（食品科学专业论文）大米多肽的分离纯化及其抗氧化活性的研究.pdf

摘要 墒季 - j ，、 酶法分离提取大米多肽和淀粉的反应条件温和，工艺简单，提取所得大米淀粉的品 质高于碱法提取所得淀粉的品质。作为大米淀粉的副产物，大米多肽具有一些生理活性， 如降胆固醇及抗氧化活性等。但在大米蛋白水解液中，因可溶性糖的溶出，影响了大米 多肽的品质及生产工艺。本文以大米为对象，采用酶法同时分离大米蛋白和淀粉，在获 得高品质淀粉的同时得到具有生物活性的大米多肽，重点对大米多肽进行了除糖、降胆 固醇活性和抗氧化活性的研究，并最终对分离得到的单一具有高活性的肽的氨基酸序列 进行了鉴定。 首先在确定大米蛋白水解液中存在的糖主要来源于水解进程的基础上，以p r o t e a s e n 水解大米所得水解液作为研究对象，通过分析水解液中多肽与糖的相对分子量分布及 组成，确定利用以d 2 0 1 强阴离子交换树脂为载体进行大米多肽与糖的分离。考察了离 子交换工艺参数对大米蛋白回收率和脱糖率的影响，得到最佳的离子交换条件为：使用 磷酸盐缓冲液( p h 7 0 ，离子强度为o 0 1 m o l l ) 作为起始缓冲液平衡树脂。平衡后，将 硼砂与糖按1 ：8 的摩尔比混合均匀后上样，上样体积与树脂的体积比为l ：l 。对吸附在 树脂上的大米多肽进行洗脱，洗脱时采用二次洗脱，先用水洗脱( 1 倍体积) ，后用o 1 m o l lh c i 洗脱( 2 倍体积) 。收集未吸附液及洗脱液，旋转蒸发后冷冻干燥。最终蛋白 回收率为9 8 2 ，脱糖率为8 4 3 。冷冻干燥后样品的干基蛋白含量为8 0 o ，干基糖 含量为9 0 。 比较了p r o t e a s en 和a l c a l a s e 水解所得粳米肽和糯米肽的降胆固醇活性及抗氧化活 性。结果表明，p r o t e a s en 水解所得粳米肽和a l c a l a s e 水解所得粳米肽的降胆固醇活性 较高，两者的活性接近，浓度为7 5 m g m l 时其降胆固醇活性为3 8 左右，但均低于大 豆肽的降胆固醇活性( 4 4 6 0 ) ；抗氧化活性主要研究了d p p h 、和0 2 这三种自由基的 清除率。结果表明，p r o t e a s en 水解所得粳米肽的抗氧化活性最好，清除d p p h 的i c 5 0 值为7 5 m g m l ，清除o h 的i c s 0 为1 2 6m g m l ，清除0 2 。的i c 5 0 为2 4 7m g m l 。 利用r p h p l c 分离纯化了p r o t e a s en 水解所得粳米肽，经过制备型r p h p l c 分离 后主要得到1 4 个峰，组分6 具有最高的d p p h 清除率( i c 5 0 为3 2 6 u g m l ) ，组分2 具 有最高的o h 清除率( 蛋白浓度为3 5 u g m l 时清除率为6 6 2 ) ，组分4 具有最高的0 2 清除率( 蛋白浓度为3 5 u g m l 时清除率为3 9 5 ) 。通过l c m s 对这三个组分进行结构 鉴定，组分2 的肽序列可能为v a k a k v 、a a a a 、v n v g g 、v d m v f v ，组分4 的肽 序列可能为c c i i k c c l i f u c c i i q c c l i q 、m f m 和w d p w l v w i v ，组分6 的肽序列 可能为e y d p e y l v e y i v 、p g h v , g h v p 和i p v p v i 。 关键词：大米多肽；脱糖；体外降胆固醇活性；抗氧化活性 a b s t r a c t a b s t r a c t u s i n gp r o t e a s et os e p a r a t et h er i c ep e p t i d ea n dt h es t a r c hh a ds o m ea d v a n t a g e s ：t h e r e a c t i n gc o n d i t i o n sw e r em i l d ；t h et e c h n o l o g yw a ss i m p l ea n dt h em o s ti m p o r t a n to n ew a s t h a tt h ep r o p e r t i e so ft h er i c es t a r c hw e r ee x c e l l e n t a st h eo u t g r o w t ho ft h er i c es t a r c h ，r i c e p e p t i d eh a ds o m ea c t i v i t i e s ，s u c ha sh y p o c h o l e s t e r o l e m i ca n da n t i o x i d a n ta c t i v i t i e s b u ti nt h e h y d r o l y s a t e s ，t h e r ew e r es t i l ls o m ek i n d so fs u g a r , w h i c hw o u l di n f l u e n c et h eq u a l i t yo ft h e p e p t i d e i nt h i ss t u d y , p r o t e a s ew a su s e dt oh y d r o l y z er i c et os e p a r a t er i c ep r o t e i na n dr i c e s t a r c ha tt h es a m et i m e t h ee m p h a s e sa r et h ee l u t i n go fs u g a ra n dt h eh y p o c h o l e s t e r o l e m i c a c t i v i t i e sa n dt h ef r e er a d i c a ls c a v e n g i n ga b i l i t i e so ft h er i c ep e p t i d e s a m i n oa c i ds e q u e n c e s o ft h es i n g l ep e p t i d e sw i t hh i g ha c t i v i t yw e r ei d e n t i f i e df i n a l l y b a s e do nt h e t h es u g a ri nt h eh y d r o l y s a t e sc a m ef r o mt h es t e po fh y d r o l y s i s ，w ea n a l y z e d t h ec o m p o n e n ta n dt h em o l e c u l a rw e i g h to ft h ep e p t i d ea n dt h es u g a rt oc o n f i r mt h a t d 2 01r e s i nc o u l ds e p a r a t et h es u g a ra n dt h ep e p t i d ee f f e c t i v e l y o p t i m u mc o n d i t i o n so f i o n - e x c h a n g ea r e ：i n i t i a lb u f f e rp h7w i t h0 01m o l li o ns t r e n g t h t h em o l a rr a t i oo fb o r a x a n ds u g a r1 ：8 a n dt h er a t i oo fs a m p l ea n dr e s i nl ：1 t h ee l u t i o nw eh a v ec h o s e nw a sw a t e r f i r s t ( 1v ) a n dt h e no 1 m o l lh c l ( 2 v ) 1 1 1 ep e p t i d es a m p l ew a sa c h i e v e da f t e rr o t a t i o n e v a p o r a t i o na n df r e e z e d r y i n g t h ep r o t e i nc o n t e n t ( b a s e do nd r y 、o ft h ep e p t i d ew a s8 0 o a n dt h es u g a rc o n t e n t ( b a s e do nd r y ) o ft h ep e p t i d ew a s9 0 j i n gm ia n dn u om ia sr a w , w es t u d i e dt h eh y p o c h o l e s t e r o l e m i ca c t i v i t ya n dt h er a d i c a l s c a v e n g i n ga b i l i t i e so ft h ep e p t i d e sh y d r o l y z e db yp r o t e a s ena n da l c a l a s e t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ej i n gm ip e p t i d eh y d r o l y z e db ya l c a l a s ea n dp r o t e a s enh a dal i t t l eh i g h a c t i v i t yo fh y p o c h o l e s t e r o l e m i c ( 3 8 w h e nt h ep e p t i d ec o n c e n t r a t i o nw a s7 5 m g m l ) ，b u t l o w e rt h a ns o yp e p t i d e ( 4 4 6 3 w h e nt h ep e p t i d ec o n c e n t r a t i o nw a s0 2 m g m l ) ；j i n gm i p e p t i d eh y d r o l y z e db yp r o t e a s en h a dt h eh i g h e s ta b i l i t yo fr a d i c a ls c a v e n g i n g ：t h ei c 5 0o f d p p hw a s7 5 m g m l ；t h ei c s oo fo hw a s12 6 m g m l ；t h ei c s oo f0 2 w a s2 4 7 m g m l r p - h p l cw a su s e dt op u r i f yt h ej i n gm ip e p t i d eh y d r o l y z e db yp r o t e a s en 14f r a c t i o n s f r o mt h es e p a r a t i o no ft h ea n t i o x i d a n tp e p t i d e sw e r eo b t a i n e dw i t hap r e p a r a t i v er p h p l c c o l u m n t h em o s ta c t i v ed p p hr a d i c a ls c a v e n g i n gf r a c t i o nw a sf r a c t i o n6 ( i c s ow a s 3 2 6 u g m l ) ；t h em o s ta c t i v eh y d r o x y lr a d i c a ls c a v e n g i n gf r a c t i o nw a sf r a c t i o n2 ( 6 6 2 w h e n t h ep e p t i d ec o n c e n t r a t i o nw a s 35 u g m l ) a n dt h em o s ta c t i v es u p e r o x y g e nr a d i c a ls c a v e n g i n g f r a c t i o nw a sf r a c t i o n4 ( 3 9 5 w h e nt h ep e p t i d ec o n c e n t r a t i o nw a s 3 5 u g m l ) t h es t r u c t u r e so f t h et h r e ek i n d so ff r a c t i o n sw e r ed e t e r m i n e db yl c - m s t h ep o s s i b l ea m i n oa c i d s e q u e n c e sw e r e ： v a k a k v 、aaaa 、v n v g g 、v d m v f vo ff r a c t i o n2 c c i i k c c l i k c c i i q c c l i q 、 m f ma n dw d p w l v w o ff r a c t i o n4a n de y d p e y l v e y i v 、p g h v g h v pa n d i p v 用v io ff r a c t i o n6 k e yw o r d s ：r i c ep e p t i d e ；e l i m i n a t i n gs u g a r ；h y p o c h o l e s t e r o l e m i ca c t i v i t y ；a n t i o x i d a n t a c t i v i t y i l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签经够一日飙 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：2 争；师签翥：一 第一章绪论 第一章绪论 长期以来，稻谷生产及其综合利用一直受到食品科学家高度关注。大米副产品如米 糠、碎米等资源都得到较好的开发和利用。米糠可用于提取米糠油、米糠蛋白、米糠多 糖和米糠植酸钙【l 】，这些物质均具有一定的功能性1 2 刮。但对作为分离大米淀粉后的副产 物的大米蛋白的开发利用研究还十分有限。 大米蛋白在大米中的含量在7 左右，主要由清蛋白、球蛋白、醇溶性蛋白和谷蛋 白四种蛋白组成 】。大米蛋白是优质植物蛋白，具有很高的营养价值【8 】。它的氨基酸组 成配比合理，与f a o w h o 推荐的蛋白质氨基酸最佳配比模式相近。如表所示，大米蛋 白的生物价( b v ) 和蛋白质效用比( p e r ) 在植物蛋白中几乎是最好的，可以与动物蛋 白媲美。此外，大米蛋白富含各类氨基酸，尤其是赖氨酸含量居谷物类食物第一位9 1 。 表1 - 1 几种蛋白质的b v 和p e r 值1 9 i t a b 1 - 1 b va n dp e ro fd i f f e r e n tk i n d so fp r o t e i n s 同时，大米蛋白是一种低抗原性蛋白，不会产生过敏反应，是唯一一种免于过敏试 验的谷物蛋白。美国临床研究表明，在7 0 0 个遗传性过敏症的病例中，不到l 的高度 过敏性病人对大米过敏，儿科也很少报道对大米蛋白过敏。因此，大米蛋白可以在诸如 婴儿食品，老年人食品中安全使用。 此外，大米蛋白还具有一定的保健功能，如预防癌症、降低血浆胆固醇等【1 0 , 1 1 】。 m o r i t a 等曾对大米分离蛋f a ( r p i ) 这些功能进行系统研究，分别以r p i 、大豆分离蛋白( s p i ) 和酪蛋白作为实验鼠饲料的蛋白质，以二甲基笨并蒽( d m b a ) 诱导雌性鼠乳腺癌变；实 验结果发现，饲喂r p i 的鼠瘤重低于饲喂酪蛋白者，说明r p i 具有抵抗d m b a 诱导癌 变的作用【l 引。另外，以r p i 和酪蛋白饲喂小鼠的对比实验中发现，r p i 能显著降低血清 中胆固醇、磷脂和甘油浓度，饲喂r p i 鼠的肝重量也低于饲喂酪蛋白实验组【l 引。 与其它谷物相比，由于大米淀粉颗粒细小，并几乎全以复粒状态存在，蛋白质与淀 粉颗粒的包络结合紧密，大米胚乳的内部结构紧密，且占大米8 0 以上的为分子量很大 ( 亚基的分子量分别为2 2 万和3 8 万) 的米谷蛋白( 仅能溶解于p h 小于3 或大于1 0 的溶 液) ，使得大米蛋白与淀粉的分离较为困难。 目前报道的大米蛋白提取方法多是碱溶酸沉法【l4 1 ，即先用高p h 碱溶液促使蛋白质 溶解，经固液分离后，再加酸至蛋白质的等电点使其沉淀，再经二次固液分离，得到大 江南人学倾l ：学位论文 米蛋白，所得产品中蛋白含量可高达8 5 以上。其原理是依据大米蛋白中8 0 以上为碱 溶性蛋白，大量的二硫键和疏水基团的存在使其溶解性下降，另外大米蛋白质在胚乳中 与淀粉结合形成1 3 u m 的粒子，这种紧密结构也会导致其不易溶出。碱液可使大米中紧 密的淀粉结构变得疏松，同时碱液对蛋白质分子的次级键特别是氢键具有破坏作用，并 可使某些极性基团发生解离，使蛋白质分子表面具有相同的电荷，从而对蛋白质分子有 增溶作用，促进了淀粉和蛋白质的分离5 1 。该方法的优点是大米蛋白的溶解性能有所改 善，但缺点是工艺繁琐，蛋白质回收率低( 约4 0 ) ，反应条件剧烈，破坏了氨基酸原 有构型，蛋白质中部分赖氨酸与丙氨酸或胱氨酸，发生缩合反应生成有毒的成分，降低 了蛋白质的营养价值，且产品颜色深，味道苦，食用性差，产品功能性质也未得到改善。 1 1 大米蛋白的酶法改性 为了改善大米蛋白的功能性质，扩大其应用范围，研究人员对其物化功能性进行了 改性。目前研究最多的是利用酶法对其进行改性。 合适的分子大小及氨基酸组成都会赋予蛋白质一定的物化性能，如溶解性、发泡性 和乳化性等。大米蛋白由于其主要组成是水不溶性蛋白，使得本身溶解性差，水解后可 释放出一定的氨基和羧基，增大蛋白分子的极性，提高其发泡性和乳化性。a n d e r s o n 研 究发现，用蛋白酶处理大米分离蛋白( 主要成分是谷蛋白) 1 小时，其1 0 蛋白溶液表观粘 度显著下降，发泡能力提高3 3 4 5 ，泡沫稳定性也大大增强。进一步的研究表明，乳 化所需要的蛋白分子量较小【l6 1 。h a m a d a 用风味酶处理米糠蛋白，在p h 7 时乳化能力高于 酪蛋白，与牛血清蛋白相当，其乳化稳定性比牛血清蛋白耐1 7 j 。 采用酶法对大米蛋白进行改性还可以得到蛋白质营养补充剂。它主要是采用蛋白酶 将蛋白质深度水解，其首要目标是提高蛋白溶解度，其次是便于食用，即冲即饮粉剂和 口服液便是较好产品形式。过去对蛋白质水解强调制备氨基酸，但现代研究表明，小肽 分子比游离氨基酸更易被人体肠道吸收和利用。食物中蛋白质消化吸收实际上也是被消 化道蛋白酶水解成小肽后，利用肠粘膜纹状缘存在肤载体主动转运机制来完成。众多的 研究表明，碱性蛋白酶，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶等具有较好的作用效果引，同时几种 蛋白酶的复合使用比单一使用一种蛋白酶具有更好的效果。 此外，研究表明，酶法水解大米蛋白所得到的肽一般还具有生物活性。目前报道所 。i 知的大米蛋白活性肽有：具有免疫活性的大米白蛋白( r i c ea l b u m i n ) 的g y p m y p l r 肽 序列，具有类阿片活性的大米蛋白的胰蛋白酶水解物中的y p m y p l p 肽序列等【l 圳。另外， 目前报道较多的是g l y t y r - p r o m e t t y r - p r o l e u a r 肽分子，命名为o r y z a t e n s i n 。经豚 鼠试验表明，o r y z a t e n s i n 具有引起回肠收缩、抗吗啡和免疫调节作用，且主要是通过激 活磷脂酶水解溶血磷脂酸释放花生四烯酸引起收缩。其作用机理与人体补体c 3 a 引起的 回肠收缩方式类似，且其氨基酸与c 3 a 肽羧基末端第7 0 - - - 7 7 序列有相同特征。大米蛋 白水解还可产生某些风味肽，当酶解产物与糊精混合经喷雾干燥即得到市售食品风味改 良剂。现代仪器分析表明这类风味肽中谷氨酸含量很高，它与盐结合形成谷氨酸单钠盐， 呈现鲜味，也有很好市场前景。 2 第一章绪论 1 2 大米蛋白与淀粉的酶法分离 基于碱法提取大米蛋白存在的缺点及酶法所具有的改性作用，我们可以采用酶法提 取、分离大米蛋白的同时，得到大米淀粉。酶法分离反应条件温和，制备的大米淀粉可 保持天然淀粉的原有品质。同时，蛋白质多肽链可水解为短肽链，提高了蛋白质的溶解 性，同时其反应的液固比小 1 8 】，提高了提取液中的固形物含量，降低了用于除去提取液 水分的能量消耗，为工业生产创造了有利条件。2 0 0 0 年，n l u m d u b w o n g 和p a s e i b 报道了用碱性蛋白酶分离大米淀粉的研究。目前，国内用蛋白酶分离大米淀粉的报道也 很多，但还没有同时分离淀粉和蛋白的研究。2 0 0 4 年，美国a r k a n s a s 州立大学的一个研 究小组发表了关于采用蛋白酶水解蛋白质以分离大米淀粉的文章。 常用的蛋白酶有复合风味蛋白酶( f l a v o u r z y m e ) ，中性蛋白酶( n e u t r a s e ) ，碱性蛋白酶 ( a l c a l a s e ) 等。研究发现，使用碱性蛋白酶所得到的蛋白抽提率最高【l 引。其原因可能是在 碱性条件下，蛋白的溶解性较好，更易被蛋白酶水解。 文献报道的关于大米蛋白的水解中，所用的原料均是经过碱法提取得到的纯度较高 的大米蛋白。因在水解过程中添加了碱调节p h 值，为获得高纯度的肽，一般需进行盐 的脱除 2 0 - 2 1 j ，常用的脱盐的方法为大孔吸附树脂法。而本实验采用的原料是大米，加入 蛋白酶使其自然水解，在获得高纯度大米淀粉的同时得到基本被完全水解的大米多肽水 解液。相较于传统的方法，此法减少了一个脱盐的步骤，且大米蛋白均被水解成肽溶于 上清液中，蛋白得率高。 但是，实验中发现，此方法得到的大米多肽水解液中糖含量较高，因此需确定糖产 生的阶段从而选择脱糖工艺。若糖是在酶解之前产生的，则可利用分子量的差异或等电 点的差异进行分离；若糖是在酶解之后产生的，关于糖和肽的分离方法还少见报道，其 方法还需进一步研究。 1 3 小分子肽和小分子糖的分离 在生物发酵的产品如乳酸、肽等的分离和纯化中，糖类( 包括单糖和多糖) 是一类除去 比较困难的杂质，其原因包括：1 、糖类为非离子化物质，不能用离子交换法除去；2 、 糖的亲水性强，难以用吸附法除去；3 、分子量往往与目标产物接近，膜处理也难以奏 效。残糖的存在，增加了水解液的粘度，给后处理造成困难；同时容易感染微生物，污 染产品；有些还会与多肽发生褐变反应，含量高时会使结晶困难，严重影响了产品的质量。 早在1 9 2 5 年，h e r m a n s 就发现含顺式邻二羟基的化合物与硼酸反应可以得到两种不 同的化合物，即1 ：1 络合物和1 ：2 络合物1 2 引。关于反应的机理，许多学者认为：在水溶 液中硼酸先转化为b ( o h ) 4 。，放出矿；再与多羟基化合物反应形成1 ：1 络合物；最后 进一步反应形成1 ：2 络合物。实际反应远比此复杂。例如硼酸还能与1 ，3 二羟基化合物 形成六元环的络合物。硼酸与糖的络合反应已被用来作为亲和层析的方法分离糖、核苷、 核苷酸、糖蛋白、儿茶酚胺等多羟基化合物。雷引林使用硼酸络合法进行了红霉素脱糖 的研究，动态交换容量为0 5 6 3 m m o i 葡萄糖m l 红霉素的损失率为8 ，但用来作为从 3 江南人学硕i j 学位论文 蛋白水解液中除去糖类的方法还未见报道。 硼酸与糖络合后生成阴离子从而用离子交换法可达到肽和糖分离的目的。 离子交换色谱( i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ) 是发展最早的层析技术之一，它的原 理是因溶质分子带不同性质的电荷和不同电荷量，可在固定相和移动相之间发生可逆交 换作用，使溶质移动速度变化，从而达到分离的目的【2 3 j 。目前，离子交换色谱己成为蛋 白质分离纯化最常用的手段。统计显示，在蛋白质纯化方案中，使用到离子交换层析的占 7 5 ，其次是亲和层析和凝胶过滤层析。离子交换因其具有很高的样品吸附容量，不但 在实验室分离中广泛被使用，而且适合于规模化的纯化蛋白质，并且离子交换剂具有从 稀溶液中浓缩蛋白质的能力，也适合于从大体积的样品中纯化所需蛋白质1 2 4 j 。 1 4 大米多肽的功能特性的研究 生物活性肽是指那些具有特殊生理功能的肽类，不仅易消化吸收，并且还具有多种 人体代谢和生理调节功能，如促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、促进矿物 质吸收等作用。人类最早发现生物活性肽是在1 9 0 2 年，伦敦大学医学院的b a y l i s s 和 s t a r l i n g 从动物的肠胃中发现了促胰液素( s e c r e t i n ) 。发展到如今，开发和研究生物活性 肽类食品在国际保健品行业中己成为一个焦点i z 5 | 。 按其来源可分为天然存在的活性肽、蛋白质酶解活性肽和化学合成的活性肽。其中， 天然存在的活性肽包括肽类抗生素、激素以及在各种组织、骨骼、肌肉、免疫系统、消 化系统、中枢系统存在的活性肽，这些活性肽的缺点是含量少或提取比较困难。化学人 工合成费时费力，成本昂贵。因此采用酶解蛋白的方法来生产生物活性肽是一种比较合 理的途径。在酶解蛋白的方法中，生物活性肽一般从细菌蛋白质、植物蛋白质和动物蛋 白质的水解中获得，通常为分子量比较小的多肽片断1 2 6 | 。这些肽食用安全性极高。经近 些年的科学研究，得知多肽可由肠道直接吸收，肽类与氨基酸以不同的途径被吸收，且 肽吸收途径比氨基酸吸收途径具有更大的输送量。食物蛋白除了具有为机体提供氨基酸 和能量的营养功能外，它还是生物活性肽的重要来源。 过去，科学家一直未对利用储藏蛋白如大豆、玉米、小麦等种子蛋白和动物蛋白及 乳蛋白水解制备生物活性肽给予应有的重视。随着科学的发展与进步，科学家逐渐注意 到：在营养蛋白的多肽链内部可能普遍存在着功能区，选择适当的蛋白酶水解这些多肽， 有可能将其释放出来，从而制备各种各样的生物活性肽。目前己从不同食物蛋白酶解产 物中分离鉴定出大量的各种具有生物活性的肽，如降压肽1 27 猫j 、阿片肽、免疫调节肽 2 9 , 3 0 】、抗氧化肽【3 l 】、抗菌肽【3 2 】、抗血栓肽3 3 1 、降血脂肽等等。这些肽在母体蛋白序列中 并不具有生物活性，但是经过在体内或体外的酶解( 如在胃肠道消化以及食物加工过程 中) ，它们的活性就被释放出来，就有可能作为具有激素样活性的生理调节剂调节机体 的重要生理功能。 已有研究表明，大米蛋白酶解物中含有多种生理活性的小分子肽段，具有降血压、 抗衰老、抗吗啡和免疫调节等活性。m o r i t a 用大米分离蛋白( i 冲i ) 和酪蛋白在小鼠中的试 验表明，r p i 能显著降低血清中的胆固醇、甘油和磷脂的浓度，鼠肝的重量也低于饲喂 4 第一章绪论 酪蛋白的试验组。二甲基苯并葸( d m b a ) 是乳腺癌的诱变剂。以3 0 m gd m b a k g 体重 的剂量饲喂小鼠，基础饲料中的蛋白质分别为r p i 、大豆分离蛋白( s p i ) 和酪蛋白。试验 结果表明，饲喂r p i 鼠的瘤重低于饲喂酪蛋白者，饲喂7 天时各组试验鼠血清中的苯酚 物羟化酶的活性差别不大。说明r p i 具有抵抗d m b a 诱导癌变的作用。从米糠中提取 的r p i 也表现出同样的效果【l4 1 。 1 4 1 降胆固醇肽的活性研究 冠心病即冠状动脉性心脏病，是指狭窄性冠状动脉疾病。它引起心肌供血不足，是 一种心肌缺血性疾病。冠状动脉性心脏病是由冠状动脉粥样硬化引起的。尽管目前对动 脉粥样硬化等心血管疾病的发病机理尚未明确，但血脂水平升高和高胆固醇症已经被确 认为动脉粥样硬化等心血管病发生和发展的重要原因，降低血脂尤其是胆固醇水平可减 少心血管疾病危险性。 抑制饮食中的胆固醇吸收是降低血液中胆固醇的有效方法【3 4 , 3 5 】。一些饮食中被酯化 的胆固醇被胆固醇酯酶在胶束内部或表面上水解成自由固醇，从两性分子转变成胆固醇 并存在于胆汁中。膳食中的胆固醇在人体肠道中，和其它脂类一起，借助于胆盐的乳化 作用，形成混合的胶束溶液，以这种胶粒形式存在的胆固醇才能被输送入肠粘膜细胞， 再经淋巴系统进入血液循环。以大豆蛋白的胃蛋白酶酶解产物( s p h ) 为例，降胆固醇的 作用是通过抑制两种吸收作用而引起的，这两种作用即伴随着抑制胆固醇胶束溶解性的 胆固醇吸收和胆汁酸的肠道再吸收【36 。此外，提高胆汁酸的排泄也可以降低血液中的胆 固醇。 肽类降胆固醇的作用主要是阻碍肠道内胆固醇的吸收，促使胆固醇排出体外，降低 血液中血脂和胆固醇的浓度，使血脂异常回复正常以降低动脉硬化及心脏血管疾病的发 生。采用动物试验可以测定肽在体内对胆固醇水平的影响，s a t o s h in a g a o k a 等用超声波 乳化的方法制备出一种人造胆汁胶束溶液，在体外模拟人体的肠道环境，再经超速离心 使胶束溶液两相分离，通过测定水相中胆固醇溶出的含量也可以考察肽对胆固醇在胆汁 胶束溶液中的溶解度的影响。 在体内降胆固醇活性的研究中，大豆蛋白经酶作用产生的食饵饲喂老鼠时，血清胆 固醇浓度降低；大豆蛋白消化物的疏水性与胆汁酸的结合呈正相关。因此，有人认为消 化生成的肽能刺激甲状腺激素的分泌增加，促进胆固醇的胆汁酸化，粪便排泄胆固醇增 加，由此起到降低血液胆固醇的作用。大米蛋白也被证实具有降胆固醇的活性。从米糠 中提取的r p i 也表现出同样的效果。但对于大米多肽的降胆固醇活性还未见报道。 1 4 2 抗氧化肽的活性研究 随着自由基生命科学研究的不断进展，氧化应激损伤和抗氧化保护作用的研究得到 了人们的同益关注，当前医学研究位列前3 位的心血管疾病、肿瘤和衰老均被认为与氧 化应激损伤及自由基代谢失调相判3 7 】。 1 9 5 6 年h a r m a n 首次提出了自由基代谢理论【38 | 。自由基是指一类可以独立存在的含 江南人学研i ：学位论义 有未配对电子的物质电，包括分子、原子、原子团或离子【39 1 。由氧诱发的自由基称为活 性氧( r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s ，r o s ) 是含氧且有高度化学活性的几种分子的总称，主要包括 超氧阴离子( 0 2 。) 、羟基自由基( o h ) 、过氧化氢( h 2 0 2 ) 、单线态氧( 1 0 2 ) ，以及脂质过氧化 物的中间产物烷氧自由基( l o ) 、烷过氧自由基( l 0 0 ) 等，这些不成对的电子使r o s 具有不稳定性和高反应性。 j 下常生理状态下，活性氧不断地产生，同时也不断被清除，机体将这些活性物质维持 到极低的、无害的水平。机体摄取的营养物质在氧化过程中，在经过呼吸链中一系列氢 和电子传递过程中会产生自由基h 。 j 下常情况下机体氧自由基的产生与清除保持平衡，内源性自由基清除剂能在体内形 成一道道防线，防止有害自由基对机体的损伤，维持体内自由基代谢的平衡，保证机体 的健康。但在衰老、疾病或特殊生理情况下，这些活性物质大量产生呈现对生物体的强 大破坏作用，体内自由基代谢就会出现失衡。如果机体处于氧应急状态，产生的活性氧 超出活性氧清除系统的能力所及时，过量的自由基会给机体造成不可逆转的氧化损伤， 其中o h 是化学性质最活泼的一种活性氧分子，它几乎能和所有的生物大分子发生反 应，并有非常高的速率常数【4 。 广义上，凡能直接或间接地有助于减轻或修复自由基损伤的食物成分皆可称为抗氧 化剂。在自由基生物学中，抗氧化剂常指化学与生物化学上具有抗氧化作用的一类化合 物，包括内源性抗氧化剂和外源性抗氧化剂两大类。其中内源性抗氧化剂包括酶类和非 酶类抗氧化系统。它们协同作用共同维护生物体内自由基的平衡；外源性抗氧化剂是指 可以通过体外添加来增强机体清除能力的物质。适当摄入外源性抗氧化剂可以降低体内 自由基水平，防止脂质过氧化，帮助机体抵御疾病。 目前，研究较多的是从植物中提取的天然抗氧化活性物质，如茶多酚、胡萝卜素、 维生素等。近年来，通过水解蛋白质得到的肽也具有良好的抗氧化活性和生物防御作用， 因此，抗氧化肽类作为一种非酶类自由基清除剂的研究正在兴起。 目前发现的抗氧化肽，它们的氨基酸残基数多小于2 0 ，分子量均较小。研究表明肽 的抗氧化性不仅和分子量相关，还和肽的氨基酸组成和序列有关【4 2 】，有研究指出，抗氧 化活性肽的作用机制与疏水性氨基酸、抗氧化氨基酸和酸性氨基酸及其构象密切相关 【4 3 】。疏水性氨基酸如丙氨酸( a l a ) 、缬氨酸( ) 和异亮氨酸( i l e ) 的非极性脂肪烃 侧链能够加强抗氧化肽与疏水性多不饱和脂肪酸相互作用，含疏水性氨基酸肽通过与氧 结合或抑制脂质中氢的释放，延缓脂质过氧化链反应，从而保护脂质体系、膜质完整性， 起到抗氧化作用。c h e n ( 1 9 9 5 ) 等从大豆蛋白1 3 - - c o n g l y c i n i n 的水解物中分离出了六种 抗氧化肽，发现此多肽含有较多的组氨酸和酪氨酸。许多氨基酸及其衍生物具有抗氧化 能力，如半胱氨酸( c y s ) 、组氨酸( h i s ) 、色氨酸( t r p ) 、酪氨酸( t y r ) 、亮氨酸( l e u ) 等。q i a n 等指出含巯基的c y s 能直接与自由基作用，从而起到抗氧化的作用；含组氨酸 肽能通过螫合过渡金属从而起到抗氧化作用，c h e n 、k i m 4 4 1 和p a r k 4 5 】等都分离到含组氨 酸抗氧化肽，并指出其抗氧化活性与螯合金属离子有关；有研究者还指出具供氢能力的 氨基酸如t r y 和t v r 将氢原子给予自由基后，自身形成的自由基中间体苯氧自由基和吲 6 第一荦绪论 哚自由基借助共振求得稳定，导致自由基链反应减慢或终止，从而起到抗氧化的作用1 4 6 】； 酸性氨基酸侧链羧基与金属离子相互作用，钝化了金属离子，减弱自由基链反应，达到 抗氧化效果。d a v a b s 、r a j a p a k s e 和j e 等都报道了含酸性氨基酸抗氧化肽，并指出其抗 氧化活性与酸性氨基酸侧链羧基螯合金属离子有关。 关于大米多肽的抗氧化活性目前还少见报道。玄关东利用碱性蛋白酶酶解米糟蛋 白，并通过凝胶色谱g 一1 5 对米糟蛋白酶解物进行分离，测定发现某些肽段具有较高的 还原能力和清除d p p h 自由基的能力【2 6 | ，但并未对具体结构进行鉴定。 关于肽抗氧化活性的比较，因目前的抗氧化活性的测定方法有多种，各种物质的抗 氧化活性之间没有可比性，如清除d p p h 活性的测定。样品与d p p h 的体积比有多 种，d p p h 溶液的浓度也不尽相同。如j a e y o u n gj e 等研究了金枪鱼鱼骨蛋白水解产 物的抗氧化活性，测定方法为e s r 法，即用j e s f a e s r 分光光度计进行测定，样品与 d p p h 的体积比为l ：1 ，d p p h 的浓度为6 0 u m ，经分离纯化后得到的活性最高的组分 的各种活性分别为：d p p h 清除率为4 5 ，羟基清除率为8 0 ，超氧基的清除率为 6 0 e 4 7 】；j i n g i o n gy a n g 等研究了军糟鱼鱼皮明胶水解产物的抗氧化活性，测定方法是 1 5 m l 样品加入1 5 m l 浓度为1 0 0 u m 的d p p h ，得出浓度为1 0 m g m l 的r s g h 的 d p p h 清除率为5 4 9 ，3 k de t - r s g h s 的清除率在水解产物中最高，为6 6 2 ，稍低 于相同实验方法下1 0 0 p p m 的v e 和1 0 0 0 p p m 的v c 【4 8 】；r e e n ar a n d h i r 等研究了绿豆芽 的抗氧化活性，测定方法为0 1 m l 的样品加入3 m l 浓度为6 0 u m 的d p p h 溶液，测 得其d p p h 清除率为1 9 ，诱发剂处理后为最大为4 9 1 4 引。以上数据说明，不同的物 质测定其抗氧化活性时，具有不同的最适d p p h 浓度，且不同的方法测出来的抗氧化 活性也存在差异。为了更好的体现物质的抗氧化活性，需确定d p p h 的适宜浓度。 1 5 多肽的分离纯化、结构鉴定的研究现状 虽然自然界中许多动植物蛋白在适宜的条件下酶解都能产生生物活性肽，酶法己成 为工业化生产生物活性肽的主流方法。但因为酶解过程中产生了大量相对分子质量相近 的肽段，且酶解物是蛋白质、肽和氨基酸的混合体系，因此生物活性肽的分离纯化己成 为制约进一步研究活性肽的结构及功能的关键所在。 活性肽的分离纯化大多通过柱层析进行的。柱层析技术操作简便，设备不复杂，样 品用量可大可小，既可以用于实验室的科学研究，又可用于工业化生产，利用多肽的分 子形状和大小不同、电离性质不同、亲和性不同，可以分别选择分子筛层析、离子交换 层析和亲和层析，也可以结合超滤膜过滤筛选不同分子量的多肽。一般来说，根据要分 离的样品和各种方法分离样品的不同原理来选用一种或几种方法进行样品的纯化，其中 最常用的是以下四种： ( 1 ) 大孔吸附树脂1 5 0 ，5 1 】 这是一类实验室常用的新型非离子型高分子吸附剂，具有吸附和筛选性能，容易再 生，在分离纯化蛋白质、多肽和氨基酸等生物活性物质时具有条件温和、设备简单和操 作方便的特性。研究证明，在多肽的分离中常用d a 2 0 1 c 型非极性的大孔吸附树脂可 7 江南人学硕? i ：学位论文 取得较好效果，这类树脂孔表的疏水性较强，可通过与小分子内的疏水部分的作用吸附 溶液中的有机物。吴金鸿采用大孔吸附树脂提纯乙醇分级的丝胶肽，得到不同极性的具 抗氧化活性的醇沉丝胶肽【5 2 | 。 ( 2 ) 凝胶过滤色谱【5 3 , 5 4 】 这是一种根据样品分子量大小分级分离的方法，它是目前最广泛使用的肽的分离方 法之一，也是所有色谱技术中最简单、条件最温和的方法。用于肽类分离的凝胶种类很 多，主要包括交联葡聚糖( s e p h a d e x ) 、聚丙烯酰胺( b i o g e l ) 、交联丙烯基葡聚糖 ( s e p h a c r y l ) 、琼脂糖凝胶( s e p h a r o s e ) 和交联琼脂糖( s e p h a r o s ec l ) ，可根据样品的分子量 级别选择不同种类及型号的凝胶进行分离，其中s e p h a d e x 是最常用的一种基质。孔青 等【5 5 】利用s e p h a d e xg 1 5 葡萄糖凝胶分离得到具有高血管紧张素转化酶抑制活性的胶原 蛋白酶解物。 ( 3 ) 离子交换色谱1 5 刨 离子交换色谱是基于溶质分子带不同性质的电荷和不同电荷量，并可在固定相和移 动相之间发生可逆交换作用的分离手段。离子交换剂是由基质和带电功能基团构成，其 基质主要包括离子交换交联葡聚糖( s e p h a d e x ) 、离子交换琼脂糖( s e p h a r o s e ) 、离子交换 纤维素( d e a e s e p h a c e l ) 和离子交换树脂，根据基质上所带的功能基团又可分为阳离子和 阴离子两类交换剂。在肽的纯化中，由于肽链相对于蛋白质较短，所带电荷强度较弱， 大多研究者主要选用具有强带电基团的s p s e p h a d e xc 2 5 进行分离，这种阳离子交换剂 由于基质s e p h a d e x 的存在，在根据电荷强弱分离样品的同时，还具有分子筛的功能。 ( 4 ) 反相高效液相色谱【5 7 j 在肽的纯化中，最常用也最有效的方法也是r p h p l c ，它是根据肽的极性大小而 达到分离样品的目的。在运用p r h p l c 时，溶剂的极性大于固定相，像以十八烷基键 合硅胶( o d s 柱) 作为固定相，水和甲醇等作流动相的分配色谱过程。由于操作简单，色 谱过程稳定，加之分离技术的灵活多变性，反相色谱己成为高压液相色谱中应用最广泛 的一个分支。这对于从多肽混合物中选出功能多肽片段和功能片段的氨基酸序列的测定 起了关键的作用。前几种方法分离后所得到的肽经r p h p l c 后，仍会得到数十个甚至 几十个峰，因此，r p h p l c 是分离纯化肽的最有效的方法。 1 6 立题背景和意义 酶法分离是利用蛋白酶对大米蛋白质的降解和修饰作用，使其变成可溶性的肽而被 抽提出来，实现蛋白与淀粉的分离。该方法的主要优点是通过离心，可同时得到大米多 肽和大米淀粉，且得到的大米淀粉可保持天然淀粉的原有品质。但是，目前酶法制备