（食品科学专业论文）增强免疫力、缓解体力疲劳保健饮料的研究与开发.pdf

四川大学硕士学位论文 增强免疫力、缓解体力疲劳 保健饮料的研究与开发 食品科学 研究生邓茉香指导教师曾凡骏 本文基于传统中医药学、现代营养医学和生命科学等综合学科，将动、植 物活性成分和维生素、矿物质等营养元素配伍，研制出具有增强免疫力、缓解 体力疲劳的复合保健饮料。 从本饮料具有的缓解体力疲劳和增强免疫力功能出发，研究功效成分与功 能的关系、各成分配伍科学依据、功效成分用量与安全性、功效用量间的关系 等，确定本保健饮料选用的主要原料为：西洋参、黄芪、蜂王浆、牛磺酸等。 通过保健饮料生产工艺的研究，得到：一、保健饮料主要植物活性成分的最佳 提取工艺为溶剂使用8 0 ( v v ) 乙醇，料液比1 ：1 2 ( w v ) ，浸提温度6 0 ， 提取时间3 0 m i n ，超声功率l o o w ，超声频率1 9 k h z ，在此条件下提取2 次；通过 对影响超声波辅助提取量能变化的研究，本实验发现：当超声器中水量占超声 容器的比例达到一定值时，超声作用强度最大，提取效果最好。而其他情况， 超声强度相对减弱；超声波作用强度大小具有对称性质，以超声器原点为中心， 在同一水平面半径相同的位置上超声强度大小基本相等。并且远离原点，超声 作用强度有所增强，总皂甙提取率增大；此外，超声波作用强度在垂直z 轴方 向上也有变化，本实验中，离超声器原点越近，超声波作用强度越弱；二、采 取热溶沉淀再精滤的工艺配制澄清母液；三、饮料调配时将非热敏性物料先高 温灭菌冷却后与热敏性物料总配，再无菌灌装：四、辅料最优配方为：柠檬酸1 o ，蜂蜜3 ，果汁3 ，西洋参香料0 4 0 ； 通过三个月恒温加速实验，对保健饮料进行卫生指标和主要功效成分稳定 性实验，结果表明本保健饮料的感观鉴定、卫生理化指标和保藏实验结果符合 四川大学面+ 学付论丈 质量要求，功效成分满足配方规定且稳定性良好。依据安全性毒理学和功能实 验评价结果，表明本保健饮料食用完全安全无毒，且具有缓解体力疲劳和增强 免疫力的功效作用； 本文依据中、西医和现代综合学科理论知识，研制出具有增强免疫力和缓 解体力疲劳的保健饮料，具有一定的学术探讨和应用研究价值，为中西医两大 保健资源的配伍、中西医和现代综合学科理论知识的结合应用以及研发具有特 定功能的复合保健食品提供了一定理论和技术知识依据；此外，本文依据西洋 参总皂甙物理化学特性，比较了传统有机溶剂浸提法与超声波辅助法的提取效 果，研究了两种方法的优化条件；并初步探索了影响超声波辅助提取量能的变 化，为相关研究提供了一定理论依据。 关键词：免疫力疲劳保健饮料西洋参总皂甙提取超声波量能 四川大学硕士学位论文 d e v e l o p m e n to fh e a l t hb e v e r a g ew i t h e n h a n c i n gi m m u n i t ya n dr e l i e v i n gf a t i g u e p o s t g r a d u a t ed e n gm o x i a n g s u p e r v i s o rz e n gf a n j u n b a s e do ns o m ei n t e g r a t i o nk n o w l e d g e s ，s u c ha sc h i n e s et r a d i t i o n a lm e d i c i n e ， w e s t i n em e d i c i n ea n dl i f es c i e n c e , t h eh e a l t hb e v e r a g ew i t he n h a n c i n gi m m u n i t y a n dr e l i e v i n gf a t i g u ew a sp r o d u c e d ，w h i c hw a sm a d eu po fa n i m a la n dp l a n ta c t i v e i n g r e d i e n t s ，v i t a m i na n dm i n e r a l s ，e r e t h ep r o d u c t sm a i nr e c i p ew a sp i c k e do u ta c c o r d i n ga st h ec h i n e s et r a d i t i o n a l m e d i c i n e sm a t c h i n gr u l e ，w h i c hw e r eg e n s e n g ，a s t r a g a i n sr o o t , r o y a lj e l l y , 2 - a m i n o e t h a n e s u l f o n i ca c i da n ds oo n ，b e i n gr e f e r e dt or e l a t i o n s h i p sb e t w e e n e f f i c i e n tc o i l s t i m e n t sa n df u n c t i o n s ，e f f i c i e n tc o n s t i t u e n t s q u a n t i t ya n ds e c u r i 吼i n a d d i t i o nw i t ht h ef u n c t i o n s 。a n ds oo n a l lt h e s er e s u l t sw e r ef i n d e dt h r o u g ht h es t u d y o fh e a l t hb e v e r a g ep r o d u c t i o nt e c h n o l o g y f i r s t l y , t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fs a p o n i n a b s t r a c t i o nw e r e ：u s i n g8 0 ( y v ) a q u e o u se t h a n o l 鹊s o l v e n ta tr e f l u xc o n d i t i o n ，t h e r a t i oo ff i q u i dt os o l i da s1 ：1 2 t h ep e r i o do fe x t r a c t i n g a s3 0m i n u t e a ，t h e t e m p e r a t u r ea s6 0 。t h ee x t r a c t i n gp o w e r 勰l o o w ，a n dt h ee x t r a c t i n gf r e q u e n c ya s 1 9 k i l z ；t h ea b s t r a t i o nw a sd o n et w ot i m e si nt h i sc o n d i t i o n s ；f u r t h e r m o r e ，t h e s t u d yr e s u l t so fe f f e e t i n gu l t r a s o n i cw a v ea b s t r a c t i o n sq u a n t i t ya n de n e r g yc h a n g i n g i n d i c a t e dt h a tt h r e ea s p e c t s o n e ，w h e nt h ei n h e r e n tf r e q u e n c yo fu l t r a s o n i e sw a t e r i nd i f f e r e n tr a t ew a st h em o s tr e a rt ou l t r a s o n i c s 。t h ee x t r a c t i o nr a t ew a st h eh i g h e s t ； t w o 。t h ec h a r a c t e ro fu l t r a s o n i ci n t e n s i t yw a ss y m m e t r yf o r m e da sc i r c l e so nt h e s a n l el e v e l ；t h r e e ，t h ed i s t r i b u t i o no fu l t r a s o n i cp o w e ri nv e r t i c a lw a sn o te q u a l l i n g ； 四川大学硕士学位论文 s e c o n d l y , t h em o t h e rl i q u i dw a sp r o d u c e db yw a l m - s o h i t i n g ，：t h i r d l y ，t h em e t l l o do f p r e p a r i n gb e v e r a g ew a s t h a ta f t e rh i 曲t e m p e r a t u r es t e r i l i z a t i o no fn o t - h e a t - v a r i a b l e m a t e r i a l ，m i x i n g i tw i t hh e a t v a r i a b l em a t e r i a l 。t h a n p a c k i n gt h e m i n a s e p s i s e n v i r o n m e n t ；l a s t l y 。t h eb e s ta c c e s s o r i a lr e c i p ew a s ：c i t r i ca c i d1 0 o ，h o n e y3 。 s y r u p3 。g e n - s e n gf l a v o ro 4 o ： i tw a su pt ot h em u s t a r dt h a tt h er e s u l to ft h r e ea c c e l e r a t i n gm o n t h se x p e r i m e n t ， a n dt h es t a b i l i t yo fb e v e r a g e sm a i ne f f i c a c yi n g r e d i e n t sw a sg o o d i tw a sc o n c l u d e d t h a tt h eh e a l t hb e v e r a g e ，w h i c hw a s $ e c u r et od n n k , c a ne n h a n c ei m m u n i t ya n d r e l i e v ef a t i g u e ，b yt h er e s u l t so fs e c u r i t ya n df u n c t i o ne x p e r i m e n t s u pt od a t e , m u l t i p l i c i t yh e a l t hb e v e r a g eh a v em a d e du po fa n i m a la n dp l a n t a c t i v ei n g r e d i e n t s 。v i t a m i na n dm i n e r a l s ，e r e a l el i t t l e s o ，t h i sp a p e rc a l lp r o v i d et h e f u n d a m e n t a lt h e o r e t i c sa n dt e c h n i q u ed a t af o rr e l a t e ds t u d y i th a sd e f i n i t et h e o r e t i c a l a n dp r a c t i e a ls i g n i f i c a n c ei nn e ws e v e r a lr e s o u r c ea n dc o m p o u n dh e a l t hp r o d u c t s d e v e l o p i n g k e yw o r d s ：i m m u n i t y , f a t i g u e ，h e a l t hb e v e r a g e ，g e n - s e n g ，s a p o n i n , a b s t r a c t i o n 。 u l t r a s o n i c 。q u a n t i t ya n de n e r g y i v 四川大学硕士学位论文 第一部分前言 1 1 缓解体力疲劳、增强免疫力保健饮料的研究概况 1 1 1引言 免疫是指机体接触“抗原性异物”或“异己成分”的一种特异性生理反应。 免疫系统对维持机体正常生理功能具有重要意义。当人们营养素摄入不足( 蛋 白质、维生素、微量元素等缺乏) 时会造成机体抵抗力下降，导致免疫活性降 低，对免疫机制产生不良影响m4 。疲劳是一个涉及许多生理生化因素的综合性 的生理过程，是人体脑力或体力活动到一定阶段时必然出现的一种正常的生理 现象，它既标志着机体原有工作能力的暂时下降，又可能是机体发展到伤病状 态的一个先兆。人体感到疲劳和机体免疫功能下降，虽然不像癌症、心脏病， 来势迅猛，直接而迅速地造成死亡，但它作为一种危害现代人健康的隐形杀手， 已严重影响了人们的工作和生活，大大增加了亚健康人群数量。 1 1 2 疲劳的形成、症状及其危害 据国际运动生化会议对疲劳的定义为：“机体的生理过程，不能将其机能保 持在一特定水平或各器官不能维持其预定的运动强度时，称为疲劳”。疲劳是防 止机体发生威胁生命的过度机能衰竭所产生的一种保护性反应，即提醒应降低 工作强度或终止运动，以免机体损伤硼。 疲劳的症状可分为一般症状和局部症状。全身性剧烈肌肉运动，可引起肌 肉疲劳，呼吸肌的疲劳，心率增加，自觉心悸和呼吸困难当疲劳继续加强， 中枢神经活动就要加强活动而补偿，逐渐又陷入中枢神经系统的疲劳，此而恶 性循环。疲劳的出现分为三个阶段：一、潜伏期，表面上正常，但经检查可发 现有疲劳的症状并继续；二、明显期，疲劳继续显著；三、蓄积期，由于没有 充分的恢复，反复继续工作，使疲劳终于成为蓄积性疲劳n ”。 疲劳过度可加速死亡。当人体长期处于疲劳状态下，可产生未老先衰和疲 劳综合症。疲劳综合症可出现：不易消除的疲惫；厌倦；烦躁；注意力不集中； 不明原因的心慌意乱；头晕；头痛；便秘或腹泻；皮肤出现色斑；厌食；腹胀； 性能力下降：高血压；高血脂；脂肪肝。出现上述二项者为轻度，四项者为中 5 四川大学硕士学位论文 度，六项及以上者为重度疲劳旧。 1 1 3 疲劳的生理生化本质 。 疲劳最主要的生理本质是由于肌肉活动而对能量代谢功能的影响。肌肉富 含蛋白质，但肌肉收缩的直接能源为a t p 。a t p 分解释放出高能的磷酸键。由 于肌球蛋白和肌动蛋白的反应，横纹肌每活动一次，需分解一个分子的a t p 。 a t p 分解为a d p ，而a d p 得到磷酸肌酸分解生成的磷酸，又立即转变为a t p 。 因此供应肌肉能源的a t p 含量维持，由于一、磷酸肌酸的分解；二、不断 地消耗氧、生成二氧化碳，不产生乳酸进入三羧酸循环的营养素的氧化过程； 三、生成乳酸的糖酵解过程m 。 疲劳时f h 于能量消耗的增加，必然使机体的需氧量增加。此时，血压升高， 特别是收缩压升高更为明显。不但如此，呼吸次数增加，肺通气量也发生很大 变化。总之，疲劳时的生理生化本质是多方面的，如体内疲劳物质的蓄积，包 括乳酸、丙酮酸、肝糖原、氮的代谢产物等；体液平衡的失调，包括渗透压、 p h 值、氧化还原物质间的平衡等“1 。 1 1 4 具有缓解体力疲劳功能的物质 具有缓解体力疲劳功效物质常见的有：人参、西洋参、黄芪、蜂王浆、当 参、三七、刺五加、葛根、乌骨鸡、灵芝、鹿茸、中华鳖、枸杞、红景天、虫 草、螺旋藻、大枣等中药，二十八醇，牛磺酸，鱼鳔胶、牡蛎提取物，麦芽油， 碱性盐，天门冬安酸盐类，咖啡因，抗自由基及抗脂质过氧化物质等。 抗疲劳的重要手段是补充能源和纠正机体内环境，特别是体液系统的不平 衡。由a t p 、辅酶q 、细胞色素c 和胰岛素等所组成的营养生化合剂，能促进 a t p 的合成，释放能量以供应需要嘲。糖是构成人体的重要组成成分之一，是人 体的主要供能物质，人体内主要表现为葡萄糖和糖原在人劳动或运动中葡萄 糖和糖原较大量消耗，从而造成中枢疲劳、运动能力降低。如果使人体内糖的 贮量增加，则可以延续上述现象的出现，提高运动和劳动的耐久力。蛋白质足 构成肌肉的主要原料，人体的运动将引起蛋白质分解加速，因此蛋白质对疲劳 的产生有重要影响。增加脂肪，对于由长期剧烈运动引起的疲劳有一定好处。 在长期剧烈运动中会产生大量乳酸，降低血的酸碱度，因此碱性食物或饮料对 6 四川大学硕士学位论文 抗疲劳也有好处。此外，维生素对人体的代谢功能有重要调节作用，现证实有 提高机体运动能力的维生素包括v e 、v 。和b 族维生素。不同的无机盐在体内具 有不同的生理功能，对高强度劳动者和运动员来说，影响较大且易缺乏的无机 元素主要有c a 、p 、f e 、k 、n a 、z n 等咖。服用s o d 、辅酶q 以及还原型谷脂甘 肽g s h ，都有抗疲劳作用。 值得注意的是，许多实验研究表明皂甙能够提高机体乳酸脱氢酶活力，肌 糖原和肝糖原的含量，同时能降低血乳酸含量从而对机体具有抗疲劳作用。并 且皂甙资源丰富，许多植物中都含有，因此皂甙是具有缓解体力疲劳功效成分 的优选之一。 1 1 5 皂甙 皂甙( s a p o n i n s ) 又称皂素，是广泛存在于植物界的一类特殊的甙类，它的 水溶液振摇后可生产持久的肥皂样的泡沫，因而得名。根据皂甙水解后生成皂 甙元的结构，可分为三萜皂甙( t r i t e r p e n o i d a ls a p o n i n s ) 与甾体皂甙 ( s t e r o i d a ls a p o n i n s ) 两大类。组成皂甙的糖常见的有葡萄糖、半乳糖、鼠李 糖、阿拉伯糖、木糖及葡萄糖醛酸、半乳稽醛酸等，常与皂甙元c 3 位的o h 连 接成甙。 1 1 5 1 结构类型及分布o ( 1 ) 三萜皂甙 其皂甙元为3 0 个碳原子组成的三萜类衍生物。大多数甙元在已或c 驾位有 c o o h 基，故又称酸性皂甙：少数甙元只含醇羟基而呈中性，如人参皂甙、柴胡 皂甙等。三萜皂甙元的结构可分为五环三萜( p e n t a c y c l it r i t e r p e n o i d s ) 及 四环三菇( t e t r a c y c l i ct r i t e r p e n o i d s ) 。三萜皂甙在植物界有较广泛的分布， 其中在双子叶植物分布较为普遍，含三萜皂甙植物较多的科及药用植物有五加 科( 人参、三七) 、伞形科( 柴胡) 、菊科( 紫菀、款冬花) 豆科( 甘草、黄芪、 皂荚) 、桔梗科( 桔梗、党参、南沙参) 、远志科( 远志) 、毛莨科( 威灵仙、白头 翁) 、蔷薇科( 地榆) 等，此外，在夹竹桃科、萝蘼科、石竹科、葫芦科、大戟 科、桃金娘科、茜草科、无患子科等植物中也有分布；单子叶植物含三萜皂甙 植物较少见，仅见于禾本科少数属；裸子植物及低等植物也较少含有这类皂甙。 7 四川大学硕士学位论文 ( 2 ) 甾体皂甙 甾体皂甙的皂甙元是由2 7 个碳原子组成，其不含羧基，呈中性，故又称中 性皂甙。甾体皂甙的基本骨架为螺旋甾烷( s p i r o s t a n e ) 或其异构体异螺旋甾旋 ( i s o s p i r o s t a n e ) ，有通式如下： 凹 2 3 - h 其中e 环是c 。，上的侧链和c ，。结合成并合的五元含氧环，e 环与f 环共用一 个碳，形成螺旋甾烷。c 。、c 。角甲基均为d 一型，a 环与b 环的稠合有反式也有 顺式，b 环与c 环以及c 环与d 环的稠合大多为反式。g 大多有一o h 基，和糖常 在此部位结合，某些皂甙元分子中还含有双键和羰基，双键常”，也有鲫”、 ”。等类型；羰基多在c 。位上。甾体皂甙在植物中已发现近百种。通过世界 各国大量的筛选，发现含有甾体皂甙及甾体皂甙元的植物，主要分布于被子植 物的1 5 科中，其中单子叶植物9 个科，占被子植物科中的6 0 9 6 ；双子叶植物6 个科，占被子植物科中的4 0 ；若以属来计算，含甾体皂甙元的有4 8 个属，其 中单子叶植物有4 1 个属，而双予叶植物仅占7 个属；若以种来计算，单子叶植 物的种数，可能占被子植物种数的9 0 以上。大部分集中在单子叶植物的百合科、 薯蓣科、龙舌兰科、延龄草科、菝葜科( 后二科在有的分类系统中也归于广义 的百合科中) ；双子叶植物仅在毛莨科、玄参科、茄科、豆科、蒺藜科、苦木 科、菊科少数种属中有分布。含有甾体皂甙的常用中药有穿山龙、绵萆薜，粉 萆解、重楼、菝葜、土茯苓、知母、麦冬、天门冬等。 1 1 5 2 物理化学通性 四川大学硕士擘位论文 皂甙大多为白色或乳白色的无定形粉末，味苦而辛辣，具吸湿性，能刺激 粘膜而引起喷嚏，无明显的熔点。可溶于水，易溶于热水、热甲醇、热乙醇， 不溶于乙醚、苯等极性小的有机溶剂。皂甙易溶于水饱和的丁醇或戊醇中，因 此常从水溶液中用丁醇或戊醇提取，借以与耱、蛋白质等亲水性成分分开。皂 甙经酶或酸水解生成的皂甙元为结晶状物质，可溶于丙酮、乙醚、氯仿等有机 溶剂。 皂甙水溶液大多能破坏红细胞而有溶血作用，因此含有皂甙的药物不能静 脉注射，但口服毒性较小，可能在胃肠道被水解所致。皂甙的溶血作用与血细 胞的种类和皂甙的结构有关，如对冷血动物的毒性较大，三萜皂甙的溶血作用 比甾体皂甙大。在同一条件下，不同的皂甙具不同的溶血指数。利用溶血指数 可以定量评价皂甙的溶血强度，也可以粗略测得电甙的含量。此外，另一些皂 甙不但无溶血作用，而且有血细胞凝聚作用，如沿阶草皂甙、竹节人参皂甙和 人参皂甙r 9 2 等。 皂甙的水溶液可以和一些金属盐类如铅盐、钡盐、铜盐等产生沉淀。酸性 皂甙的水溶液加入硫酸铵、醋酸铅或其它中性盐类即产生沉淀。中性皂甙的水 溶液则需加入碱式醋酸铅等碱性盐或氢氧化钡等才能产生沉淀。由此可用于皂 甙的提取和分离甾体皂甙在乙醇溶液中能与胆甾醇生成分子复合物而沉淀， 当沉淀用乙醚回流时，胆甾醇可溶于乙醚，而皂甙不溶，从而达到分离的目的。 1 1 5 3 主要定量分析方法 皂甙类成分由于结构中一般没有共轭体系，而且皂甙为大极性化合物，通 常需水或醇提取，水溶性杂质多，给其定量分析带来一定的困难。皂甙类成分 含量测定的常用方法有薄层色谱法、比色法、高效液相色谱法。此外，还有气 相色谱法、重量法、溶血指数法、液滴逆流色谱法极谱法、酸碱滴定法、库 仑滴定法等。少数目前还使用重量法测定总皂苷含量，如中国药典( 2 0 0 5 年版) 用重量法测定桔梗中三萜总皂苷。样品用甲醇提取，用以反复脱脂，残 渣干燥称重，规定含总皂苷不少于6 0 9 6 ；单体皂苷可采用薄层扫描法和高效 液相色谱法。多数采用高效液相色谱法，检测方法有紫外检测器 如中国药 典( 2 0 0 5 年版) 人参中三萜皂瞥类成分人参皂苷r9 1 、人参皂苷re 和 人参皂苷r b l 的测定，检测波长为2 0 3 r t m ：重楼中甾体皂苷类成分重楼皂苷 9 四川大学硕士学位论文 i 和重楼皂苷i i 的测定，检测波长为2 1 0 n m 和e l s d 检测器( 如黄芪中三 萜皂苷类成分黄芪甲苷，知母中甾体皂苷类成分菝葜皂苷元的测定) 。样品可 用甲醇提取后直接进样分析( 如莺楼) ，或先用三氯甲烷脱脂再用水饱和的正 丁醇提取，提取液蒸干，残渣甲醇溶解后进样分析( 如人参) ，或甲醇提取， 回收甲醇，残渣用水饱和的正丁醇萃取，萃取液回收正丁醇，样品上d 1 0 1 大 孔吸附树脂柱，水洗后再用不同浓度的乙醇溶液洗脱，收集含皂苷部分，回收 乙醇，残渣用甲醇溶解进样分析( 如黄芪) 。 i 1 5 4皂甙的生理活性及其功效作用 皂甙类成分能降低液体表面张力而产生泡沫，故可作为乳化剂。内服后能 刺激消化道粘膜，反射地促进呼吸道和消化道粘液腺的分泌，故具祛痰止咳的 功效，如桔梗、远志、紫菀常用作祛痰药。桑寄生、接骨木中的皂甙具祛风湿 作用。人参皂甙具强壮、大补元气作用，并对某些病理状态的机体起双向调节 作用或称适应原样作用。不少皂甙还有降胆固醇、抗炎、抑菌、免疫调节、兴 奋或抑制中枢神经、抑制胃液分泌，杀精子、杀软体动物等作用。有些甾体皂 甙也有抗肿瘤及抗真菌作用，大量用作合成甾体激素的原料。 ( 1 ) 缓解体力疲劳功能 许多动物实验表明皂甙能够提高机体乳酸脱氢酶活力，肌糖原和肝糖原的 含量，同时能降低血乳酸含量从而对机体具有抗疲劳作用。如张雪香碡1 等，用西 洋参人参皂甙喂养小自鼠，分别选用k i n g 氏法，乙醛、对羟基联苯比色法，蒽 酮比色法测定小白鼠的乳酸脱氢酶( l d h ) 活力，血乳酸含量及肌糖原，肝糖原 含量。结果表明，食用1 5 天g s b 自鼠的l d h 活力及肌糖原、肝糖原含量与对照组 比较有所增加，有显著性差异( p ( 0 0 5 ) ，而对照组1 5 天前后l d h 活力无显著性 差异。食用2 9 天g s 的小鼠在运动后2 0 m i n 、5 0 r a i n 的血乳酸值不仅明显低于对照 组，而且也低于本组实验前水平( p o 0 1 ) 证实了人参皂甙具有抗疲劳作用。 再如姚思宇“1 等给小鼠服用三七皂甙3 0 天后，小鼠的游泳时间明显长于未服用的 对照组小鼠，并能使机体内血尿素氮减少，体内肝糖原储备增加，从而提高耐 力。实验证实三七皂甙能帮助机体乳酸的清除，减少氧的消耗从而缓解体力疲 劳。上述结果均说明了三七皂甙具有缓解体力疲劳的功效。 ( 2 ) 增强机体的免疫功能 1 0 四川大学硕士学位论文 研究表明黄芪皂甙和人参皂甙均能增强网状内皮系统的吞噬功能，促进抗 体生成，加快抗原抗体反应和淋巴细胞转化。党参电甙及其水溶性成分均能提 高动物巨噬细胞功能，使细胞内的脱氧核糖核酸、糖类酸性磷酸酮、琥珀脱氡 酶的活性增强。黄芪皂甙对增强体液免疫、细胞免疫和免疫调节作用有广泛影 响。氧化芍药甙、苯甲酰芍药甙、苯甲酰氧化芍药甙能增强动物肝脏杯氏细胞 吞噬碳粒的作用，增加腹腔渗出液细胞数，能缩短体内碳粒廓清时间。 周小玲等嘲实验结果表明，三七总皂甙可降低外周血白细胞移行抑制指数， 增强机体的全身性特异性细胞免疫功能。外周血中性粒细胞和肺泡巨噬细胞具 有趋化、粘附及吞噬杀菌的功能，因此在抗细菌感染及清除入侵病原方面具有 重要作用；三七总皂甙还能明显提高外周血中性粒细胞和肺泡巨噬细胞的吞噬 率，说明它对机体的非特异性细胞免疫功能有增强作用。研究结果显示皂甙对 体内形成抗体的b 淋巴细胞增殖方面无明显的影响。王斌等哪通过检测脾细胞增 殖反应以及白介索l ( i l 1 ) 和自介素2 ( i l 一2 ) 活性，研究绞股蓝总皂甙体外对 免疫细胞功能的影响，结果表明，2 5 0 m g l 可明显促进刀豆蛋白a 诱导小鼠t 淋巴细胞增殖反应和脂多糖诱导b 淋巴细胞增殖反应；还可促进大鼠腹腔巨噬 细胞产生i l l 活性以及脾细胞产生i l 一2 活性。王先远等“”研究：苦瓜皂甙对 衰老小鼠免疫功能的影响，发现苦瓜皂甙不影响脾脏指数，但胸腺指数有升高 趋势，实验组吞噬指数、血清i l 一2 水平明显升高。苦瓜皂甙能明显增加胸腺 中c d 。细胞数，显著降低胸腺和脾脏中c d 。，c d 8 + 双阳性t 细胞数。体外实验表 明，苦瓜皂甙不但可促进脾脏分泌i l 一2 ，还可显著增强腹腔巨噬细胞分泌肿瘤 坏死因子a ( t n fa ) ，但不影响胸腺细胞凋亡百分率这表明苦瓜皂甙可通过改 变t 细胞各亚群比例，促进i l 一2 分泌，增强吞噬指数，提高衰老小鼠免疫功 能。王庭富等n 1 对人参皂甙r 9 3 的免疫功能进行实验研究，结果表明人参皂甙 r 9 3 能明显提高小鼠碳粒廓清速率、免疫器官重量、血清溶血素含量、脾淋巴细 胞转化和自然杀伤细胞心k ) 活性，箕结果均具有显著性差异。方桂伦等报道 了人参总皂甙通过刺激健康人和再生障碍性贫血患者的红系、粒系和巨核系祖 细胞增殖而促进血细胞生成。陈小红等“3 1 观察发现，人参皂甙能够明显地刺激 红系、粒单系、巨核系细胞数的增殖及转录因子的诱导作用，有效调控血细胞 与增殖或分化有关基因的表达。 ( 3 ) 皂甙不仅具有缓解体力疲劳和增强机体免疫力的功能，还可调节机体的物 四川大学硕士学位论文 质代谢，促进核酸及蛋白质的合成，调节血糖，可使高胆固醇症动物体内胆圆 醇降低，但对正常动物则能促进脂质合成，如王先远o ”和陈爽等“”的研究；具 有抗氧化作用，如王先远等“6 1 郭颂等“”李春英“”张嘉麟等“”王银萍等研究表 明，皂甙可显著增强超氧化物歧化酶( s o d ) 、谷胱甘肽过氧化物酶g s h p x ) 活力， 能显著降低血脂及过氧化脂质的含量，消除自由基，减轻自由基对细胞的损伤， 增加s o d 的含量等；还可以抗菌、抗病毒、抗炎及抗诱变等作用。 1 1 6免疫力的人体系统u 1 免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成。免疫器官根据它们的作 用，可分为中枢免疫器官和周围免疫器官；免疫细胞是泛指所有参与免疫应答 或与免疫应答有关的细胞及其前身，包括造血细胞、淋巴细胞等。执行固有免 疫功能的细胞有吞噬细胞、n l ( 细胞( 自然杀伤细胞) 等，执行适应性免疫功能 的有t 淋巴细胞及b 淋巴细胞，各种免疫细胞均源于造血干细胞。 人体的免疫功能包括天然免疫( 非特异性免疫) 和获得性免疫( 特异性免 疫) 两部分。天然免疫是机体在长期进化过程中逐步形成的防御功能，广泛且 与生俱来，所以又称为非特异性免疫，如正常组织( 皮肤等) 的屏障作用、正 常体液的杀菌作用。获得性免疫是指机体在个体发育过程中，与抗原异物接触 后产生的防御功能。免疫细胞初次接触抗原异物时并不立即发生免疫效应，而 是在高度分辨自我和非我的信号过程中被致敏，启动免疫应答，逐渐发展为具 有高度特异性功能的细胞和产生免疫效应的分子随后再遇到同样的抗原异物 时即发挥免疫防御功能。因此，获得性免疫具有1 、特异性，具有高度选择性， 只针对引起免疫应答的周一抗原起作用；2 、异质性，此免疫是由不同类型的免 疫细胞对相应的抗原异物分别产生应答；3 、记忆性，免疫细胞被特异致敏原保 存记忆的信息遇到同样的抗原异物时，能增强或加速发挥其免疫力；4 、可转移 性，特异性免疫可通过将免疫活细胞和抗体转移给正常个体，使受体对原始抗 原异物发生特异反应。特异性免疫和非特异性免疫有着密切的关系。前者是建 立在后者的基础上，而又大大增强后者对特异性病原体或抗原性物质的清除能 力，显著提高机体防御功能。免疫功能是机体逐步完善和进化的结果，其中非 特异性免疫是生物赖以生存的基础。 四川大学硕士学位论文 1 1 7营养与免疫田 均衡营养关系到人体免疫系统行使其正常功能。当人们营养不良时，表现 出免疫系统退化病变。免疫系统的异常会导致免疫应答的不健全，引起吞噬作 用减弱，细胞和体液免疫功能下降。 随着各种学科间的相互渗透，免疫学发展到食品科学和营养学研究的许多 领域。免疫反应的特异性与敏感性使它能够检测和定量地研究食品蛋白、有毒 性地植物与动物成分、食品传播性细菌地毒素与病毒。另外，通过营养免疫的 研究可以提供安全的食品原料和利用新的食物来源，尤其是蛋白质；常见的食 品蛋白质有：肉类蛋白、大豆蛋白、大麦种子蛋白、小麦蛋白、花生蛋自和鸟 类卵蛋白。这些蛋白一方面提供人体充分的蛋白质，另一方面，它们是免疫性 很强的免疫原。 不仅蛋白质缺乏会引起免疫功能紊乱，其他营养素缺乏同样会导致免疫活 性降低，如维生素、微量元素等缺乏也会造成不同程度的免疫失调。缺锌可损 害人和动物的免疫防御能力，从而导致疾病。通过小鼠实验人们观察到，动物 或人在缺锌或出现其他营养不良时都伴随有胸腺萎缩和淋巴细胞减少，宿主防 御能力下降。 1 1 8具有增强免疫力的功能性物质啪 人体由于营养素摄入不足造成机体抵抗力下降，会对免疫机制产生不良影 响。现在有不少功能性物质( 如黄芪、蚂蚁、人参、西洋参、蜂王浆、虫草、 枸杞、螺旋藻、灵芝、绞股蓝、蜂胶、鲨鱼软骨、刺五加，茯苓、阿胶、银杏 叶等) 具有较强韵免疫功能调节作用，可增强人体对疾病的抵抗力。与人体免 疫功能关系比较密切且具有明显增强作用的物质有营养强化剂( 如蛋白质、维 生素a 、维生索c 、维生素e 、铁等) 、免疫球蛋白( i g ) 、免疫活性肽、超氧化 物歧化酶( s o d ) 、双歧杆菌和乳酸菌、大蒜素和一些生物制剂等。 其中，活性多糖是一种额型高效免疫调节剂，能显著提高巨噬细胞的吞噬 能力，增强淋巴细胞( t 、b 淋巴细胞) 的活性，起到抗炎，抗细菌、抗病毒感 染、抑制肿瘤、抗衰老的作用。活性多糖主要分为植物多糖、动物多糖、菌类 多糖、藻类多糖等。常用到的有：黄芪多糖、人参多糖、香菇多糖、猴菇菌多 糖、灵芝多糖、猪苓多糖、茯苓多糖、云芝多糖、黑木耳多糖、银耳多糖、刺 四川大学硕士学位论文 五加多糖等。 1 。1 9粗多糖 多( 聚) 糖类( p o l y s a c c h a r i d e s ) 由二十多个到上万个单糖组成的大分子， 一种单糖组成的多糖，称为均多糖( h o m o s a c c h a r i d e ) ；由二种以上不同的单 糖组成的多糖，称杂多糖( h e t e r o s a c c h a r i d e ) 在多糖结构中除单糖外，还 含有糖醛酸、去氧糖、氨基糖与糖醇等，且可有别的取代基“1 。自然界中植物、 动物、微生物都含有多糖，生物体内多糖除以游离状态存在外，也以结合的方 式存在。结合型多糖有与蛋白质结合在一起的蛋白多糖和与脂质结合在一起的 脂多糖等。已发现不少多糖物质及其衍生物具有药用价值，尤其在抗凝、抗血 栓、调血脂、调节免疫功能和抗肿瘤、抗放射方面都有显著的药理作用与疗效， 多糖的研究日益受到重视。 1 1 9 1 粗多糖物的提取与纯化 ( 1 ) 提取 首先要根据多糖的存在形式及提取部位不同决定在提取之前是否作预处理， 对于动物多糖一般采用丙酮、乙醚、乙醇进行预处理。目的是脱脂o ”脱脂后的 残渣或不需要脱脂的原料常用水作溶剂提取多糖蚴，此外用碱性水液胤埘，氯化 钠水液作提取溶剂，也有用水、3 的碱溶液、1 0 的碱溶液依次提取嘲，所得的多 糖提取液有的可直接过滤或者用离心法除去不溶物。具体包括一，除蛋白。除蛋 白的技术主要应用于动物多糖的提取，以新鲜组织或丙酮脱脂脱水的组织或丙 酮脱脂脱水为原料，可用水或盐溶液提取部分粘多糖。但因大部分粘多糖是与蛋 白质结合的，需用酶降解蛋白质部分或( 和) 用碱使多糖蛋白质间的键裂开以促 进粘多糖在提取时的溶解吼她嘲。在碱性提取的同时用蛋白酶处理组织，可将提 取过程简化溉“。多糖中的游离蛋白质可用蛋白沉淀剂如三氯乙酸、鞣酸等除去 锄例，少量蛋白则用s e v a g 法除去阻3 1 一；二、去离子。去离子是为以后进一步纯 化及色谱分析作准备，最古老的去离子方法是透析法，必需选择一种规格适宜的 透析膜以免样品损失，透析方法不仅能去盐也可以除去各种小分子物质3 0 “。 使用柱离子交换法如用g 一2 5 以达到去离子作用，本法比较简单，但是增大了溶液 的体积，影响多糖的沉淀结果。纤维滤器透析法是根据膜技术而新发展起来的， 1 4 四川大学硕士学位论文 以这种方式对大多数样品进行浓缩速度很快，而且温和，所以即使发生失活也是 很小的。利用不同孔径的膜有可能使大小不同的分子分级。但这个方法的分辨 率要比分子筛层析可能达到的小得多；三、乙醇沉淀。用乙醇沉淀是一种从溶 液中定量回收多糖的简单方法，由于不同性质或不同分子量的多糖沉淀所需乙 醇浓度不同，它同样也可以用于样品中不同糖组分的分级分离嘲。要根据具体情 况使用不同浓度的乙醇，其中需要考虑的包括多糖的浓度及盐浓度。 ( 2 ) 分离精制及纯度检查 一般组织中存在多种多糖。因雨需要对多糖混合物进行分级分离。对多糖进 行分级分离的方法有多种，其中利用多糖在乙醇中的溶解度不同是一最为常用 的简单面有效的方法踟。根据多糖阴离子电荷密度的不同，可利用季铵络合物的 生成、离子交换色谱和电泳进行分级分离乜1 m 4 叫。根据分子量大小的不同，用凝 胶色谱、超滤等技术进行分级分离也是工业生产常用的方法“。4 3 6 1 最好的纯度标准是建立多项指标，每一项指标测定一种不同的特性“多糖 纯度”标准不能用通常化合物的纯度标准来衡量，因为即使多糖纯品其微观也并 不均一。测定多糖纯度的方法有功能团分析、比旋度、水解后糖组分分析、纸 色谱和高效液相色谱、超离心和高压电泳、超离心分析法等。现在色谱技术已 经得到较快的发展。应用也很方便，一般应用三种以上的色谱系统证明样品的纯 度嗍。电泳( 醋酸薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、玻璃纤维纸电泳等) 所检查 的带，一般均宽憾摒研。层析则以各种凝胶的柱层析较好胁”，必须得单一对称狭 窄的峰，高效液相层析配以适合糖分析柱，则效果更好。1 。 1 1 9 2 多糖的分子量测定 多糖的分子量测定最常用的是凝胶过滤法胁一。对于粘度大的多糖，可采用 粘度法求分子量。亦有用蒸汽压渗透法，此法用于些寡糖的分子量测定是很有 利的，但它最大的缺点是测定的结果是数均分子量，而由糖复合物( 特别是糖蛋 白) 得到的寡糖在多数情况下是不均一的，因此不能精确地了解某一糖链混合物 中各个组分的分子量。此外还有超离心法、光散射法、玻璃纤维纸电泳、聚丙 酰胺凝胶电泳m 1 测分子量，粘度法及超滤法估计分子量溉蜘利用不同方法测定 多糖分子量可以从不同角度对多稽分子量迸行确证，同时也是对多糖纯度的考 察。在测定过程中要注意标准品的选择，尽量使用与被测多糖结构相似的标准品， 四川大学硕士学位论文 因为不同结构的标准品虽然其绝对分子量相同而在一定的条件下所表现的分子 量会有所不同。多糖分子量的测定没有一种绝对的方法，其分子量只代表相似链 长的平均配布而不是确切的分子大小。往往用不同的方法会得到不同的分子量。 1 1 9 3 多糖的结构分析及舍量测定 多糖的结构分析手段很多，其中包括化学降解、酶降解、免疫化学或外源凝 集素亲和实验，放射层析、薄层色谱、纸色谱、高效液相色谱、红外光谱。“、 核磁共振光谱咖、质谱、气液连用嘲、x 一射线衍射等。糖的位置、糖环的大 小、异头碳的结构、连接的位置、内部排列顺序、分支、非碳端的取代等都不 可能通过一种方法解决，必须几种方法结合使用才能完成，尽管现在的二维核磁 共振光谱几乎可以取得多糖的完整结构信息，对于一个纯品而言，当我们把二维 核磁共振技术如c o s y 谱、n o e s y 谱、h o h a h a 谱及t o c s y 谱以及其它脉冲序列方 法结合起来，n m r 的信息将使我们能够推导出多糖的完整结构。此外质谱由于其 高度的灵敏性使其在多糖的结构分析中占有十分重要的位置。但从质谱还不能 直接得到完整的结构信息。因此质谱的应用主要有两个目的，第一，对各种应用 技术的不足作补充；第二，对极少数量的样品提供实验的方法和研究的策略，利 用极少的样品导出多糖的结构。 多糖含量测定法常采用容量滴定法，紫外一可见分光光度法。中国药典 ( 2 0 0 5 年版) 有的生药以多糖为指标控制质量，如用容量滴定法测定云芝多 糖以无水葡萄糖计不得少于3 0 9 6 ；以硫酸一葸酮紫外一可见分光光度法测 定灵芝多糖以无水葡萄糖计不得少于0 5 ；以苯酚一硫酸反应紫外一可见 分光光度法测定玉竹多糖以葡萄糖计不得少于6 o 。生药中的多糖常用水直 接提取分析。 1 1 9 4 粗多糖的生理活性及其功效作用 随着科学技术的发展，不少多糖的生物活性被发掘并用于临床。发现有些 多糖，特别是多聚葡萄糖具有显著的抗癌活性，因此引起各国家者的广泛研究。 这类多糖主要在d - 葡萄糖通过8 - 1 ，3 - 苷键相互缩合而成，对某些实验动物肿 瘤有明显的抵制作用，而且毒性很低。例如，从香菇中分离出的香菇多糖 ( 1 e n t i n a n ) 具有b - 1 ，3 - 葡萄糖苷键，是一种直链多糖，呈显著的抗癌活性。 1 6 四川大学硕士学位论文 由茯苓中分离的茯苓多糖具有8 - 1 ，3 - 葡萄糖昔键与少量1 3 - 1 ，6 - 葡萄糖苷键， 也有显著的抗癌活性。此外还有黄芪多糖、刺五加多糖、灵芝多糖、黄精多糖 都可促进人体的免疫功能。 ( 1 ) 提高机体免疫活性 齐春会等n ”实验表明枸杞粗多糖能促进或改善体液免疫功能，从而具有免 疫活性。口服给予枸杞粗多糖对l a c a 小鼠脾细胞增殖反应和抗体生成反应均具 有明显的促进作用，但对c t l 细胞特异性杀伤p 8 1 5 瘤细胞的杀伤活性无明显影 响；明显增加快速老化模型小鼠( s a m p 8 ) 脾抗体生成细胞的数目，升高脾细胞产 生抗体i g g 水平。宫朋嗍等实验表明木立芦荟粗多糖具有增强免疫力功能作用。 木立芦荟粗多糖按1 0 0 、2 0 0 、4 0 0 m g k g 给小鼠灌胃7 天，可使正常及免疫抑制 小鼠免疫器官重量明显增加，亦能明显增强小鼠网状内皮系统吞噬功能。 张志远h 3 1 对芦笋粗多糖进行实验发现，芦笋粗多糖大、中、小剂量组和香菇多 糖组均可显著提高正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能( p o 0 1 ) 。而芦笋粗多糖各 剂量组又优于香菇多糖组。与生理盐水组比较。大剂量芦笋粗多糖组对正常小 鼠溶血索及溶血空斑的形成和淋巴细胞韵转化有显著影响( p ，中剂量组 有极显著影响( p o 0 1 ) 。小剂量组对溶血空斑的形成有显著影响( p o 0 5 ) 。因 此芦笋粗多糖具有较强的免疫功能。姜元荣等以脱脂米糠为原料提取四种多 塘：高温及低温条件下蒸馏水提取水溶性多糖(