（食品科学专业论文）亲和层析酶联免疫吸附法检测β2兴奋剂的研究.pdf

中文摘要 本研究采用混合酸酐法制备莱克多巴胺c t o p a l i n e ，r c i ) 免疫抗原和沙丁胺醇( s a l b u t a m o l ， s a l ) 免疫抗原，经鉴定r ( 了免疫抗原( r c r _ b s a ) 的偶联比率为2 5 8 ：1 包被抗原 c 】m a ) 的偶联 比率为4 8 4 1 ：1 ，s a l 免疫抗原( s a i ，b s a ) 的偶联比率为1 2 8 ：1 ，包被抗原( s a 0 0 a ) 的偶联比率为 1 8 7 ：1 。采用重氮化法制各克伦特罗( c l e n b u t e m l ，c l ) 免疫抗原，c l 免疫抗原( c l b s a ) 的偶联比率 为2 4 2 1 ：1 ，包被抗原( c l o a ) 的偶联比率为1 3 6 3 ：1 。 利用制备好的抗原免疫家兔，获得抗r i 卫抗血清，抗c l 抗血清，抗s 砒血清，以制各相应 的多克隆抗体。采用间接酶联免疫吸附检测法( e l i s a ) 对抗血清效价进行了检测，抗r c 诫血清， 抗c l 抗血清，抗鼬山虎血清最高效价分别为1 ：3 2 0 0 0 ，1 ：1 6 0 0 0 ，1 ：1 6 0 0 0 。经鉴定三种抗血清的特 异性较高和与各自抗原同系物的交叉反应率也很低。在优化包被抗原浓度。封闭条件，抗体和酶 标二抗的浓度，显色时间等条件的基础上，采用间接竞争e u s a 法建立检测r c t ，c l ，s a l 的标 准曲线，三者分别在0 5 5n g m l 1 2 1 卢g m l 、2 7 1 n g m l - o 6 6 # g m l 、1 4 8 n g m l - 3 2 4 9 9 m i _ ；浓 度范围之间，呈良好的线性相关，r c t 、c l 、s a l 的最小检测极限0 5 5 n g m l 、2 7 1 n g m l 、 1 4 8 n g m l 。将各抗原以1 ，1 0 ，1 0 0 n g g 的浓度添加时，猪肉组织。猪尿液中的回收率在7 8 3 3 1 1 9 范围内。在间接竞争e u s a 方法的基础上，制备了r c t ，c l ，s a l 间接竞争酶联免疫吸附检测技 术，可用于检测动物肌肉组织、尿液中r c t ，e l ，s a l 的残留量。 为进一步降低检测限，在间接竟- 争- e l i s a 的基础上，利用抗r c i 抗体，抗c l 航体，抗s a l 抗 体制备免疫亲和层析柱0 a c ) ，先将样品中r c t ，c l ，s a l 富集，再进行间接竞争e u s a 检测，建 立了检测r c t ，c l ，s i 戮留的亲和层析柱一酶联免疫吸附衅c _ e u s a ) 检测技术。经优化后 队c - e u s a 方法的检测限可降低一个数量级，达o 0 1 n g g 。 关键词：莱克多巴胺，克伦特罗。沙丁胺醇，酶联免疫吸附检测法，免疫亲和层析 i i l a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , r a c t o p a m i n e ( r c t ) ，c l e n b u t e ：r o l ( c l ) a n ds a l b u t a m o l ( s a dw e r ec o u p l e dt oc a r t i e r p r o t e i n ( b s a & o a ) t op r e p a r ei m m u n o g e n a n dc o a t i n ga n t i g e nu s i n gt h em i x e da n h y d r i d em e t h o da n d d i a z o t i z e dm e t h o d t h ec o u p l i n gr a t i oo fr c tt ob s aw a g2 5 8 ：1a n dr c rt oo aw a s4 8 4 1 ：1 ，c lt o b s aw a s2 4 2 1 ：1a n dc lt oo aw a s1 3 6 3 ：1 ，s a lt ob s aw a s1 2 8 ：1a n ds a lt oo aw a s1 8 7 ：1 啊1 e nt h ea n t i r c ts e n l m 。t h ea n t i c ls e r u ma n dt h ea n t i - s a ls e r u mw e r er a i s e di nr a b b i t s r e s p e c t i v e l yu s i n gp r e p a r e di m m u n o g e n s a f t e rm o n i t o r i n gt h et i t e ro fa n t i - s e r u mb yt h e i n d i r e c t e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) , t h eh i g h e s tt i t e ro ft h ea n t i - r c t 3 r u m ，t h ea n t i - c l s e t u n la n dt h ea n t i - s a ls e r u mw e r e1 ：3 2 0 0 0 ，1 ：1 6 0 0 0 ，1 ：1 6 0 0 0m s p e c t i v e l y n es p e c i f i c i t yo ft h r e e k i n d so fa n t i - s e r u mw a sh i i g ha n dt h f e ek i n d so fa n t i s e r o mh a d n tc r o s s - r e a c t i o nw i t ht h es i m i l a r s t r u c t u r eo ft h e i ra n t i g e n s b a s i n go nt h eo p t i m i z a t i o ni nt h ep r o c e d u r e si n c l u d i n gc o a t i n gc o n c e n t r a t i o n ， b l o c k i n gc o n d i t i o n , c o n c e n t r a t i o no fa n t l b o d ya n dt h es e c o n da n t i b o d yc o n j u g a t e dh r p 。t h ec a l i b r a t i o n c u r v e sf o ri n d i r e c tc o m p e t i t i v ee l i s ad e t e c t i n gr c t , e l , s a lw a sd e v e l o p e d t h el i n e a rd e t e c t i n g r a n g eo fc a l i b r a t i o nc u r v e 8t od e t e c tr c r , c l , s a lw e r e0 5 5n g m l - 1 2 1g g m l 、2 7 1 n g m l 一0 6 6 z g m l 、1 4 8n g m l 一3 2 4 a g m i a n dt h el i m i to fd e t e c t i o nw e r e0 ，5 5 n g m l 、2 7 1 n g m l 、1 _ 4 8 n g m l r e s p e c t i v e l y t h er e c o v e r i e sr a n g e df r o m7 8 3 3 t o1 1 9 f o rd e t e c t i n gr c t , c l , s a lr e s i d u e si n s w i n em u s c l ea n du d n ew i t ha d d i t i o n a lc o n c e n t r a t i o nr a n g i n g1 ，1 0 ，1 0 0n g g a c c o r d i n gt ot h ei n d i r e c t c o m p e t i t i v ee l i s a ，t h ed e t e c t i o nk i td e t e c t i n gr e s i d u e so fr c t , c l , s a li ns w i n et i s s u ea n du d n e w e r ed e v e l o p e d f o rd e c r e a s et h ed e t e c t i o nl i m i t i o nf u r t h e r , a n t i - r c tp o l y c l o n a la n t i b o d y ，a n t i - c lp o l y e l o n a l a n t i b o d y ，a n t i - s a lp o l y c l o n a la n t i b o d yw e r ee m p l o y e dt op r e p a r ei m m u n o a f f l n i t yc o l u m n r c t ，e l , s a c , r e s i d u e si ns a m p l e sw e r ec o l l e c t e da n dp u r i f i e dt h r o u g hi m m u n o a f f i n i t yc o l u m nc o n j u g a t e d a n t i - r c tp o l y c l o n a la n t i b o d y ，a n t i - c lp o l y c l o n a la n t i b o d y ，a n t i - s a lp o l y c l o n a la n t i b o d y ，t h e ne i n t i o n h a d b e e nd e c t e c t e db yi n d i r e c tc o m p e t i t i v ee l i s a a f t e ro p t i m i z a t i o n ，t h ed e t e c t i o nl i m i t i o no f i a c - e l i s ar e a c h e d00 1 n g g ，l o w e rt h a ni n d i r e c tc o m p e t i t i v ee l i s ab yo n eo r d e ro fm a g n i t u d e k e y w o r d s ：r a c t o p a m i n e ，c l e n b u t e r o l ，s a l b u t a m o l ，e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y s ， l m m u n o a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y 图1 b 2 * 奋剂的结构示意图 圈2 b - 受体模型 图表目录 图3 莱克多巴胺的分子结构式 图4 沙丁胺醇结构式 图5 克伦特罗结构式 表1 r c r - b s a 的免疫程序 图6 c l 免疫原反应过程示意图 表2 c l - b s a 的免疫程序 3 图7 s a l 免疫原反应过程示意图 表3 s a l - b s a 的免疫程序 图8 包被抗原r c t - o a 的全波长扫描图 图1 0 免疫抗原c l - b s a 的全波长扫描圈 图1 2 免疫抗原s a l - b s a 的全波长扫描图 圈1 4 合成抗原的s d s p a g e 鉴定 图1 5 r c r - b s a 光密度分布图 图l r c r ，c l ，s a l 抗血清效价曲线 图1 8 不同包被抗原浓度的比较 图1 9 超声破碎对e l i s a 的影响 图9 免疫抗原r c t - b s a 的全波长扫描图 图1 1 包被抗原c l - o a 的垒波长扫描圈 图1 3 包被抗原s a l - o a 的全波长扫描图 图1 6 r c t - o a 光密度分布图 国2 0 不同包被方式的比较 圈2 1 封闭的优化 图2 2 不同抗r c t 抗体浓度的比较 图2 3 不同抗c l 抗体浓度的比较 4 2 4 2 4 3 4 4 4 5 图2 4 不同抗s a i d 抗体浓度的比较。 图2 5 不同酶标二抗浓度的比较 图2 6 不同底物作用时问的比较 表4 抗血清特异性的检测 表5 抗血清间交叉反应率的检测 图2 7 r c t 间接竞争e l i s a 标准曲线 4 7 ，4 7 图2 8 c l 间接竞争e l i s a 标准曲线。 图2 9 s a l 间接竞争e l i s a 标准曲线 表6 样品中添加r c t 的回收结果m 4 8 表7 样品中添加c l 的回收结果5 1 表8 样品中添加s a l 的回收结果 图3 0 0 2m 甘氨酸p h 梯度洗脱r c t - 琼脂糖5 1 图3 1 不同浓度r c t 的i a c - e l i s a 检测结果 囤3 2 0 1n g m l r c t , c l , s a l 的i a c e l l s a 检测结果，5 3 o j坞第；号勉弘柏蚰姐 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 却琵猾 f i 时间：洲年多月圹日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： 砷鼍讲 ， j 芦引良 i l 帆坷年6 月伊 0 绐月 多 年 丽1 问时 第一章前言 1 1 研究背景 8 0 年代初美国一家公司意外发现，将一定量的克伦特罗添加在饲料中，可明显促进动物生 长，并增加瘦肉率。它们作用机制在于刺激动物体蛋自质的合成而引起肌纤维细胞内物质增多， 体积增大，且减缓蛋白质的降解过程，减少机体脂肪沉积l l j 。s i l l e n e e 等用2 5 m g k g 饲料连续8 d 饲养鼠结果与对照组比较，用药组增重4 8 。提高饲料转换率2 6 ，增加肌重9 【2 】。对猪的 试验证明，克伦特罗有显著的降脂作用，且肥育猪比青年猪效果好。据报道，若猪在出栏前2 0 天吃了这种含有“瘦肉精”的违禁饲料，每天可增重1 至1 5 公斤。且瘦肉率提高1 3 1 。 8 0 年代后期，我国部分大专院校、科研院所将其作为开发项目，向饲料厂、养殖户推广这种 新型饲料添加剂。瘦肉精具有在动物体内分布快、消除缓慢的特点。能够改变养分的代谢途径。 促进动物肌肉，特别是骨骼中蛋白质的合成，抑制脂肪的合成和积累，从而改善体品质，使生长 速度加快，瘦肉相对增加。它可使猪等畜禽生长速率、饲料转化率、胴体瘦肉率提高1 1 0 以上， 所以有人称它为“瘦肉精”【4 】。据测算，每头猪只要投人1 0 元的“瘦肉精”便可获5 0 元的利润，某 位负责养猪场投资的人士说，一头吃“瘦肉精”的猪，可以多卖1 0 0 元左右口删。 瘦肉精的化学名叫克伦特罗，是b 2 一兴奋剂的一种，常用于防治哮喘性慢性支气管炎、肺气肿 等呼吸系统疾病。当使用5 一加倍治疗时，可重新分配脂肪与肌肉的比例，从而促进动物牛长而 提高畜牧生产效益。但b z - 兴奋剂多是化学合成类药物，性质较稳定，用于促生长目的时剂量一般 都超 i 立s m g k g ，使用时间也很长( 多在3 周以上) ，成为导致b 2 一兴奋剂残留的主要原因。当人体中 累计摄入剂量超过一定值或一次食入高残留量( 1 0 0 n g g ) 的内脏组织如肝、肾、肺时易出现b r 兴奋剂的毒副作用。人、畜中毒症状相似，主要有骨骼肌收缩增加，肌肉震颤，四肢和面部肌肉 最明显，轻者感觉不适，重者出现行走不稳。其他中毒症状还有心动过速、心律失常、腹痛、肌 肉疼痛、恶心和晕眩等，严重者还可危及生命1 7 1 w 。 每年因食用了有较高残留浓度克伦特罗的肉制品而引起的食物中毒事件时有发生，严重的危 及了人们的生命安全。1 9 9 3 年，法国发生2 2 人中毒。1 9 9 4 至1 9 9 5 年西班牙又发生同样事件，2 5 3 人出现头晕、心悸、呼吸困难、震颤、头痛症状。1 9 9 5 年意大利也有1 6 人中毒。1 9 9 6 年8 月意大 利c a s t e r t a 市发生克伦特罗残留事件，有6 2 , k 因食用残留克伦特罗的牛肉而产生心悸、心动过速、 神经紧张等症状。所有患者均在出现症状前1 0m i n 至3 h 食用了牛肉1 1 1 】。1 9 9 8 ：年4 f l ，香港卫生署 证实，有9 位市民食用了残留盐酸克伦特罗的“猪肺汤”发生中毒，表现心悸、头痛、手震和晕眩。 2 0 0 0 年1 0 月，香港又发现7 2 位市民因进食“哮喘猪内脏”而发生中毒口2 1 。 鉴于b 2 一兴奋剂残留的毒副作用，克伦特罗及其它的同类物如沙丁胺醇、特布它林等早在1 9 8 5 年就被欧洲经济共同体国家禁止使用。因此，欧盟采取更加严密的措藤，通过一系列法规严格控 制8 2 - 兴奋剂作为饲料添加剂使用。有些国家执行最高t 碧l ( t , , m l s ) 限制，如英国规定的m 砌j 为 o 5 n g g ，荷兰规定的m r h 为1 n g ，g 【“】。美国在9 晦代初使用克伦特罗作为动物促生长剂，但都是 用于非上市动物【1 ”。欧洲的中毒事件促使美国食品与药物管理局( f d a ) 也提醒公众警惕克伦特罗 的非法使用。在我国，早在1 9 9 7 年3 月，我国农业部 农牧发( 1 9 9 7 ) 3 号】就严令禁止b 2 一兴奋剂在畜 牧生产中的应用”“。在2 0 0 0 年 农牧发( 2 0 0 0 ) 4 号】对严厉打击非法使用盐酸克伦特罗发出紧急通 知。在2 0 0 1 年对检出使用违规药物的企业、养殖场做出了通报批评。2 0 0 2 年农业部发布的禁用药 物清单中明确规定禁止克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、塞曼特罗、特布他林及其制剂在食品 动物的饲养过程中使用。 但由于生产者单纯追求经济利益，且b 2 兴奋剂目前的检测手段仍相对滞后，“瘦肉精”禁而不 止，有少数饲养场目前仍存非法使用克伦特罗其生产销售从公开转人地下，在一些地方已经形 成网络，隐蔽性堪与毒品交易相比。据说，有些饲料厂家把“瘦肉精”装成味精袋大小的包装，搭 配送给大主顾，还有些兽药店则偷偷卖给熟人，这严重威胁着人民健康。因此，检测动物产品及 饲料中克伦特罗有着十分重要的意义。 其它人工合成的b 2 类兴奋剂如塞曼特罗( c i m a t e r 0 1 ) 、舒喘灵( r a c t o p a m i n c ) 、卡布特罗 ( c a r b u t c r 0 1 ) 也有类似的作用，但莱克多巴胺，沙丁胺醇促生长作用与克伦特罗相似，体内清除时间 又较克伦特罗为短，毒副作用也较克伦特罗为弱，因此，莱克多巴胺，沙丁胺醇成为继克伦特罗后， 营养重分配剂的首选品。且克伦特罗( 瘦肉精) 由于其营养重分配作用的深入研究和广泛应用而引 起有关方面的重视，国内外均已研究出快速有效的检测方法对其进行监测，使得其非法使用受到了 较有效的控制，而莱克多巴胺i l “，沙丁胺醇由于检测手段研究的相对滞后。而又与克伦特罗具有同 样促生长效果，因而逐步取代克伦特罗，成为不法分子谋取经济利益的新手段。 因此，必须不断研究和完善检测试剂盒这样快速有效的检测方法，才能更好的促进我国畜牧业 健康发展，保障我国肉类消费品的食用安全，保证消费者的正当权益。 1 2 主要研究对象 1 2 1 概述 b 2 - 兴奋剂( b 2 - a d 咖c r g i ca g o n i s o 是一类结构和功能类似肾上腺素的苯乙醇胺类衍生物，因能 与动物体内大多数组织上的b 2 - 肾上腺素能受体结合而得名【1 6 】。1 3 2 - 兴奋剂具有苯乙醇胺的结构母 核，故又称苯乙醇胺类( p h e n y l e t l l a n o l a m i n e s ，p e a s ) 其苯环上连接有碱性的b 羟胺( 仲胺) 侧链， 侧链的取代基通常为n - 叔丁基或n - 异丙基。按照苯环上取代基的差异，可以将盼兴奋剂分为苯胺 型( a n i l i n e - t y p e ) 乘l 苯酚型( p h e n o l - t y p e ) 。苯胺型略兴奋剂结构中具有芳伯胺基，如c l 、溴布特罗、 马布特罗、马贲特罗和塞曼特罗等。苯酚型b 2 兴奋剂一般具有邻( 间) 苯二酚或苯酚结构，如s a l 、 非诺特罗、特布他林、肾上腺素、异丙肾上腺素等陋”1 。 1 2 1 1 作用机理 b r 兴奋剂的结构如图1 所示，b - o h 、六元芳香环、乙基胺侧链上带正电的氨原子为其活性所 必需。1 9 3 3 年，e a s 和s t e d m 提出b 一激动剂的3 个部分与b 受体结合，其3 个部分为b o h 、脂 肪氮及芳香环【”l 。 o i l 图i b 2 - 奋剂的结构示意圈 f i g u r e1 t h em o l e c u l a rs l m c t u r a lf o r m u l ao f b 2 - a d t c n e t g i ca g o n j s t b 2 兴奋剂与受体结合，如图2 所示，通过刺激蛋白( g s ) 作用于腺苷酸环化酶( a c d ，使之活 化，活化的腺苷酸环化酶使三磷酸腺苷( a t p ) 转变成为环腺苷酸( a m p ) ，环腺苷酸激活蛋白激酶 k p 趵【或其本身被磷酸二酯酶e ) 失活】促使酶的磷酸化。产生系列效应：心率增加，支气管、 子宫、肠壁肌肉松驰，胰岛素释放和糖原崩解渊。 蘩骥 图2 b - 受体模型 f i g u r e 2 t h e m o d eo f b - a c c c p t o r b ：。兴奋剂用于医学临床，主要用于扩张支气管和增加肺通气量，可治疗支气管哮喘、阻塞性 肺炎、平滑肌痉挛和休克等症，在兽医i 临床用作牛、马的产道松弛剂，如副山用于平喘，c l 作为 子富松驰剂等川。此外，人服用盼兴奋剂后，不仅增加肌肉工作效率，而且增加肺容量，运动员 常用于缩短高强度训练后的恢复期，成为运动竞赛中常用的兴奋剂之例。 1 2 2 莱克多巴胺 莱克多巴胺盐酸( r a c t o p a m i n eh y d r o c h l o r i d e ) ，是一种苯酚胺类b 肾上腺素激动剂，能选择性 激动支气管平滑肌的8 2 受体，临床上普遍用于支气管哮喘治疗。2 0 世纪8 0 年代的一系列动物试验 表明，当用药量为治疗剂量的5 1 0 倍时，牛、猪、羊和家禽口。增多种动物体内的营养成分由 脂肪向肌肉转移，表现为营养“再分配效应p a n i n ge f f e c t s ) ，具有调控动物体营养代谢路径， 增强脂肪分解代谢，促进蛋白质合成，显著增加酮体瘦肉率，提高饲料转化率的作用。莱克多巴 胺的效应与动物种属有关，对猪的效应尤为明显，其可诱发猪体内脂肪组织分解和骨髂肌增生口q ， 3 使大鼠肌小管内肌纤维蛋白合成增加，快速增重和提高饲料转化率口j 。饲料中添加憎值水平的莱 克多巴胺，即可引起猪背最长肌和臀部骨骼肌肥大，腹脂减少。饲养实验表明，饲料中添加( 5 2 0 ) , u g g 的莱克多巴胺具有促进增重，提高饲料转化率，增加瘦肉率的作用。由于r 玎具有营养再 分配作用，可明显提高瘦肉率，作为一种新型促生长添加剂可能在畜产品生产中使用，人类食用 含有该残留的畜产品会引发食物中毒，因此，除了美国批准其可作为猪的饲料添加剂，欧洲、中 国已禁止使用，但事实上常有非法使用情况的报道。在体育比赛中，r c 啊增强运动员、动物( 如 马协t 肉，提高运动成绩，国际奥委会已将其列为禁用药物。因此，研究和开发r c t 的分析技术， 对于临床药物代谢研究以及食品安全检测和体育赛事兴奋剂检测都具有重要意义。 1 2 2 1 药理作用 r c t 的分子结构式如下图1 。市场销售的r c t 为其盐酸盐，是r s 、s r 、r r 、s s 4 种异构体的 混合物。莱克多巴胺为b 2 受体兴奋剂，对体内代谢的作用较强。能降低脂肪的生成和促进脂肪的 分解，促进蛋白质合成并减少其降解：还能促进胰岛素的释放使糖原分解增加，因此能利用合成 脂肪的能量和成分来增加蛋白质的合成。现在认为r c r 作用的机制是其与b 2 受体结合引起受体 兴奋，激活腺苷酸环化酶，生成c a m p ，c a m p 作为第二信使触发一系列生化反应，从而达到营养 再分配的目的。有研究表明，使用r i 口后，背最长肌中的r n a 浓度，r n a d n a ( 代, 表d n a 转录括 性) 比值显著上升，表明r c 呵能在转录或翻译水平促进了蛋白质的合成。r c i 往猪背最长肌中 c a m p 浓度显著上升，证明c a m p 能促进基因转录和翻译过程。另外，r c 壤现为能增强猪股二头 肌中n a + 、x + a t p a s e 活性，提高细胞内，b n a + 、k + 梯度，促进氨基酸转运进入细胞内，为蛋白 质合成提供更多底物。c h p 浓度的增加还降低了肌肉和肝脏细胞内c a “浓度，减缓肌肉蛋白的 降解。同时发现，r c r 可能与细胞膜上8 2 受体结合，使皮下脂肪中c a m p 含量显著增加进而通 过e a m p 肃j 激脂肪分解，抑制脂肪合成洲。 h 图3 菜克多巴胺的分子结构式 f i b r e3 t h e m o l e c u l a rs t r u c t u r a l f o r m u l ao f r a c t o p a m i n e 1 2 2 2 药动学特性b 7 】 o h r c t 在几种动物体内的研究表明，口服给药吸收迅速，大鼠在给药后0 5 2 h ，血浆及全血中 药物达峰浓度。雄性及雌性大鼠体内的消除半衰期均约为7 h ，但雄性大鼠以2 0 1 1 1 眺g 剂量给药时 消除半衰期延长为1 5 h 。犬胃管给药，达峰度时间为4 8 h ，血浆及全血中药物消除半衰期约为6 h 。 r c r 在体内代谢较快，停药后在一段时间内很快被代谢，样品中母体的浓度一般很低，大体为 n g m l t g 平。研究表明，莱克多巴胺单葡萄糖苷酸轭合物是猪、牛、狗、鼠、火鸡等尿液中的主 要代谢产物。但是在鼠的胆汁中还发现以下3 种残留代谢物：莱克多巴胺硫酸酯、莱克多巴胺硫 酸、葡萄糖苷酸非共轭化合物，且鼠和其他种类的动物的尿液中不存在这3 种残留。尿液中代谢 物经酶水解可释放出母体化台物。因此，其可在停药后的较长时间内检出。 4 1 2 2 3 毒理学特性 人体中累计摄入剂量超过一定值，或食入莱克多巴睃高残f l ( 1 0 0 n g g ) 的内脏组织( 如肝、肾、 或肺1 时，易出现毒副反应吲。人、畜中毒症状相似，表现为骨骼肌收缩增加，破坏快缩肌纤维 与慢缩肌纤维间的融合，引发肌肉震颤，四肢和面部肌肉尤为明显。其他中毒症状包括心动过速、 心率失常、腹痛、肌肉疼痛、恶心和眩晕等【勰j 。 1 - 2 3 沙丁胺醇 沙丁胺醇( s a l b u t a m o l ，s a l ) ，又名咳喘宁是人工合成的b - 肾上腺素受体兴奋剂之一，是水 杨醇类b 肾上腺素激动剂，临床和添加剂用的一般是其硫酸盐，为白色或几乎白色的粉末。沙丁 胺醇是选择性8 2 受体激动剂的一种。能选择性激动支气管平滑肌的b 2 受体，临床上广泛用于治疗 支气管哮喘 2 9 1 。 沙丁胺醇( s a c ) 和克伦特罗( c l e n b r t e r o l ，c l ) 均为b 2 肾上腺素能受体兴奋剂，可起促生长的作 用，而克伦特罗由于其研究较深入最早用傲饲料添加剂，用于畜禽增产，其使用范围最广，受 到世界各国的限制也最严厉。盐酸克伦特罗又称瘦肉精，是一种白色或类白色的结晶粉末，猪食 用后在代谢过程中能够促进蛋白质合成，加速脂肪的转化和分解。提高猪肉的瘦肉率p q 。w i l l a m j c a r t e r 和m a r y e l y n c h l 3 l j 以3 月龄和2 4 月龄小鼠为研究对象，分别以1 0 3 m g k g f f ：n 6 0 0 u g k g 的用量， 对沙丁胺醇和克伦特罗在肌肉质量和胴体组成的影响进行了比较，s a l 和c l 分别增加肌肉重1 9 和2 5 ，增加蛋白质含量比例分别为2 0 和3 0 。结果表明，它们的促生长作用相差并不大。由 于近年来世界各地陆续发生食用残留克伦特罗的动物性食品的中毒事件。使得各国均加强了对克 伦特罗的监督检测，克伦特罗的非法使用受到了极大的限制，不法分子不得不去寻找新的替代品。 其它人工合成的b 类兴奋剂如塞曼特罗( c i m a t e m l ) 、舒喘灵( r a c t o p a m i n e ) 、卡布特罗( c a r b u t e m l ) 也有类似的作用，但s a i 促生长作用与克伦特罗相似，体内清除时间又较克伦特罗为短，毒副作 用也较克伦特罗为弱，因此，s a l 自g 为继克伦特罗后，营养重分配剂的首选品p “。克伦特罗f 瘦肉 精) 由于其营养重分配作用的深入研究和广泛应用而引起有关方面的重视，国内外均已研究出快速 有效的检测方法对其进行监测，使得其非法使用受到了较有效的控制，而沙丁胺醇由于检测手段 研究的相对滞后，而又与克伦特罗具有同样促生长效果，因而逐步取代克伦特罗，成为不法分子 谋取经济利益的新手段。 f 一 喁 图4 沙丁胺酵结构式 f i g u r e 4 t h e m o l e c u l a rs t r u c t u r a l f o r m a l ao f s a l b u t a m o l 1 2 3 1 药理作用 人口服沙丁胺醇在体内的吸收速度快，1 7 l 左右达到血药浓度的最高峰，分布半衰期为4 2 h 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 作用维持在5 b 以上。沙丁胺醇在畜禽体内的吸收速度也较快，1 5 1 1 左右达到血药浓度的最高峰。 分布半衰期为3 2 9 h 。s a l q 大多数组织膜上b 受体，主要是与分布在血管平滑肌和细支血管平滑 肌上的b 2 受体结合，激活细胞膜上的腺苷酸环化酶，该酶催化a i p 转化为c a m p ，c a m p 又作为第 二信使，引起细胞产生一系列变化，导致气管、支气管平滑肌松弛，骨骼肌收缩，骨骼肌血管平 滑肌松弛，过敏介质释放减少，并增加呼吸道纤毛运动，促使痰液排出。在动物体内通过刺激蛋 白质的合成而引起纤维细胞内物质增多，体积增大，且减缓蛋白质的降解过程，减少胴体的脂肪 含量，减少非胴体部分的脂肪沉积。w a r r i s s 等分别以脂肪型和瘦肉型猪为研究对象，以2 7 m g k g s a l 的添加剂量饲喂【捌。结果与对照相比。脂肪型实验组平均日增重增加5 ，屠宰率增加2 ， 眼肌面积增自d 1 4 ，背膘厚度下降2 5 。在瘦肉型猪实验组，屠宰率提高2 ，眼肌面积增自1 1 3 。 对猪的试验证明，s a l 有显著的降脂作用，且肥育猪比瘦肉猪效果好。此外，人服用刚正后，不 仅增加肌肉工作效率，而且增加肺容量，运动员常用于缩短高强度训练后的恢复期，成为运动竞 赛中常用的兴奋剂之一印j 。 1 2 3 2 药动学特性p 2 州 s a l 部分在肝中降解，部分以原形从尿中排出。停药后若干天其对蛋白质、脂肪代谢的作用 随即消失。因此，s a i 作为营养重分配剂常常采用混饲给药。以2 8 m g k g 饲料饲养猪1 3 月， 达到促生长的效果。但同时也会造成药物蓄积，主要是在内脏、毛发、视网膜内残留时间较久。 用药后数天内s a i 可出现在尿及身体各器官中，在肝脏中可保留十余天。而在视网膜组织中至少 可保留4 个月【3 h 。 1 , 2 3 3 毒理学特性 人在食用含鼢山较高的动物组织后出现肌肉颤动、肌痛、头痛、晕眩、神经过敏、心悸、心 动过速，甚至恶心、呕吐等中毒症状，此类病状可持续1 6 d ，一般食后1 5 m i n 6 h 内出现症状， 症状持续9 0 m i n 6 d ，症状虽可逆，但对有心血管病的人仍有较大危害【3 6 一”。 1 2 4 克伦特罗 克伦特罗( c l c n b u t c r o l ，c l ) 又称克喘素、氨哮素，是人工合成的b 一肾上腺素能受体兴奋剂之 一是一种强效激动剂，可用于治疗哮喘。化学名为2 一【( 叔丁氨基) 甲基】- 4 氮基3 ，5 一二氧苯甲醇， 其它人工合成的b - 兴奋剂类药物如塞曼特、沙丁胺醇、舒喘灵，卡布特罗也有类似c l 的作用，但 尤以c u 目溶性最高，毒性最大，c l 有强而持久的松驰支气管平滑肌的作用，其药用制剂常用其 盐酸盐制成片剂或膜剂，以及加入洋金花制成的称为“喘立平的气雾剂、盐酸克伦特罗用于动物 被称为瘦肉精，是一种白色或类白色的结晶粉末，无臭、味苦闭。其化学性质稳定、一般的加热 方法不能将其破坏，加热到1 7 2 时才能分解。且胃肠道吸收快，人或动物口服后2 吩钟即起作 用，2 3 小时血浆浓度可达峰值。作用时间持久，药理作用较强，一般情况下只需要微量就会出 现症状p ”。 圆 p i 呱 一 啦 _ g 。 。 h 图5 克伦特罗结构式 f i g u r e 5 t h e m l e c u l a ts t r u a u r a l f o r m u l a o f c l e n b u t c r o l 1 2 4 1 药理作用 4 0 4 4 c l - - 与大多数组织细胞膜上受体，特别是分布在血管平滑肌和细支气管平滑肌的b 受体结合， 激活细胞膜上的腺苷酸环化酶，该酶催化a t p 变为c a m p ，c a m p 作为第二信使引起细胞产生一系 列变化，导致气管和支气管平滑肌、血管平滑肌松驰，骨骼肌收缩，过敏介质释放减少，并增加 呼吸遭纤毛运动，促使痰液排出、常用于防治哮喘性慢性支气管炎、肺气肿等呼吸系统疾病榉l 。 1 2 4 2 药动学特征 c l 作为营养重新调配剂常常采用混饲给药，以1 3m 眺g 饲料箱养猪l 3 月，造成药物 蓄积，主要蓄积于内脏、毛发、视网膜。用药后1 d 内c l 可出现在尿和身体各器官中m ，在肝脏 中可保留数天，但在视网膜组织中至少可保留5 个月。瘦肉精进人动物体内，主要分布于肝、肺 等内脏。在肝脏中去甲基后从尿中排出。肌肉中含量较肝脏低很多邮”1 。 有人给猪以4 m 眺g 静注，分布半襄期为0 6 2 h 。消除半衰期为4 8 7 h ，体清除率为0 6 3 h 。表明 c 【在猪体内分布快，消除缓慢a 静注后- 表观分布容积高达4 4 8 l k g ，表明该药能广泛分布于全 身各组织。以相同剂量肌注和内服，c 瞌猪体内吸收半衰期分别为0 2 2 h 和0 2 8 h ，达峰值时间分 别为0 印b 和1 4 6 h ，峰浓度分v i 为1 2 7 9 ，m i 和o 6 5 9 m l ，消除半衰期分别为4 2 5 h 和3 1 5 h 【* j 。可见 猪肌注射内服本品表现为吸收快，消除较慢的特点。c 琏体内药效持久与其分布广泛、清除率 较小、消除半衰期较长有直接关系。吃了瘦肉精”的猪，其肉在色、昧上无特别之处人们靠肉 眼无法辨认。 1 2 4 3 毒理学作用 人口服后1 0 2 0 m i n 起效，2 3 h 达最高血浆浓度，作用维持5 h 以_ l ，c 瞌血中含量很低，而 在尿中含量很高，人口服治疗量2 0 4 0 l l g ，在血中浓度低于o 1 5 n g m l ，而尿中最高浓度达1 0 2 0 n 咖l ，4 8 h 后尿中浓度下降至l 2 i l 咖l p 】。 人类瘦肉精中毒的症状表现比较特别一般在食用含c 嵫高的动物组织后1 5 m i n 6 h 内出现 症状，持续9 0 m i n 6h ，症状表现为心率加速、心悸，特别是原来就患有心律失常的病人更易发 生心脏反应，中毒者出现心室早搏、st 段与t 设幅压变低，四肢、面颈部骨骼肌震颤，尤其是交 感神经功能亢进的患者更易发十头痛、恶心、呕吐、胸闷、面部潮红。瘦肉精中毒能让人产生特 别的兴奋，代射紊乱，能引起血液乳酸，丙酮酸升高，并可能出现酮体。耱尿病人应用这一药物 可能会引起酮中毒或酸中毒。此外，过量应用或与糖皮质激素合用时，有可能引起低钾血症，从 而导致心律失常。反复用药后发生低敏感现象也很常见，表现为支气管扩张作用明显减弱，作用 持续时间缩短。其对高血压、心脏病、甲状腺机能亢进、前列腺肥犬的人有危险。也有专家认为， “瘦肉精”有可能对人体致畸致癌。运动员服用c l 后，不仅增加肌肉，而且增加肺容量，缩短高强 度训练后的恢复期ac l 部分在肝中降解。部分以原形从尿中排出。停药后若干天对蛋白质、脂肪 代谢的作用才消失。 1 3j j 2 兴奋剂检测分析现状 目前i h - 兴奋帮是食品安全问题的重点监控对象，许多国家对饲料和食品中的嘧兴奋剂实施 了严格监控，相关的残留毒理学和分析方法研究也活跃起来。联合国粮农组织，世界卫生组织食品 添加剂联席委员会推荐c l 的日许量( a d 玲为0 4 p g k g ，即体重为6 0k g 的个体每天的摄入量不得 超过2 4 z g 。牛或马的肌肉朋肪、肝肾和牛奶的m r b 分别为0 2 、0 6 和0 0 5 z g k g 。残留分析方法 的检测限宜低于0 1 m g k g ，定量限小于o 2 a g m 。目前尚未制定m 虬的最高残留限量。 目前，国内外对b 2 - 兴奋剂残留的检测技术报道很多，主要有高效液相色谱法( s p l c ) 、气相 色谱法( g c ) 、高效薄层色谱法( h p t l c ) 、气，质联用分析 法( o c m s ) 、湖质联用分析法( t c , c m s ) 、 高效液相色谱，傅立叶红外光谱法( l c 枷1 1 r ) 、放射免疫测定法( r i a ) 、e l i s a 和放射受体分析法等。 由于免疫测定法、l c m s 和g c m s 的灵敏度能较好地满足b 2 兴奋剂残留分析要求，检测限通常 低于o s # g k g ，应用较多。近几年国内对此类药物残留检测的报道也逐渐增多，建立了各种仪器 分析方法和酶免疫分析方法。但国内对兴奋剂的残留检测大多是针对c l ，虽然也制各出s a l 和r c r 单克隆抗体，但对r c t 和s a l 的免疫研究和残留检测还处于起步阶段g c - s z ! 。 1 3 1 仪器分析法 b 2 一兴奋剂检测方法主要有高效液相色谱法l q 、气质联用法( g c 肿s ) 、薄层色谱法f i l c ) 、 气相色谱一傅立叶红外联用法压q 曝) 、液质联用法函口m s ) 等。其中h p l c 、6 c m s 、较为常用。 1 3 1 1 高效液相色谱法( h p l c 少“1 h p l c 在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器。实现了操作自动化：但需要 昂贵的仪器，操作繁琐，需处理样品，成本高，检测一个样品大约需一天时间，成本1 2 唬。h p l c 一般使用反相柱进行b 2 一兴奋剂检测，离子对色谱法可以和反相液相色谱法相结合。h p l c 所用的 检测器主要有以下4 种。 紫外分光光度( u v ) 检测器：u v 检测克仑特罗时的波长是2 2 2 2 4 5 n m ，检测时易被杂质成分 干扰，园此纯度不高的样品不宜采用该法。我国目前检测b 2 兴奋剂残留的h p l c 法均采用u v 检测 器黄士新等采用f i p l c u v ；捌定猪肝脏和肌肉组织中克喘素的残留，最低检测限2 n g g ，停药 后残留量迅速下降，肌肉在停药后2 d e p