（食品科学专业论文）低乳糖牛奶生产工艺及乳糖水解率测定方法的研究.pdf

摘要 摘要 r 利用乳糖酶对牛奶中的乳糖进行水解可以解决乳糖不耐受的问题，同时，水解牛 奶瞰普通牛奶更具优点：改善口味、提高营养价值。因此对牛奶中的乳糖进行水解具 有非常重要的意义。低乳糖牛奶具有广泛的市场前景。 本文针对乳糖酶缺乏者的乳糖不耐受现象等问题，原统的研究了如何生产乳糖水解 率为6 0 以上的低乳糖牛奶。通过3 8 ( 3 、2 0 ( 2 、6 不同水解温度，0 5 9 k g 、0 8g k g 、 1 o g k g 、1 5 9 k g 不同乳糖酶添加量，不同作用时间等因素的单因素试验，确定了实验 室制做低乳糖牛奶的工艺参数。并运用碘量法、冰点下降法、高效液相色谱法、酶催法 四种方法对同一低乳糖牛奶样品的水解率进行了测定，对不同方法进行了对比分析。同 时，对低乳糖牛奶进行了中试试验，确定了实际生产工艺参数。 试验结果表明：水解温度为3 8 ( 3 ，酶添加量为0 8 9 k g ，水解3 个小时可以获得水 解率为6 0 以上的产品，并且产品的酸度及微生物指标符合标准；2 0 c 的水解温度不适 合生产使用，因为微生物污染严重；水解温度6 c ，酶添加量为1o g k g ，水解时间为2 0 小时可以获得水解率为6 0 以上的产品，其酸度及微生物指标令人满意。 对同一样品运用碘量法、冰点下降法、高效液相色谱法、酶催法进行乳糖水解率的 测定，测得水解率分别为6 3 ，2 、6 2 、6 1 、6 1 8 。建议各单位根据实际情况，依据 下列先后顺序选择测定低乳糖牛奶的乳糖水解率方法：高效液相色谱法、酶催法、碘量 法、冰点下降法，并且尽量不采用最后一种方法。对于企业首先建议使用酶催法。 对低乳糖牛奶进行中试生产，确定的工艺参数为：水解温度为3 8 。c ，添加乳糖酶量 为0 8 9 k g ，水解3 个小时；或水解温度为i o c ，添j n s l 糖酶量为1 o g k g ，水解2 2 个 小时。同时提出了在生产低乳糖牛奶的过程中应注意的问题及解决措施。 关键词：低乳糖牛奶乳糖酶乳糖水解 奎蜚奎些盔堂霉耋；i 墼笙耋，：，一! ! ! ! ! ! ! ! 一 a b s t r a c t h y d r o l y s i n gl a c t o s eo fm i l k w i t ht h el a c t a s ec a ns l o v et h ep r o b l e mo fl a c t o s ei n t o l e r a n c e a tt h es a m et i m e ，h y d r o l y s e dm i l kh a sm o r ea d v a n t a g e st h a nc o m m o nm i l k ，l i k et a s t e dw e l l a n dn u t r i t i o ni m p r o v e d s o ，h y d r o l y s i n gl a c t o s eo f m i l kh a sg r e a ts i g n i f i c a n c e t h el o w - l a c t o s e m i l kh a sl a r g e rm a r k e t a i m m i n ga tt h ep r o b l e mo fl a c t o s ei n t o l e r a n c e ，t h i st e x ts t u d i e dh o wt op r o d u c et h e l o w - l a c t o s em i l kw h i c hl a c t o s eh y d r o l y t i cp e r c e n t a g eb e y o n d6 0 t h r o u g ht h es i n g l ef a c t o r e x p e r i m e n to fd i f f e r e n th y d r o l y s i n gt e m p e r a t u r e 3 8 ( 2 ，2 0 c ，6 c ，d i f f e r e n tq u a n t i t yo f l a c t a s e 0 5 9 k g ，0 8 9 k g ，】0 9 k g , 1 5 9 k g ，a n dd i 彘r e n tf u n c t i o no ft h et i m e ，d e f i n e dt h ep r o d u c t i o n c r a f tp a r a m e t e ro ft h el o w - l a c t o s em i l k a n dd e t e r m i n e dt h eh d r o l y t i cp e r c e n t a g eo ft h es a m e l o w 1 a c t o s em i l ks a m p l ep r o d u c t i o n ，i nw h i c hf o h i m e t h o d sw e r eu s e d ，i o d i m e t r ym e t h o d ， f r e e z i n gp o i n td e c e n tm e t h o d ，h p l ca n de n z y m i cm e t h o d t h o u l g ha n a l y s e dt h ed i f i e r e n t m e t h o d s ，p o i n t i n go u ti t sc h a r a c t e r i s t i c s a tt h es a m et i m e ，t h ep r o d u c t i o nc r a f tp a r a m e t e rw a s d e f i n e du s i n gt h em e t h o d o f m i d - e x p e r i m e n t t h ee x p e r i m e n tr e s u l tm a d ec l e a rt h a tw h e nt h eh y d r o l y s i n gt e m p e r a t u r ei s 3 8 c ，t h e q u a n t i t yo ft h el a c t a s e i s08 9 k g ，a n df u n c t i o nt i m ei s3h o u r sc a r lp r o d u c em i l kw i t h6 0 l a c t o s eh y d r o l y t i c p e r c e n t a g e ，a n dt h ea c i d i t y a n dm i c r o o r g a n i s mo ft h em i l ka r e u pt o s t a n d a r d t h eh y d r o l y s i n gt e m p e r a t u r eo f2 0 cc a nn o tb eu s e d b e c a u s et h em i c r o o r g a n i s m w a sp o l l u t e d s e v e r e l y t h eh y d r o l y s i n gt e m p e r a t u r ei s 6 t h e q u a n t i t yo ft h e 1 a c t a s ei s 1 o g k ga n df u n c t i o nt i m ei s2 0h o u r sc a na l s op r o d u c em i l kw i t ht h eh y d r o l y t i cp e r c e n t a g e b e y o n d6 0 a n d t h el e v e lo f t b e a c i d i t ya n dm i c r o o r g a n i s ma r es a t i s t i e d t ot h es a m e s a m p l ep r o d u c t i o n ，u s i n g t h ei o d i m t r ym e t h o d ，f r e e z i n g p o i n td e c e n tm e t h o d ， h p l ca n de n z y m i cm e t h o d ，t h ed i f i n e dh y d r o l y t i cp e r c e n t a g ei s 6 3 2 ，6 2 ，6 1 ，6 1 8 s e p a r a t e d l y t h et e s tr e s u l ts u g g e s tt h a te v e r yu n i tt a k eo n e so v c f l sa c c o r d i n gt oi t sa c t u a lb y t h eo r d e rb e l o w h p l c ，e n z y m i cm e t h o d ，i o d i m e t r ym e t h o da n df r e e z i n gp o i n td e c e n tm e t h o d ， a n dd on o ta d o p tt h el a s tm e t h o da sf a ra sp o s s i b l e e n z y m i cm e t h o di sf i r s ts u g g e s t e dt o i n t e r p r i s e t h ed e f i n e dp r o d u c t i o nc r a f tp a r a m e t e rf o rh y d r o l y s i n gt e m p e r a t u r e q u a n t i t yo ft h e l a c t a s ea n df u n c t i o nt i m eo ft h el o w l a c t o s em i l kf o rm i d - e x p e d m e n tw a s3 8 c ，0 8 9 k g ，3 s e p a r a t e d l ya n d6 c 1 o g k g , 2 2s e p a r a t e d l y t h ep r o b l e mw h i c hs h o u l dt ob en o t i c ea n dt h e s o l v em e t h o d s r e l a t i v e l yw e r eb r i n gf o r w a r di nt h i st e x t m a s t e rc a n d i d a t e ：h u iw a n g m a j o r ：f o o ds c i e n c e s u p e r v i s o r ：l a n w e iz h a n g k e y w o r d s ：l o w l a c t o s em i l kl a c t a s e h y d r o l y s i so f t h el a c t o s ep i l o t - u 1 前言 1 1 研究目的和意义 随着中国经济迅速发展，人们对食品的要求越来越高，要求食品是营养的、卫生的、 保健的、符合中国国情的。其中，乳制品最具代表性，牛奶愈来愈受到国人的重视，被 誉为“白色血液”、“接近完善的食品”、“人类最完美的食物”。世界卫生组织把人均乳品 消费量列为衡量一个国家人民生活水平的主要指标。 牛奶，营养价值非常丰富，含有人体生长发育和新陈代谢所必需的全部营养物质， 而且消化率、吸收率非常高。据测定，如果每人每天饮用1 l 牛奶，就可以满足人体对 脂肪、维生素b 2 的需要，以及除铁、铜、锰之外所有矿物质包括钙、磷等的全部需要( 见 表1 1 、1 - 2 ) 。这是其它任何一种食物都无法比拟的，牛奶以其独特的优秀品质，堪称人 类最完美的食物( 骆承庠1 9 9 9 ：王大勇，2 0 0 0 ) 。 表1 - 1 牛奶的营养价值 t a b l e l 一ln u t r i t i o n a lv a l u eo f t h em i l k 东北农业大学硕士学位论文 表1 - 2 每升牛奶中必需氨基酸含量 t a b l e l 2t h ec o n t a i no f n e c e s s a r ya m i n oa c i de v e r yl i t e rm i l k 牛奶是人类所需天然食品中，营养最平衡并且能迅速补充体弱者的体力与营养的一 种天然食品，但有人喝了牛奶以后，很快会出现腹胀、腹痛、腹泻等症状，因此产生“恐 奶症”，对牛奶敬而远之，“望奶兴叹”，不敢再喝牛奶。 牛奶中的糖类物质有很多，其中9 9 8 是乳糖( 汪玉松，1 9 9 5 ) ，乳糖是由半乳糖和 葡萄糖构成的双糖，在牛奶中的含量约为4 8 ，在体内不易被消化和吸收，引发乳糖不 耐受现象，所谓的乳糖不耐受现象( 何梅，1 9 9 9 ) ，是指由于乳糖在水中的溶解度较差， 在人体的肠腔中又不能被直接吸收。必须先经过乳糖酶水解，否则会形成腹胀、腹鸣、 排气增多、腹泻、腹痛等症状。乳糖酶缺乏( s a v a i a n o ，1 9 8 7 ) ，是指小肠刷状缘绒毛 膜细胞的膜结合酶即乳糖酶活性低下，乳糖酶缺乏可分为三类： 1 先天性乳糖酶缺乏是指自出生时机体乳糖酶活性即低下或缺乏，是机体常染色体 上隐性基因所致，这一类型很少见。 2 继发性乳糖酶缺乏( w h o ，1 9 9 5 ) ，是指由于各种原因致使小肠上皮损伤而导致的 暂时性乳糖酶活性低下，常见病因如：感染性腹泻、局限性回肠炎、乳糜泻、免疫球蛋 白缺乏症、营养不良等疾病，多数机体疾病康复后恢复正常。 3 原发性乳糖酶缺乏( 又称成人型乳糖酶缺乏) 是由于乳糖酶活性随年龄逐渐降低 而引起，无其它疾病影响，是最常见的一种，发生时间因种族和地区不同而不同，婴儿 断乳后开始发生，有的2 0 岁左右时才开始出现( b h k l a ，1 9 7 5 ) 。3 1 3 岁中国儿童乳糖 酶缺乏发生率为8 7 啊杨月欣，1 9 9 9 ) 。 乳糖酶缺乏是正常现象，一般认为与世代形成的饮食习惯不同所造成的遗传基因突 2 交有关( 钟燕，2 0 0 0 ) ，人们对乳糖不耐受的基础研究目前己取得了一定的进展，其与人 类的关系也越来越受到人们的重视，乳糖酶缺乏者中有5 0 左右的人存在乳糖不耐受症 状。1 9 6 3 年首次报道的成人乳糖酶缺乏，影响了世界的1 ，3 至1 2 人( j o r g e ，1 9 9 9 ) 。 乳糖酶缺乏发生率随不同国家、不同种族人群的变化而变化( f e m a n d e s ，1 9 9 2 ) 。 调查表明白种人是5 一10 ，黑种人是7 0 8 0 ，我国汉族成人为7 5 - - 9 2 ( f e r g u s o n ，1 9 9 1 ) 。实验证实，英国白种人和非白种人，l d ( 乳糖酶缺乏) 和l 工( 乳糖 不耐受) 的发生率为4 7 和7 5 ；据报道，日本儿童中从3 岁起，l i 的发生率增加，4 岁开始，l i 的发生率急剧增加( n o s e ，1 9 7 9 ) 。随着人的生长发育，体内乳糖酶活性呈 规律性衰减，结果造成乳糖吸收障碍，这是一个普遍的世界性的问题( s u l l i v a n ，1 9 9 8 ) 。 看下表1 - 3 ： 表1 3 世界范围内乳糖消化不良的流行区域及发生率 t a h i e i 3t h ea r e aa n dr a t eo f l a c t o s ei n t o l e r a n c ei nt h ew o r l d 由表1 3 中可以看出，所有不同地区的人均存在不同程度的乳糖酶活性低下。一般 说来，大部分人从断奶期到5 岁左右期间，乳糖酶的活性呈下降趋势。只有白种人和非 洲的一些有养牛习惯的部落世代有饮食牛奶的历史，在断奶期后，乳糖酶的活性仍然旺 盛，这种现象应该是世代遗传的结果。 亚洲人的乳糖不耐受情况十分严重，我国乳糖不耐发生率极高，中国预防医学院与 食品卫生研究所调查发现，东方人中有乳糖不耐症的人较多，3 5 岁时为2 2 1 ，7 8 岁时为3 9 ，1 l 一1 3 岁时为3 6 8 ，成年人更多。根据我国上海地区汉族成年居民调查， 乳糖吸收不良者占8 0 ( 吕晓华，2 0 0 2 ) 。这一情况直接影响了牛奶的生产和消费。颜 纪贤等( 1 9 8 7 ) 从北京、上海、广州和哈尔滨四大城市从3 一1 3 岁儿童中随机抽样，调查了 中国儿童l d 和l 工的发生率，结果表明，3 5 岁，7 8 岁和1 1 1 3 岁组儿童中，l d 的发 生率分别为3 8 5 、8 7 6 和8 7 8 ，l i 的发生率分别为各1 2 2 、3 2 2 、2 9 0 ，该研 究证明我国8 7 的儿童乳糖酶活性下降的年龄在7 - 8 岁。有人用氢呼气试验测定健康成 东北农业大学硕士学位论文 人乳糖吸收不良发生率为9 2 ( 肖玉桦，1 9 9 9 ) ；聂少萍等人对广东青少年进行调查，l i 发生率很高( 聂少萍，2 0 0 2 ) 。 乳糖酶缺乏引发的乳糖消化不良会产生许多不良后果。全脂牛奶中约3 0 的热量和 脱脂牛奶中6 0 的热量是由乳糖提供的，对于乳糖不耐症患者，无法充分利用这种能量， 旦身体的能量需要不能得到满足，蛋白质就被用于满足能量需要，而不能作为构成人 体蛋白的单元：对于不能吸收的乳糖，会被肠道微生物作为碳水化合物进行发酵而产酸 产气，从而导致胃肠失调：由于乳糖吸收不良，还会影响到对牛乳中矿物质尤其是钙的 吸收( b e r n a r d ，1 9 8 3 ) ，因为乳糖区别于其它糖，它是矿物质的载体，可促进矿物质的吸 收，因此t 假如乳糖不被吸收，将导致乳糖被排放到大肠无法利用，那么有乳糖吸收障 碍的人将会发生矿物质和钙质丢失的症状，这与小儿佝偻病和成年人的骨质疏松症都有 关系( d a v i d s o n ，1 9 8 4 ；m a u l e n ，1 9 9 4 ) 。另外调查结果还显示，乳糖酶缺乏患者比正常 情况的人的骨胳结构差，更为严重的是，因体内缺乏乳糖酶，使乳糖无法水解成单糖即 葡萄糖和半乳糖而被吸收利用，半乳糖能促进脑苷糖和粘多糖的合成，可能影响到幼儿 的智力发育。乳糖吸收障碍不仅伴有乳糖不耐的征兆，还伴有食欲下降，导致饮食量减 少。腹泻也导致一定数量己被消化食物的丧失，这些本能够被消化的食物没有被吸收( 包 括有价值的蛋白、维生索、矿物质和一些牛奶中的糖类) ，使得牛奶的利用率极低，也浪 费了牛奶这种宝贵的饮食资源。 乳糖被水解后，生成易被人体吸收的葡萄糖和半乳糖，其中部分葡萄糖又会转化成 果糖，而半乳糖在乳糖酶作用下会合成约6 8 的低聚半乳糖。葡萄糖是人体各器官代 谢的能量来源，半乳糖是人体大脑和粘膜组织的结构成分，果糖可赋予产品更高的甜度 和更佳的风味，低聚半乳糖则能够促进肠道有益菌群的繁殖，剩余的乳糖就可发挥如前 所述的营养与保健作用。有人报道过：饮奶同时进食食物可以使乳糖吸收不良情况降低 4 7 ( n o e l ，1 9 8 5 ) 。也有人考虑用物理方法将乳糖除去，但是，维生素和矿物质将一 起被除去，并不可取，利用乳糖酶对牛奶中的乳糖进行水解是最佳的办法。 利用乳糖酶对牛奶中的乳糖进行水解，可以解决乳糖不耐受的问题，因此，对牛奶 中的乳糖进行水解具有非常重要的意义： 1 为营养失调的儿童和体弱的病人提供高质量的蛋白质和特别的糖原。 2 可为乳糖不耐人群解除不能消费牛奶的痛苦。 3 可普遍提高人们对奶制品中多种蛋白质、维生素、矿物质及糖类的吸收、促进肠 道中有益菌群的生长、繁殖。 4 牛奶水解后，奶香味增加，甜度比原来增加近3 4 倍，甜度相当于蔗糖的0 8 倍，明显改善口味，增加滋味；提高了牛奶的营养价值( n i j p e s ，1 9 8 1 ) 。 5 用水解乳制作酸奶，其凝乳时间、产酸速度均比普通乳快，并且组织状态、口味 等与普通奶做的酸奶相比无差异。( 陈小真，1 9 9 8 ) 1 2 低乳糖牛奶市场前景及工业化生产现状 目前乳制品市场中解决乳糖不耐症的方法主要是饮用酸奶，酸奶中的乳酸菌能使牛奶 中的乳糖部分水解，但由于酸牛奶的酸度仍有一部分人无法接受，所以利用乳糖酶水解牛 4 奶中的乳糖，则是解决乳糖不耐受症的理想途径。有人还认为可以食用不含乳糖或乳糖含 量极低的干酪，其实不可取。市场上低乳糖乳制品还不多，利用乳糖酶研究生产低乳糖牛 奶，满足众多乳糖不耐受症者的需求显然是件非常有意义的工作。目前，各种乳制品在食 品消费市场中占有很大的比例，市场上液态奶的种类多种多样，若以系统划分，只有鲜奶 和酸奶两种系列。随着人们生活水平不断的提高、意识不断的超前，人们对饮食营养结构 需求方向也不断地变化，如何让营养成份更多、更好、更方便的被人体吸收，己成为人们 倍加关注的问题，故新的奶制品的开发，己成为目前乳品行业的研发重点，新型低乳糖奶 粉已经研制成功( 中国乳业信息，1 9 9 9 ) ，人们开始进行超高温低乳糖牛奶的研制( 丁裕海， 2 0 0 2 ) ：龚广予等人也对此进行了开发( 龚广予，2 0 0 0 ) 。要从根本上改变奶制品的营养性 能，使之更加易于被人体吸收，并扩大食用奶制品的人群，这便是新的系列产品一低乳糖 奶制品。低乳糖奶制品，是通过纯生物发酵产品一中性乳糖酶，对奶制品中的乳糖进行水 解，重新调整奶制品中的营养结构，如果从根本上改变奶制品的营养性能，就要开发新的 系列产品低乳糖奶制品。早期人们对低乳糖奶制品的开发，只是为了针对消费者中具有 乳糖不耐受现象的人群而推出的产品，但是，经过更深一步的调查研究，发现低乳糖奶制 品绝不仅仅适用于具有乳糖不耐受症的人群，可以覆盖到奶制品销售市场的各个角落，经 过调查，低乳糖奶制品的应用不少于以下六种人群( b h l d a ，1 9 7 5 ) ： 1 亚洲人。据统计在亚洲人群中约有9 0 的成年人存在乳糖不耐受现象，解决乳 糖不耐受现象，最好最快捷的途径，就是为他们提供低乳糖奶制品。 2 孕妇。众所周知，孕妇在孕育期内，是胎儿摄取营养成份的最佳时期。在这一特 定时期内，大量吸收营养成份以供自身与胎儿所需，最好的方法就是经常性地食用奶制 品。而由于营养结构的原因，奶制品中的乳糖成份不易被母体直接吸收，从而使奶制品 中的营养成份流失，影响母体与胎儿对营养的吸收。乳糖酶能使乳糖水解成半乳糖、葡 萄糖，易被直接吸收，促进母体肠道中有益菌的生长，更能促进母体对钙、镁、磷等有 益物质的吸收，从而及时补充妊娠后期母体与胎儿所需的大量营养成份( g a m a n a ，1 9 8 1 ) 。 由此可见低乳糖奶制品在孕妇中具有巨大的潜在市场。 3 手术后的病人。对手术后的病人而言，及时补充因手术过程中所流失的能量是非 常必要的，就其所需的奶制品数量而言也是十分可观的。在我国，每年因术后病人所需 的营养品消费额，在整个营养品消费市场中能达到4 5 以上，而奶制品作为最好的营养 品，被视为术后病人不可缺少的必需品之一。低乳糖奶制品能够为术后病人提供更容易、 更直接被吸收的葡萄糖等营养成份。为术后病人及时恢复体力、增加能量起到关键作用。 4 婴幼儿及青少年。在婴幼儿初长及青少年成长时期，对钙、镁、磷等有益物质的 吸收量较其他人群相比要高出许多。由中性乳糖酶水解乳糖生成的物质，能够促进大脑 发育。近两年，从中央到地方各级政府正逐年加大力度推行“学生奶”计划，奶制品消 费市场的己发展到低龄人群。据调查，尽管婴幼儿、青少年在乳糖不耐受人群中占有的 比例不大，但由于成长所需等原因，低龄人群对营养物质的需求高于其他人群，低乳糖 奶制品的开发，能够使缺乏锌和钙、铁、维生素的青少年儿童及时得到营养物质的补充， 并能更好的促进青少年对奶制品的吸收，使其更好的成长。 5 白领人群。在上海知识水平较高的白领人群对低乳糖奶制品的呼声很高，随着 新生产业的不断涌现，知识层次较高的白领人群队伍的不断壮大，再加上该人群意识超 前、接受事物快，对消费市场的影响也越来越大。由于外来文化与工作压力等因素的影 响，这类人群对饮食结构的需求有了很大的变化，数量少，质量高的食品己成为该人群 的首选。据统计，上海等地区，每天早餐配送的低乳糖液态奶消耗量达到3 0 吨。按这个 数字计算，整个上海市周边地区消耗量将会有多大? 这仅仅是早餐配送奶，若是开发具有 一定货架期的屋顶包、方砖包低乳糖液态奶，将会有多大的消耗量? 6 中老年人。现如今，中国的部分地区己步入老年社会，中老年人口的增多使得与 其配套的中老年保健奶制品的消费量也在逐步上升，老龄人口在奶制品消费市场中占有 一席之地，中老年保健奶制品的开发己成为奶制品开发中的工作重心。由中性乳糖酶水 解乳糖而生成的低聚半乳糖，具有促进中老年人肠道内有益菌的生长，从而起到调解肠 道内微生态平衡的作用。因此，开发防止便秘、治疗肠胃功能低下、适用于中老年人食 用的低乳糖奶制品是十分必要的，同时由于低乳糖奶制品中所含的半乳糖能够促进骨胳 对钙的吸收，从而起到增加骨密质、减少骨质疏松的作用。 为了开发低乳糖制品，国外从6 0 年代开始研究直接向牛奶中添加酶制剂，进行乳糖 水解工艺，由于成本过于昂贵，7 0 一8 0 年代国内外又开始进行采用固定化酶反应器水解 奶中乳糖的研究( 杨贞耐，1 9 9 0 ) ，由于酶柱堵塞、微生物污染和再生问题始终无法解决， 使用固定化酶后，低乳糖牛奶的生产成本也始终无法降下来。早在过去美国和欧洲已经 发展了几个系统，然而，所有这些系统在实践中都以失败告终，其中，有一种基于玻璃 球的固定化装置系统，尽管水解牛奶时最初被看好，但处理的对象很快转成酸乳清 ( s i e n n a ，1 9 0 4 ) 。如果放眼全世界的酶制剂市场，有许多用固定化酶方法都是在发表的 论文上，实际只有一种固定化酶在工业上使用( k l i s e r ，1 9 8 9 ) ，那就是利用纯净的葡萄糖 浆生产果糖，它涉及的是葡萄糖异构酶，在这种情况下，由于是纯底物，故是可能的， 而牛奶是不同的底物。很长时间，所有用固定化酶的尝试在实验室外不可行。 在国外，随着微生物乳糖酶的出现，就开始了低乳糖乳制品的生产，后来也有人用 黑曲霉乳糖酶处理酸乳清制造糖浆，但由于乳糖酶的来源昂贵，同时在酶水解乳糖过程 中存在一些技术问题，所以低乳糖制品的生产仍然限于小批量水平，大规模的工业化生 产还有待于进一步研究( m o r i s i ，1 9 7 4 ；s t r c d ，1 9 9 3 ) 。近几年来国内某些学者提出了乳 糖酶的课题，并对乳糖酶的提纯进行了研究( 杨贞耐，1 9 8 9 ) ，所提取的酶的活力和产量 均较好，并能够有效地水解乳糖。目前提出开发低乳糖乳产品，已具备一定的开发条件。 1 乳糖酶的来源很多，有微生物、植物和动物等，由于微生物繁殖快，能在短时间 内获得较高产量的酶，所以目前在国外，基本上利用微生物来生产乳糖酶，而且以乳酸 酵母、脆皮酵母、米曲霉和曲霉为多，这四种微生物产生的乳糖酶已被证明在食品工业 中是可以接受的( d i c k s o n ，1 9 9 7 ：b r o d s k y ，1 9 7 6 ) 。 2 酶水解乳糖时，为了达到较高的水解率，酶的需要量较大，这是发展低乳糖产品 的不利因素。在无菌包装的同时，将乳糖酶产品直接加至u h t 奶中生产低乳糖牛奶，由 于所加酶量多，所以没有得到较大的发展。为了节省酶量，降低成本，可以将乳糖酶进 行固相化处理，即将酶固定于不容性载体上装柱，在牛奶通过柱的同时，其中乳糖被水 解。利用这种方法，乳糖酶可以得到反复利用。目前在国外使用最多的不容性载体是聚 6 前言 丙烯酰胺凝胶，但由于此种凝胶较脆，酶易漏出，而且组成单位有毒。近来日本提出用 k 一角叉藻聚糖作固定剂，以克服这些缺点，效果较好。 用固相化乳糖酶生产低乳糖牛奶，仍存在两个主要技术问题急需解决： 固相化乳糖酶在足以防止微生物生长的高温底物中，没有足够长的活性寿命。 固相化乳糖酶不能耐受乳中脂肪和蛋白质对其的污染。所以，在国外至今仍处 于实验室或小型实验厂水平。 综上所述，开发能更易被人体吸收、被更多的消费群体所适用的低乳糖系列奶制品， 己成为各乳品企业一个新的工作亮点，低乳糖系列奶制品能使乳制品行业跨上一个新的 台阶，使乳制品消费市场更加壮大。低乳糖系列奶制品将使“终生不断奶”，这一世界性 的口号适用于更多的人群。 一7 东北农业大学硕士学位论文 2 材料与方法 2 1 低乳糖牛奶生产工艺参数的研究 2 1 1 材料与设备 2 1 1 1 试验材料 b - 半乳糖苷酶：哈尔滨美华生物技术有限公司( 批号2 2 0 1 0 2 ) o n p g ( 邻硝基苯b d 半乳糖苷) ：s i g m a 公司出品 全脂乳粉：澳大利亚进口 蛋白胨：北京奥博公司生产 猪胆盐：北京双施微生物培养基制备厂 营养琼脂：北京奥博生物技术有限公司 培养基：普通营养琼脂培养基 ( 上海医学化验所试剂厂，批号9 8 1 0 0 6 ) ； 乳糖胆盐发酵培养基 ( 上海医学化验所试剂厂，批号9 8 0 4 0 1 ) ； 伊红美蓝琼脂培养基 ( 上海医学化验所试剂厂，批号9 7 0 2 0 1 ) ； 乳糖发酵培养基 ( 上海东海制药厂，批号9 9 0 3 2 0 ) ； 乳糖 ( 上海生物化学试剂商店二厂，批号8 9 1 0 0 9 ) 。 其它所用试剂均为分析纯 2 1 1 2 设备 7 2 1 分光光度计：上海精密科学仪器有限公司 屯热手提式压力蒸汽消毒器：哈尔滨市松花江医疗器械厂 电子恒温水浴锅：哈尔滨市松花江医疗器械厂 s c s - 2 4 摇床：上海市离心机械研究所( 1 6 0 1 8 0 转分) 电子精密天平：上海梅特勒一拖利多仪器有限公司 微量可调式移液器：芬兰制造 微型旋涡混合器：上海精科实业公司制造 p h s - 2 9 a 型酸度计：上海第二分析仪器厂 恒温培养箱：上海精密科学仪器有限公司 冰箱：海尔集团制造 材料和方法 2 1 2 测定项目及方法 还原乳的制备： 称取4 8 9 全脂乳粉装入5 0 0 m l 三角瓶中，加软化水溶解，玻璃棒搅拌定容至4 0 0 m l ， 加棉塞封口，同样方法做样数个，分别标a l ，a 2 ，a 3 ，a 4 经1 0 0 c ，灭菌1 0 分钟， 备用。 2 121 还原乳组成成分测定 ( 1 ) 蛋白质含量的测定：用凯氏定氮法( 金世琳，1 9 8 7 ) ( 2 ) 腊肪含量的测定：用盖勃法进行测定( 金世琳，1 9 8 7 ) ( 3 ) 牛奶酸度的测定：用0 i n a o h 标准溶液滴定，按食品手册操作( 黄伟坤，1 9 8 9 ) 。 ( 4 ) 乳糖含量的测定( 葸酮比色法) a 、样品处理： 用上述方法做好还原奶后准确吸取2 5 m l 于2 5 0 m l 容量瓶中，加5 0 m l 水，缓慢加 入5 m l 乙酸锌及0 6 的亚铁氰化钾溶液5 m l ，加水至刻度，混匀，静置3 0 m i n 过滤， 滤液稀释5 倍备用。 b 、直线回归方程的建立： 取试管5 支，分别加入o 1 m g m l 的标准乳糖溶液o 2 0 、0 4 0 、0 6 0 、o 8 0 、1 0 0 m l ， 再向各管补加蒸馏水至1 0 0 m l ，另取1 支试管加蒸馏水1 0 0 m l 作为空白管，向以上6 支试管中分别加入o 2 蒽酮溶液4 0 0 m l ，混匀，沸水浴1 0 m i n ，取出，冷却至室温，测 各管的o d 6 2 0 。值，将数据作回归处理，得出直线回归方程。 c 、样品测定： 取试管2 支，分别加入稀释样品液o 0 5 m l ，再向各管补加蒸馏水至1 0 0 m l ，另取1 支试管加蒸馏水1 0 0 m l 作为空白管，向以上3 支试管中分别加入o 2 蒽酮溶液4 0 0 m l ， 混匀，沸水浴1 0 m i n ，取出，冷至室温，测各管的o d 6 2 0 。值，将数据代入直线回归方程， 即可求得测定管中乳糖量，再经换算，可计算出样品中乳糖的含量。 2 1 2 2 1 3 一半乳糖苷酶活力的测定 ( 1 ) 试剂的配制 磷酸缓冲液( p h = 6 5 ) 0 1 mn a z c o 。溶液 0 n p g 溶液( 1 0 0 m l 的磷酸缓冲液中，溶解4 0 0 m 9 0 n p g ，保存在暗处备用) ( 2 ) 样品测定 a 、称取1 0 0 m g 乳糖酶，用磷酸缓冲液溶解，定容至1 0 0 m l 。此溶液在几小时之内是 稳定的。取上述酶液l m l ，用1 0 0 m l 缓冲液溶解，能使用几小时。( 适当稀释，使o d 值 在0 3 以内) 。 b 、在试管中吸入3 m l o n p g ，3 0 c 水浴7 分钟，之后加入再次稀释的酶液l m l ，摇匀 3 0 水浴1 0 分钟后加入2 r n ln a , c 0 ，来终止反应，摇匀试管的内容物。4 2 0 r m 测定0 d 值。 测定3 次取平均值。 9 东北农业大学硕士学位论文 c 、空白对照测定：先混合3 m lo n p g 溶液和2 m ln a 2 c 0 3 溶液。然后3 0 c 水浴 l o m i n ，4 2 0 n m 作为空白对照值。 ( 3 ) 结果计算： 乳糖酶单位( u g ) 。 公式中： e c m 一吸光值 。 ! ：! ：! 竺立 1 0 ( 1 1g ) 0 7 7 7 一换算系数，即o n p i p mo o 值 1 卜反应时间 1 0 6 一折算系数 1 卜折算系数 2 1 2 3 温度、时间、酶添加量等因素对水解率的影响 ( 1 ) 水解温度3 8 c ，添加酶量为0 5 9 k g ，0 8 9 ，l c g ，1 0 9 k g ，1 5 9 k g 条件下测定水 解率。 用电子分析天平分别称取乳糖酶0 2 9 ( 0 5 9 k g ) 0 3 2 9 ( 0 8 9 k g ) ，0 4gr 1 0 9 k g ) 0 6 甙1 5 9 k g ) 加入标a l ，a 2 ，a 3 ，a 4 试管中，投入酶后用混合器混匀，放入3 84 c 摇床 中水解( 1 6 0 r m i n ) 计时，分别于1 小时、i 5 小时、2 小时、2 5 小时、3 小时、4 小时、 5 小时后分别测定水解率。 酶催法测定水解率( 葡萄糖测定试剂盒) ：( 标准o d 值为0 2 3 5 ) a 、工作液的配制：( 试剂规格：葡萄糖酶试剂暂被称为a 液，苯酚试剂称为b 液) 用移液管吸a 液l o m l 、b 液1 0 m l 于同一试管内，混合器混匀( 倾斜角度为4 5 。3 0 s ) ， 混合后吸取各3 m l 放入标号为e 0 ，e l ，e 2 ，e 3 ，e 。的干燥试管中，待用。 b 、稀释奶样( 1 ：9 ) 3 8 c 水解1 小时后，立即用吸管从a l ，a 2 ，a 3 ，a 4 中分别吸出奶样l m l 放入标有 b l ，b 2 tb 3 t b 4 的试管中，再各吸入9 m l 的蒸馏水，混合器混匀，配成1 ：9 的稀释液。 c 、分别从b l ，b 2 ，b 3 ，b 4 中吸出l m l 稀释奶样依次加入e l ，e 2 ，e 3 ，e 4 试管，用 混合器混匀后，t = 3 7 。c 下水浴2 0 m i n ，然后用7 2 1 分光光度计比色，最后用下面公式将 吸光值换算成水解率。 水胁专霸詈 公式中：4 6 一未水解牛奶中乳糖的百分比含量 2 一折算系数 d 、1 5 小时、2 小时、2 5 小时、3 小时、4 小时、5 小时的水解率分别用同上方法 测定。 1 0 ( 2 ) 水解温度为2 0 c ，酶添加量为0 5 9 k g ，0 8 e ：, k g ，1 0 e , k g ，1 5 9 k g 条件下测 定低乳糖牛奶乳糖水解率。 按上述方法制各还原乳，将还原乳灭菌后冷却至2 0 c ，用同上方法测定2 小时、3 小时、3 5 小时、4 小时、5 小时、6 小时、7 小时的乳糖水解率。 ( 3 ) 水解温度为6 c ，酶添加量0 s g k g ，o 8 e d k g ，1 0 e k g ，1 5 9 k g 条件下低乳糖 牛奶水解率。 按上述方法制各还原乳，将还原乳灭菌后冷却至6 ，放6 冰箱不断搅拌水解，于 8 小时、1 1 小时、1 4 小时、1 7 小时、2 0 小时、2 3 小时、2 0 小时、2 3 小时、2 5 小时后 测乳糖水解率。 2 1 2 4 酸度及微生物指标测定 通过测定乳糖水解率达到6 0 以上的低乳糖牛奶的酸度、菌落总数及大肠菌群， 可以得知酶的添加量的大小及水解时间的长短，对产品质量的影响。 ( 1 ) 制备灭菌还原乳标号为c 1 ，c 2 ，c 3 ，冷却3 8 ，将酶以0 8 9 k g 比例分别投 入试管内，3 8 c 摇床水解，c 1 水解3 小时后立即用8 0 水灭酶，c 2 于水解4 小时后立 即灭酶，c ，于水解5 小时后立即灭酶。 用标准n a o h 溶液滴定法、平板菌落总数计数法( 诸葛健，1 9 9 7 ) 、乳糖胆管发酵 法( 诸葛健，1 9 9 7 ) 测c l ，c 2 ，c ，中奶样的酸度、菌落总数、大肠菌群。 ( 2 ) 同上方法制备还原乳标为d l 、d 2 、d 3 、d 4 、d 5 d 6 ，灭菌后冷却至2 0 c ，将酶 以0 8 9 爪g 比例投入d i 水解7 个小时，酶以1 o g k g 比例投入d 2 水解7 个小时，酶以 1 5 9 k g 比例投入d 3 、d 。、d 5 、d 6 水解7 个小时，水解后立即灭酶，测试管d 1 、d 2 、d 3 、 d 一d s 、d s 中奶样的酸度、细菌总数、大肠菌群。 ( 3 ) 同上方法制还原乳标为b i ，e 2 ，e 3 ，灭菌后冷却至6 。c ，将酶以1 o e g k g 比例 投入，6 。c 冰箱搅拌水解，2 0 小时，2 3 小时，2 5 小时后分别测定酸度，菌落总数及大肠 菌群。 2 2 低乳糖牛奶乳糖水解率测定方法的研究 2 2 1 材料与设备 2 2 1 1 试验材料与试剂 新鲜牛奶 乳糖酶 哈尔滨美华生物技术有限公司( 批号2 2 0 1 0 2 ) 氟化钠溶液 淀粉溶液 醋酸铅溶液 甲基橙水溶液 东北农业大学硕士学位论文 碘溶液 盐酸溶液 硫代硫酸钠溶液 草酸钾磷酸二氢钠缓冲溶液 碘化钾、硫酸铜 半乳糖、葡萄糖、乳糖、蔗果三糖( 生化试剂) 2 2 1 2 仪器与设备 冰点测量仪( 精确度00 0 5 c ) 高效液相色谱仪 电子恒温水浴锅 p h s 2 9 a 型酸度计 电子精密天平 滴定管、碘量瓶、容量瓶等 南京大学仪器设备制造厂 美国w a t e r s 公司生产 哈尔滨市松花江医疗器械厂 上海第二分析仪器厂 上海梅特勒一拖利多仪器有限公司 2 2 2 乳糖水解率测定方法的比较研究 测定乳糖水解率的方法有很多，为了寻求准确、快速、适用于生产过程的方法，对 碘量法、冰点下降法、高效液相色谱法、酶催法进行比较实验。 2 2 2 1 碘量法 a 、低乳糖牛奶的制备： 称取1 2 0 0 g 的新鲜牛奶( p h 6 6 6 8 ) ，经煮沸后冷却至3 8 c ，再准确称取1 0 0 0g ( 其 余部分留作待测样品) ，添加0 8 9 k g 乳糖酶，然后立即将牛奶样品放入3 8 c 的恒温水浴 锅中，并不断搅拌，3 个小时后取出牛奶样品并迅速作灭酶处理备用。 b 、酶解前牛奶中乳糖含量的测定： 样品处理：在2 0 c 下准确称取未酶解牛奶样品1 0g 至2 5 0 m l 容量瓶中，分别加入 2 0 的醋酸铅溶液4 m l 及草酸钾一磷酸二氢钠缓冲溶液4 m l ，最后用蒸溜水定容至其刻 度并摇匀静置后过滤备用。 用移液管准确移取2 5 m l 的上述滤液于2 5 0 m l 的容量瓶中，加入1 滴o 1 的甲基 橙水溶液、5 的氟化钠溶液0 5 m l 、0 i m o l l 的单质碘的标准溶液2 5 m l ，再加入0 1 m o l l 的氢氧化钠溶液3 7 5 m l 盖紧瓶塞并用水密封后置于黑暗处3 0 分钟，之后再加入 0 5 m o l l 的盐酸溶液8 m l ，1 的淀粉指示剂0 5 m l ，摇匀后再用0 1 m o l l 的硫代硫酸钠 的标准溶液滴定溶液呈现出淡粉色。这时所消耗的硫代硫酸钠标准溶液的毫升数为v 。 c 、酶解后牛奶中醛糖含量的测定： 低乳糖牛奶样品测定同a 、b 法，测得硫代硫酸钠消耗量为v ，。 d 、水解率的计算： 1 2 。：必监。1 0 0 m l v o m s v l 该计算公式中： m s 表示硫代硫酸钠的标准溶液的物质的量的浓度； m 表示单质碘的标准溶液的物质的量的浓度； v 。表示在每次进行测定时所准确移取的单质碘的标准溶液的毫升数； v ，表示每次进行未酶解牛奶滤液的滴定时所消耗的硫代硫酸钠标准溶液的毫升数； v 2 表示每次进行低乳糖牛奶滤液的滴定时所消耗的硫代硫酸钠标准溶液的毫升数。 e 、精密度实验：量取4 0