h ec o n c e n t r a t i o n so fs u r f a c t a n t t r i t o ni ne x t r a c t i o nb u f f e ra n dt h ec o n c e n t r a t i o no fa m m o n i u ms u l f a t ef o rp r e c i p i t a t i n g t h ee n z y m e e t c ，w e r er e s e a r c h e d x l c v h e nt h es o y b e a nl o xw a sp u r i f i e db yg e l c h r o m a t o g r a p h y , t w oi s o e n z y m e s ( l o x - 1a n dl o x 一2 ) w e r e s e p a r a t e da n dt h e c o m p a r i s o n so f t h e i rb i o c h e m i c a lp r o p e r t i e s ，i n c l u d i n gt h eo p t i m u m t e m p e r a t u r ea n dp h ， t h e r m o s t a b i l i t ya n da c i d b a s es t a b i l i t y , m ic h a e l i sc o n s t a n tk m ，t h ee f f e c to fs o m em e t a l i o n sa n do r g a n i cc o m p o u n d so nt h e i r a c t i v i t ye t c ，w e r es y s t e m a t i c a l l yd o n e t h e s c r e e n i n go fi n h i b i t o r sf o rs o y b e a nl o xw a sp e r f o r m e da n ds o m ei n h i b i t o r ss u c ha s n d g aa n dc a t e c h i nh a v es t r o n gi n h i b i t i o nt os o y b e a nl o xa n du s e df o rr e d u c e i n gt h e b e a n yf l a v o rp r o d u c e dd u r i n gp r e p a r a t i o no ft h es o y m i l k s o y b e a nl o x w a se x t r a c t e du s i n g5 0m m o lp h o s p h a t eb u f f e r sw i t hd i f f e r e n tp h t h ee x p e r i m e m t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee n z y m ei s o l a t e d b y5 0m m o lp h o s p h a t e b u f f e r sw i t hp h6 8h a dt h eh i g h e s ta c t i v i t ya n ds p e c i f i ca c t i v i t ya n dw a s v e r ys t a b l e w i t h i n3d a y sa t4 0 c s o y b e a nl o xw a si s o l a t e db y5 0m m o l ，p h6 8p h o s p h a t e b u f f e r s c o n t a i n i n gd i f f e r e n tc o n t e n t so ft r i t o nx 一10 0 n er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ea c t i b i t ya n d s p e c i f i ca c t i v i t yo ft h ee n z y m ew e r ei n c r e a s e dw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no ft r i t o nx 10 0 w a s2 h o w e v e r , w h e nc o n t i n u i n gt oi n c r e a s et h e c o n c e n t r a t i o no ft r i t o ni nt h e e x t r a c t i o nb u f f e r , t h ea c t i v i t yo ft h ee n z y m ew a ss l i g h t l yi n c e a s e d ，b u ti t s s p e c i f i c a c t i v i t yw a sd e c r e a s e d t l l es o y b e a nl o xe x t r a c t e db y5 0m m o l ，p h6 8p h o s p h a t eb u f f e rc o n t a i n i n g2 o f t r i t o nx 一10 0w a s p r e c i p i t a t e du s i n gt h ed i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fa m m o n i u ms u l f a t e i t w a sf o u n dt h a tt h e s p e c i f i c a c t i v i t yo ft h el o xo b t m n e df r o ma m m o n i u ms u l f a t e f r a c t i o n a t i o nw i t h2 0 - 4 0 w a sa b o u tt h r e et i m e sh i g h e l t h a nt h a to ft h ec r u d ee n z y m e 上海海洋大学硕十学位论文 t h es o y b e a nl o xa f t e ra m m o n i u ms u l f a t ef r a c t i o n a t i o nw a sf u r t h e rp u r i f i e db y s e p h a d e xg 一2 0 0g e lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y t w oi s o e n z y m e so fs o y b e a nl o x w e r e s e p a r a t e da n dd e s i g n a t e dl o x 一1a n dl o x - l ，r e s p e c t i v e l y b yc o m p a r i s o nw i t ht h e c r u d ee n z y m e ，t h es p e c i f i ca c t i v i t i e so fl o x 一1a n dl o x 一1h a dr i s e nb y5 2 1a n d4 8 6 t i m e s ，r e s p e c t i v e l y t h ec o m p a r i s o n so ft h ep r o p e r t i e so ft w oi s o z y m e ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u mp h s w e r e7 0f o rl o x 1a n d9 0f o rl o x 2 b o t hl o x 一1a n dl o x 一2h a dt h es a m e o p t i m u mt e m p e r a t u r e2 5 。c l o x - l a n dl o x 一2b o t he x h i b i t e dh i 幽t h e r m o s t a b i l i t y w i t h i n3 0 t h em i c h a e l i sc o n s t a n tk mo fl o x 1w a s8 2m m o l la n d12 2m m o l l f o rl o x 2 t h er e s p o n s i y e n e s so ft w oi s o z y m e st om e t a li o n sw a sd i f f e r e n t f e 3 + c a ni n h i b i tt h e a v t i v i t yo fl o x 1 - b u tn oi n h i b i t i o nw a sf o u n df o rl o x 2 m n 2 + a n dn a + c a ni n h i b i t b o t hl o x 1a n dl o x 2 c a 2 + c a ns t i m u l a t el o x 一1 ，b u ti n h i b i tl o x 2 c ：u 2 + c a n s t i m u l a t el o x 一1 b u tn os t i m u l a t i o nw a ss h o w nf o rl o x 一2 2 - m e r c a p t o e t h a n o la n d s u r f a c t a n ts d sh a ds t r o n gi n h i b i t i o nf o rl o x - 1a n dl o x 一2 t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t sf r o mt h es c r e e n i n go ft h ei n h i b i t o r sf o rl o xs h o w e d t h a tb h a ，n d g a ，e s c u l e i t i n ，c a f f e i ca c i d ，c a t e c h i n , a n de p i c a t e c h i nh a dv e r ys t r o n g i n h i b i t i o nf o rl o x 1 l o x 2a n dl o x m e nt h ec o n c e n t r a t i o no ft h e s ei n h i b i t o r sw a s 1 0m m o l l ，t h ea c t i v i t yo fe n z y m ec a nb ec o m p l e t e l yi n h i b i t e d v c ，g a l l o y l g a l l i ca c i d ， v ea n dn a c lc a np a r t l yi n h i b i tt h ea c t i v i t yo fl o x 一1a n dl o x - 2 a m o n gt h e s e i n h i b i t o r s ，t h ei n h i b i t i o n so fc a t e c h i na n de p i c a t e c h i nf o rl o xw e r es t r o g e rt h a n o t h e r s m e nt h e i rc o n c e n t r a t i o n sw e r e0 1m m o l l ，m o r et h a n9 0 o ft h ea c t i v i t yo ft h e e n z y m ec a nb ei n h i b i t e d a c c o r d i n gt ot h es e c u r i t yo ff o o d s ，n g d a ，c a t e c h i n se t c ，a st h ei n h i b i t o r so fl o x ， w e r eu s e df o ri m p r o v i n gt h eb e a n yf l a v o ro fs o y m i l k t h er e s u l t so ft h es e n s o r y e v a l u a t i o ns h o w e dt h a tt h ef l a v o ra n dc o l o ro ft h es o y m i l kp r e p a r e df r o mt h es o y b e a n s e e d st r e a t m e n t e dw i t hi n h i b i t o rs o l u t i o nw e r ei m p r o v e d k e yw o r d ：s o y b e a nl i p o x y g e n a s e ；i s o e n z y m e ；p u r i f i c a t i o n ；p r o p e r t y 上海海洋大学硕士学位论文 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论 文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中 已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经 发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的 内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：善罐 日期：砷年，月r 日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密 口 ，在年解密后适用本版权书。 不保密叮 学位论文作者签名： 日期：珂年f 月歹日 学 名 獬产 j y 6 叩 上海海洋大学硕士学位论文 引言 脂肪氧合酶( l i p o x y g e n a s e ，简称l o x ，e c1 1 3 11 1 2 ) 广泛存在于动、植物 及微生物中。1 9 4 7 年，t h e o r e l l 等人首次从大豆中分离到脂肪氧合酶并获得结晶n 3 。 脂肪氧合酶属于氧化还原酶类，专一性地催化含有顺、顺一1 ，4 戊二烯结构的多 不饱和脂肪酸的氧化，通过分子加氧，生成具有共轭双键不饱和脂肪酸的氢过氧 化物。图1 表示脂肪氧合酶催化亚油酸的氧化作用。 卜 m 傻肌w 一 、。，念 。、。八。渊八、，、念i p 、a i a 、，渊 i 王 m ：矾a 八_ 煳妒m 旷啪 脂肪氧合酶在食品工业的应用 1 改善食品品质 脂肪氧合酶之所以引起食品界的关注，主要基于它是一种形成或改善食品风 味的酶。脂肪氧合酶能够催化食品中的多不饱和脂肪酸氧化生成氢过氧化衍生物， 然后在过氧化物裂解酶的作用下，氢过氧化物进一步降解，形成挥发性六碳醇与 3 上海海洋大学硕士学位论文 醛类，给与食品一种青草芳香自然风味。若将这种风味物质添加到其它的食品中 也会使人们感到十分新鲜的感觉。例如，脂肪氧合酶催化亚麻酸氧化生成亚麻酸 1 3 s - 位氢过氧化物，分解后能形成具有天然风味顺一3 一己烯酸和反一2 一己烯醛芳香 化合物，这种香味类似于叶子淡淡清香。另一个例子是亚油酸经脂肪氧合酶的催 化生成亚油酸氢过氧化物，然后降解为己醛，是食品工业清香香精重要成分。由于 天然风味物质的安全性高，比化学合成的风味物质更受人们的欢迎，价格也更高。 因此，利用脂肪氧合酶催化生产天然风味物质具有广阔的应用前景馏。7 1 。 2 产生食品的不良风味 虽然脂肪氧合酶催化所产生风味和香味成分是很多食品所需要的，然而，脂肪 氧合酶在一些食品中催化的反应也能产生不良的风味。1 9 3 2 年a n d r e 和h o u 发现大 豆的豆腥味主要由l o x 引起。l o x 催化多不饱和脂肪酸的氧化，产生氢过氧化合物， 氢过氧化合物通过均裂或b 一裂变分解，就形成了醛、酮等二级氧化产物，氢过氧化 合物进一步氧化可以转化为环氧酸。这些氧化产物导致果蔬加工制品产生不良的 风味，比如说大豆及其制品的豆腥味，以及油脂和含油食品在贮藏和a n t _ 过程中的 色、香、味发生劣变等。另外，脂肪氧合酶催化脂肪酸氧化生成的脂肪酸氢过氧 化物也能攻击食品中的其它成分，例如色素、维生素、蛋白质和酚类物质等，造 成营养成分的破坏。 近年来，由于分子生物学及分子遗传学等学科的飞速发展，大家丌始利用基因 沉默、基因删除等手段进行转基因植物的研究，同时结合先进的化学检测方法对 l o x 产物进行分析，大大推动了l o x 途径及代谢产物生理作用的研究。但是，由于l o x 是一个多基因家族，存在同工酶，使得各种l o x 具体的生理作用、作用机理及在信号 途径中扮演的角色等研究仍然存在着很多困难睁1 2 1 。 3 在其它工业上的应用 脂肪氧合酶除了在食品工业中有重要应用以外，在其它工业上也有重要的应 用。据国外文献报道，可用脂肪氧合酶对脂肪酸进行选择性催化，形成特定的脂肪 酸氢过氧化物衍生物，再将之进行环氧化，生成的环氧化油可用作聚氯乙烯增塑剂， 在工业、电气、建筑、交通、农业、生活等各方面都有广泛的用途国1 。 脂肪氧化合酶的研究进展 1 脂肪氧合酶的反应机制 关于脂肪氧合酶催化脂肪酸的过氧化机制，学者们提出不少假设，在这些假设 4 上海海洋大学硕士学位论文 中，包括两种不同途径：好氧反应和厌氧反应，也可能它们同时发生。氢过氧化 物产生包括三个步骤：( 1 ) 天然酶激活；( 2 ) 从活化亚甲基中移去一个氢原子；( 3 ) 将氧接入底物分子中产生氢过氧化物。每分子脂肪氧合酶都含有一个非血红素铁 原子，在大豆脂肪氧合酶中这个铁是高自旋的，有两种氧化态：f e 2 + ( 非活性形式) 和f e 3 + ( 活性形式) 。在绝大多数脂肪氧合酶催化的反应中，铁在f e 2 + 和f e 3 + 两种氧 化态之间转变，但铁原子很难离开大豆脂肪氧合酶旧。 脂肪氧合酶作用机制可用大豆脂肪氧合酶同工酶l o x 一1 作用于底物亚油酸( r o 0 h ) 来解释。脂肪氧合酶处于未活化状态时，酶分子中f e 以还原态存在；酶与微量 1 3 - l - r o o h ( 1 3 - l - 亚油酸的氢过氧化物) 作用即转变成活化态，此时酶分子中f e 以 氧化态形式存在。活化态脂肪氧合酶作用于亚油酸的第一步是从c 1 11 - _ 立体选择 性地取走一个氢，产生黄色亚油酸自由基一酶复合物，同时可能伴随发生0 2 被活化 成0 。一。0 。通过“反面”机制接到亚油酸分子上被取走h 后的h l o x 相反一侧，氢过 氧化亚油酸游离基从酶分子中f e 取走一个电子和从介质中得到一个质子形成 1 3 - l - 亚油酸氢过氧化物( 1 3 一l 一氢过氧化一1 8 一顺一9 ，反一1 卜二烯酸) ，这时，双键 从c - 1 2 移动n c - 1 l ，构型从顺式转变成反式。在p h 9 时，大豆脂肪氧合酶同工酶 l o x 一1 以亚油酸为底物的主要产物是1 3 - l - r o o h 。除外，还可能产生其它三种异构 体：1 3 一d r o o h ( 1 3 - d - 氢过氧化- 1 8 - j l l 页- 9 ，反一1 卜二烯酸) 、9 一d r o o h ( 9 - d 一氢过 氧化- 1 8 - 反一9 ，反一1 0 一顺一1 2 一二烯酸) 和9 一l - r o o h ( 9 - l 一氢过氧化一1 8 一反一1 0 ，反 一1 2 一二烯酸) 1 0 3 。 2 脂肪氧合酶的结构 脂肪氧合酶是一种单一多肽链蛋白质，分子量高达1 0 3 k d a 。从一些动、植物机 体组织中提取得到的脂肪氧合酶进行了纯化和表征，其中以大豆种子中提取脂肪 氧合酶研究最为充分，已经得到了编码大豆l o x 一1 蛋白质的e d n a ( l o x a ，克隆体) ， 近来，另外两种克隆体：l o x b 和l o x c 也被确定，l o x c 可能编码大豆l o x 一2 ，l o x b 编 码一种至今还未鉴定出的脂肪氧合酶同工酶3 。大豆l o x 一1 对了解所有脂肪氧合酶 是一个很好模型，这是因为它较易纯化，较稳定。除此之外，e d n a 编码大豆l o x 一1 已被克隆和测序，且这种蛋白质已在细菌系统得到表达1 。通过x 一射线衍射确定 了大豆l o x - i ：_ 三维空间结构。在该构象中包括两个区域：较小的氨基末端区域，是 由1 4 6 个残基组成b 一折叠；较大的羧基末端区域，由酶的活性位点和一个由6 9 3 个 氨基酸残基形成的螺旋二级结构组成。虽然，对脂肪氧合酶结构研究积累大量信 息资料，但对其结构和功能之间关系仍不是很清楚。据报道，在成熟大豆种子中， 如果以蛋白质为基准，同工酶l o x - 3 含量最高，l o x 一1 含量与l o x 一3 几乎相当，l o x 一2 5 上海海洋大学硕士学位论文 含量最少；若以酶活性为基准，l o x 一2 酶活性最高，所以在大豆中它们的总活性很 相近n 纠7 1 。 脂肪氧合酶活性部位的结构尚不完全清楚，其活性部位的基团可能含有铁、芳 香族氨基酸残基和酪氨酸残基等。目前普遍认为，脂肪氧合酶的催化中心与铁离 子有关口1 ，其活化态为高自旋的氧化型f e 3 + ，非活化态为高自旋的还原型f e 2 + 。图2 为目前推断出的l o x 活性中心的结构。 a s n6 舛 图2 脂肪氧合酶的活性中心结构 f i g u r e2f r a m e w o r ko ft h ea c t i v es i t eo f1 i p o x y g e n a s e 3 脂肪氧合酶同工酶的研究 大豆脂肪氧合酶特性随着对脂肪氧合酶性质研究深入，人们对各种不同脂肪氧 合酶进行简要区分。据脂肪氧合酶氧化花生四烯酸位置特异性，将脂肪氧合酶( l o x ) 分为5 - l o x ，8 - l o x ，1 2 - l o x 和1 5 - l o x 。大豆l o x - 1 属于1 5 一l o x ，它已被广泛用于 研究同类脂肪氧合酶功能和结构性质模型n 引。利用离子交换层析法可将脂肪氧合 酶分离成i 型和i i 型，大豆l o x - 1 属于i 型，它是i 型中表征最好的酶，其最高活性 在p h9 2 e 右；而i i 型酶包含大豆l o x - 2 和大豆l o x 一3 ，最适p h 值分别为6 5 和7 0 。 由于层析法不断改进又将l o x 一3 分离成l o x 一3 a 和l o x 一3 b 。另外，大豆脂肪氧合酶的 三种同工酶的底物特异性也不尽相同，大豆l o x - 1 对亚油酸活性较高，最适p h 值为 9 ，大豆l o x - 2 对花生四烯酸活性比亚油酸要高。大豆l o x - 2 和大豆l o x 一3 对亚油酸 甲酯活性比亚油酸稍高。另外大豆l o x 一1 能与水溶性硫酸亚油酸酯反应，但大豆 l o x 一2 和大豆l o x 一3 对这个底物活性很有限。脂肪氧合酶氧化反应产物除氢过氧化 物外，在豌豆脂肪氧合酶催化亚油酸反应中，发现另一种反应产物，它是酮二烯 脂肪酸堙。 这些同工酶最适p h 值、底物特异性、热稳定性、等电点和很多生化特性并不相 6 上海海洋大学硕十学位论文 同n 卵。目前，国内在l o x 同工酶分离纯化和特性研究方面仍处空白。 4 脂肪氧合酶的抑制作用 通过对l o x 抑制剂的研究，其抑制机理可以分为与底物竞争酶的活性部位、鳌合 作用、还原作用和竞争脂质自由基等。另外还有一些抑制剂的抑制机理尚不清楚。 4 1 与底物竞争酶的活性部位 与底物竞争酶的活性部位，此机制是指抑制剂可以作为底物参与反应，从而抑 | i i j l o x 活性。例如，v c 对l o x 活性的抑制作用是作为l o x 氧化反应的底物，其在5 0 0u m o l l 可以抑s w j l o x 活性的7 0 。不过也有不同看法，认为v c 是自由基清除剂。 4 2 鳌合作用 在脂肪氧合酶中铁以两种状态存在，f e 2 + 状态是非活化态，只有转变成f e 3 + 才 具有催化活性。抑制剂与f e 2 + 发生鳌合作用后，将保持其非活化状态。罗勒和山奈 的提取物对l o x 存在抑制作用，其i t 5 0 分别为2 0 1 6 3 、2 7 1 5 2l lg m l ，同时它们是f e 2 + 鳌合剂，其鳌合能力和提取物的浓度之间存在着线性关系，提取物的浓度越大，鳌 合能力越强。这两种提取物在抑s w j l o x 的过程中可能是作为亚铁的鳌合剂，它们可 能是通过与活性中心f e 2 + 相互作用，从而导致酶的失活。芸香苷、儿茶素以及咖啡 酸等也是f e 2 + 鳌合剂，同时也对l o x 有抑制作用。 4 3 还原作用 从其催化机制中可以知道，f e 2 + 是不具备催化活性的，只有f e 3 + 有催化活性。 因而当f e 3 + 被还原成f e 2 + 时，其活性会受到抑制。硒化物可以抑$ 1 j l o x ，从电子自旋 共振( e s r ) 图谱中观察到铁活性部位会由于硒化物而改变，f e 3 + 可以接受硒化物的 电子，转变成f e 2 + 。这表明硒化物很可能是还原铁离子，同时改变非还原铁离子的 状态。去甲二氢愈创木酸是一种有效的l o x 抑制剂1 ，其抑制机理也是将f e 3 + 转变成 f e 2 + 。 4 4 竞争脂质自由基 有一些抑制剂可能是和催化过程中的自由基发生反应，从而使链式反应终止。 s e r p e n 等认为在b 一胡萝卜素抑制l o x 的过程中，b 一胡萝卜素的添加可以减小l o x 催化反应过程中共轭二烯基的生成速率。1 3 一胡萝卜素是在链反应开始时和亚油酸 自由基( l ) 反应，转变成它的初始状态( l h ) ，因此酶就不能完成链反应。与b 一胡 7 上海海洋大学硕+ 学位论文 萝卜素抑制机理相似的还有栎精，它在4 0um o l l 时具有最大的抑制作用，此时可 以抑带1 l o x 活性3 0 。 由于脂肪氧合酶对油脂的氧化作用导致食品质量的下降，货价期的缩短，因此 对脂肪氧合酶的抑制方法研究具有重要的理论和现实意义。我国目前对脂肪氧合 酶的研究起步较晚，发展较为迟缓，其动力学研究、分子生物学研究以及抑制机理 是今后应重点加强的基础理论研究。 研究内容 脂肪氧合酶在生物体内一定具有它特点的生理功能，但从食品风味的角度来看， 该酶可以看作为风味酶，对于该酶的研究必将具有理论和实践意义。考虑到国内 对该酶的研究尚缺乏系统和深入的报导，因此本文将主要集中对脂肪氧合酶的基 本特性进行研究，并对它在食品工业上的应用进行探讨。本研究的内容有下歹：l j 4 个 方面： 1 以大豆为材料，对大豆脂肪氧合酶的提取条件及纯化方法进行探讨。 2 对酶的基本特性，尤其是对大豆l o x 同工酶的生化特性进行研究。为探讨该 酶的结构、功能以及它们的催化机理提供基础资料。 3 脂肪氧合酶对脂肪酸的氧化作用产生的不良风味导致食品质量的下降。因 此本文对脂肪氧合酶的抑制作用，尤其是筛选该酶的抑制剂进行研究。 4 通过感官试验，在抑制剂对大豆腥味的消除作用方面进行研究。 8 上海海洋大学硕士学位论文 第一章大豆脂肪氧合酶( l o x ) 提取及纯化 从生物体组织中提取并获得高纯度的目标酶分子是一项复杂的过程。酶的纯 化过程一般包括研究材料的选择和预处理、破碎细胞、酶的提取、酶的纯化、浓 缩、干燥和保存。本章以大豆( 粤豆) 为研究材料，采用机械法中的碾磨方法破 碎细胞并进行脱脂预处理。在大豆l o x 的提取过程中，主要考察了关键因素，即提 取缓冲液的p h 对酶活性的影响，以及表面活性剂一曲拉通x 一1 0 0 对酶提取效率的影 响。在酶的沉淀技术中采用硫酸胺分步沉淀法。在酶的纯化过程中采用s e p h a d e x g - 2 0 0 凝胶柱层析技术。通过上述提取及纯化过程，获得了两种l o x 同工酶，即 l o x l 和l o x - 2 ，纯化倍数分别为5 2 1 和4 8 6 。 1 1 材料、试剂与设备 1 1 1 试验材料 大豆( 粤豆) 购自广东茂圣公司，于低温( 4 ) 下保存，备用。 1 1 2 试剂 曲拉通x - 1 0 0中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 土温2 0中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 s e p h a d e xg 一2 0 0中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 亚油酸s i g m a 公司 x a d - 2 s i g m a 公司 考马斯亮蓝华美生物试剂公司 牛血清白蛋白华美生物试剂公司 其它化学试剂或溶剂均为市售分析纯 1 1 3 仪器与设备 p h s 一3 b 精密p h 计 7 5 2 型紫外光栅分光光度计 低温离心机 8 0 - 2 型离心机 7 8 一l 型磁力加热搅拌器 核酸蛋白检测仪 9 上海精科雷磁 上海第三分析仪器厂 日立电器公司 上海手术器械厂 江苏国华仪器厂 上海实验仪器厂 上海海洋大学硕士学位论文 s e p h a d e xg - 2 0 0 层析柱 恒流泵 台式水浴恒温器 上海实验仪器厂 上海实验仪器厂 上海分析仪器厂 1 2 试验方法 1 2 1l o x 活性的测定伫“2 2 底物溶液的制备：取0 5 m lt w e e n2 0 置于1 0 o m l0 2 m o l lp h9 0 的硼酸 缓冲液中，滴加0 5 m l 亚油酸，充分混合后，加入1 3 m ll nn a o h ，混合澄清， 再加入9 0 m lo 2 m o l lp h9 0 的硼酸缓冲液，以蒸馏水加至2 0 0 m l ，以浓盐酸调 整p h 至6 5 ，充入氮气加以保护。此时底物浓度约为7 5 m m o l l 。 对照溶液的制备：取0 1 m l 酶溶液于含有2 o m l 无水乙醇的试管中，加入0 9 m l 底物溶液混合，稳定后，加入7 o m l6 0 乙醇溶液至总体积为1 0 o m l 。 样品测定：吸取1 o m l 样品，加入9 o m l 底物溶液中，在2 5 。c ，连续通氧的 情况下反应6 m i n 。取反应混合物l - o m l 至2 o m l 无水乙醇终止反应，然后加入7 o m l 的6 0 乙醇溶液稀释，如混浊可4 0 0 0 转分离心l o m i n 。此样品于2 3 4 n m 测吸光度。 在2 5 。c 、p h 值6 5 下，以亚油酸为底物的1 0 o m l 反应体系在2 3 4n m 处每分钟吸 光度增加0 0 0 1 定义为一个酶活单位( u ) 。 1 2 2 蛋白质含量的测定 蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝g 一2 5 0 法砼3 一朝，以牛血清白蛋白( b s a ) 作标 准，绘制标准曲线，测定酶溶液的蛋白质浓度。 1 2 3 大豆的预处理 取新鲜大豆( 粤豆) 去皮，加入酸性石英砂研磨以破碎细胞，以正己烷洗涤 3 5 次去脂。冷风吹干后得到的大豆干粉于低温( 4 ) 下保存，供酶的提取。 1 2 4h o x 提取条件的确定 1 2 4 1 提取液p h 对大豆l o x 提取的影响 以下对酶的提取及纯化，在没有特别注明的情况时均在4 下进行。 配制5 0 o m m o l lp h 分别为5 0 、6 0 、6 3 、6 5 、6 8 、7 0 、7 5 的磷酸缓 冲液。 分别取上述大豆干粉2 0 9 ，置于2 0 0 m l5 0 o m m o l l 不同p h 的各磷酸缓冲液髓5 矧中，匀浆l m i n ，过滤。在4 c 下，1 8 0 0 0 9 离心1 5 m i n ，取上清液，作为粗酶提 1 0 上海海洋大学硕十学位论文 取液。按1 2 1 和1 2 2 中的方法分别测定l o x 活性及其蛋白质含量，以确定酶 提取缓冲液的最适p h 。 1 。2 。4 。2t ri t o n 对大豆k o x 提取效率的影响 配制5 0 o m m o l lp h6 8 分别含有浓度为o 、0 5 、1 、1 5 、2 0 、2 5 ( v v ) t r i t o nx - 1 0 0 的磷酸缓冲液。 各取脱脂大豆干粉2 0 9 ，分别置于上述含不同浓度的2 0 0 m l5 0 o m m o l lp h 6 8 磷酸缓冲液中，匀浆l m i n ，过滤。在滤液中加入适量x a d 一2 用以吸附t r i t o n ，经 缓慢搅拌后，于4 。c ，1 8 ，0 0 0 9 离心1 5 m i n ，取上清液，作为粗酶液。分别测定l o x 活性及其蛋白质含量，以找到酶提取液中最佳的t r i t o n 浓度。 1 2 5 不同饱和度硫酸铵对k o x 沉淀的影响 根据上述最适的提取p h 和t r i t o n 浓度进行酶的提取。取大豆干粉2 0 9 ，分 别置2 0 0 m l 含2 ( v v ) t r i t o nx 一1 0 0 的5 0 o m m o l l ，p h 6 8 磷酸缓冲液中， 匀浆，过滤。在滤液中加入适量x a d 一2 ，缓慢搅拌后，于4 。c 下，1 8 ，0 0 0 9 离心1 5 m i n ， 取上清液，作为粗酶，用于硫酸铵分步沉淀。 分别取8 只离心管，每管加入粗酶液2 0 o m l 。取硫酸铵，研磨后加入上述装 有粗酶的离心管中，边加边搅拌均匀，使其硫酸铵的饱和度分别达到0 、2 0 、3 0 、 4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、8 5 ，静置2 h 后，4 。c 下2 5 ，0 0 0 9 离心3 0 m i n ，取上清液记 录体积，测定l o x 活性及蛋白含量，计算比活力。各管沉淀部分以最少体积提取 液溶解，在4 c 下，对2 l5 0 o m m o l lp h 6 8 磷酸缓冲液中透析过夜，其间更换 三次透析液。记录体积，测定l o x 活性及蛋白含量计算比活力，用以确立l o x 硫 酸铵分步沉淀的饱和度范围。 1 2 6k o x 的纯化 1 2 6 1k o x 的硫酸铵分步沉淀 在4 下，粗酶液以饱和度为2 0 的硫酸铵处理，静置1 h 后，1 8 ，0 0 0 9 离心 1 5 m i n 。取上清液，继续对其加入硫酸铵至饱和度为4 0 ，静置2 h 后，2 5 ，0 0 0 9 离 心3 0 m i n ，所得沉淀部分以最少体积的5 0 o m m o l lp h 6 8 磷酸缓冲液溶解。于4 下对2 l5 0 o m m o l lp h 6 8 磷酸缓冲液透析过夜，其间更换三次透析液。测定 l o x 活性，蛋白质浓度，计算比活力，回收率。此样品用于柱层析进一步纯化。 1 2 6 2s e p h a d e xg - 2 0 0 层析 上海海洋大学硕+ 学位论文 s e p h a d e xg - 2 0 0 层析柱( 2 1x9 5 c m ) 的准备盥引：称取s e p h a d e xg 一2 0 0 干品 5 - 6 9 ，加蒸馏水浸泡，沸