（食品科学专业论文）干酪乳杆菌LC2W细胞壁组分免疫活性的研究.pdf

上海海洋大学硕士学位论文 干酪乳杆菌l c 2 w 细胞壁组分免疫活性的研究 摘要 乳杆菌是肠道土著菌群的重要成员之一，能在肠道中定植，能改 善或调节肠道微生物菌群的平衡、增强机体免疫力及抑制肿瘤的形成 等。研究表明，作为g + 细胞壁主要组成成分的肽聚糖和磷壁酸，可能 是其免疫原性的主要来源。目前，乳杆菌( 如植物乳杆菌和鼠李糖乳杆 菌) 细胞壁肽聚糖和磷壁酸已被成功分离提取出来，并被证明是一种新 型的免疫原和非特异性免疫增强剂。而对干酪乳杆菌细胞壁组分免疫 功能相关研究还鲜见报道。本文分离提取干酪乳杆菌细胞壁组分肽聚 糖和磷壁酸，通过体外细胞实验，研究所提取的两物质对小鼠巨噬细 胞细胞系r a w 2 6 4 7 细胞的激活作用、吞噬功能及细胞因子表达的影 响。 以m r s 基础培养基对干酪乳杆菌l c 2 w 进行增菌培养，收集对数 期菌体，洗涤菌体并采用超声破碎细胞壁，s d s 加酶处理去蛋白、d n a 及r n a ；纯化的细胞壁进一步经三氯乙酸处理分离提取磷壁酸和肽聚 糖，并在波长1 9 0 - 6 0 0n m 范围内采用紫外光谱全波长扫描检测其纯 度，选用体外培养的r a w 2 6 4 7 作为研究对象，通过测定干酪乳杆菌 l c 2 w 磷壁酸和肽聚糖对r a w 2 6 4 7 细胞活性的影响，探讨此细胞壁 两组分的免疫调节作用。 首先，巨噬细胞作为先天性免疫的重要成员，对巨噬细胞的激活 与刺激作用是诱导宿主免疫应答的第一步，只有激活的巨噬细胞才能 发挥其免疫功能。实验选择观察其受刺激后r a w 2 6 4 7 巨噬细胞形态、 m t t 代谢水平及细胞内乳酸脱氢酶( l d h ) 活性的变化，研究提取的细 胞壁主要组分肽聚糖和磷壁酸对巨噬细胞激活途径的影响，结果表明， 上海海洋大学硕士学位论文 受刺激后的r a w 2 6 4 7 巨噬细胞形态发生明显变化，在1 0 - - 1 0 0g g m l 浓度范围内，磷壁酸和肽聚糖能够有效增强其代谢能力和l d h 活性， 并呈一定的剂量依赖性，表明干酪乳杆菌l c 2 w 的磷壁酸和肽聚糖对 巨噬细胞具有激活与刺激作用。 其次，实验选择吞噬中性红、肠道致病菌大肠杆菌和沙门氏菌为 研究对象，并采用c f d a s e 荧光标记的方法研究磷壁酸和肽聚糖对 r a w 2 6 4 7 巨噬细胞吞噬致病菌能力的影响。结果显示，与对照组相比， 经磷壁酸和肽聚糖2 4h 刺激后，巨噬细胞吞噬中性红、致病性大肠杆 菌和肠炎沙门氏菌能力均有明显增强，并呈剂量依赖性；但经刺激后 巨噬细胞吞噬大肠杆菌的能力明显高于沙门氏菌，可能是由于两致病 菌的入侵方式存在差异。结果证明了采用c f d a s e 标记，荧光分光光 度检测法定量检测致病菌的吞噬功能简便、快速和重复性好，巨噬细 胞受磷壁酸和肽聚糖激活后，其吞噬能力明显提高。 最后，研究磷壁酸和肽聚糖对r a w 2 6 4 7 巨噬细胞产生的主要免 疫因子的影响。结果显示经磷壁酸和肽聚糖2 4h 刺激后，r a w 2 6 4 7 巨噬细胞释放的n o 、i l 一1 2 量明显比未经刺激的对照组高，1 0 0r t g r n i 。 和3 0r t g n ：1 l 间差异也显著( p o 0 5 ) ，而研究还发现，在1 0 - - 1 0 0 t e d m t , 浓度范围内，经刺激后的巨噬细胞产生的抗炎性因子i l 1 0 并没有增 加。结果表明磷壁酸和肽聚糖能显著提高生物活性因子( i l 1 2 、n o ) 的 释放，促进巨噬细胞杀伤、清除病原体及肿瘤细胞的作用，从而提高 其免疫监视功能。同时，适量的浓度刺激并没有造成过度的炎症反应。 关键词：干酪乳杆菌l c 2 w ；细胞壁组分；免疫活性 i i 上海海洋大学硕士学位论文 i m m u n o m o d u l a t o r ya c t i v i t yo f c e l lw a l lc o m p o n e n t so f l c a s e i l c 2 w 锄v i t r o a b s t r a c t a sa l li m p o r t a n tm e m b e ro fi n t e s t i n a l i n d i g e n o u sm i c r o f l o r a ，l a c t o b a c i l l ie x e r t c r i t i c a lp h y s i o l o g i c a li m p a c t so nh o s th e a l t hi n c l u d i n gr e s i s t i n gp a t h o g e nc o l o n i z a t i o n ， a d ju s t i n gm i c r o e c o l o g yb a l a n c e ，a n t i - t u m o rf o r m i n g ，i m p r o v i n gh o s td e f e n s ea n d i m m u n es y s t e m i ti s r e p o r t e dt h ei m m u n o m o d u l a t o r ya c t i v i t yo fl a c t o b a c i l l i i s p r e d o m i n a n t l yd e r i v e df r o mt w oc o m p o n e n t so fi t sc e l lw a l l ，i e p e o t i d o g l y c a n ( p g ) a n dt e i c h o i ca c i d ( t a ) ，w h i c ha x eu b i q u i t o u si ng r a mp o s i t i v eb a c t e r i a a l t h o u g ht h e i m m u n o m o d u l a t o r ya c t i v i t yo fl a c t i ca c i db a c t e r i ah a db e e nw i d e l yr e c o g n i z e d ，t h e i m m u n o g e n i co ft h eb a c t e r i aw a sr e g a r d e da ss t r a i n s p e c i f i cb a s e do nt h ee v i d e n c e o b t a i n e ds of a r p ga n dt ai s o l a t e df r o mt h ec e l lw a l lo fam a j o r i t yo fp r o b i o t i c l a c t o b a c i l l u s s p e c i e se g l b p l a n t a r u ma n dl b r h a m n o s u s h a da l r e a d yb e e n e x t e n s i v e l yi n v e s t i g a t e df o rt h e i ri m m u n o g e n i cp r o p e r i t e sa n dp r o v e dt ob ep o t e n t i a l n e wn o n s p e c i f i ci m m u n i t ye n h a n c e r s ，w h e r e a sf e ws t u d i e sc o n c e r n i n gt h ep ga n dt ao f l b e a s e lc e l l so nh o s ti m m u n ef u n c t i o nh a db e e nr e p o r t e d i nt h ep a p e r , t h ei s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o no fp ga n dt af r o ml b c a s e il c 2 w c e l l sa n dt h e i re f f e c t so n am u r i n e m i c r o p h a g ec e l ll i n er a w 2 6 4 7i na s p e c t so fm i c r o p h a g es t i m u l a t i o na n da c t i v a t i o n ， p h a g o c y t o s i sa n dc y t o k i n ee x p r e s s i o ni nv i t r ow e r er e p o r t e d l b c a s e il c 2 ww a sc u l t u r e di nm r sb r o t ha t3 7 0 ca n dt h e nt h eb a c t e r i ac e l l si n t h el a t e - l o g - p h a s ew e r ec o l l e c t e d 。w a s h e db a c t e r i a lc e l l sw e r eb r o k e nb yu l t r a s o n i c t r e a t m e n t ，州t l lp r o t e i n ，d n aa n dr n ad e p l e t e de f f e c t i v e l yb yt r e a t m e n tw i t he n z y m e a n ds d s t aa n dp gw a sf u r t h e re x t r a c t e df r o mt h ec r u d ec e l lw a l lf r a c t i o nb ya d d i t i o n o ft r i c h l o r o a c e t i ca c i d ( t c a ) t h ep u r i t yo ft h ei s o l a t e dp ga n dt aw e r ec h e c k e db y s c a n n i n gt h eo p t i c a l a d s o r b a n c ef r o m19 0 n mt o6 0 0n l t l r e s p e c t i v e l y t h e nt h e i m m u n o m o d u l a t o r ye f f e c t so ft h et w oc e l l w a l lc o m p o n e n t so f 三e a s e ll c 2 ww e r e a s s e s s e di nv i t r ov i a s u r v e y i n gt h e i ri m p a c t so na c t i v i t i e so fm a c r o p h a g ec e l l s ， e m p l o y i n gt h ec u l t u r e dm u r i n em a c r o p h a g ec e l ll i n er a w 2 6 4 7a ss u b j e c t s f i r s t l y , a sa ni m p o r t a n tc o m p o n e n to fh o s ti n n a t ei m m u n i t y , a c t i v i t a t i o na n d s t i m u l a t i o no fm i c r o p h a g e sw a st h ef i r s ta n dc r i t i c a ls t e pi ni n d u c i n gi m m u n er e s p o n s e i n h o s t ，o n l ya c t i v a t e dm a c r o p h a g ec a nh a v ei m m u n ef u n t i o n s ot h em t te n e r g y m e t a b o l i s ml e v e l ，t h ea c t i v i t yo fl a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ( l d h ) a n dc e l lc h a n g eo f i i i 上海海洋大学硕十学位论文 s t m u l a t e dr a w 2 6 4 7m a c r o p h a g ew e r eo b s e r v e di nt h ep a p e r , a st os t u d yt h ee f f e c to f p ga n dt ao nc e l ls t i m u l a t i n gp a t h w a yo fm u r i n em a c r o p h a g ec e l l s i tw a ss h o w e dt h a t c e l lm o 印h o u so fs t m u l a t e dr a w 2 6 4 7m a c r o p h a g ec h a n g e do b v i o u s l y ，a n dt h ee n e r g y m e t a b o l i s ml e v e l ，t h ea c t i v i t yo fl d hw a se n h a n c e de f f e c t i v e l yf r o m10 l t g m lt o 10 0 p g m l ，a l s oi nad o s a g e - d e p e n d e n tm a n n e r t h e s ef i n d i n g ss u g g e s t e dt h a tp ga n d t ai nc e l lw a l lo flc a s e il c 2 wc a l la c t i v a t em a c r o p h a g ec e l l s ，f o u n d e df o ri m m u n e f u n c t i o n s e c o n d l y ，t h ep h a g o c y t i ca c t i v i t yt on e u t r a lr e da sw e l la se n t e r o p a t h o g e i c p a t h o g e n sw i t hc f d a - s ef l u o r e s c e n t l y l a b e l e do fm u r i n em a c r o p h a g er a w 2 6 4 7c e l l s w a sr e s e a r c h e di nt h ew o r k t h er e s u l t sd e m o n s t r a t et h a tt h ep h a g o c y t i ca c t i v i t yo f m a c r o p h a g ec e l l ss t i m u l a t e df o r2 4hb yp ga n dt aw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h o s e i nc o n t r o lg r o u p ，a n dw a sa l s oi nad o s a g e d e p e n d e n tm a n n e r ，b u tp h a g o c y t i ca c t i v i t yt o e s c h e r i c h i ac o l ie p e ca s1 7 2w a so b v i o u s l yh i g h e rt h a nt h a tt os a l m o n e l l ae n t e r i t i s a s5 0 0 41 ，m a y b et h ew a yo fi n v a s i o no fb o t hp a t h o g e n i cb a c t e r i ai sv a r i o u s i ti s e v i e d n c et h a tt h ed e t e c t i o no ff l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p i c a lw i t hc f d a s el a b e l l i n g w a sc o n v e n i e n t ，f a s ta n dg o o dr e p e t i t i v e n e s s t h e p h a g o c y t i ca c t i v i t yo fm u r i n e m a c r o p h a g er a w 2 6 4 7c e l l ss t i m u l a t e db yp g a n dt aw a se l e v a t e d f i n a l l y , t h ee f f e c to fp ga n dt ao ni m m u n ef a c t o ro fm a c r o p h a g er a w 2 6 4 7c e l l s w a si n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tm a c r o p h a g er a w 2 6 4 7c e l l ss t i m u l a t e d f o r 2 4h b yp ga n dt ap r o d u c e dm o r ei n t e r l e u k i ni l 一12 ，a n dn i t r i co x i d e ( n o ) t h a nt h e c o n t r 0 1 t h ep r o d u c t i o nd i f f e rs i g n i f i c a n t l y ( p ，t ：一7 ：圈 图2 - ij 】三常年【| 破碎后的干酪乳杆菌l c 2 w 细胞形态变化 f i g2 - 1c e l lc h a n g e o f n o r m a la n db r o k e n c a s e il c 2 w a ：n o d a ll c 2 w ：b ：b r o k e nl c 2 w 上海海洋大学硕士学位论文 2 3 2 提取物紫外光谱分析 肽聚糖和磷壁酸的全波长扫描结果见图2 2 、图2 3 ，光谱显示，两组分仅在1 9 0 r i m 处有一吸收峰，这是糖特征性的紫外吸收峰，在2 6 0n m 和2 8 0n m 处均无明 显吸收，说明经超声破碎，胰酶、核酸酶处理，t c a 去脂等分离步骤分离所得的 细胞壁主要成分肽聚糖和磷壁酸的提取方法能够有效地去除肽聚糖中的杂蛋白、 核酸。 图2 2 肽聚糖的紫外光谱 f i g 2 - 2u vs p e c t r ao f p e p t i d o g l y c a n 1 7 上海海洋_ 人学硕十学位论立 困2 3 磷壁酸的紫外光谱 f i g2 - 3u vs p e c t r a o f t e i c h o l ca c i d 2 3 3 巨噬细胞外部形态的变化 在显微镜下，观察巨噬细胞的外部形态，发现添加药物组细胞体积明显增大， 呈圆形、椭圆、菱形、梭形或者不规则形，还可见较长的伪足。对照组细胞一般 呈圆形、椭圆形，很少见有突起。 图2 4 正常和刺激后的巨噬细胞r a w 2 6 47 细胞形态变化 f i g2 4 c e l le h 加g e o f n o d a l 锄ds t m u l a l e d r a w 2 6 47 m a c r o p h a g e a ：n o r m a lr a w 2 6 47m a c r o p h a g o ：b ：s t i m u l a t e dr a w 2 6 47m a c r o p h a g e 2 3 4 磷壁酸和肽聚糖对r a w 2 6 47 巨噬细胞代谢活力的影响 r a w 2 6 47 巨噬细胞与乳杆菌l c 2 w 细胞壁主要组分肽聚糖和磷壁酸共培养 后，经m t t 法测定结果表明，细胞经两物质刺激，其代谢m t l 的能力明显高于对 照组，并成一定的剂量效应：当浓度为5 0v g m l 和1 0 0p 咖l 时，细胞代谢水平较 对照组相比，差异非常显著( p 00 5 ) ，见表2 - 1 。 上海海洋大学硕士学位论文 表2 1 磷壁酸和肽聚糖对r a w 2 6 4 7 巨噬细胞代谢水平的影响 t a b l e2 1e f f e c to f t e i c h o i ca c i da n dp e p t i d o g l y c a no i lr a w 2 6 4 7m a c r o p h a g em e t a b o l i s m 注：与对照组相比差异显著( p ( o 0 5 ) i 与对照组相比差异非常显著( p o 0 1 ) 2 3 5 磷壁酸和肽聚糖对l d h 活性的影响 0 6 0 5 0 4 司0 。3 0 2 0 1 0 0l u2 u了u5 u1 0 d 浓度( 掣g m 1 ) 图2 - 5 磷壁酸和肽聚糖对r a w 2 6 4 7 巨噬细胞内l d h 活性的影响 f i g2 - 5e f f e c to ft e i c h o i ca c i da n dp e p t i d o g l y c a no nl d hi nr a w 2 6 4 7m a c r o p h a g e 注：与对照组相比差异显著( p o 0 5 ) ：与对照组相比差异非常显著( p 0 o i ) 由图2 5 可得，磷壁酸和肽聚糖在1 0 1 0 0 a g m l 浓度范围内随浓度增大均可 显著增加r a w 2 6 4 7 巨噬细胞内l d h 活性；与对照组相比，当浓度达到3 0l x g m l 时，差异非常显著( p o 0 5 ) 。 1 9 上海海洋大学硕士学位论文 2 4 讨论 细胞壁是位于细胞膜外的一层较厚坚韧并略具弹性的结构，且本身机械强度 高，生物活性稳定，除有保护细胞的作用，其含有的活性成分可作为免疫调节剂 发挥其免疫调节作用，目前，国内外研究比较关注细胞壁组分肽聚糖和磷壁酸。 肽聚糖是g + 细胞壁的最主要成分，由n 乙酰葡糖胺和n 乙酰胞壁酸通过四肽桥 聚合而成的空间立体结构，坚固高达5 0 层，占细胞壁总重的8 0 以上，保持了细 胞壁固有的生物学特性。其可直接作为一种免疫原激活免疫细胞，增强其吞噬和 杀伤外来入侵病原微生物，也可诱导各种细胞因子的释放，调节宿主的免疫功能【2 0 2 1 2 引。磷壁酸是g + 细胞壁特有成分，是含有磷酸甘油残基的多聚物，可特异或非 特异结合到靶细胞上，与循环抗体结合激活免疫应答反应，还可介导宿主免疫细 胞杀伤作用，是重要的免疫赋活因子 2 1 ，3 9 。国内外研究者已经对多种乳杆菌的肽 聚糖及磷壁酸进行分离提取，本实验采用了超声破碎、s d s 处理、酶处理及t c a 处理分离提取磷壁酸和肽聚糖，结果显示，超声处理加s d s 处理能够有效的破碎 细胞，而实验通过紫外光谱分析发现经过酶处理能够有效地去除乳杆菌的非共价 蛋白及共价蛋白，避免了实验中蛋白成分影响制备样品的生物活性因素。 巨噬细胞是一种具有多种功能的免疫细胞，其不仅参与机体非特异性免疫防 御，还参与机体的抗肿瘤及免疫监视作用。通常研究表明只有激活的巨噬细胞才 具有活跃生物学作用的效应细胞。因此，可以认为巨噬细胞的激活是巨噬细胞实 现其多种功能的基础1 7 引。巨噬细胞的激活过程是个复杂多步骤地过程，在不同的 活化阶段，涉及不同刺激因子的作用，细胞形态及功能也发生改变，一般巨噬细 胞处于静止状态，在外来抗原或某些细胞因子作用下转变为活化的巨噬细胞，在 此变化过程中，巨噬细胞形态改变( 浆膜成不规则波浪形、细胞器增多凸起、伪足 增多变成) 、代谢增强( 胞内蛋白质合成与a t p 生成增加、酸性磷酸酶增强) 、功能增 强( 吞噬能力、杀菌剂杀瘤能力、分泌活性因子能力) 等【9 _ 2 1 。本实验中，细胞刺激 前后，细胞形态发生的变化也说明了所提取的磷壁酸和肽聚糖能够激活巨噬细胞 r a w 2 6 4 7 。 l d h 存在于巨噬细胞内，其功能是催化乳酸脱氢成为丙酮酸或丙酮酸还原为 乳酸，即参与能量物质的有氧氧化或无氧酵解。巨噬细胞在吞噬过程中其能量来 源主要通过糖酵解途径，该过程中产生的乳酸使细胞内p h 下降有利于溶酶体酶发 挥作用，巨噬细胞被激活后，胞i 为l d h 等酶的活性均明显提高，故l d h 活性与巨 噬细胞的激活程度相关，被认为是巨噬细胞被激活的标志之一r7 7 、碣j 。本实验研究 结果显示，与对照组相比，磷壁酸和肽聚糖均能增强其细胞内l d h 活性，并呈一 上海海洋大学硕士学位论文 定的浓度依赖性，高浓度的两物质表现出极其的刺激作用，表明磷壁酸和肽聚糖 激活具有巨噬细胞作用。已知活细胞线粒体的乳酸脱氢酶能催化m t t 形成m t t - 甲 复合物，该复合物浓度的高低可反映细胞能量代谢的水平及生长增殖的能力【_ 7 9 】。 本实验研究发现，巨噬细胞经肽聚糖和磷壁酸刺激后，其产生的m t t - 甲复合物能 力显著高于对照组，结合上述试验结果，进一步说明乳杆菌l c 2 w 细胞壁组分可活 化巨噬细胞r a w 2 6 4 7 ，增强其代谢能力。一般认为，代谢功能是机体状态好坏的 一个重要指标。巨噬细胞的代谢状况和其吞噬能力直接相关，代谢旺盛，则说明 巨噬细胞的吞噬能力增强；代谢减弱，则吞噬功能下降【7 2 】。本实验通过体外细胞 实验研究表明，干酪乳杆菌l c 2 w 细胞壁所提取的磷壁酸和肽聚糖可激活巨噬细 胞，为巨噬细胞发挥其免疫功能奠定基础。机体内免疫调节作用是错综复杂的过 程，而本实验选择体外细胞实验模型，较体内环境简单，条件易控制，并为体内 进一步研究提供实验数据和实验思路。 2 5 结论 1 本实验利用超声波及s d s 处理后，干酪乳杆菌l c 2 w 破碎效果很好，获得完 整的细胞壁，通过光谱分析可见经一系列酶处理及t c a 处理可有效的提取细胞壁 主要组分肽聚糖和磷壁酸。 2 由于激活后巨噬细胞形态、代谢水平及细胞内酶活发生变化，本实验以此作为 测定指标，检测所提取的细胞壁组分磷壁酸和肽聚糖免疫活性，结果表明刺激后 的巨噬细胞形态发生明显变化，并且磷壁酸和肽聚糖能够有效增强其代谢能力和 l d h 活性，从而激活巨噬细胞r a w 2 6 4 7 信号传导途径，为其进一步发挥免疫作 用奠定基础。 2 l 上海海洋大学硕士学位论文 第三章干酪乳杆菌l c 2 w 肽聚糖和磷壁酸对巨噬细胞吞噬活 性的影响 3 1 前言 大肠杆菌和沙门氏菌是人体常见的肠道致病菌，能引起急、慢性腹泻，肠胃 炎等感染性疾病，造成免疫系统紊乱，严重者甚至威胁生命，治疗手段多采用抗 生素等。但目前由于大量滥用抗生素，造成了动物肠道菌群严重失调，多种抗药 菌株大量出现，造成动物体对各种疾病的抵抗力降低，使混合型疾病增多，治疗 的难度加大 8 0 1 。有效采用益生菌及其细胞组分作为微生态制剂，抑制病菌侵入， 提高机体免疫，使我们对解决抗生素的副作用充满了希望【8 1 1 。巨噬细胞在机体中 广泛分布，是非特异性免疫反应的重要效应细胞，参与机体对多种病原微生物的 抵抗作用。巨噬细胞吞噬能力可以作为抗感染强弱的重要指标，测定方法多采取 体外抑菌实验，方法简便，需时短，用药量少，不需要动物和特殊设备，结果可 靠，实验具有一定可行性【9 7 2 1 。前一实验已经初步研究证明了提取的磷壁酸和肽 聚糖能够激活巨噬细胞。由于激活的巨噬细胞有较强的吞噬和胞饮作用，因此本 实验通过体外抑菌实验，测定小鼠巨噬细胞系r a w 2 6 4 7 受到干酪乳杆菌l c 2 w 磷 壁酸和肽聚糖刺激后对中性红以及致病菌吞噬能力的变化。初步探讨干酪乳杆菌 l c 2 w 细胞壁成分对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响，为进一步研究干酪乳杆菌 l c 2 w 的免疫调节作用奠定基础。 5 一( 6 ) 羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯( c f d a - s e ) 是一种酯化荧光素衍生物 制备的分子探针，可自由穿透细胞膜并在细胞内被酯酶转化成能发出黄绿色荧光 的c f s e i s 2 】。c f d a s e 在国外已被广泛应用于细胞和细菌的示踪剂，取代昂贵且不 安全的同位素标记，而检测效果非常理想，但国内应用此探针标记细菌的研究还 鲜有报道。本实验选用c f d a s e 做为荧光探针来标记大肠杆菌和沙门氏菌，通过 荧光分光光度计来检测巨噬细胞吞噬功能，以求找到种简便、客观和准确的方 法。 上海海洋大学硕士学位论文 3 2 材料与方法 3 2 1 菌种和细胞 干酪乳杆菌l c 2 w ( l a c t o b a c i l l u sc a s e ic g m c cn o 0 8 2 8 ) ，致病性大肠杆菌 ( e n t e r o p a t h o g e n i ce s c h e r i c h i ac o l ie p e ca s1 7 2 ) ，肠炎沙门氏菌( s a l m o n e l l a e n t e r i t i sa s5 0 0 4 1 ) 由光明乳业技术中心提供。小鼠巨噬细胞系r a w 2 6 4 7 细胞株， 由中国科学院上海细胞生物学研究所购得。 3 2 2 试剂与药品 3 2 2 1 试剂 表3 1 实验试剂表 t a b l e3 - 1e x p e r i m e n t a lr e a g e n t sl i s t 上海海洋大学硕士学位论文 3 2 2 2 培养基 m r s 固体培养基：用于乳酸菌菌种的纯化及平板计数； m r s 液体培养基：用于乳酸菌的增殖培养； 营养肉汤培养基：用于致病菌的纯化； 营养琼脂培养基：用于致病菌的增殖培养； d m e m 完全培养液由8 3 d m e m 培养液、1 5 胎牛血清、1 链霉素( 1 0 0 ) l g m l ) 、1 青霉素( 1 0 0u m l ) 组成。用于r a w 2 6 4 7 细胞的常规培养； d m e m 的不完全培养液由8 5 d m e m 培养液、1 5 胎牛血清组成。用于细胞 试验。 3 2 3 试验仪器与设备 表3 - 2 实验仪器及设备表 t a b l e3 - 2e x p e r i m e n t a la p p a r a t u sa n de q u i p m e n t sl i s t 3 2 4 微生物培养 乳杆菌l c 2 w 在含有体积分数为1 0 甘油的m r s 液体培养基中于8 4 条件 上海海洋大学硕士学位论文 下保存。将l c 2 w 菌种接种于m r s 液体培养基，3 7 静黄培养1 4 1 6h ，并转接 2 代。培养完毕后，迅速降温至4 。在8 0 0 0 g ，1 5r a i n ，4 离心收集细菌沉 淀，并用磷酸盐缓冲液( p h = 7 5 ) 反复洗涤细菌3 次，备用。挑取斜面保藏的致病菌 菌种转接至装有1m l 营养肉汤液体培养基的离心管中，3 7 培养1 2h 。按1 接种量连续转接两代备用。 3 2 5r a w 2 6 4 7 细胞培养 同2 2 5 。 3 2 6 细胞壁组分分离提取 同2 2 6 。 3 2 7 巨噬细胞吞噬中性红能力的测定 采用中性红试验，按2 2 8 条件和过程制备另- - 9 6 孑l 细胞培养板，将巨噬细胞 与不同浓度的样品置3 7 、5 c 0 2 恒温箱孵育4h 。弃去培养液，每孔加入中性 红1 0 0 此，3 7 作用1h 后，用p b s 洗3 次，加1 0 0l a l 细胞裂解液( 无水乙醇：o 1 m 乙酸= 1 ：1 ) ，置4 冰箱过夜，采用酶联免疫测试仪测定4 9 0n l n 处各孑l 吸光值( a 值) ，求每组a 值平均值，结果并以巨噬细胞吞噬率表示。 吞噬率( ) = ( 实验孔a 值- 对照孔a 值) 对照孔a 值1 0 0 3 2 8 致病菌荧光标记 按照改进l o g a n 法【8 3 1 ，把c f d a s e 溶解于d m s o ，配制成浓度为1m m 贮备 液，用0 2l a m 的微滤膜过滤除菌后于2 0 保存备用。实验时向5m l 致病菌菌悬 液( 1 1 0 8c f u m l ) 中加入7 5l a l 的c f d a s e 贮备液，3 7 避光孵育1 5r a i n 。将 茵悬液离- 心( 8 0 0 0 x g ，4 ，1 0m i n ) 黼，以除去未标记上的c f d a s e 。重新 悬浮于p b s 中，并避光保存备用。 3 2 9 不同浓度下巨噬细胞吞噬致病菌荧光强度的检测 取细胞悬液( 1 1 0 6 m e ) 加入2 4 孔培养板中，每孔加入1m l ，2h 后弃去未贴壁 细胞，用p b s 洗3 次后，向实验孔加入不同浓度1 0l - t g m l 、2 0 “g m l 、3 0l - t g m l 、 5 0p g m l 、1 0 0p g m l 的样y 5 0 0l a l ( 以d m e m 不完全培养液配制) ，同时设有培养 2 5 上海海洋火学硕士学位论文 液单纯培养细胞的对照孔。置3 7 ，5 c 0 2 培养箱培养2 4h 后，向各孔加5 0 0i t l c f d a s e 标记的致病菌悬液，将培养板置3 7 ，5 c 0 2 分别孵育lh 后，用无菌 p b s 沈涤3 次，将未被吞噬的致病菌洗脱。之后每个培养皿中加入0 7m l 胰酶作用 1 0m i n ，待细胞完全脱落，加入0 3m l 完全培养液终止反应。 3 2 1 0 时间对巨噬细胞吞噬致病菌荧光强度的影响 于每个培养皿中加入细胞悬液( 1x 1 0 6 m l ) 1m l ，2h a 弃去未贴壁细胞，实验 组加入1m l5 01 t g m l 采用培养液溶解的样品及im lc f d a s e 标记的致病菌悬液， 对照组中加1m l 完全培养液和lm l 标记好的菌悬液。将培养皿置3 7 ，5 c 0 2 分别孵育0 5h 、1h 、1 5h 、2h a ，用无菌p b s 洗涤3 次，将未被吞噬的致病菌洗脱。 之后每个培养皿中加入0 7m l 胰酶作用1 0m i n ，待细胞完全脱落，加入0 3m l 完全 培养液终止反应。 3 2 1 l 数据分析 实验结果用平均值4 - 标准差( i 士s ) 来表示。采用e x c e l 对实验数据进行作图及拟 合处理。采用s p s s l l 0 软件中的o n e w a ya v o n 进行分方差析，并用l s d 法进 行多重比较。 3 3 结果 3 3 1 磷壁酸和肽聚糖对r a w 2 6 4 7 巨噬细胞吞噬中性红能力的影响 由表3 1 可见，磷壁酸和肽聚糖在1 0 - - 1 0 0g g m l 浓度范围内均能增强巨噬细胞吞 噬中性红能力，并呈剂量依赖性，吞噬率分别增加5 3 5 - 2 0 1 2 和5 0 。1 1 9 0 6 。 在低浓度1 0g g m l 和2 0i t g m l 时，与对照组相比，经磷壁酸和肽聚糖刺激后，巨 噬细胞吞噬能力显著增力l a ( p 0 0 5 ) ；当浓度达到3 0i t g m l 后，两物质都能极显著增 强巨噬细胞吞噬中性红能力( p o 0 5 ) 。 上海海洋大学硕士学位论文 表3 3 磷壁酸和肽聚糖对巨噬细胞r a w 2 6 4 7 吞噬中性红的影响( _ 士s ) t a b l e3 3e f f e c to ft e i c h o i ca c i da n dp e p t i d o g l y c a no nt h ea c t i v i t yo fr a w 2 6 4 7 m a c r o p h a g e s e n g l o b i n gn e u t r a lr e d 注：与对照组相比差异显著( p ，o 0 5 ) ；+ 与对照组相比差异非常显著( p o o o 3 3 2 浓度对r a w 2 6 4 7 吞噬致病菌的影响 由表3 2 和3 3 可知，在1 0 1 0 0p g m l 浓度范围内，经磷壁酸和肽聚糖刺激 后，巨噬细胞吞噬致病性大肠杆菌和肠炎沙门氏菌能力均有明显提高，并随浓度 的增大而增强。与对照组相比，浓度为1 0i x g m l 时，吞噬能力表现差异显著 ( p 0 0 5 ) ；当达到浓度2 0l x g m l 开始，吞噬能力增强非常显著( p 0 0 5 ) 。经不同 浓度肽聚糖刺激后，巨噬细胞吞噬大肠杆菌的能力比吞噬沙门氏菌的能力要强。 当浓度为1 0i - t g m l 和2 0t t g m l 时，吞噬大肠杆菌的能力比吞噬沙门氏菌的能力有 显著提高( p 0 0 5 ) ；吞噬大肠杆菌的能力与吞噬沙门氏菌的能力相比，随浓度增为 3 0l a g m l 时，差异非常显著( p o 0 0 1 ) ，而磷壁酸刺激后的巨噬细胞吞噬大肠杆菌 和沙门氏菌的能力出现更明显差异，在1 0 - - - 1 0 0i r t g m l 浓度范围内，吞噬大肠杆 菌的能力与吞噬沙门氏菌的能力相比，差异都非常显著( p 0 0 5 ) ， 意i 三4 掣酸和肽聚糖对r a w 2 6 4 7 e f f 巨噬细胞吞噬致病性大肠杆薛的影嘲瑚e c t n b l e 3 4 r a 、 ， 6 d 0 7 f 。，。t e i c h o i e a p i d a n ，：r , e 二p - t i i a o _ g ；l y 。c a 工n 7 7 0 叨n 4 t 因h e 8 7 影a c 唯t i 搴v i t x y 士s o f 竺竺竺燮燮墼竺竺竺 组别 浓度( 昭m l )荧光强度 、 旺：与对照组相比差异显1著00。p如，。5，；与对照组1相3比563：；t-0磊0；04三；三石i13152j：0003旺2 与对照组相比差异显著( p o ，0 5 ) ；与对照组相比；磊磊i ：- - 一 t a b l e 5 篙竺和竺2 ，r a w 2 6 4 7 巨噬细胞吞噬肠炎沙门氏菌的影响 呦1 。3 巧怒品竺c 确州p e p “t 。i d o g l y 删c a n 黝蛐t h e r , c p u u o g y c a r l o n t h e 删a c t i v 响i t y o f 了= 竺竺竺堕型墼型竺竺竺 组别 浓度( 嵋m l ) 一 荧光强度 = = 一 注：与对照组相比再五；10；0三忑i-=三；磊五磊12瓦5荟4三4土磊o磊00三8三,；：i忑坚兰兰芝 滋屿对照组相比差异显著( p o 0 5 ) 与对照组相比差磊磊磊= 一 上海海洋大学硕士学位论文 01 02 03 05 01 0 0 浓度( hg ，m l ) 图3 - 1 经肽聚糖刺激后r a w 2 6 4 7 巨噬细胞吞噬致病性大肠杆菌和肠炎性沙门氏茵能力的比较 f i g 3 lc o m p a r i s i o n to f t h ea c t i v i t yo f r a w 2 6 4 7 m a c r o p h a g e ss t i m u l a t e db yp e p t i d o g l y c a n e n g l o b i n ge s c h e r i c h i ac o l ie p e ca n ds a l m o n e l l ae n t e r i t i sa s5 0 0 4 1 注：与沙门氏菌比较差异显著( p o 0 5 ) ；与沙门氏菌比较差异非常显著( p o 0 1 ) 下同 0 i o2 03 05 0i 0 0 | ：6 度( t ，m l ) 图3 - 2 经磷壁酸刺激的r a w 2 6 4 7 巨噬细胞吞噬致病性大肠杆菌和肠炎性沙门氏菌的比较 f i g 3 - 2c o m p a r i s i o n to f t h ea c t i v i t yo f r a w 2 6 4 7 m a c r o p h a g e ss t i m u l a t e db yt e i c h o i ca c i d e n g l o b i n ge s c h e r i c h i ae o l ie p e ca n d