（食品科学与工程专业论文）枯草芽孢杆菌（bacillus+subtilis）wy45产β甘露聚糖酶的纯化与性质研究.pdf

中田农业大学碗士论文 中文摘要 摘要 本文研究了通过筛选得到的枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) w y 4 5 产甘露聚糖酶的发酵条 件，并对其所产甘露聚糖酶进行了分离纯化同时对纯酶的酶学性质进行了研究。主要结果有： 1 枯草芽孢杆菌( b a c i l l u s s u b d l i s ) w y 4 5 液体发酵产生甘露聚糖酶。发酵培养基经优化后，在 4 的魔芋稽粉为碳源1 3 3 1 的大豆蛋白胨为氮源，初始p i - 1 5 5 。5 0 培养9 6h 的条件下该 菌产酶韵酶活从初始的2 0 4u r a t 提高到2 8 0 0u m l ，优化提高了1 3 7 倍优化效果明显，且该 酶活水平为现在已报道的同类酶中的最高水平。 2 枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b 脓) w y 4 5 产甘露聚糖酶经6 0 - 9 0 硫酸铵沉淀，s - 1 0 0 凝胶过滤 层析，q s f f 离子交换层析等分离纯化步骤后得到电泳纯的纯酶，最终纯化倍数为6 鸺，酶活 回收率为1 9 8 0 ，经s d s p a g e 电泳测定该酶的分子量为4 4 4 7 k d a 。 3 p l l 对该甘露聚糖酶活力的影响很大。该酶的最适反应p h 为6 o ，在5 5 - 6 5 的范围内，酶的 相对活力都在以上；当p h 低于5 0 和高于9 0 对，活力显著下降。在4 0 下，酶在所采 用的p 4 5 o - 1 1 0 的范围内都根稳定。该酶的最适反应温度为6 5 ，大于6 5 c 酶活力即迅速下 降，7 0 时酶活力水平已低于l 矾大多数金属阳离子对该酶活力有提高的作用，特别是c 0 2 和n i + 关键词：甘露聚糖酶，枯草芽孢杆菌w y 4 5 ，发酵条件，纯化与性质，魔芋粉 中国农业大学硕士论文 英文摘要 a b s t r a c t 6 - m a n a n n a s ei sa l l e n z y m ec a p a b l eo fh y d r o l y z i n gb - 1 , 4 - d - m a n n o - p y a n o s y l l i n k a g e so fg l u c o m a n n a n s , y i e l d i n gm a n n o - o l i g o s a c c h a r i d e st h a th a v et h em a r k e d e f f e c t o nt h ep r o l i f e r a t i o no fb i f i d o b a c t e a b a c i l l u ss u b t i l i sw y 4 5w a si s o l a t e df r o ms o i l s a m p l e s ，w h i c hc a np r o d u c eh i g ha c t i v i t yo fe x t r a c e e l l u l a rb - m a n a n n a s e t h em a i n e e s e a r c hc o n t e n t so ft h i st h e s i si n c l u d et h ef o l l o w i n g ：o p t i m i z i n gt h ec u r u r ec o n d i t i o n s o ft h ef e r m e n t a t i o n ，p u r i f y i n gt h eb - m a n a n n a s ep r o d u c e db yb a c i l l u ss u b t i l i sw y 4 5a n d f i n d i n go u tt h em a i nc h a r a c t e r i z a t i o n so ft h ep u r i f i e de n z y m e t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ： 1 b a c i l l u ss u b t i l i sw y 4 5g r e wb e s tw h e nc u l t u r e da t5 0 w i t ht h em e d i u mc o m p o s e d o f4 k o n j a cp o w d e ra sc a r - b o ns o a r r = c ，1 3 3 s o y ap e p t o n ea sn i t r o g e ns o u r c o ，a n d a d j u s t i n gp ht o5 5 a f t e r9 6h o u r sc u l t u r i n g ，t h ee n z y m ec o u l ds h o wt h eh i g h e s ta c t i v i t y a s2 8 0 0u m la n di ti st h eh i g h e s tv a l u ea sf a ra sn o w 2 t h eb - m a n a n n a s ew a sp u r i f i e dt o h o m o g e n e r yb ya m m o n i u ms u l f a t c ( 6 0 - 9 0 ) p r e c i p i t a t i o n ，s e p h a c r y ls 1 0 0g c lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h ya n dt h eq - s e p h a r o s ei o n e x c h a n g ec b d o m a t o g r a m p h y i ns d s - p a g eas i n g l ep r o t e i ns t r i p 啪b es e e n t h e m o l e c u l a rw e i g h to ft h ep u r i f i e de n z y m ew a s4 4 4 7 k d a ；t h ee n z y m ew a ss e n s i t i v et ot h et e m p e r a t u r ea n dp h , a n dt h em a x i m u me n z y m e 。a c t i v i t ye x i s t e da t6 5 c ，a n dt h eo p t i m i z e dp hw a s6 0 i tw a s s t a b l ea tp h5 5 6 5 ，b e l o w 5 0 ( 2 m o s tm e m a li o n sc o u l de n h a n c et h ee n z y m ea c t i v i t y , e s p e e i a n yc 0 2 a n dn i + 。 k e yw o r d s ：m a n n a s e ，b a c i l l u s s u b t i l l s w y 4 5 ，f e r m e n t a t i o n ，p u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n , k o n j a cp o w d e r i i 独创性声明 v 7 7 4 3 8 1 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究威 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 张蟠评巧 帆阿年 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阕，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 蝴再 时间：年厂月f 馅 翮懿2 夸芝婚 响：w 彩月7 j _ 日 中田农业大学硕士论文第一章绪论 第一章绪论 1 1 研究的目的和意义 1 1 1 研究意义 植物是自然界主要的可再生有机资源主要成分是纤维素、半纤维素和木质素。半纤维素占 植物干重的3 5 ，在自然界中含量仅次于纤维素与纤维素( e 1 , 4 葡聚糖主链) 相比，半纤维素结 构与组成十分复杂，包括木聚糖、甘露聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖和木葡聚糖等多种组 分，而其中又以木聚糖和甘露聚糖两种多糖与食品、饲料及制浆造纸工业关系最大【1 0 甜l ， 甘露聚糖( m n n ) 是毗哺型d 一甘露糖残基以1 4 一b 一糖营键连接而成的线状多糖如 果主链某些残基被葡萄糖残基取代或半乳糖残基通过1 ，6 一。一糖苷键与甘露糖残基相连形成分 支，则称之为异甘露聚糖，主要有半乳甘露聚糖( g a l a c l o n 脚) ，葡甘露聚糖( g l u c o m a n n n a n ) ， 半乳葡甘露聚籍( g a a c t o g l u c o m a n n a n ) 上述物质构成了植物半纤维紊的第二大组份这些物质 的降解主要依靠的酶就是p 一甘露聚糖酶( e - - m a n n a n a s e ：e n d o l ，4 1 3 由一m 帅n a n n n o h y d r o l a s e ；e c 3 2 1 7 8 ) 完全降解还需要b 一甘露糖苷酶( b - - m a n n o s i d a s e ) 、外一b d 一甘露聚藉酶( e x o - b - d - m a n n a n a s e ) 、半乳糖苷酶( g a l a c t o s i d a s e ) 、葡萄糖苷酶( g l u c o s i d a s e ) 和脱乙酰基化酶( d e a c y t l ee s t e r a s e ) 等支链酶的协同作用p 加。 不同来源、不同种类的甘露聚糖和异甘露聚糖所含的单糖成分、聚合度、糖苷键连接和排列 方式以及糖残基上是否被取代等情况不同，导致它钔在溶解度、粘度等性质上存在着明显的差别 这些都是影响b 一甘露聚糖酶作用的因素。一般的，溶解度越大、单糖成分越简单、被取代的羟 基越少、分支越少的甘露聚糖和异甘露聚糖越容易被水解嗍。 低聚糖( o t i g o s a c c h a r i d c ) 是指2 - 1 0 个单藉通过糖苷键连接起来形成的富链或具有支链的一 类糖的总称，是1 9 3 0 年b h e l c r i c h 等首先提出的，它具有较优良的保湿性、耐酸性和耐热性， 而且在防结晶析出等方面也有很强的作用，因而广泛应用于食品工业更引人注意的是低聚糖还 是非常有效的双歧杆菌促生长因子( b i f i d u sf a c i o t , b f ) 双歧杆菌促生长因子是能促进双歧杆菌 生长繁殖的一大类天然及合成物质。人体肠道菌群对宿主一一人的健康具有重大影响当人体处 于健康状态时有益菌群占优势，其中双歧杆菌( b i f u i o b a a e r i a ) 为优势菌种之一低聚糖对双 壤杆菌的生长繁殖有促进作用，因而对维持人体健康有重要意义。能提高人体免疫力，使肠道d h 下降，抑制肠道有害麓生长，产生b 族雏生素，分解致癌物质，促进肠道蠕动。增进蛋白质吸收 功能性低聚糖可增强人体免疫骑御系统研究袭明甘露低聚糖与毒素、病毒、真棱生物结合后可 中圈农业大学硬士论文第一章绪论 妨碍抗原的吸收，增强肌体的细胞免疫和体液免疫，还可刺激肝脏甘露结合蛋白的分泌，识别结 合甘露糖，在动物免疫力降低时，发挥天然抗感染免疫功能。 目前已形成工业化生产规模的低聚糖品种多达十几种成为功能性食品基料的一大支柱 8 一甘露聚糖酶能够水解甘露聚糖，葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖( 1 - 4 ) 一b d 一甘露毗喃糖为单糖、二糖、三糖、四糖等低聚糖甘露低聚糖是一种水溶性膳食 纤维，能降低血清胆固醇和三脂酰甘油的含量，摄入甘露低聚糖后不会引起血糖水平的波动，因 此可作为高血压、糖尿病和肥胖症患者用甜味剂。甘露低聚糖是一种防龋齿、低腐蚀性的功能性 甜味剂它不能被链球菌发酵来生成不溶性葡聚糖，从而使得口腔微生物缺少沉积、产酸和腐蚀 的场所。 1 1 2b 一甘露聚糖酶的应用 b 一甘露聚糖酶作为工具酶用于对天然多糖类物质糖链结构的分析，复杂糖类或糖蛋白的糖 链中常有b 一甘露糖苷键存在，因此利用b 一甘露聚糖酶水解其中的甘露多糖类物质。并测定 水解产物中多糖类物质的种类和比例，从而可推知其多糖结构1 9 , 1 q “1 利用b 一甘露聚糖酶水解 古b 一甘露聚糖的植物胶生成含有不同糖分子( 2 - 1 0 个) 组成的分支甘露低聚糖，其具有有效地 降低人体胆圃醇水平、减轻便秘、降低血糖、增加肠内有益菌和减少有害菌等的生理功能，国内 外现已广泛用作食品或饲料添加剂，以及直接用作保健食品。在造纸工业中，用酶法代替传统的 碱法处理纸浆，b 一甘露聚糖酶和b 一木聚糖酶等半纤维素降解酶类协同使用，能有效地除去纸 浆中的半纤维素。明显改善纸质在纺织工业中用作天然纤维中半纤维素胶质的降解，并能有效 地除去纺织印染产品上粘附的多余的染料，以取代常规的化学处理工艺降低了能耗和对环境的 污染b 一甘露聚糖酶还是油井石油压裂液的优质生物破胶剂，具有效率高、成本低、对地层伤 害小等优点在饲料工业中用作饲料酶添加荆，起到消除抗营养因子的作用和改善饲料的营彝价 值。 1 2 甘露聚糖酶的研究进展 1 2 1 国外的研究进展 对b 一甘露聚糖冀的研究始于上世纪5 0 年代末6 0 年代初，是人们在研究甘露聚塘及其水解 时发现的最早是由c o u 曲i s ，j l 粤1 】等人1 9 5 8 年在对苜蓿的半乳甘露聚糖的研究中发现了8 一甘 露聚糖酶钓存在随后短短的5 年时间里诬有许多关于生产b 一甘露聚糖酶的真菌、细菌、高等 2 中国农业大学硕士论文第一章绪论 植物。如刺槐、咖啡、杏树及杏仁等，动物，如哺乳动物、蜗牛及牡蛎等等方面的报道其中许 多工作是由c o u r t o i s , j e 与其同事一起完成的，其内容包含真菌、高等植物和动物，因而可以说 在早期对b 一甘露聚糖酶的研究中c o u r t o l s 贡献卓越 2 0 世纪6 0 、7 0 年代对产甘露聚糖酶的解甘露聚糖气杆菌、枯草芽孢杆菌k 一5 0 、巨曲霉、 黑曲霉和沃特曼青霉 t z l 3 1 4 1 5 】等菌株的报道等研究工作着重于产酶菌株的筛选、酶的分离纯化和 酶学性质以及作为工具酶用于对天然多糖类物质糖链结构的分析。 1 3 一甘露聚糖酶及其相关酶类最先被w h i s t l e r 、b i s h o p 、d e u e l 、c o u r t o i s 和其他一些研究 者用来确定葡萄甘露聚糖和半乳甘露聚糖的结构 8 0 年代随着日本、法国、前苏联、美国等国家先后对嗜水气单孢菌f 一2 5 、卡塞尔黄肠球菌 f l 2 1 2 1 、嗜碱芽孢杆菌a m 0 0 1 1 l 1 s 1 9 , 2 0 1 等细菌产生b 一甘露聚糖酶( e c 3 2 1 7 8 ) 的报道，人 们发现经b 一甘露聚糖酶水解植物胶如魔芋粉、角豆胶、瓜儿豆胶等产生的低聚甘露糖能促进双 歧杆菌的增殖至此。一甘露聚糖酶作为微生物的酶制剂开发向应用研究和产业化发展 年代对产酶菌株的研究报道是5 0 - 7 0 年代的总和的2 倍，9 0 年代对该酶的研究更是广泛。为8 0 年代报道的2 倍以上。 值得一提的是，与其他酶的研究一样，b 一甘露聚糖酶的研究也同样涉及一些极端环境下的 微生物更进一步拓宽了该酶的研究和应用领域 1 9 8 4 年r i h e i r a k a h a s h i , i s a ok u s a k a b c ( 1 6 1 等放线菌的的b 一甘露聚糖酶，并提出了一个通过 平板透明圈缔造法从土壤中寻捉产b 一甘露聚糖酶徽生物的实验方法同时也首次对从热带植物 椰子中提取的甘露聚糖进行了研究 1 9 8 8 年a k i n o 寸7 1 首次报道出嗜碱性徽生物一一嗜碱芽孢杆菌a m 0 0 1 来生产1 3 一甘露聚糖 酶t 该菌所产生的酶为有3 个组分的胞外酶文中引用了对许多嗜碱性徽生物的产酶机制及酶特 性的研究非常有益的研究结论指出。嗜碱性徽生物细胞内的p h 是中性的。并且由它们产生的胞 内酶其最适p h 接近中性，而箕产生的胞外酶在碱性环境下活力较高 1 9 9 2 年a m k it o s h i y o s h i 2 5 增次报道了产1 3 一甘露聚塘酶的海洋细菌- - - - 9 i 细菌m a l 2 9 和 m a l 3 8 ，其所产酶的最佳p h 为7 0 - 7 5 酶的最佳p h 位于中性对其以后的提纯及生产非常有益 在此以前，除了y a m a u r a 蝴道的假单胞菌( p s e u d o u n o n a s f l a r e s c e n ss u b s p e c i e sc e l l u l o s a ) p t 5 所产8 一甘露聚糖酶的最佳p h 为7 5 之外，许多关于真菌及细菌所产b 一甘露聚糖酶的报道中， 其酶的p h 要么俯酸( p h 3 5 - 6 0 ) 要么偏碱( p h 9 0 ) ，很少位于中性。 在产e 一甘露聚糖酶的梗端环境徽生物中，以嗜热细菌的报道较多弘芦1 1 9 9 1 年，l u t h i 的 3 中田农业大学硕士论文 第一章绪论 有关基因克隆的报道中提到了b 一甘露聚糖酶基因的来源菌为极端嗜热菌一一解糖热解纤维素 菌1 9 9 0 年t a l b o tg 报道了嗜热脂肪芽孢杆菌1 9 9 6 年。m c c u t c h e nc m p 1 憎次对那不勒斯栖 热袍菌5 0 6 8 所产高度热稳定性b 一甘露聚糖酶进行了报道该菌所产b 一甘露聚糖酶最佳温度 为9 1 c ，9 1 c 时半衰期为1 3 h ，1 0 0 c 时3 5 m i n 。这是迄今为止报道的最具热稳定性和高温下活力 最高的b 一甘鹰聚糖酶这些微生物所产酶的应用报道使得甘露聚糖酶的应用范围更为宽广，同 时也更大限度地造福人类。 1 9 9 6 年c h a r l e sw h e n d r c k s 3 0 等提出了一种新的培养基配方进行对产半纤维素酶的微生物 筛选，并筛选到了有较产高酶活的甘露聚糖酶的菌株。 1 9 9 6 年gm o u b i t z ”1 等报道了葡甘露聚糖对真菌产甘露聚糖酶的诱导作用，并证实该酶的 最适p h 为4 , 5 。最适反应温度为6 5 c 1 9 9 7 年该研究小组又发表了甘露聚糖酶与木聚糖酶同时 应用于造纸时优良的漂白作用明显优于传统氯漂 1 9 9 8 年n k a t a o k a 和y t o k i w a l 2 9 1 报道一株产甘露聚糖酶的厌氧细菌一一梭状芽孢杆菌 k t - 5 a ，该菌来自于池塘底部沉积的淤泥 1 9 9 9 年m w 缅。和kl n g v o r s e n r 锄究了一株同时产甘露聚糖酶和甘露糖苷酶的耐盐菌株 在产b 一甘露聚糖酶的极端环境微生物的研究中又加入了重要的一个组成部分。 2 0 0 0 年0 p o l t z , m k r a h , kkt h o m s e n ，r b o r r s s 将一株产甘露聚糖酶的嗜熟海生菌 a t c c - 4 3 8 1 2 的d n a 进行了提取并对其序列进行了分析，指出指导嗍合成1 1 3 k d a 酶的基因片断 为第2 6 家族基因 2 0 0 1 年m a s a h i r ok u r a k a k e 。t o s h i a k ik o m a k i 【翘研究了来自曲霉的甘露聚糖酶，该酶用咖啡渣 及麦肤培养，其最高酶活出现在8 0 c ，而甘露糖苷酶的最高酶活也出现在7 0 c 左右，他们提纯 了这两个酶，并发现其有转糖苷作用 2 0 0 2 年md m o n t i e l 。札h c m d c ”协专门研究了链霉菌c b c t 一3 3 4 1 产b 一甘露聚糖酶在 纸浆生物漂白方面的特性，指出其最佳反应p h 为4 0 最适反应温度在5 5 c ，在m n 2 存在是酶 活大大提高 1 2 2 国内的研究进展 胃内对于b 甘露聚藉酶的研究开始于7 0 年代末，主要集中在枯草芽孢轩菌、地衣芽孢杆 菌、嗜碱芽孢杆菌、黑曲霉和诺卡氏苗形放线菌等产酶菌株的研究上肚l 捌1 内容主要包括菌株 的筛选发酵条件优化。产酶进程研究，8 一甘露聚糖酶的分离纯化和性质研究，以及菌株的复 4 中田农业太学硕士论文第一章绪论 台诱变等。 1 9 9 5 年杨文博【9 】等对产b 一甘露聚糖酶地表芽孢杆菌进行了分离筛选并对发酵条件进行了 优化结果表明以魔芋粉为碳源的发酵产酶效果最好。 1 9 9 8 年田亚平、金其荣【1 4 研究了募曲霉8 一甘露聚糖酶的酶学性质及其化学组成。 1 9 9 9 年崔福绵等f 1 “搬道了枯草芽孢杆菌中性b 一甘露聚糖酶的产生和性质，该酶在中性p h 下最高酶活达到9 6 u m 1 同年杨清香等也对嗜碱芽孢杆菌n t r 3 3 产b 一甘嚣聚糖酶的特性进行 了报道，其产酶最佳碳源为1 槐豆胶。 2 0 0 0 年吴襟、何秉旺【”l 发表了诺卡氏菌形放线菌1 3 一甘露聚糖酶的纯化和性质研究的论文， 经硫酸铵沉淀、9 5 乙醇沉淀、c m - s c p h a d e xa s 0 柱层析、羟基磷灰石柱层析、d e a e - 纤维素离 子交换及s e p h a d c xg 1 0 0 分子凝胶过滤柱等b 一甘露聚糖酶的比活提高了1 3 7 倍 2 0 0 2 年余红英杨幼慧。扬跃生，吴序栎雷红涛l 对枯草芽孢杆菌1 3 一甘露聚糖酶补料 发酵及其特性进行了研究，采用正交实验设计对枯草芽孢杆菌产b 甘露聚糖酶的培养基组成和 培养条件进行优化，在此基础上进行摇瓶补料发酵，酶活达2 2 3 4 7 u ml ，较未补料的酶活提高了 3 2 9 0 酶反应的量适p h 为6 5 ，最适温度为7 0 0 ；该酶在ph 50 1 00 和7 0 以下稳定水解 魔芋胶产物主要为二糖以上低聚糖 2 0 0 3 年孙远明，王炜军，杨幼慧，杨跃生【2 1 】等研究了双水相萃取直接从枯草芽孢杆菌发酵液 中提取b 一甘露聚塘酶的方法，指出聚乙二醇口e ( 湃均相对分子质量、p e g 浓度、( i 吼h s o , 浓度、n a c l 浓度对甘露聚籍酶和总蛋白分配系数、相体积比和对萃取率的影响实验表明p e g 1 0 0 02 0 ( m m ) 和( n h 4 ) z s 0 4l s 杈m m ) tn a c i 为2 ( w w ) 组成的双水相体系，室温下直接对含菌体 的枯草芽孢杆菌发酵液抽提0 甘露聚糖酶，可纯化2 7 6 倍蓐取率达粥7 9 1 2 3 不同来源甘露聚糖酶主要性质比较 甘露聚糖酶的来源广泛，且因其来源不同而使其性质有很多差异，以下的三个表格分别 为细菌来源、真蔼来源和植物来源的甘露聚糖酶酶的部分性质比较 5 中田农业大学硕士论文第一章绪论 表1 - 1 细菌产生的t b 一甘露聚糖酶性质 来源分子量最适最适温度 p h温度等电点抑制剂 ( 些2世 旦2叠定性瑟定性 a l k a l o p h i l i c 5 19 07 01 04 04 3 a g b a c i l l u ss p3 81 0 08 - 1 1 5 52 5 h 矿 m 1 6 - 5 ) a l k a l o p h i l i c b a c i l l u ss p ( ：a v l - 0 0 1 ) b a c i l l u s s u b t i l i s ( k - 5 0 ) 4 b a c h l u s s u b a l i sn m 3 9 b a c i l l u ss u b a l i sd ( 1 b a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s ( n k - 2 7 ) 3 4 7 5 8 5 9 4 2 2 2 3 7 9 3 8 3 7 2 6 1 0 0 9 06 0 6 0 5 o 5 0 5 0 6 0 9 0 4 0 1 0 5 9 8 9 8 - 9 5 - 9 5 5 - 6 4 9 - 9 0 5 0 - 8 o 6 06 0 - 9 0 7 07 0 5 1 0 0 1 6 2 5 67 0 h b r oa p m a - 1 3 8 4 9 h b r o s p m a - 1 3 9 a m e r o m o n a s h y r o p h a ( f - 2 5 1 4 ) 6 5 7 0 - 7 5 7 5 4 05 5 1 0 0 4 0 5 0 5 0 5 5 5 0 5 5 2 5 5 9 5 7 5 1 5 2 5 1 4 8 5 0 5 1 - 5 5 4 0 5 0 m n 2 + 3 8 幢 h 矿 l 矿 p b 2 + 6 蜡妒舻 硝妒驴 妒一 中周农业大学硕士论文第一章绪论 表1 - 2 真菌产生的b 一甘露聚糖酶性质 来源分子量最适 最适温度p h温度等电点 i k 旦2b h旦2稳定性稳定性 a s o e r g i l l u sn i g e r i a s o e r g i l l u sn i g e r i a s o e r g i l l us a c u l e a t u s t r i c h o d e r m ar e e s e i ( q m 9 4 1 4 ) t r i c h o d e r m ar e e s e i ( r o t r rc - 3 0 ) t r i c h o d e r m a h a r z a n u m ( f 5 8 ) t r i c h o d e r m a c u t a n e u m o c m 2 9 4 7 ) 刀t 出v i at e r r e s t r i s s p o r o t r i c h u n c e u u l o p h i l u m 4 | 6 3 8 6 0 6 0 4 1 z 5 - 75 5 5 8 6 53 2 - 7 4 5 4 6 5 4 5 2 4 9 94 - 6 55 0 4 5 - 7 5 4 5 6 5 5 2 3 0 5 5 8 9 6 2 4 5 5 5 5 0 5 5 5 5 7 0 7 0 7 5 7 5 6 0 s c l e r o t i u mr o l f s i l 4 1 93 07 04 5 4 03 2 ! ：2 3 ：q 歪 3 ：5 7 粥 1 8 巧 帖 如 枷 如 如 诌 舄 酊 钙 n 弱 稻 凇 中国农业大学硕士论文 第一章绪论 表1 - 3 植物产生的b 一甘露聚糖酶性质 来源 分子量最适最适温度 p h 温度等电点 ( 逝2醴( 篁蕴定性 稳定性 魔芋 5 3加 4 - 8 ，6o - 4 0 莴苣 4 6 4 | 7 5 - 4 9 西红柿 4 34 8 6 59 3 百台球 3 34 4 5 4 0 2 5 - 6 0 2 0 - 5 0 紫花苜蓿种子 4 14 54 04 - 8 1 3 本课题研究的内容和目标 1 3 1 进行菌株的产酶发酵条件的优化 对筛选到的菌株进行发酵条件的优化，包括碳氮源，初始p h ，培养温度等条件得到优化， 从而得到该菌株的最佳发酵产酶培养基，使其酶活达到一个较高的水平。 1 3 2 纯化菌株所产的甘露聚糖酶 运用硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析等常规分离纯化方法对该菌株所产的甘露聚 糖酶进行分离纯化并最终得到s d s p a g e 电泳所确认的电泳纯纯酶 1 3 3 研究纯酶的性质 在得到电泳纯纯酶之后，对纯酶的反应最适温度、温度稳定性、最适p h 、p h 稳定性、底物 特异性及水解特性进行研究 8 中圈农业大学硕士论文第- - - t 枯草芽孢杆菌w y 4 5 产量一甘露聚糖醇发酵条件研究 第二章枯草芽孢杆菌w y 4 5 产b 一甘露聚糖酶 发酵条件研究 2 1 引言 在b 一甘露聚糖酶发酵的研究主要集中在黑曲霉( a s p e r g i u u s ) 和芽孢杆菌( b a c i l l u s ) ，而 芽孢杆菌中研究最多的是枯草芽孢杆菌( b a c i l l u s s u b t i l i s ) 、地衣芽孢杆菌( b a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s ) 和嗜碱芽孢杆菌( a l k a l o p h i l i cb a c i l l u ss p ) 三种其中以又以枯草芽孢杆菌的发酵产酶酶活最 高，但目前所见报道中其活力最大值也仅为3 3 4 6 u m 1 由于b 一甘露聚塘酶活力水平普遍较低， 限制了b 一甘露聚糖酶在实际生产中的应用发酵条件既影响菌体的生长繁殖也影响酶的形 成提高酶产量的最直接的办法就是对培养基以及培养条件进行优化。对于胞外酶来说，选择 适宜的碳源既可以提高6 - - 甘露聚糖酶的产量，也可以定向地促进b - - 甘露聚糖酶的合成本 章主要从碳源、氮源、碳氮比、初始p h 、培养温度等方面对芽孢杆菌w y 4 5 的发酵产酶条件 进行了优化。 2 2 材料与方法 2 2 1 菌株 菌株w y 4 5 为本实验室从土壤样品中筛选出来的枯草芽孢杆菌c 8 口c 讲ws u b t i l i s ) 2 2 2 主要仪器设备 l r h - 2 5 0 a 恒温恒湿培养箱广东医疗器械厂 h 0 u 0 0 a 冷冻摇床中科院武汉科学仪器厂 m i n i 电泳仪及稳压电源 b i o - r a d r u 1 8 0 0 p c 紫外可见光光度计北京普析通用 t o l f d 0 3 2 0 型p n 计 m e t t l e r g l , - 2 0 b 冷冻离心机上海安亭科学仪器厂 光学显微镜z c i s sa x i o s k o p2 0 g e r m a n y 2 2 3 主要试剂 槐豆胶( s i g m a ) ，酵母提取物( 0 x c i d ) 。牛肉蛋白胨( 奥星公司) ，魔芋精粉( 四川魔芋粉 厂) ，魔芋普通粉( 四川魔芋粉厂) ，琼脂粉( 奥星公司) ，其他试剂均为国产分析纯 9 中臣农业大学硕士论文第二章枯草芽孢杆菌w y 4 5 产1 3 一甘露聚糖酶发酵条件研究 2 2 4 实验方法 2 2 4 1 发酵产酶条件 2 2 a 1 1 平板培养基( ) 槐豆胶0 5 牛肉蛋白胨0 2 ，酵母提取物0 2 ，k h 2 p o o 1 m g s 0 4 7 h 2 00 0 2 5 ，琼脂 粉1 5 ，1 2 1 杀菌2 0 r a i n 2 2 4 1 2 发酵产酶培养基( ) 槐豆胶1 5 ，牛肉蛋白胨0 8 。酵母提取物0 4 ，k h 2 p o t0 1 ，m g s o t 7 h 2 0 0 0 2 5 ，1 2 1 杀菌2 0 r a i n 。 2 2 4 1 3 摇瓶培养条件 2 5 0 m l 三角瓶中装4 0 m l 发酵培养基接入l c m 2 的平板培养基上生长3 天的菌体，在5 0 恒温空气浴往复式摇床上以2 0 0 r m i n 的速度振荡培养。 2 2 4 2 发酵产酶条件的优化实验 2 2 4 2 1 不同碳源对菌株产酶的影响 在发酵产酶培养基的基础上，上述培养条件下，改变碳源种类，浓度1 5 0 a ，考察碳源对产 酶的影响碳源包括单糖和多糖( 槐豆胶、魔芋精粉、魔芋普通粉、花芋粉、瓜儿豆胶、脱脂 椰粉、沙蒿粉、可溶性淀粉、马铃薯淀粉、葡萄糖、甘露单糖) 共1 1 种 2 2 4 2 2 不同碳源浓度对菌株产酶的影响 最佳碳源确定后用其作为唯一碳源并改变其浓度( 1 - - 5 。每o 5 为一个梯度，若9 个梯度) 考察不同碳源浓度对产酶的影响。 2 2 4 2 3 不同氮源对菌株产酶的影响 上述两条件确定后，用不同的有机氮源或无机氮源作为唯一氨源浓度1 ，来考察氨源对 产酶的影响，共选用千酪素、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉蛋白胨、酵母提取物、麦芽提取物、 ( n h , h h p 0 4 、n h 4 h 2e 0 4 、( n h , ) 2 s 0 4 、k n 0 3 、n h 4 c i 、尿素等1 2 种氮源。并调节所有培养基 初始p h 与对照发酵产酶培养基相同 2 2 4 2 4 不同碳氮比对菌株产酶的影响 确定最佳碳源、最佳碳源浓度以及最佳氮源后改变氮源相对于碳源的添加量以考察碳氮比 对产酶的影响，选择l ：l 、2 ：l 、3 ：1 、4 ：1 、5 ：1 、6 ：l 共6 个比例梯度 2 2 4 2 _ q 培养基初始p h 值对菌株产酶的影响 在优化碳氮源的基础上以0 1 m o l 1 的柠檬酸n a 0 h 溶液调节培养基初始p h 值梯度为3 5 、 1 0 中田农业大学硕士论文第二章枯草芽孢杆蕾w y 4 5 产b 一甘露聚糖酶发酵条件研究 4 0 、4 5 、5 0 、5 5 、6 0 、6 5 、7 0 、7 5 、8 0 。 2 2 4 2 6 不同培养温度对菌株产酶的影响 在上述所有培养基条件确定之后，采用不同的温度( 3 0 一5 5 ) 发酵培养菌株，考察温度 对产酶的影响。 2 2 4 3b 一甘露聚糖酶活力测定( d n s 法) f 矧 发酵液在1 0 0 0 0 9 离心力条件下离心1 0 m i n ，取上清液为粗酶液。 在o 9 m l0 5 ( w v ) 槐豆胶底物中( p h 6 5 ，0 0 5 m o f l 的磷酸缓冲液配制) 加入适当稀 释的酶液0 1 m l 。6 0 水浴中准确反应1 0 m i n ，用d n s 试剂测定产生的还原糖量 酶活力定义为：上述反应条件下，每分钟释放出1pm o l 相当于d 甘露糖的还原糖所需要 的酶量为1 个酶活力单位 2 2 4 4 蛋白质含量测定 3 4 1 l o w r y 法，以牛血清蛋白为标准。 2 2 4 5 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 与酶谱分析 s d s p a g e 按照l a e m m l i 3 5 l 的方法进行。分离胶1 2 5 ，浓缩胶4 5 ，考马斯亮兰染色显 示蛋白带，低分子量标准蛋白与样品在同一条件下进行电泳。非变性状态下酶谱分析： n a t i v e - p a g e7 y 法n _ k ，在样品与分离胶中不加s d s 和巯基乙醇。电泳后按b e g u i m 方法【”l 活 性染色定位活性带低分子量标准蛋白( a m e r s h a m ) ：r a b b i tp h o s p h o r y l a s eb ，9 7 k d a ：b o v i n e s e r u ma l b u m i n ，6 6 k d a ：o v a l b u m i n ，4 5 k d a ：c a r b o n i ca n h y d r a s e 3 0 k d a ；t r y p s i ni n h i b i t o r 2 0 1 k d a ：l a c t a l b u m i n ，1 4 4 k d a 。 2 3 结果与讨论 2 3 1 不同碳源对酶活力的影响 不同碳源对酶活力的影响见表2 - 1 。从结果看魔芋精粉的诱导产酶能力最高，酶活最高 可达1 1 5 6u m l ，比以槐豆胶为碳源的酶活高出5 倍以上普通魔芋粉和花芋粉的产酶趋势与魔 芋精粉非常相似，但最高单位酶活要低3 0 0 - - 5 0 0u 左右槐豆胶和脱脂椰粉也可诱导该菌产酶， 但酶活低于5 0 0u 其他碳源基本没有诱导产酶作用，甘露单糖和对于菌株的发酵产酶甚至起到 了抑制的作用 培养基中魔芋精粉的浓度对产酶量都有很大的影响如图2 1 所示。4 的魔芋精粉浓度下 酶活最高，最高酶活值为1 5 3 0u m l 。 中田农业大学硕士论文第二章枯草芽孢杆菌w y 4 5 产b 一甘露聚糖酶发酵条件研究 1 3 - - 甘露聚糖酶属于诱导酶，在嘈碱芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、黑曲霉等菌株等的发酵优化 中都有魔芋粉是最优的诱导产酶底物的报道，与本实验的结果相一致可见魔芋精粉和魔芋普 通粉是一种在产8 - - 甘露聚糖酶菌株液体发酵中普遍最佳的碳源在取发酵液测酶活力的同时 在显微镜下观察其菌株生长情况，发现魔芋精耢培养的发酵液中菌体密度在所选碳源中最大， 这说明魔芋精粉不仅是b 一甘露聚糖酶的极好的诱导物，同时还是菌株赖以生长的优良碳源。 较高的碳源浓度有利于菌株的生长，也使产酶的稳定性增加，但浓度过高时，培养基过于粘稠 甚至成凝胶状，使得透气性下降导致供氧不足而抑制了菌株的生长和产酶。 表2 - 1 不同碳源对w y 4 5 产b 一甘露聚糖酶的影响 t a b2 i e f f e c to f c a r b o n8 0 u r s0 1 1b m a n a n n a s ep r o d u c t i o n 毯遂酸擂左i g 纽i ) 槐豆胶2 0 4 魔芋精粉1 1 5 6 魔芋普通粉9 1 6 花芋粉6 5 1 脱脂椰粉3 5 7 瓜儿豆胶 4 8 沙蒿粉3 2 马铃薯淀粉 3 4 葡萄糖3 3 苴叠皇接3 2 0 0 0 ：1 5 0 0 01 0 0 0 藿5 0 0 o i1 522 533 54 4 55 魔芋粉浓度( 争) 图2 - 1 魔芋赣浓度对发酵产爵的影响 f 嘧- 2 - ie f f e c t o f c a r b o ns o u r c cc o n c e n h a t i o n 0 1 1b - r r m n a n n a s e p r o d u c t i o n 1 2 中田农业大学硕士论文第二章枯草芽孢杆菌w y 4 5 产b 一甘露聚糖酶发酵条件研究 2 3 2 不同氮源和碳氮比对酶活力的影响 不同氮源对于产酶的影响很大结果如表2 2 所示，5 种有机氮源培养的菌株产酶的酶活 高，且稳定，效果明显优于所有的无机氮源而大豆蛋白胨和牛内蛋白胨又明显优于其他的有 机氨源。以大豆蛋白胨为氨源发酵酶活较牛肉蛋白胨高约1 5 0u 左右。 表2 - 2 不同氰源对w y 4 产b 一甘露聚糖酶的影响 t a b 2 - 2 e f f e c t o f e f f e c t o f n i t r o g e ns o u r o o i lb - m a l l n s s c p r o d u c t i o n 氢遂 醒适盘g 纽1 2 干酪素1 2 1 1 大豆蛋白胨2 3 4 5 胰蛋白胨1 0 3 4 牛肉蛋白胨2 1 8 8 酵母提取物1 5 1 1 麦芽提取物1 6 删凰) m p o 7 6 n v x 4 h 2p 0 4 7 ( n i - h h s o 8 3 k n 0 3 4 7 n i 玉c 1 2 5 7 基蠢! g 碳氮比也是影响发酵过程的一个重要因素氨源过多。会使菌体生长过于旺盛。不利于代 谢产物的积累：氮源不足。菌体繁殖量少也影响酶的产量碳氮比优化结果如图2 - 2 所示 碳氨比在4 ：l 时矗适于产酶，较大的碳氮比有利与萤株的快速生长产酶，可以明显使产酶时间 提前2 4 h 以上；但过高的氮源浓度会抑制酶蛋白的产生，大于5 ：1 的碳氮比不仅浪费氮源而且 也降低了酶的合成分泌量 中国农业大学硕士论文 第二章枯草芽孢杆蔫w y 4 5 产1 3 一甘露聚糖酶发酵条件研究 3 0 0 0 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0 3 、14 l5 、 磺氰比 图2 - 2 碳氮比对发酵产酶的影响 f i g 2 - 2 e f f e c to f t h er a t i oo f c a r b o ns o u r t on i t r o g e ns o u r c eo nb - m a n a n n a s ep r o d u a i o n 氮源是构成细胞原生质和酶蛋白的主要原料，在微生物生长过程中，含有有机氮源的培养基 常表现菌株生长旺盛的特点，而无机氮源利用较快，可用作速效性氮源菌体生产过程中。有 机氮源的利用使培养基的p h 有所升高，但并没有影响酶的合成和分泌，而无机氮源中的铵盐 棱分解利用后，培养基的p h 下降，酶的合成分泌量明显下降。芽孢杆菌的发酵优化中有机 氮源几乎都优于无机氮源