（食品科学专业论文）己烯雌酚单克隆抗体制备与确证及其免疫亲和柱的试制.pdf

江 苏大学硕 士 学位论文 摘要 己烯雌酚( d i e t h y l s t i l b e s t r o l ，d e s ) 作为一种人工合成的非甾醇类雌激素， 在临床治疗、畜牧生产中有着广泛应用，但是d e s 的残留会对人体产生一系 列的毒副作用。因此，许多国家和地区已明确禁止d e s 在食品动物中的使用。 然而受经济利益的驱使，非法使用和滥用现象依然存在。为确保动物食品安 全和我国畜牧水产品出口贸易的畅通，建立快速、灵敏的检测技术已成为当 前迫切需要解决的一个重要问题。 d e s 残留分析中，样品前处理是核心。免疫亲和层析技术与传统的样品 前处理技术相比，操作简单、具有高选择性的净化和富集能力，是一种有着 良好应用前景的样品前处理技术。本论文以免疫学为基础，制备并确证d e s 完全抗原和单克隆抗体，并对其免疫亲和层析柱的制备与使用技术进行初步 研究，为建立以免疫亲和层析为核心的样品前处理技术奠定基础。主要研究 内容和结果如下： 1 琥珀酸酐法合成己烯雌酚半琥珀酸酯( d e s h s ) ，得率较高的反应条 件为：d e s 、h s 摩尔比为1 ：1 0 ；温度4 5 。c ；时间4 8h 。采用混合酸酐法和碳二 亚胺法制备完全抗原，用紫外光谱法、s d s p a g e 、红外光谱法、高分辨率质 谱法逐步确证和监测完全抗原的制备成功，并计算出载体蛋i 刍b s a 与d e s h s 的偶联率为1 ：2 6 。 2 选择6 8 周龄的b a l l b c 雄性小鼠进行免疫，研究了免疫方式、免疫剂量、 载体蛋白及免疫次数对免疫效价的影响。结果表明：背部皮下多点注射比腹 腔注射免疫效价高；免疫剂量( 10 0 5 0 叫只和2 0 0 1o o 蚓只) 对免疫效价无 t 江苏大学硕士学位 论 文 显著影响；k l h 作载体的免疫效价高于b s a 作载体；免疫四次即可获得较高 的免疫效价。 3 建立了d e s 间接非竞争e l i s a 法：1 0 0n gd e s 孑l3 7 。c 包被2h ；5 的 脱脂奶粉4 9 c 封闭过夜；一抗3 7 。c 作用2h ；h r p i g g3 0 0 0 倍稀释，3 7 。c 反应 2h ；显色液3 7 作用15m i n 。 4 利用p e g 法进行细胞融合，采用有限稀释法进行三次亚克隆，筛选得到 能稳定分泌抗d e s 的亚型为i g g 3 单抗的杂交瘤细胞株1 8 g 5 。蛋白g 亲和层 析纯化腹水获得抗体蛋白。紫外光谱测定其浓度为1 0 15m g m l ；s d s p a g e 显示其分子量约为1 5 0k d ；间接非竞争e l i s a 测定其效价为1 0 0 0 0 ，最佳工 作浓度为1 0 0 0 倍稀释；计算得其亲和常数为1 4 8 1 0 9 。间接竞争e l i s a 测得 d e s 抑制标准曲线方程为y = 0 2 1 4 5 x + 0 4 7 1 3 ，r 2 = o 9 9 6 5 ，线性区间为o 1 2 0n g m l ，半抑制浓度i c 5 0 为0 7 3 5n g m l ；与结构类似物己烷雌酚、双烯雌 酚的交叉反应率分别为o 3 7 和o 9 8 。 5 以b r c n 活化的s e p h a r o s e4 b 为载体，以纯化的1 8 g 5 的腹水型单克隆抗体 作为配基，制备的免疫亲和层析柱对d e s 的回收率为6 2 2 。 关键词：己烯雌酚，完全抗原，单克隆抗体，免疫亲和层析 i i 江 苏大学硕士学位论文 a b s t r a c t a san o n - s t e r o i d a ls y n t h e t i ce s t r o g e n ，d i e t h y l s t i l b e s t r o l ( d e s ) i sw i d e l yu s e di nc l i n i c a l t r e a t m e n ta n dl i v e s t o c kp r o d u c t i o n h a v i n gm a n ya d v e r s ee f f e c t so nh u m a n b o d y , d e si ss t r i c t l y p r o h i b i t e df r o mu s i n gi nf o o da n i m a l sp r o d u c i n gi nm a n yc o u n t r y sa n dr e g i o i l s h o w e v e r , i ti s s t i l lu s e di l l e g a l l yf o re c o n o m i ci n t e r e s t s i no r d e rt og u a r a n t e es a f e t yo ff o o da n de x p o r tt r a d ei n a n i m a la n da q u a t i cp r o d u c t s ，i ti s n e c e s s a r yt oe s t a b l i s har a p i da n ds e n s i t i v ed e t e c t i o n d u r i n gd e sr e s i d u ea n a l y s i s ，t h es a m p l ep r e t r e a t m e n ti st h ek e y c o m p a r e dw i t h t r a d i t i o n a ls a m p l ep r e - t r e a t m e n tm e t h o d s ，i m m u n o a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ( i a c ) ，h a v i n gg o o d a p p l i c a t i o np r o s p e c t ，i sc h a r a c t e r i z e db ys i m p l eo p e r a t i o n ，h i g hs e l e c t i v ep u r i f i c a t i o na n d e n r i c h m e n tc a p a b i l i t y i nt h i sp a p e r , d e sc o m p l e t ea n t i g e na n dm o n o c l o n a la n t i b o d i e sw e r e p r e p a r e da n dc o n f i r m e db a s e do ni m m u n o l o g y , a n dt h e ni a cc o l u m nw a ss t u d i e dp r e l i m i n a r y , w h i c hl a yaf o u n d a t i o nf o rt h es a m p l ep r e - t r e a t m e n tt e c h n o l o g y t h em a i nr e s u l t sw e r ea s f o l l o w s ： 1 d i e t h y l s t i l b e s t r o lw a sd e r i v a t i v e di n t os e m i s u c c i n a t e ( d e s h s ) b ys u c c i n i ca n h y d r i d e m e t h o d t h eb e s tp r e p a r a t i o nc o n d i t i o n sw e r et h a tm o l a rr a t i oo fd e st oh sw a s1 ：10 ，t e m p r e t u r e w a s4 5 c ，a n dr e a c t i o nt i m ew a s4 8h o u r s c o m p l e t ea n t i g e nw e r ep r e p a r e da c c o r d i n gt o m e t h o d so fm i x e da n h y d r i d ea n de d c c a t a l y z ea n dw e r ec o n f i r m e db yu vi r ，s d s - p a g e ，a n d m s t h en u m b e ro fd e s h sb o u n dt ob s aa n dw a s2 6 2 b a l l b cm a l e m i c eo f6 8w e e k sw e r ei m m u n i z e dw i t ht h ec o m p l e t ea n t i g e n b yr o u t i n e m e t h o d i m m u n o l o g i c a lm e t h o d s ，d o s e ，c a r r i e rp r o t e i n sa n dt i m e sh a v i n ge f f e c t so ni m m u n e w e r ec o n s i d e r e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tb a c ks u b c u t a n e o u sm a n yp o i n t si n j e c t i o nw a sb e t t e r t h a ni n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o n ，i m m u n o l o g i c ad o s e ( 10 0 5 0a n d2 0 0 1 0 0 p , gp e ro n e ) h a dn o s i g n i f i c a n te f f e c to ni m m u n e ，a sc a r t i e rp r o t e i nk l hw a sb e t t e rt h a nb s a ，a n df o u ri m m u n i t y h a dag o o di m m u n e r e s p o n s e 3 an o n c o m p e t i t i v ei n d i r e c te l i s am e t h o dw e r ee s t a b l i s h e d t h eo p t i m a la p p l i c a t i o n c o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w i n g ：c o a t e da n t i g e nd e sc o n c e n t r a t i o nw a s10 0 0 n g m l b l o c k i n g i i i 江苏大 学 硕士 学 位论文 b u f f e rw a s5 o fs k i m m e dm i l kp o w d e r h r p i g gw a sd i l u t e d3 0 0 0t i m e s c o a t e da n t i g e n ， p r i m a r ya n t i b o d ya n dh r p i g o s h o u l db ei n c u b a t e d2hu n d e r3 7 。c b l o c k i n gb u f f e rs h o u l db e i n c u b a t e do v e r n i g h tu n d e r4 c t h es u b s t r a t ew a si n c u b a t e da t37 。cf o r15m i n 4 c e l lf u s i o nw a sc a r r i e db yu s i n gp e gm e t h o d t h r o u g ht h r e et i m e ss u b c l o n i n g ， m o n o c l o n ea n t i b o d y ( m c a b ) h y b r i d o m ac e l l18 g 5w a so b t a i n e d ，w h i c hw a sa b l et op r o d u c t i g g 3a n t i b o d ys u b t y p e s m c a ba g a i n s td e s w a so b t a i n e dt h r o u g hm i c ec u l t i v a t i o na n da f f i n i t y p u r i f i c a t i o n t h ec o n c e m t r i o no ft h ep u r i f i e dm c a bi s 1 015m g m l ，m o l e c u l a rw e i g h ti s a p p r o x i m a t e l y15 0k d ，t i t e ri s10 0 0 0 ，t h eb e s tw o r k i n gc o n c e n t r a t i o ni s10 0 0 一f o l dd i l u t i o na n d a f f i n i t yc o n s t a n ti s1 4 8 x10 9 d e si n h i b i t i o ns t a n d a r dc u r v ei sy = 0 214 5 x + 0 4 713 ，r 2 = o 9 9 6 5 ， a n dl i n e a rr a n g ei so 1 - - - 2 0n g m l ，i c s oi so 7 3 5n g m l t h ec r o s sr e a c t i o nr a t ew i t hh e x e s t r o l a n dd i e n e s t r 0 1w a s0 3 7a n d0 9 8 5 t h er e c o v e r yr a t i oo fd e si ni a cc o l u m ni s6 2 2 。w h i c hw a sp r e p a r e db a s e do n s e p h a r o s e4 ba n dm c a b k e yw o r d s ：d i e t h y l s t i l b e s t r o l ，c o m p l e t ea n t i g e n ，m o n o c l o n ma n t i b o d y , i m m u n o a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y i v 江苏大 学 硕士 学位论 文 d e s h e x d i e h s d e s h s d m f b s a k l h e d c t l c h p l c g c m s l c m s l c l l e s p e e l e l i s a n c p c m c a b 缩略词 d i e t h y s t i l b e s t r o l 己烯雌酚 h e x o e s t r o l己烷雌酚 d i e n o e s t r o l 己二烯雌酚 s u c c i n i ca n _ h y d r i d e琥珀酸酐 d i e t h y l s t i l b e s t r o lh e m i s u c c i n a t e 己烯雌酚半琥珀酸酯 d i m e t h y l f o r m a m i d e 二甲基甲酰胺 b o v i n es e r u ma l b u m i n牛血清白蛋白 k e y h o l el i m p e th a e m o c y a n i n 钥孔血蓝蛋白 c a r b o d i i m i d e碳二亚胺 t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y 薄层色谱 h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y高效液相色谱 g a sc h r o m a t o g r a p h i cm a s ss p e c t r o m e t r y 气相色谱串联质谱 h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yt a n d e m 液相色谱串联质谱 m a s ss p e c t r o m e t r y i m m u n o a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y 免疫亲和层析 l i q u i d l i q u i de x t r a c t i o n 液液萃取 s o l i d p h a s ee x t r a c t i o n 固相萃取 e n z y m ei m m u n o a s s a y 酶免疫 e n z y m e - l i n k e di m m u n o a s s a y酶联免疫 n e g a t i v ec o n t r o l 阴性对照 p o s i t i v ec o n t r o l阳性对照 m o n o c l o n ea n t i b o d y单克隆抗体 江 苏 大 学硕 士 学位 论文 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属我解密后适用本授权书。 学位论文作者签名：伦丽丽 指导教师签名：- 争英 2 0 0 9 年6 月11 日 叩年易月i 厂日 江 苏大 学 硕 士 学 位论文 独创性申明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容以外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本 文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：伦丽丽 日期：2 0 0 9 年6 月1 1 日 江苏大学硕士学位论文 1 1 己烯雌酚概述 第一章绪论 己烯雌酚又名乙蔗酚、乙烯雌酚，1 9 3 8 年c h a r l e sd o d d 等人首次合成，它是第一个有 活性的口服人工合成的非甾醇类雌激素，在人造雌激素中是作用较强的一种【1 1 。d e s 化学 名为：( e ) 4 ，4 ，一( 1 ，2 一二乙基- 1 ，2 - 亚乙烯基) 双苯酚，为无色或白色结晶性粉末，在乙醇、乙 醚、氯仿或强碱溶液中溶解，在水中几乎不溶。结构式如图1 1 所示，分子式为c 1 8 h 2 0 0 2 ， 分子量为2 6 8 3 5 4 【2 1 。 1 1 1 己烯雌酚的主要用途 h o 图1 1 己烯雌酚分子结构 f i g1 1s t r u c t u r eo fd i e t h y l s t i l b e s t r o l h ( 1 ) 在临床医学上的应用 d e s 上市早期用作安胎药和避孕药，随后用于产后断奶的辅助治疗，也曾用于抑制青 春期长速过猛女孩的生长。2 0 世纪4 0 - 6 0 年代期间，美国等国家大约1 1 0 0 0 的孕妇服用 过此药【3 1 。 d e s 用于预防和治疗骨质疏松症。1 9 8 4 年美国国立卫生研究院( n i h ) 关于骨质疏松 症的会议，声明雌激素是治疗骨质疏松症最有效的方法。单独服用d e s 或与其它形式的抗 雄性激素联用进行治疗，可以明显缓解并预防骨的流失和促进骨吸收4 1 ，但也有导致生殖 道癌变的风险【5 1 。 d e s 作为雌激素替代品广泛应用于中年女性中。随着年龄的增长，女性3 5 岁以后卵巢 功能逐渐衰退，内源性雌激素分泌不断减少，生殖器官缓慢萎缩，使垂体与卵巢之间的平 衡关系发生改变，导致植物性神经系统功能紊乱，引起更年期综合症，此时急需补充外源 性雌激素来满足身体需求【6 。7 】。早在2 0 世纪6 0 , - - 一7 0 年代，美国等发达国家就提出了激素替代 疗法，用适量的人工合成雌激素来补充体内雌激素的不足，能减轻上述症状【8 1 。 l 江 苏 大 学 硕士 学 位论文 单用雌激素和雌孕激素联合治疗对绝经后妇女有明显的心血管保护作用，可加速脂蛋 白的代谢，改善血脂及全身血管，改善冠心病人的心肌缺血，降低纤维蛋白原，增强纤溶 功能等 9 1 。研究发现d e s 对胎鼠中脑神经元也具有保护作用，并能提高其功能活性【1 0 】。 ( 2 ) 化妆品中的应用 长期使用d , n 量的雌激素可以预防衰老，d e s 与卵泡素同时使用能使老化的皮肤嫩化。 某些化妆品样品中d e s 含量竞高j 2 生2 9 7 9 肛g g t l l 】。同时，d e s 能促进黑色素细胞增殖及酪氨 酸酶活性，对相关皮肤色素性疾病可能有一定的治疗作用【1 2 】。近几年盛行的丰胸产品大多 也是采用d e s 作为雌激素【1 3 】。 ( 3 ) 在畜牧业中的应用 国外，除欧盟以外的许多国家( 美国、加拿大、澳大利亚、新西兰等) 都曾把人工合 成的雌激素( 包括d e s ) 用作畜禽生产中的促生长剂【1 4 】。1 9 4 3 年l o r e n z 首次报道给小公鸡 皮下植, , z d e s ，8 周后公鸡的胸部和腿部肌肉脂肪含量增加了3 倒1 5 】。从此d e s 便被普遍应 用于养鸡业生产中，并且在2 0 世纪4 0 - - 7 0 年代取得了很好的效果。据报道美国大约有6 3 的肉牛埋植了促生长激素【1 6 】。r u m s e r y 等试验结果- l i e n 肉牛通过每日1 2 服1 0m gd e s ，能增 强体内蛋白质沉积和增加r 增重，可以很快产生显著和直接的经济效益【1 7 】。 国内，d e s 同样一直被作为一种动物生长促进剂用于猪、牛、羊、鸡等畜禽饲料c t l 8 】。 在兽医临床上，d e s 主要用于治疗乏情不孕【1 9 1 、治疗蛋鸡停产【2 们、山羊育肥【2 l 】、胎衣不下、 排出死胎、治疗子宫炎等【2 2 1 。d e s 和大剂量v e 综合治疗母猪乏情不孕，每天给予3 0 0 5 0 0m g 的v e ，第三天肌肉注射d e s3 - - 5m g ，一般在注射后l 3 天发情，有效率9 5 以 上，一次情期配种受胎率9 0 以上【1 9 】。d e s 诱导发情，并通过神经内分泌系统的作用，激 发卵巢的机能，使卵巢从相对静止状态转为活跃状态，促使卵泡急剧发育，从而排出成熟 卵子【2 3 1 。 1 1 2 己烯雌酚的毒副作用 1 9 7 6 年c o a t s 通过模型生态系统研究发现，d e s 在环境中降解很慢，能在人和动物脂肪 及组织中富积，形成严重残留，并且动物体内的不同部位之间代谢情况存在差异t 肌肉和 血清中最快；粪便和尿液中次之；胆汁、肾和肝脏中最慢。即使排出体外也会严重污染水 源和土壤，并通过食物链形式又重新在体内富积 2 4 】。 d e s 应用早期就曾有人报道过对小鼠具有致癌性，但当时没有引起人们的重视。直到 2 0 世纪7 0 年代大量的动物试验证明d e s 的确是一种致癌物质，孕期服用会增加其后代患生 2 江 苏大学硕 士 学位论文 殖道癌症的风险 2 5 - 2 9 】。 与d e s 致癌性关系最密切的是子宫颈透明细胞腺癌( c l e a rc e l l a d e n o c a r c i n o m a , c c a ) 。 过去这种病只发生在绝经期后的中老年妇女中，但是2 0 世纪7 0 年代以后其发病率在年轻女 性中有所增加。1 4 岁前极少发生，1 9 岁到达发病高期，2 4 岁时患该病的累计危险性达 0 0 1 4 , - - , - , 0 1 4 【2 5 1 。至1 9 7 9 年全世界大约有4 0 0 例c c a 患者，其中大多数患者都与其母亲在 妊娠早期服用过d e s 有关【2 6 1 。 d e s 还会导致阴道癌、子宫内膜癌和乳腺癌等癌症【2 7 1 。1 9 4 7 - - - - 1 9 7 5 年美国和荷兰，早 期服用d e s 及其他合成类雌性激素的近三百万孕妇，患乳腺癌的风险增加了1 1 0 0 0 。在1 2 7 5 名胎儿期接触过d e s 的妇女常规检查中，约3 4 出现生殖道异常【2 引。据美国报道9 1 例8 - - - 2 5 岁的阴道癌患者中就有4 9 例其母亲在怀孕期间服用过d e s ，该药致阴道癌的不良反应可延 迟1 3 , - - , 2 2 年后在子代表现出来【2 9 1 。 孕期服用d e s 不仅对女性后代造成严重危害，对男性后代的危害更是不容忽视。孕期 服用d e s 易导致男性后代睾丸异常、发育不全、精子数减少和活力下降等一系列生殖系统 问题 3 0 - 3 2 】。研究发现将d e s 注入鹌鹑胚蛋的蛋黄中，后代雄性个体会出现雌性化【3 3 _ 3 4 1 ，所 有接触过d e s 的新生小鼠血液中的睾丸激素均减少并且抑制胚胎期睾丸细胞的增殖，从而 影响睾丸的发育，破坏睾丸的组织结构【3 5 】。长期摄入d e s 会导致雄性雌性化，造成严重的 “阴盛阳衰 【3 6 】。 孕期服用d e s 会导致胎儿早产、影响胎儿性别分化和生长发育，还会导致胎儿脑瘫痪、 失明及其它神经缺陷【3 7 1 。民间曾经也有通过孕期服用激素来控制胎儿性别分化的偏方。 p a p i e m i k 等就孕期服用d e s 对孕妇分娩情况是否有影响进行了对照试验，结果发现试验组 其早产率和产后大出血均高于对照组【3 8 1 。 基于上述原因，欧盟、日本、韩国等各国政府相继颁布了禁用d e s 的管理条例【3 9 1 。2 0 0 2 年我国农业部发布了食品动物禁用的兽药及其它化合物清单，明确规定：禁止将d e s 及其盐、酯及制剂以任何用途用于所有食品动物【4 0 1 。 1 2 己烯雌酚常用检测方法 为了减少人和动物暴露于d e s 的危险，检测畜禽肉、蛋、奶中d e s 是否存在是至关 重要的。目前，国内外报道的理化检测方法主要有高效液相色谱法和质谱法等。 江苏大学硕士学位 论文 1 2 1 高效液相色谱 高效液相色谱法( h p l c ) 可以检测生物体内及其他复杂基质中的d e s ，其原理是： 根据样品中各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等的差异在色谱柱中进行分离， 利用紫外、荧光或电化学检测器等进行检测。国标g b t5 0 0 9 1 0 8 2 0 0 3 畜禽肉中d e s 的 测定f 4 l 】，采用紫外检测器法，检出限为o 2 5m g k g 。国标g b t2 0 4 4 3 2 0 0 6 鸡组织中d e s 残留的测定【4 2 1 ，采用电化学检测器法，在鸡组织中的检出限为11 t g k g ，与g b t5 0 0 9 1 0 8 2 0 0 3 相比，检出限下降2 5 0 倍。 1 2 2 气相色谱串联质谱 气相色谱串联质谱法( g c m s ) 是最早商品化的联用仪器，适于分析小分子、易挥发、 热稳定、能气化的化合物，对于沸点较高的物质需采用衍生化的方法降低沸点进行测定。 宫向红采用g c m s 检测水产品中d e s 含量，检出限为0 5 t t g k g 4 3 1 。国外，也曾有人 采用高针对性、高灵敏度的g c m s 检测d e s ，其检出限小于o 1 p p b 4 4 。 1 2 3 液相色谱串联质谱 高效液相色谱串联质谱法( l c m s 、l c m s m s ) 是近年来发展起来的新的检测技术， 与液相色谱法不同的是：使用三重四极杆质谱或离子阱质谱作为检测器，代替高效液相色 谱的检测器，该方法兼具定性功能、灵敏度高，但仪器价格昂贵。 国标g b t2 0 7 6 6 2 0 0 6 4 5 1 、国标g b t2 0 7 6 7 2 0 0 6 4 6 1 均采用液相色谱串联质谱法测定牛 猪肝脏和肌肉组织及尿液中的d e s 等激素，内标法定量，d e s 检出限为1 0 “g k g ，回收 率为8 0 - 1 0 2 。四川省地方标准d b 5 1 t6 5 8 2 0 0 7 4 7 】采用高效液相色谱串联二级质谱法 检测猪肉中的d e s ，检出限为0 0 5l a g k g ，加样回收率为5 0 - 1 2 0 ，与国标相比检出限 更低，但回收率不稳定。 1 2 4 免疫学检测 免疫学检测法的基本原理是细胞因子( 或受体) 与相应的特异性抗体( 单克隆抗体或 多克隆抗体) 结合，通过同位素、荧光或酶等标记技术加以放大和显示，从而定性或定量 显示细胞因子( 或受体) 的水平。该方法的优点是简便、快速、灵敏、高特异性、少受抑 制物或相似生物功能因子的干扰，如抗体的特异性高可区分不同型或亚型的细胞因子，一 4 江 苏大 学 硕 士 学 位论 文 次能检测大量标本，易标准化【艚】。 酶免疫试验( e i a ) 泛指以酶作为标记指示物的免疫测定技术，根据其测定中是否需 要分离洗涤步骤来分开结合和未结合的抗原或抗体，而分为固相和均相两大类方法【4 9 1 。 酶联免疫吸附分析技术( e l i s a ) 是当前兽药残留免疫学检测方法中最为常用的一种 方法。德国在这方面的技术较成熟，2 0 世纪7 0 年代成功制备了d e s 的抗体，后来又研发 了相应的检测试剂盒，检测限小于0 1n g m l 。最近，国内一些实验室正在制备针对d e s 的特异性抗体4 9 1 。 1 3 畜产品中己烯雌酚残留检测的样品前处理技术 样品前处理是指样品的制备和对样品中待测组分进行提取、净化、浓缩富集及化学衍 生化的过程。大多数样品组成复杂，由于各种干扰组分的存在，无法直接进行分析检测， 必需通过前处理将待测组分与干扰组分加以分离【5 们。现阶段，色谱、质谱、免疫分析及联 用技术不断优化和日趋完善，兽药残留的检测工作逐渐简化，而样品前处理占用7 0 以上 的分析工作量，越来越成为兽残分析过程中的关键。 1 3 1 传统溶剂萃取 传统溶剂萃取是利用化合物在两种互不相溶( 或微溶) 的溶剂中溶解度或分配系数的 不同，使化合物从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中。经过反复多次萃取，将绝大部分的 物质提取出来。 沈富林等常温下以乙腈为溶剂提取饲料中的d e s 等物质，正己烷脱脂后，在碱性条件 下( p h 8 - 1 0 ) 用乙醚多次萃取【5 。 1 3 2 超声辅助萃取 超声波萃取是基于超声波的特殊物理性质，通过压电换能器产生的快速机械振动波来 减少目标萃取物与样品基质之间的作用力从而实现固液萃取分离。 z h a n g 等以甲醇为溶剂常温超声提取肉中的d e s ，在碱性条件下( p i l l 0 3 ) 用氯仿分三 次萃取【5 2 1 。应永飞等在前人的基础上，以甲醇为溶剂于6 0 。c 下超声提取动物组织中的d e s 等l ，2 二苯乙烯类药物【5 3 1 。 5 江苏大 学硕 士 学位 论文 1 3 3 固相萃取 固相萃取是使一定体积的样品溶液通过装有固体吸附剂的小柱，样品中与吸附剂有强 作用的组分被完全吸附；然后，用强洗脱溶剂将被吸附的组分洗脱出来的方法。 国标g b 2 0 7 6 6 2 0 0 6 4 5 1 、g b 2 0 7 6 7 2 0 0 6 t 4 6 1 和四川省地方标准d b 5 1 t6 5 8 2 0 0 7 4 7 1 均以叔 丁基甲基醚为溶剂提取牛猪肝肾和肌肉组织及牛尿中的d e s 等待测物质，使样品以一定的 流速流经硅胶固相萃取柱，淋洗后洗脱。 国外较多采用o a s i sh l bs p e 柱纯化内分泌干扰素、类固醇类激素等 5 4 - 5 6 】。b a l v a r e z s a n c h e z 、m a r t ap e d r o u z o 、h s i n c h a n gc h e n 分别将有机溶剂提取后样品以一定的流速流经 o a s i sh l bs p e 柱，淋洗后采用甲醇或甲基叔丁醚洗脱。 与传统的液液萃取相比，固相萃取有如下优点：( 1 ) 分析物的高回收率；( 2 ) 有效 地将干扰组分分离；( 3 ) 减少一些有机溶剂对环境的污染；( 4 ) 可处理小体积样品；( 5 ) 无相分离操作，容易收集分析物；( 6 ) 操作简单、省时、省力、易于自动化。 1 3 4 免疫亲和层析 免疫亲和层析( i a c ) 是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。根 据抗原抗体或蛋白质a 、g 与一些鼠亚类抗体之间均具有高亲和力( 结合常数k 在1 0 8 1 0 1 0 之间) ，高专一性，可逆结合特性而建立起来的一种色谱方法【5 7 】。在一定条件下，把可结 合的一对分子中的一方( 称配体) 结合在惰性载体上使其固相化，另一方随流动相流经该载 体，双方即结合为一整体。而这种结合是可逆的，改变条件可将它们解离，从而得到与配 体有特异结合能力的某一特定的物质。其工作原理如图1 2 所示【5 8 1 。 i a c 具有以下的特点：( 1 ) 作为固相萃取( s p e ) 手段对样品进行前处理，纯化的样 品可直接用于h p l c 、g c 、h p e c 、m s 、e l i s a 等方法进行检测，大大简化样品前处理的 过程，减少净化过程中目标化合物的损失，降低有机溶剂的使用和样品前处理成本。( 2 ) 对特定组分具有高度的保留与浓缩能力，只要加样量不超过i a c 柱容量，对组分的富集与 回收能力几乎与样品体积和浓度无关，故i a c 特别适用于复杂样品中浓度极低组分的分离 富集。( 3 ) 对组分进行净化的同时也能提供定性信息，在实际应用中i a c 也可以作为一种 定性手段。( 4 ) i a c 多组分处理能力，一方面i a c 对待侧组分的高选择性使测定方法对不 同样品中相同目标分析物的通用性极强；另一方面，固定有多种特异性抗体的i a c 柱可同 时对多种组分进行纯化，即多组分免疫亲和色谱( m i a c ) ，从而使i a c 具有分离富集多种 6 江苏大 学 硕士 学 位论文 目标分析物的能力【5 8 】。 图1 2 免疫亲和层析柱工作原理 a ) 样品提取液过柱；b ) 目标物特异性反应；c ) 杂质的淋洗；d ) 目标物的洗脱 f i g1 2p r i n c i p l eo fi m m u n o a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y a ) s a m p l ep e r c o l a t i o n ；b ) s p e c i f i cr e a c t i o nb e t w e e no b j e c ta n dl i g a n d ； c ) w a s h i n go fi n t e r f e r i n gc o m p o u n d s ；d ) o b j e c te l u t i o n i a c 柱的富集净化能力很强，通过一步净化就能提纯1 0 0 0 1 0 0 0 0 倍【5 8 】。目前i a c 技术 已广泛应用于医学检验【5 9 1 、食品卫生【删、环境保护等领域。对各类样本中的农药【6 、兽药 【6 2 1 、毒素【6 3 】等具有很高的富集纯化效率，某些生物样品的粗提液经过i a c 柱后，目标生物 大分子可达电泳级水平，且具有很高的回收率。 1 4 立题依据与意义 d e s 作为一种人工合成的非甾醇类雌激素广泛应用于临床治疗和畜牧业生产，而d e s 的使用对人体及环境造成许多危害和破环作用。因此，建立和不断发展新的快速、灵敏的 d e s 检测方法显得至关重要。 目前，在d e s 检测中，h p l c 和l c m s 是最常用的方法，这两种方法中样品前处理 是分析的关键。由于大多数生物样品中d e s 含量低、干扰成分多。常规样品前处理选择性 低，从而影响了d e s 检测结果的准确性。与传统的样品前处理技术相比，i a c 技术能够同 时实现样品中待测物的分离、纯化与富集，一步层析就可使复杂样品中的特定组分得到高 7 江苏大学硕 士 学位论文 度纯化与富集，避免使用大量的有机溶剂，减少对环境的污染。 本论文针对畜产食品中禁用兽药d e s 残留微量、分离提取十分困难的问题，拟研究 d e s 单克隆抗体制备与确证技术，并对其i a c 柱的制备及使用进行初步研究，为建立以免 疫亲和层析为核心的样品前处理技术奠定基础。 1 5 论文的主要研究内容 ( 1 ) 利用有机合成技术制备完全抗原，并采用多种检测技术对所制备的完全抗原进行 确证，以确保完全抗原的制备成功。 ( 2 ) 进行动物免疫，研究不同的免疫方法、免疫剂量、不同的蛋白作载体制备的完全 抗原及免疫次数对免疫效价的影响。 ( 3 ) 建立d e s 间接非竞争e l i s a 检测方法，为抗血清效价检测和杂交瘤细胞的筛选提 供可靠的保障。 ( 4 ) 利用细胞融合技术，通过间接非竞争e l i s a 法筛选阳性杂交瘤细胞株，鉴定抗体 亚型，制备腹水型单抗，并对其性质进行鉴定，为制备免疫亲和层析柱提供可利用的单抗。 ( 5 ) 初步进行d e s 免疫亲和层析柱制备技术和使用方法的研究。 8 江苏大 学 硕士 学位论 文 2 1 引言 第二章完全抗原的的制备与确证 d e s 和大多数其它激素类化合物一样，由于分子量小( 2 6 8 3 5 4 d e s h s b s a 分子量 b s a 分子量 6 62 k d 表明的确有一定量的半抗原衍牛物d e s h s 被偶联到载体b s ak 2 46d e s h s b s a 的高分辨率质谱检测 为了计算每个b s a 分亍e 结合的半抗原衍生物d e s h s 的数量，对b s a 和d e s h s b s a 进行高分辨质谱检测分析，结果直u 下： 江 苏 大 学 硕 士 学位论 文 ( a ) b s a ( b ) d e s 。h s 。b s a 图2 1 0b s a 、d e s h s b s a 的高分辨率质谱图 f i g2 10m a s ss p e c t r u mo fb s aa n dd e s - h s - b s a 由图2 1 0 可知，b s a 的分子量为6 6 6 7 9 ，d e s h s b s a 的分子量为7 6 2 4 0 ，所以每个b s a 分子上结合的d e s h s 的数目为( 7 6 2 4 0 6 6 6 7 9 ) 3 6 8 , , 2 6 。 载体蛋白与半抗原偶联率的大小会影响特异性抗体的产生。但是连接到载体上的半抗 原并不是越多越好，因为当载体蛋白上偶联的半抗原分子过多时，可能会不利于载体与淋 1 9 江苏大学硕 士 学位 论文 巴细胞的结合，不能有效地刺激载体产生免疫应答反应，有报道认为偶联率在1 ：1 1 ：3 0 为 宜【7 3 _ 7 4 。 2 5 本章小结 ( 1 ) 琥珀酸酐法合成d e s h s 的最佳反应条件为：d e s 与h s 摩尔比l ：1 0 、反应温度4 5 、反应时间4 8h 。 ( 2 ) 2 0 0 - 3 0 0 目硅胶柱分离纯化反应产物，t l c 监测，所用展开剂为石油醚：丙酮( 2 ：1 ， v ：v ) 。r f = 0 0 9 的样品，其红外光谱鉴定具有d e s h s 的特征吸收峰。 ( 3 ) 完全抗原( d e s h s b s a 、d e s h s k l h ) 的制备采用混合酸酐法和碳二亚胺法。 紫外光谱、红外光谱、s d s p a g e 分析结果表明，d e s h s 己被成功偶联到载体蛋白b s a 上。 ( 4 ) 高分辨率质谱法测定了载体蛋白b s a 、完全抗原d e s h s b s a 的分子量，分别为 6 6 6 7 9 和7 6 2 4 0 ，计算出b s a 与d e s h s 的偶联率为1 ：2 6 。 江 苏 大 学硕 士 学位论 文 3 1 引言 第三章动物免疫及d e s 间接非竞争e l ls a 法的建立 制备单克隆抗体前首先要免疫动物，免疫用动物应具有良好的免疫应答能力，一般选 择成年、健康、雄性且体重符合一定要求的动物。实验室常用的免疫动物有兔子b a l l b c 小鼠、c 5 7 小鼠等。本论文选用的是6 8 周龄b a l l b c 雄性小鼠【5 7 。5 8 】。 免疫方法、免疫剂量、免疫次数等因素都可能会对动物的免疫应答反应产生重要的影 响。另外，不同的蛋白作为载体制备的免疫原也可能会对免疫效果产生不同的影响。