（食品科学与工程专业论文）棉籽抗氧化多肽和ace抑制多肽的研究.pdf

棉籽蛋白氨基酸组成齐全，比例合理，营养价值接近豆类蛋白质，是一种十 分重要的植物蛋白质资源。但目前对棉籽蛋白的食用功能及棉籽蛋白活性肽的生 物活性方面的深入研究尚未见到较详细的报导。本课题以脱酚无毒棉籽饼粕为原 料，提取棉籽蛋白，加入生物酶进行酶解，对水解物的抗氧化能力和血管紧张素 转换酶( a c e ) 抑制活性进行分析，利用超滤、凝胶色谱、反相高效液相色谱、 等方法进行产物分离纯化，并用质谱对得到的活性肽进行了结构鉴定。本论文系 统研究了酶解工艺的各主要参数、产物的抗氧化活性和a c e 抑制活性、抗氧化 肽和a c e 抑制肽的分离纯化和结构表征，为开发功能性产品提供理论依据和技 术支撑。主要结果如下： 1 利用碱法提取棉籽蛋白，正交法优化提取条件。采用s d s p a g e 测定棉 籽蛋白的亚基成分，结果显示减法提取的蛋白组成较简单。氨基酸分析结果显示 棉籽蛋白氨基酸组成独特，平衡良好。同时棉籽蛋白具有较好的保水性和吸油性， 以及良好的乳化性和乳化稳定性，适合应用于食品中。 2 以棉籽蛋白为底物，分别用商品酶a l c a l a s e 碱性蛋白酶、f l a v o u r z y m e 风 味蛋白酶、n e u t r a s e 中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶对其进行水 解，测定了各酶解物的水解度和抗氧化能力。结果表明n e u t r a s e 中性蛋白酶水解 物的抗氧化能力最强。在n e u t r a s e 中性蛋白酶水解棉籽蛋白单因素试验的基础 上，采用响应面设计进行了试验优化，得到最优的酶解条件为：温度3 9 5 、水 解p h 为7 5 、水解时间5 5 h ，在此水解条件下，水解度可达到3 8 0 9 。 3 利用s e p h a d e xg 2 5 凝胶色谱将棉籽蛋白n e u t r a s e 中性蛋白酶水解物 ( c p h ) 分成四个组分f r a i i v ，通过抗氧化活性分析，发现f r a i i i 具有最强 的抗氧化活性。采用半制备r p h p l c 将f r a 1 1 1 分成8 个组分，以d p p h 清除率 为指标筛选出具有较强抗氧化活性的组分f r a i i i 5 ，经r p h p l c 鉴定为单一峰； 采用m a l d i t o f t o f 二级质谱，鉴定抗氧化活性肽f r a i i i 5 的相对分子量为 8 5 7 4 d a ，最后经分析软件得出该肽的氨基酸组成及序列为h d d a p r f ( h i s a s p a s p - a l a - p r o a r g p h e ) 。 4 对棉籽蛋白的六种蛋白酶水解产物的a c e 抑制能力进行了比较，结果表 明木瓜蛋白酶水解产物的a c e 抑制能力最高( 8 5 6 1 ) 。在单因素试验的基础上， 经响应面分析优化，得到最佳酶解条件为：水解温度为4 3 5 ，e s 为1 0 4 ， p h 值为7 5 ，该条件下制备的棉籽蛋白酶解物的水解度达到2 5 6 9 ，a c e 抑制 率达到8 8 1 5 。利用超滤技术将木瓜蛋白酶水解物分离为四个组分，分别为： p 。，一 l 摘要 u f i ( 3 0 k d a ) ，u f i i ( 3 0 - - 1 0 k d a ) ，u f i i i ( 1 0 5 l a ) ，u f i v ( 5 k d a ) ， 其中u f i v ( 3 0k d a ；u f - i i ，3 0 - 10k d a ；u f - i i i ，lo - 5k d a ；u f - w ， 2 4 3k d a , 2 4 3 0 8 2k d a , o 8 2 - o 3 5k d a , a n d 温度 料液比，其中提取p h 值对提取率的影响最为显 著，但是p h 值偏高蛋白质的纯度会有所下降。当提取条为a 2 8 3 c i d 2 时( 实验6 ) 时，蛋白质的提取率最高为8 9 4 5 ，但是蛋白质的纯度只有7 6 1 4 。当提取条 件为a 2 8 2 c 3 d l ( 实验5 ) 时，蛋白质提取率为8 3 4 0 ，蛋白质的纯度为9 4 9 1 ， 综合考虑蛋白质的提取率和纯度这两个因素，确定碱溶酸沉法提取棉籽蛋白的最 佳工艺条件为a 2 8 2 c 3 d l ，即实验5 结果：料液比为1 ：2 5 ( w v ) ，提取p h 为1 1 5 ， 5 0 的条件下浸提2 h ，蛋白质提取率为8 3 4 0 ，纯度为9 4 9 l 。 本研究采用的方法比较简单，成本低，蛋白质的得率比较高。但是在实际生 第二章棉籽蛋白质的提取及其理化性质分析 产中，不能只考虑影响提取率的主要因素，还要考虑其他影响因素，如调节p h 值时加酸的浓度和速度等。 表2 3 正交试验结果 t a b l e2 3r e s u l t so fo r t h o g o n a lt e s t 2 4 5 棉籽蛋白的凝胶电泳分析 碱法提取棉籽蛋白的s d s p a g e 电泳的分析结果如图2 6 所示，所用低分子 蛋白m a k e r 分子量分别为9 7 2 k d a 、6 6 4 k d a 、4 4 3 k d a 、2 9 0 k d a 、2 0 1 k d a 和 1 4 3 k d a 。从s d s p a g e 电泳图谱可以看出棉籽蛋白的分子量相较小，结构也比 较简单，有两个亚基，分子量分别为2 0 3 k d a 和1 4 3 k d a ，这有可能有利于酶解 的进行。 第二章棉籽蛋白质的提取及其理化性质分析 ml2 7 “，： 一、” 9 7 2k d a 嬲 6 6 4 k d a 落如 。； 考 4 4 3k d a 耱： 。； 2 9 o l a 一 2 0 1k d a 1 4 3k d a 图2 6 棉籽蛋白的s d s p a g e 电泳图谱 泳道m ：m a k e r ；泳道l ：棉籽蛋白( 5 0 m g m l ) ：泳道2 ：棉籽蛋白( 5 m g m l ) ； f i g2 6s d s - p a g ee l e c t r o p h o r e t i co fc o t t o n s e e dp r o t e i n m ：m a k e r ；l a n el ：c o t t o n s e e dp r o t e i nw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no f5 0m g m l ；l a n e2 ：c o t t o n s e e d p r o t e i nw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no f5m g m l 2 4 6 棉籽蛋白氨基酸组成分析 棉籽蛋白的氨基酸分析见表2 4 ，棉籽蛋白氨基酸组成平衡性很好，比例合 理。与大豆蛋白相比，其谷氨酸和精氨酸都远远高于大豆蛋白，赖氨酸和脯氨酸 比大豆蛋白稍低，其他氨基酸的含量与大豆蛋白均相当。精氨酸可用于治疗高血 压、肝昏迷、肝硬化等疾病，也在婴幼儿发育过程中其重要作用。因此，棉籽蛋 白是仅次于豆类的优良蛋白质资源。此外，棉籽蛋白中含有在体内作为白血球成 分、可调节脂肪乳化的脯氨酸3 6 4 9 9 k g ，含有具有增进食欲，促进儿童生长和 发育作用，还能提高钙的吸收及其在体内积累，加速骨骼生长功能的赖氨酸 3 4 3 4 9 k g ，这两种氨基酸的含量虽比大豆蛋白低，却远高于菜籽蛋白。由此可见， 棉籽蛋白营养价值高，是制作婴幼儿健康食品或高级调味料的很好原料。 纺。鬈。啦：，l兹嚆溪髭镬秀氆兰、妒： 鳓， 懈? 一 ；i ，爹邕 第二章棉籽蛋白质的提取及其理化性质分析 表2 4 棉籽蛋白氨基酸组成 t a b l e2 4a m i n oa c i dp r o f i l e so fc o t t o n s e e dp r o t e i n 氨基酸含量( ) 天门冬氨酸 谷氨酸 丝氨酸 组氨酸 精氨酸 甘氨酸 苏氨酸 脯氨酸 丙氨酸 缬氨酸 蛋氨酸 胱氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 苯丙氨酸 赖氨酸 酪氨酸 总量 2 4 7 棉籽蛋白各组分功能性质的研究 蛋白质的功能特性指蛋白产品在食品加工、贮藏和销售过程中对人们所期望 的食品特征产生影响或作出贡献的某些物理、化学特性的总称。一般将其分为四 个主要方面：水化性质、表面性质、结构性质和感官性剧1 2 钔。本实验对棉籽蛋 白的吸水性、吸油性、乳化性和乳化稳定性进行了研究。 2 47l 吸水性 蛋白质的吸水性与食品黏度有关，它受p h 值、温度、离子强度的影响。图 2 7 展示了棉籽蛋白的吸水性与p h 值的关系。由上图2 7 可以看出，在p h 值范 围为4 - - 8 之间，棉籽蛋白的吸水性保持在3 0 4 0 之间。棉籽蛋白在p h = 5 时， 测得的吸水性最强。随着p h 增加所测得的的吸水性减小，可能是棉籽蛋白易溶 解于碱性溶液，而不能沉降下来，导致结果偏低。除了p h 值对蛋白质的吸水性 有影响外，温度对蛋白的吸水性也有影响，一般情况下，随着温度的升高，蛋白 质的保水性降低。与其他蛋白质相比，棉籽蛋白的吸水性略低于大豆蛋白，却高 于小麦蛋白和酪蛋白【1 2 副。 9 9 3 4 猖o 7 9 7 6 9 6 5 3 6 4 8 强 3 5 7 9 虼5 5 4 5 2 0 8 3 4 6 玉圪 4九，o2 9 6 78 7 8 4 2 1 ： ； 8 2 4 2 k 4 2 3 2 3 1 l 3 4 4 3 2 第二章棉籽蛋白质的提取及其理化性质分析 p 、9 棼 妥 督 图2 7 棉籽蛋白的吸水性 f i g2 7w a t e ra b s o r p t i o no fc o t t o n s e e dp r o t e i n 2 4 7 2 吸油性 吸油性是指蛋白中产品吸附油脂的能力，它与蛋白质的种类、来源、加工方 法、温度等因素有关，而且也与所用油脂的种类有关，本实验所用油脂为菜籽油。 由图2 8 可知，棉籽蛋白在温度范围1 0 8 0 ，吸油性在3 8 2 4 之间。在较高 温度时，棉籽蛋白的吸油性