（食品科学专业论文）嗜鞣管囊酵母发酵木糖高产乙醇菌株的选育及其发酵条件优化.pdf

合肥工业大学 本论文经答辩委员会全体委员审查，确认符合合肥工业大 学硕士学位论文质量要求。 答辩委员会签名：( 工作单位、职称) 。坼步月旺蜮授 司掀 辁峰专 誓三 导师： 黟犀 i 合肥工业大学副教授 安徽省农科院副研究员 合肥工业大学副教授 合肥工业大学教授 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得合肥工业大学 或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名彳诌开岔签字日期：矽7 年乡月 学位论文版权使用授权书 彳日 本学位论文作者完全了解 金胆王些太堂 有关保留、使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权 金胆工些太堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：彳；殇彳灰 签字日期：矽年午月功日 学位论文作者毕业后去向： i 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 胁罩 签字日期： 勿，年午月钐日 电话： 邮编： 嗜鞣管囊酵母发酵木糖高产乙醇菌株的选育及其发酵条件优化 摘要 乙醇是一种重要的工业原料，在食品、医药、化工、能源等领域有着广泛 的用途。嗜鞣管囊酵母是一种可同时利用葡萄糖和木糖发酵产乙醇的菌种，但 其发酵木糖产乙醇能力较低。本文以嗜鞣管囊酵母a s2 15 8 5 为原始菌株，采 用离子注入诱变的方法进行诱变选育；通过对高产突变株木糖发酵工艺进行的 优化，探索发酵培养基和发酵条件对产乙醇效果的影响规律；同时对高产突变 株利用秸秆水解液发酵产乙醇的效果进行了考察，主要结论如下； 接种龄对嗜鞣管囊酵母发酵效果的影响结果表明，最佳接种龄为2 4h ；采 用最佳诱变注量1 2 5 1 0 1 4i o n s e m 2 对嗜鞣管囊酵母a s2 1 5 8 5 进行注入诱变， 通过平板初筛，摇瓶发酵复筛，获得了一株发酵木糖高产乙醇突变株r o u t - 5 4 , 其乙醇产量为1 0 4 4g l ，较原始菌株提高了1 2 7 4 ，将其传代七次，各代摇瓶 发酵产乙醇能力较稳定。 在单因素试验的基础上，采用正交试验优化突变株r o u t 5 4 的摇瓶发酵培养 基组成和发酵条件，最佳发酵培养基：木糖5 0g l ，酵母粉1 0g l ，( n h 4 ) 2 s 0 4 1 5g l ，m g s 0 4 7 h 2 01 5g l ，k h 2 p 0 41 0g l ；最佳发酵条件：温度3 0 c ，摇 床转速1 2 0r m i n ，接种量1 0 ；该条件下突变株m u t 5 4 乙醇产量达11 8 7g l 。 通过对原始菌株和突变株r o u t 5 4 耐乙醇能力、关键酶活以及蛋白质组差异 的研究，初步表达了突变株m u t 5 4 乙醇产量提高的机理，突变株m u t 5 4 耐乙 醇能力高于原始菌株，乙醇脱氢酶( a d h ) 、木糖还原酶( x r ) 和木糖醇脱氢酶 ( x d h ) 最大比活力较原始菌株分别提高1 3 9 6 、1 4 2 1 和2 0 9 3 ，二者的蛋 白质种类也有较大的差异。 利用突变株r o u t 5 4 进行秸秆乙醇发酵的试验结果表明，乙醇产量为1 3 7 2 g l ，糖利用率为8 8 6 6 ，生物量为5 3 7g l ，分别较原始菌株提高8 5 4 、3 9 1 和1 0 9 6 ；将秸秆水解液进行亚硫酸钠法脱毒预处理后，突变株m u t 5 4 利用 其发酵乙醇产量可达1 4 7 5g l ，较未脱毒处理提高7 5 1 ；这表明合适的脱毒 方法可有效的去除发酵抑制因子，提高发酵液中乙醇的积累。 关键词：嗜鞣管囊酵母；木糖；乙醇；选育；秸秆水解液 s c r e e n i n go fp a c h y s o l e nt a n n o p h i l u ss t r a i no fh i g he t h a n o l p r o d u c t i v i t yf r o mx y l o s ea n do p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s a b s t r a c t e t h a n o li sak i n do fi m p o r t a n ti n d u s t r i a lr a wm a t e r i a l s i th a sw i d eu s a g ei n f o o d ，m e d i c i n e ，c h e m i c aa n de n e r g yf i e l d s p a c h y s o l e nt a n n o p h i l u sc a np r o d u c e e t h a n o lf r o mx y l o s ea n dg l u c o s e ，b u ti t sp r o d u c t i v i t yo fe t h a n o lf r o mx y l o s ei sl o w t h ei n i t i a lp a c h y s o l e nt a n n o p h i l u sa s2 15 8 5w a st r e a t e db yn + i o n si m p l a n t a t i o n t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fh i g hy i e l dm u t a n tw a so p t i m i z e d t h ef e r m e n t a t i o n o fs t a l kh y d r o l y s i sb yh i g hy i e l dm u t a n tw a ss t u d i e d t h em a i nr e s u l ta sf o l l o w s ： t h eb e s ti n o c u l a t i o nw a s2 4h c o n s i d e r i n gt h es u r v i v a lr a t ea n dr a n g eo f p o s i t i v em u t a t i o n ，w er e c o m m e n d e dt h en 十i o n si m p l a n t a t i o no f12 5xl0 1 4i o n s e r a 2 f o rm u t a t i o nb r e e d i n go fp a c h y s o l e nt a n n o p h i l u s w es c r e e n e do u tap a c h r s o l e n t a n n o p h i l u sm u t a n tr o u t - 5 4 ，w h i c hh a dp e r f e c tg e n e t i cs t a b i l i t yo fp r o d u c i n g e t h a n o la f t e rc o n t i n u o u s7 p a s s a g e s t h em u t a n tr o u t - 5 4h a dah i g h e r x y l o s e c o n s u m p t i o nr a t e ，b i o m a s sa n da b i l i t yo fe t h a n o l r e s i s t a n tt h a nt h ep a r e n ts t r a i n c o m p a r e dw i t ht h ep a r e n ts t r a i n ，t h ee t h a n o lc o n c e n t r a t i o nf e r m e n t e db yt h er o u t - 5 4 f o r7 2hi n c r e a s e db y12 7 4 t h em u t a n tr o u t - 5 4w a sm o r es u i t a b l ef o rp r o d u c i n g e t h a n o lf r o mx y l o s ec o m p a r e dw i t ht h ep a r e n ts t r a i n o nt h eb a s i so fo n e - f a c t o re x p e r i m e n t ，t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ft h e m u t a n tr o u t 一5 4w i t hf l a s kw e r eo p t i m i z e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nm e d i u m ：x y l o s e5 0g l ，y e a s te x t r a c t10 9 l ， m g s 0 4 7 h 2 01 5g l ，( n h 4 ) 2 s 0 41 5g l ，k h 2 p 0 41g l ，t h eo p t i m u mc o n d i t i o n s o fc u l t i v a t i o n ：t e m p e r a t u r e3 0 ，r o t a t i n gr a t e1 2 0r r a i n ，i n o c u l u m1 0 i nt h e s e c o n d i t i o n ，t h ee t h a n o ly i e l do fm u t 5 4r e a c h e d11 8 7g l b yc o m p a r i n ge t h a n o lr e s i s t a n c e ，s p e c i f i c a c t i v i t y o fk e ye n z y m e sa n d p r o t e o m ed i f f e r e n c e so ft h ep a r e n ts t r a i n sa n dm u t a n tr o u t 一5 4 ，w ep r e l i m i n a r y s t u d i e dt h eh i g h y i e l dm e c h a n i s mo fr o u t 5 4 t h er e s u l t ss h o wt h a t ：m u t a n tr o u t 5 4 h a dah i g h e re t h a n o lr e s i s t a n c et h a np a r e n ts t r a i n t h es p e c i f i ca c t i v i t yo fa l c o h o l d e h y d r o g e n a s e ( a d h ) ，x y l o s er e d u c t a s e ( x r ) a n dx y l i t o ld e h y d r o g e n a s e ( x d h ) o f m u t a n tr o u t - 5 4i n c r e a s e db y1 3 9 6 ，1 4 2 1 a n d2 0 9 3 ，r e s p e c t i v e l y t h e r ew a sa g r e a t e rd i f f e r e n c e si np r o t e i nb e t w e e nm u t a n tm u t - 5 4a n dp a r e n ts t r a i n w es t u d i e dt h e a b i l i t yo fp a r e n ts t r a i n sa n dm u t a n tm u t - 5 4t h a tp r o d u c e e t h a n o lf r o ms t r a wh y d r o l y s a t e i no r d e rt oi m p r o v ee t h a n o lp r o d u c t i o n ，w ec h o s e d d i f f e r e n tm e t h o d sf o rd e t o x i f i c a t i o n t h er e s u l t ss h o wt h a t ：e t h a n o lp r o d u c t i o n s u g a ru t i l i z a t i o na n db i o m a s sf e r m e n t e db ym u t a n tr o u t 5 4f o r7 2 h w a s13 7 2g l ， i i 8 8 6 6 a n d5 3 7 g l ，r e s p e c t i v e l y i n c r e a s e d b y8 5 4 ，3 9 1 a n d 1 0 9 6 c o m p a r i n gw i t hp a r e n ts t r a i n t h em e t h o do fs o d i u ms u l f i t e c o u l de f f e c t i v e l y d e t o x i f yt h es t a l kh y d r o l y s a t e a f t e rd e t o x i f i c a t i o n ，t h ee t h a n o ly i e l dw a s1 4 7 5g l a n di n c r e a s e db y7 5l t h i ss u g g e s t st h a ta p p r o p r i a t ed e t o x i f i c a t i o nm e t h o dc a l l e f f e c t i v e l yr e m o v ef e r m e n t a t i o ni n h i b i t o r yf a c t o r , i n c r e a s ee t h a n o lc o n c e n t r a t i o n k e y w o r d s ：p a c h y s o l e nt a n n o p h i l u s ；x y l o s e ；e t h a n o l ；s c r e e n i n g ；s t a l kh y d r o l y s a t e 1 1 1 致谢 本研究论文是在我的导师潘丽军教授的悉心指导下完成的。潘老师为人和 蔼、治学严谨，具有敏锐的思维和开阔的学术视野，这些都是我永远学习的榜 样。在两年半的研究工作中，从研究方向的选择、具体实验方案的制定到毕业 论文的修改，潘老师都给了我很多的建议和帮助。在此向潘老师表示衷心的感 谢，希望您在繁忙的工作中多注意身体，最后祝您身体健康、心想事成。 感谢杨培周老师、李兴江老师、郑志老师、罗水忠老师、韩卓老师、陈小 燕老师在实验过程中给我的指导和支持。 感谢3 1 2 1 作室众多同学在生活和实验中给予我的关心和帮助，吴锦长的幽 默、鲍俊杰的机灵、周俊的热情、袁忠娣的可爱、庞锐的纯真、徐涟漪的乖巧、 孟玲玲的豪气、胡琳琳的矜持、黄增霞的低调，这些我永远都会记得，也许以 后我们各奔前程，但你们永远是我最好的朋友，祝你们在以后的人生道路上一 帆风顺、事业有成。感谢张希磊、郭磊等好友，你们在我人生的低潮时给予我 鼓励和支持，祝你们工作顺利、心想事成。 最后特别要感谢我的爸爸妈妈，谢谢您们这么多年来对我的养育之恩，在 以后的日子里我会常回去看您们，祝爸爸妈妈身体健康、万事如意。 i v 作者：储开庆 2 0 11 年3 月16 日 目录 第一章绪论1 1 1 乙醇的理化性质及应用1 1 1 1 乙醇的性质。1 1 1 2 乙醇的应用1 1 2 微生物利用木糖发酵产乙醇的途径1 1 3 木糖发酵产乙醇菌株研究进展2 1 3 1 天然菌株2 1 3 2 木糖发酵产乙醇菌株诱变选育：。4 1 3 3 木糖发酵产乙醇代谢工程菌5 1 4 利用木质纤维素生产乙醇研究现状6 1 5 本课题研究的目的、意义及主要内容7 1 5 1 研究目的与意义7 1 5 2 研究内容7 第二章嗜鞣管囊酵母a s2 1 5 8 5 发酵木糖高产乙醇菌株的选育。9 2 1 材料与方法9 2 1 1 菌种9 2 1 2 试剂9 2 1 3 仪器与设备1 0 2 1 4 培养基。1 0 2 1 5 分析方法1 l 2 2 试验方案1 3 2 2 1 原始菌株的活化1 3 2 2 2 培养方法1 3 2 2 4 菌种诱变筛选方案1 3 2 2 5 突变株遗传稳定性研究1 4 2 2 6 突变株m u t 5 4 与原始菌株发酵木糖产乙醇特性研究1 4 2 3 结果与分析1 4 2 3 1 种龄对嗜鞣管囊酵母a s2 1 5 8 5 产乙醇能力的影响。1 4 2 3 2 氮离子注入诱变剂量对鞣管囊酵母存活率的影响1 5 2 3 3 诱变剂量对嗜鞣管囊酵母正突变率的影响1 6 2 3 4 高产菌株的筛选。1 7 2 3 5 突变株遗传稳定性研究1 7 2 3 6 突变株r o u t 5 4 与原始菌株发酵特性研究1 7 2 4 本章小结1 9 第三章发酵木糖高产乙醇突变株r o u t 5 4 发酵条件优化2 0 v 3 1 材料与方法2 0 3 1 1 菌种2 0 3 1 2 试剂2 0 3 1 3 仪器与设备2 l 3 1 4 培养基2 1 3 1 5 分析方法2 1 3 2 试验方案一2 1 3 2 1 培养基优化2 l 3 2 2 培养条件优化2 2 3 3 结果与分析2 3 3 3 1 培养基优化结果2 3 3 3 2 培养条件优化结果2 7 3 4 本章小结3 0 第四章突变株m u t 5 4 高产机理的初步探讨及其在秸秆乙醇生产中的应用。3 l 4 1 材料与方法3 1 4 1 1 菌种3 1 4 1 2 试剂3 2 4 1 3 仪器与设备。3 2 4 1 4 培养基3 3 4 1 5 分析方法。3 3 4 2 试验方案3 6 4 2 1 突变株r o u t 5 4 与原始菌株耐乙醇能力研究3 6 4 2 2 突变株m u t 5 4 与原始菌株x r 、x d h 、a d h 比活力研究3 6 4 2 3 突变株m u t 5 4 与原始菌株菌体蛋白质双向电泳3 7 4 2 4 突变株r o u t 5 4 与原始菌株发酵秸秆水解液产乙醇特性研究3 8 4 2 5 不同脱毒方法对突变株m u t 5 4 发酵秸秆水解液产乙醇能力的影响3 8 4 3 结果与分析3 8 4 3 1 突变株m u t 5 4 与原始菌株耐乙醇能力比较3 8 4 3 2 突变株m u t 5 4 与原始菌株a d h 、x r 、x d h 比活力的变化3 9 4 3 3 突变株m u t 5 4 与原始菌株蛋白质种类差异性4 l 4 3 4 突变株r o u t 5 4 与原始菌株发酵秸秆水解液产乙醇特性研究4 2 4 3 5 不同脱毒方法对突变株m u t 5 4 发酵秸秆液产乙醇的影响4 4 4 4 本章小结4 5 第五章结论与展望4 7 5 1 结论4 7 5 2 展望4 8 v i v i i 插图清单 图1 1 木糖在细菌和酵母茵中的代谢途径2 图1 2 利用木质纤维素生产乙醇的主要工艺流程7 图2 1 乙醇标准曲线1 1 图2 2 木糖含量标准曲线1 2 图2 3 种子生长曲线1 5 图2 4 种龄对乙醇产量和得率的影响1 5 图2 5 氮离子注入诱变时嗜鞣管囊酵母存活率曲线1 6 图2 - 6 离子注量对嗜鞣管囊酵母正突变率的影响1 6 图2 7 各正突变株的乙醇产量1 7 图2 8 突变株r o u t 5 4 与原始菌株发酵过程中产生的乙醇1 8 图2 9 突变株r o u t 5 4 与原始菌株发酵过程中生物量变化1 8 图2 1 0 突变株r o u t 5 4 与原始菌株发酵过程中木糖变化1 9 图3 1 木糖浓度对突变株m u t 5 4 发酵结果的影响2 3 图3 2 氮源种类对突变株r o u t 5 4 乙醇产量的影响一2 4 图3 3 硫酸镁浓度对突变株r o u t 5 4 乙醇产量的影响2 4 图3 - 4 硫酸铵浓度对突变株r o u t 5 4 乙醇产量的影响2 5 图3 5 磷酸二氢钾浓度对突变株r o u t 5 4 乙醇产量的影响2 5 图3 - 6 温度对突变株r o u t 5 4 乙醇产量的影响2 7 图3 7 转速对突变体r o u t 5 4 乙醇产量的影响2 8 图3 8 接种量对突变体r o u t 5 4 乙醇产量的影响2 8 图4 1 蛋白质含量标准曲线3 5 图4 2 木糖和葡萄糖标准曲线3 6 图4 3 乙醇添加量对突变株r o u t 5 4 和原始菌株生物量的影响3 9 图4 4 原始菌株和突变株r o u t 5 4 发酵过程中a d h 比活力的变化3 9 图4 5 原始菌株与突变株r o u t 5 4 发酵过程中x r 比活力的变化4 0 图4 6 原始菌株和突变株r o u t 5 4 发酵过程中x d h 比活力的变化4 0 图4 7 a 原始菌株和突变株r o u t 5 4 双向电泳结果4 l 图4 7 b 突变株r o u t 5 4 与原始菌株蛋白质匹配结果4 l 图4 8 突变株r o u t 5 4 与原始菌株秸秆液发酵过程中生物量的变化4 2 图4 - 9 突变株r o u t 5 4 与原始菌株发酵秸秆液过程中还原糖量的变化4 3 图4 1 0 突变株r o u t 5 4 与原始菌株发酵秸秆液过程中乙醇含量的变化4 4 图4 1 1 不同脱毒方法下的总糖损失率4 5 图4 1 2 不同脱毒方法对突变株r o u t 5 4 发酵结果的影响4 5 v i l l 表3 8 培养条件验证试验结果3 0 表4 1 等电聚焦步骤3 7 表4 21 2 s d s p a g e 凝胶配制方法3 8 i x 第一章绪论 1 1 乙醇的理化性质及应用 1 1 1 乙醇的性质 乙醇( c h 3 c h 2 0 h ) 俗称酒精，是一种结构简单的短链醇类。在常温、常压下， 乙醇是一种易挥发、易燃的无色透明液体，相对密度o 7 8 9 ，熔点一1 1 4 3 ，沸 点7 8 4 c ，具有潮解性，可以快速从空气中吸收水分【l 】。它的水溶液具有特殊 的、令人愉快的香味，并略带刺激性。乙醇是一种很好的溶剂，可与水、乙酸、 乙二醇、丙三醇、氯仿、硝基甲烷、乙醚等溶剂互溶。 1 1 2 乙醇的应用 乙醇是一种重要的工业原料，广泛应用于各个领域内。在饮料工业中，乙 醇是啤酒、葡萄酒、白酒等酒精饮料的主要成分。在医疗卫生领域， 2 5 5 0 的乙醇擦身可使高烧患者皮肤血管扩张，迅速散热，缓解病情；7 0 的乙醇可 用于杀菌消毒。在化工领域，乙醇可用来生产乙醛、乙醚、乙二醇等化工原料， 同时也是染料、洗涤剂、化妆品等化工产品主要原料和溶剂。在能源工业中， 乙醇可以作为基础原料和燃料【2 1 。随着石油资源的逐渐减少、全球环境污染日 益严重，许多国家都在寻求可替代石油的新能源【3 1 ，燃料乙醇应运而生。燃料 乙醇，一般是指将体积浓度达到9 9 5 以上的乙醇。向燃料乙醇中加入适量变 性剂就可以形成变性燃料乙醇，再将其与一定比例的汽油混合，就可以在汽油 发动机中直接使用。向汽油中添加燃料乙醇可增加燃料含氧量，提高其辛烷值 及抗爆性，使燃烧更充分。使用这样的燃料可以减少石油的消耗，降低c o 等 大气污染物的形成。燃料乙醇是一种可再生的绿色能源，可利用小麦、玉米、 稻谷及其秸秆等生物质通过微生物发酵进行生产【4 1 。我国在2 0 0 1 年开展燃料乙 醇工业，到2 0 0 6 年为止，已先后批准建设了黑龙江华润、河南天冠、安徽丰原、中 粮集团等企业的燃料乙醇生产项引5 1 ，现在中国的燃料乙醇生产量已居世界第三 位【6 1 。 1 2 微生物利用木糖发酵产乙醇的途径 自然界中很多微生物都可以代谢葡萄糖产乙醇，主要是先通过e m p 途径将 葡萄糖转化为丙酮酸，再将丙酮酸转化为乙醇。但在可利用木糖的微生物中， 其木糖的代谢途径与葡萄糖有所不同。在真菌和酵母中，木糖在n a d p h 依赖 型木糖还原酶( x y l o s er e d u c e t a s e ，x r ) 的作用下被还原为木糖醇，在n a d + 依赖型 木糖醇脱氢酶( x y l i t o ld e h y d r o g c n a s e ，x d h ) 的作用下氧化为木酮糖，在木酮糖激 酶( x y l u l o k i n a s c ，x k ) 的作用下磷酸化为木酮糖5 磷酸，进入磷酸戊糖途径( p p p ) 生成果糖6 磷酸和甘油醛3 磷酸，二者进入糖酵解途径( e m p ) 生成丙酮酸，最 后在丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的作用下生成乙醇；而在细菌中，木糖在木糖 异构酶( x y l o s ei s o m e r a s e ，x i ) 的作用下直接形成木酮糖，再经x k 磷酸化后形成 木酮糖5 磷酸，然后进入p p p 途径和e d 途径，最后生成乙醇7 ，引，如图1 - 1 。 n a d p hn a d p + 图1 1 木糖在细菌和酵母菌中的代谢途径归1 f i g 1 1p a t h w a yf o rx y l o s em e t a b o l i s mb ym i c r o o r g a n i s m 此外酵母代谢木糖产乙醇的理论得率为4 6 ，低于葡萄糖的5 1 【1 0 】。本论 文中乙醇得率定义如下： 乙醇得率( ) = 渊1 0 。 1 3 木糖发酵产乙醇菌株研究进展 1 3 1 天然菌株 自然界中能发酵木糖产乙醇的菌种有细菌、真菌以及酵母菌，对此国内外 许多学者进行了大量的研究。 细菌中能利用木糖发酵产乙醇的菌种并不多，且乙醇得率一般都不高。细 菌利用木糖发酵产乙醇具有发酵速度快、周期短的优点，但也容易产生较多的 副产物，其中有些甚至是有毒的，会影响产物分离和产品质量】。另外在细菌 发酵过程中易受噬菌体污染，引起菌体大量死亡，导致乙醇产量降低。 对于能发酵木糖产乙醇的真菌，目前的研究主要集中在粗糙脉孢菌 ( n e u r o s p o r ac r a s s a ) 和尖镰孢菌( f u s a r i u mo x y s p o r u m ) 。w e n e 等【1 2 】通过筛选得到 一株尖镰胞菌a n l 2 2 7 6 0 ，用其发酵2 木糖培养基，乙醇最大产量为8 2g l ， 乙醇得率为4 1 。粗糙脉孢菌和尖镰孢菌具有产生纤维素酶和半纤维素酶的能 力，可以直接利用木质纤维素发酵产乙醇，简化生产工艺。但是它们合成产物 速度较慢，会延长生产周期，增加生产成本。另外木质素等物质也会对其发酵 产生抑制作用，所以要将其应用于乙醇的工业生产中还有待研究。 酵母菌中能利用木糖发酵产乙醇的菌株较多，目前国内外研究主要集中在 2 嗜鞣管囊酵母( p a c h y s o l e nt a n n o p h i l u s ) 、树干毕赤酵母( p i c h i as t i p i t i s ) 和休哈塔 假丝酵母( c a n d i d as h e h a t a e ) ，它们既可以利用葡萄糖又可以利用木糖，所以在 利用生物质生产燃料乙醇方面有着较大的应用前景。酵母菌发酵木糖产乙醇具 有乙醇得率高、酒精耐受能力高、副产物少、不易被细菌和病毒污染的优点。 此外，酵母菌大多数不产生有毒副产物，可以放心的应用于工业生产中。这三种 菌株在利用木糖发酵产乙醇时，都需要少量氧气的存在，即“微通氧”【l 川。在无 氧条件下，它们可以利用木糖生长但不产生乙醇；在氧气过量时，生成的乙醇 会被氧化为酸或者同化为高分子物质，导致乙醇产量的降低。s k o o g 等【l4 j 发现 用聚乙烯乙二醇可以抑制乙醇的继续同化，减少乙醇的转化，提高乙醇的积累。 此外它们在利用木糖发酵产乙醇的同时也可能会产生木糖醇等副产物。 y a b t o e h k o v a 等【1 5 】对2 l 株可利用木糖酵母的发酵性能进行了研究，结果表明树 干毕赤酵母和休哈塔假丝酵母可利用木糖发酵产乙醇，但基本不产木糖醇；嗜 鞣管囊酵母可利用木糖既产乙醇又产木糖醇。 嗜鞣管囊酵母是发现最早的能利用木糖发酵产乙醇的菌种，它在发酵木糖 产乙醇的同时也会产生大量木糖醇，所以常作为研究酵母木糖代谢途径的模式 菌种，迄今为止对它的研究已有很多 1 6 , 1 7 】。z h a o 等【1 8 】利用嗜鞣管囊酵母1 7 7 1 发酵2 的木糖培养基，乙醇最大产量为2 7 9 l 。代金龙等【1 9 对一株嗜鞣管囊酵 母d 2 1 木糖发酵条件进行了优化，其在最优条件下发酵5 木糖培养基，乙醇产 量可达到1 2 5g l 。杨文等【2 0 】研究了不同温度对嗜鞣管囊酵母发酵结果的影响， 结果发现其最佳发酵温度为2 8 - - 3 2 。在此温度范围内，最大比生长速率为0 1 9 h ，最大木糖比消耗速率为2 8g ( g h ) ，最大比乙醇产率4 3g ( g h ) 。b r a v o 等弘u 对嗜鞣管囊酵母发酵木糖产乙醇的动力学进行了研究，结果表明当木糖浓度为 2 5 ，木糖比消耗速率为o 3g ( g h ) ，最大比生长速率为0 2 4h 一，乙醇比生成速 率为o 0 6 5g ( g h ) ，乙醇得率为3 4 。徐淑霞等【2 2 】研究了镧、铈、钕三种稀土离 子对嗜鞣管囊酵母p 0 1 发酵性能的影响，结果表明当单独使用低浓度镧、铈、 钕离子时，会提高菌种产乙醇能力；当单独添加较高浓度的稀土离子或添加混 合离子时，则会降低管囊酵母产乙醇能力。k r u s e 等【2 3 】研究了嗜鞣管囊酵母在 罐发酵木糖产乙醇过程中不同通氧量对发酵结果的影响，结果表明在氧充足的 条件下，嗜鞣管囊酵母主要利用木糖进行生长和繁殖，产生少量木糖醇，不产 生乙醇；在无氧条件下，细胞生长繁殖较慢，生物量很低，乙醇产量为1 2g l ， 木糖醇产量为5g l ；在微通氧条件下，乙醇产量提高到3g l ，木糖醇下降到3 6 g l 。由此可见管囊酵母发酵木糖产乙醇在微通氧的条件下发酵效果最好。这可 能是因为在嗜鞣管囊酵母代谢木糖过程中，木糖还原酶是以n a d p h 为辅酶，而 木糖醇脱氢酶却是以n a d + 为辅酶，在无氧条件下n a d + 生成速率不高，所以导 致木糖醇大量积累，木糖代谢速率降低。而在微通氧条件下，氧原子可以作为 受氢体，使n a d + 再生，从而降低了木糖醇的积累，提高了乙醇产量。 3 树干毕赤酵母利用木糖发酵产乙醇具有发酵周期短、乙醇得率高的特点。 a g b o g b o 等【2 4 1 利用树干毕赤酵母c b s 6 0 5 4 发酵6 木糖培养基，乙醇最大产量 为2 4 3 9 l 。苏海峰等【2 5 】对树干毕赤酵母c b s 5 7 7 3 发酵高浓度木糖产乙醇进行 了研究，当木糖浓度为2 0 时，其乙醇产量仍可达到4 8 。刘建等 2 6 1 通过对 树干毕赤酵7 1 2 4 进行固定化增殖，使其获得了微通氧的发酵条件和耐高糖能 力，提高其产乙醇能力。杨斌等【2 7 】对树干毕赤酵母y - 7 1 2 4 发酵混合糖产乙醇 进行了研究，结果发现在发酵初期，菌体消耗葡萄糖速率大于木糖，当葡萄糖 减少到一定量后，菌体消耗木糖速率变快，这表明葡萄糖的大量存在对木糖的 利用有抑制作用。这可能是因为木糖进入细胞的过程是主动运输，需要运输因 子的参与，而大多数微生物中没有特异的木糖运输因子，木糖只有通过与葡萄 糖运输因子结合才能进入细胞。h a m a e h e 等【2 8 】研究了去除酿酒酵母的1 8 种单 糖运输因子对其利用木糖的影响，结果发现在去除所有单糖运输因子后，木糖 无法被运输进入酿酒酵母体内，从而导致菌体无法利用木糖进行生长，这表明 酿酒酵母主动运输木糖进入细胞需要葡萄糖运输因子的存在。有研究认为树干 毕赤酵母具有高亲和力木糖特异性运输系统，这可能就是树干毕赤酵母可高效 代谢木糖产乙醇的原因。 休哈塔假丝酵母是自然界中木糖发酵性能较好的天然菌株之一，其乙醇 得率和耐乙醇能力均较高。李芳芳等【2 9 】对休哈塔假丝酵母1 7 6 6 木糖发酵条件 进行了优化，正交试验结果表明当发酵温度为2 8 、发酵时间为2d 、摇床转 速为1 5 0r r a i n 、初始p h 为5 时，乙醇得率可达到3 1 5 7 。s a n c h e z 等p u j 研究 了p h 和通氧速率对休哈塔假丝酵母发酵木糖产乙醇能力的影响，结果表明当 p h 为4 5 、通氧充足时，木糖醇平均得率为7 8 ，最终乙醇得率为4 1 。k a s t n e r 等【3 1 】利用休哈塔假丝酵母a t c c2 2 9 8 4 发酵混合糖，结果发现当葡萄糖木糖比 例为1 ：1 时，木糖消耗速度比葡萄糖低三倍；为了提高乙醇产量和减短发酵周 期，他们建立了一种两步发酵工艺：( 1 ) 菌体在通氧条件下利用木糖大量增殖 和发酵；( 2 ) 加入葡萄糖在无氧条件下发酵产乙醇，应用这种发酵工艺，乙醇 产量可达4 5 5 0g l 。 1 3 2 木糖发酵产乙醇菌株诱变选育 在微生物发酵过程中，人们都希望目标产物在发酵液中可以大量积累、代 谢途径朝着某一方向进行、菌株稳定性良好，这就要求对原有菌株进行改良。 诱变育种是一种在微生物改良方面应用最广的方法，它的一般过程是先用物理、 化学等方法诱导微生物遗传特性发生变异，再从变异群体中筛选出符合人们某 种需求的突变株，最终培育成新品种【3 2 1 。离子束注入诱变是在2 0 世纪八十年 代由中国科学院等离子体物理研究所开创的一种新技术，经过2 0 多年的发展， 已经在生物育种领域内得到了广泛的应用 3 3 , 3 4 】。它的基本原理是能量沉积、质 量沉积以及电荷交换。能量沉积是指生物体有机大分子与注入的离子发生碰撞 4 后获得能量，导致自身键断裂或缺陷；质量沉积是指生物体有机大分子与注入 离子形成新的大分子，导致分子质量发生改变；电荷交换是指生物体有机大分 子与带电荷的离子碰撞，自身电子发生转移 3 5 】。上述三种效应会引起生物体碱 基缺失、d n a 断裂、染色体易位等现象，从而使基因发生突变。将离子束注入 诱变育种技术应用于微生物中，它具有菌体存活率曲线呈“马鞍型”、突变谱广 以及正突变率高的特点。龚加顺等 3 6 】将n + 注入生产单宁酸酶的黑曲霉9 7 0 1 中， 发现菌体存活率曲线呈“马鞍型”，并获得了较其它诱变方法更高的正突变率和 更大的变异幅度。虞龙等f 3 7 】利用低能离子注入v c 生产菌株，正突变率最高可 达2 3 3 6 ，筛选出的高产菌株糖酸转化率可达9 4 3 6 。作为一种新兴技术， 离子束注入诱变育种具有广阔的应用前景和发展空间。 由于许多可利用木糖发酵产乙醇的天然菌株乙醇得率均不高，无法满足工 业化生产的需要，所以国内外许多学者对这些菌株进行诱变选育【3 引。陈承等d 引 嗜鞣管囊酵母g 2 1 进行了紫外和d e s 复合诱变，通过筛选得到一株发酵木糖 高产乙醇菌株z 3 0 4 ，利用其发酵5 木糖培养基，木糖利用率达7 1 4 2 ，乙 醇得率为3 7 。季洁等【4 0 1 选择在乙醇驯化基础上乙醇耐受性提高的休哈塔假丝 酵母c i c c l 7 6 6 进行紫外诱变，通过筛选得到了一株呼吸缺陷型突变株，再将 其与酿酒酵母a t c c 4 1 2 6 进行原生质体融合，最后得到一株高效发酵木糖产乙 醇的菌株f 6 ，其发酵5 木糖培养基，最大乙醇产量为1 8 7 5g l ，较原始菌株 提高了2 8 。陈叶福等【4 1 】采用紫外线诱变和离子注入诱变对休哈塔假丝酵母 c i c c l 7 6 6 进行改良，通过筛选得到一株发酵木糖高产乙醇菌株s y 5 8 ，其发酵 6