（食品科学专业论文）Rahnella+spPJT09胞外多糖的发酵条件与结构分析.pdf

谨以此论文献给我的恩师、同学和家人! 郭静 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名： 签字日期：力咖年箩月当徊 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下 事项： 1 、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。 2 、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中 国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社”用于出版和编入c n k i 中国知识资源总库， 授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：导师签字： 签字日期：驯。年歹月珈日 签字日期：年月 f 确扔 r a h n e l l as p p j t 0 9 胞外多糖的发酵条件与结构分析 r a h n e i l as p p j t 0 9 胞外多糖的发酵条件与结构分析 摘要 细菌胞外多糖的微生物来源非常广泛，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均可以 产生胞外多糖。因此，寻找细菌胞外多糖高产菌株并对其进行培养条件优化以提 高产量，对多糖的工业化生产非常重要。菌种和培养条件是影响胞外多糖产量和 组分的主要因素。产糖菌株对于温度、p h 、发酵时间、碳源和氮源等许多因素 比较敏感，故本论文筛选并鉴定了一株胞外多糖高产菌株，并对菌株产糖培养基 和发酵条件进行了研究，采用高效凝胶渗透色谱( h p g p c ) 、1 dn m r 和2 d n m r 技术对其平均分子量及结构进行了分析。本论文主要研究内容如下： 1 从大型真菌子实体中筛选得到一株胞外多糖高产菌株p j t 0 9 ，经 1 6 s r d n a 鉴定为r a h n e l l a ( 拉恩氏菌属) 。 2 由单因素实验和响应面法确定了g a h n e l l as p p j t 0 9 菌株最适产糖的发酵 培养基组成为( g l ) - 蔗糖4 0 ，酵母膏5 ，n a c l1 5 ，z n c l 20 3 ，k 2 h p 0 41 ；在 此基础上由单因素试验确定了最佳发酵条件为：每2 5 0 m l 三角瓶装液量为 1 0 0 m l ，接种量为3 ( v v ) ，初始p h 值为6 0 ，2 8 ，1 6 0 r m i n 培养7 0 h 。在此 营养和发酵条件下，r a h n e l l as p p j t 0 9 多糖产量为2 4 0 5 9 l ，转化率达到6 4 。 3 确定了r a h n e l l as p p j t 0 9 菌株胞外多糖的最佳提取工艺为：将发酵液调 浓缩至原来的1 2 ，浓缩液调p h8 0 ，再加入2 倍9 5 乙醇沉淀多糖，然后用去 离子水复溶后再沉淀，得到胞外多糖粗品。经s e p h a c r y ls - 3 0 0h r 凝胶柱层析分 离纯化后得到纯多糖p 0 9 。由高效凝胶渗透色谱法( h p g p c ) 确定了p 0 9 的重均分 子量为3 2 0 k d a 。 4 经1 d n m r 和2 d n m r 技术进行了多糖结构分析，确定了p 0 9 为1 3 ( 2 ，6 ) d f r u f ( 1 e v a n 型果聚糖) 。 r a h n e l l as p p j t 0 9 具有易培养，营养要求简单，发酵周期短、果聚糖产量高、 生产成本低等特点，具备工业化大规模生产的优良特性。本论文的研究为果聚糖 的生物活性、构效关系及开发应用的研究提供了一定的理论基础。 关键词：r a h n e l l a ；胞外多糖；发酵；结构；果聚糖 r a h n e l l as p p j t 0 9 胞外多糖的发酵条件与结构分析 t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fe x o p o l y s a c c h a r i d ep r o d u c i n g f r o mr a h n e l l as p p j t 0 9a n dt h es t r u c t u r a la n a l y s i s a b s t r a c t b a c t e r i a l e x o p o l y s a c c h a r i d e s ( e p s ) h a v e aw i d em i c r o b a l s o u r c e s ，b o t h g r a m n e g a t i v eb a c t e r i a la n dg r a m p o s i t i v eb a c t e r i a lc a i lp r o u d u c ee p s s e a r c h i n gf o r e p sh i 曲p r o d u c t i o nb a c t e r i a la n do p t i m i z i n gt h ec u l t i v a t i o nc o n d i t i o n st oi m p r o v e t h ep r o d u c t i o ny i e l di sv e r yi m p o r t a n tt ot h ei n d u s t r i a lp r o d u c t i o nf o re p s t h es t r a i n a n dc u l t u r ec o n d i t i o n si n f l u e n c et h ea n a o u n ta n dt h ec o m p o s i t i o no fe p s t h e p r o d u c t i o no fe p si ss e n s i t i v et om a n yf a c t o r ss u c ha st e m p e r a t u r e ，p h ，i n c u b a t i o n p e r i o d s ，c a r b o ns o u r c e sa n dn i t r o g e ns o u r c e s i nt h i sp a p e r ，t h ee p sh i 曲p r o d u c i n g s t r a i ni ss c r e e n e da n di d e n t i f i e d t h ef e r m e n t a t i o nm e d i u ma n dc o n d i t i o n sf o re p s p r o d u c t i o nf r o mt h es p e c i a ls t r a i na r ec a r r i e do u ta n dt h ea v e r a g em o l e c u l a rw e i g h t a n ds t r u c t u r eo ft h ee p si s a n a l y z e db yh i 曲p e r f o r m a n c eg e lp e r m e a t i o n c h r o m a t o g r a p h y ( h p g p c ) ，id n m ra n d2 dn m rt e c h n i q u e t h ec o n t e n t so ft h i s p a p e ra r e 嬲f o l l o w i n g ： 1 n ee x o p o l y s a c c h a r i d ep r o d u c i n gs t r a i np j t 0 9i s s c r e e n e df r o mf r u i t i n g b o d i e so fl a r g ef u n g ia n di d e n t i f i e da sr a h n e l l as p b yp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a l e x p e r i m e n ta n d16 s r d n as e q u e n c ea n a l y s i s 2 t h eb e s tm e d i u mc o m p o n e n t so ft h er a h n e l i as p p j t 0 9a r ed e t e r m i n e db ya s i n g l e - f a c t o rt e s ta n dr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ( e l ) ：s u c r o s e4 0 ，y e a s te x t r a c t5 ， n a c l1 5 ，z n c l 2o 3 ，k 2 h p 0 41 ；b a s e do nt h es i n g l e f a c t o rt e s t ，t h eo p t i m a l f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa r e ：2 5 0 m lf l a s kc o n t a i n i n glo o m lm e d i u m ，i n o c u l u m v o l u m e3 ( v v ) ，i n i t i a lp h6 0 ，r o t a t es p e e do ff e r m e n t a t i o n16 0 r r a i n ，t e m p e r a t u r e 2 8 c ，t i m e7 0 h i ns u c ho p t i m a ln u t r i t i o n a n de n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n s ，t h e m a x i m u mc o n c e n t r a t i o n so ft h ee p si s2 4 0 5 9 l ，a n dt h ec o n v e r s i o nr a t ec a nr e a c h u pt 06 4 3 t h e o p t i m a le x t r a c t i n gp r o c e s s f o re x o p o l y s a c c h a r i d ei sd e t e r m i n e d 觞 f o l l o w i n g ：a tf i r s t ，t h ef i l t r a t ei sc o n c e n t r a t e dt o1 2v o l u m e ，a n dt h e n i ti sa d j u s t e dt o p h8 0a n dp r e c i p i t a t e db y2v o l u m eo f9 5 e t h a n o l ，t h ep r e c i p i t a t ei s s o l v e di n i d e i o n i s e dw a t e ra n d p r e c i p i t a t e da g a i n , t h e nc e n t r i f u g e d , a tl a s t ，t h ec r u d e e x o p o l y s a c c h a r i d ei so b t a i n e d t h ep u r ep o l y s a c c h a r i d e ( p 0 9 ) i so b t a i n e db yu s i n g s e p h a c r y ls - 3 0 0 h rg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h i ct e c h n i q u e t h ea v e r a g em o l e c u l a r w e i g h to fp 0 9i sd e t e r m i n e dt ob e3 2 0k d ab yh i g hp e r f o r m a n c eg e lp e r m e a t i o n c h r o m a t o g r a p h y ( h p g p c ) 4 t h es t r u c t u r eo fp 0 9i s a n y l y z e db yn m rt e c h n i q u e t h ep 0 9i s1 3 ( 2 ， 6 ) 一d - f r u f ( 1 e v a n - t y p e ) r a h n e l l as p p j t 0 9h a sm a n ya d v a n t a g e sf o ri n d u s t r i a l p r o d u c t i o n ：e a s yt o c u l t u r e ，s i m p l en u t r i t i o n a lr e q u i r e m e n t s ，s h o r tf e r m e n t a t i o np e r i o d ，h i g hl e v a ny i e l d ， a n dl o wp r o d u c t i o nc o s t s t h es t u d yo ft h i sp a p e ri st op r o v i d eat h e o r e t i cf o u n d a t i o n f o r t h e s t u d yo fs t r u c t u r e - a c t i v i t yr e l a t i o n s h i pa n dt of u r t h e re x p l o i t a t i o na n d a p p l i c a t i o no fl e v a n k e yw o r d s ：r a h n e l l a ；e x o p o l y s a c c h a r i d e sf e p s ) ；f e r m e n t a t i o n ；s t r u c t u r e ；l e v a n r a h n e l l as p ，p j t 0 9 胞外多糖的发酵条件与结构分析 目录 o 前言1 o 1 多糖研究概述1 0 2 细菌胞外多糖的研究背景2 0 2 1 细菌胞外多糖的定义与分类2 0 2 2 细菌胞外多糖的生理功能2 0 2 3 胞外多糖产生菌及菌种筛选与鉴定4 0 2 4 细菌胞外多糖的分离纯化6 0 2 5 多糖结构分析7 0 2 6 细菌胞外多糖的研究现状8 0 2 7 细菌胞外多糖的应用1 1 o 3 果聚糖的研究概述1 6 o 3 1 果聚糖的定义与分类。1 6 o 3 2 果聚糖的微生物来源及研究进展1 6 0 3 3 果聚糖的生物合成18 0 3 4 合成基因与调控1 9 0 3 5 果聚糖的应用2 0 0 4 本课题研究的目的、意义及内容2 1 o 4 1 研究目的与意义：2 1 0 4 2 研究内容2 2 1 胞外多糖高产细菌的筛选与鉴定2 3 1 1 引言2 3 1 2 材料与仪器：。2 3 1 2 1 试剂2 3 1 2 2 主要仪器2 4 1 2 3 培养基。2 4 1 3 方法2 5 分离与筛选2 5 r a h n e l l as p p j t 0 9 胞外多糖的发酵条件与结构分析 1 3 2 菌种鉴定2 5 1 3 3 菌株产糖性状评价- 2 6 1 4 结果2 6 1 4 1 产胞外多糖细菌的筛选2 6 1 4 2 菌株p j t 0 9 的鉴定2 7 1 4 3r a h n e l l as p p j t 0 9 产糖性状评价3 0 1 5 讨论3l 1 6 小结3 2 2r a h n e l l as p p j t 0 9 产胞外多糖的发酵试验3 3 2 1 引言3 3 2 2 材料与仪器3 3 2 2 1 菌种3 3 2 2 2 主要试剂3 3 2 2 3 主要仪器3 4 2 2 4 培养基3 4 2 3 方法3 4 2 3 1 液体发酵流程3 4 2 3 2 培养基组分的优化：3 5 2 3 3 发酵条件的优化3 6 2 3 4 多糖含量的测定3 6 2 3 5r a h n e l l as p p j t 0 9 摇瓶发酵曲线的测定3 8 2 3 6 多糖转化率测定。3 8 2 4 结果与分析3 9 2 4 1 多糖的含量测定。3 9 2 4 2 培养基组分的优化。4 0 2 4 3 发酵条件的优化4 6 2 4 4 发酵曲线。4 7 2 4 5 多糖转化率4 8 2 5 讨论4 9 r a h n e l l as p p j t 0 9 胞外多糖的发酵条件与结构分析 2 6 小结4 9 3r a h n e l l as p p j t 0 9 胞外多糖的制备与结构分析5 0 3 1 引言5 0 3 2 材料与仪器5 0 3 2 1 菌株5 0 3 2 2 试剂5 0 3 2 3 主要仪器5 1 3 3 方法51 3 3 1 多糖的提取5l 3 3 2 多糖提取工艺的优化一5 1 3 3 3 多糖的纯化5 2 3 3 4 多糖的分子量测定5 2 3 3 5 多糖结构的核磁分析；5 3 3 4 结果与分析5 3 3 4 1 多糖的提取工艺优化。5 3 3 4 2 多糖的纯度检验5 5 3 4 3 分子量的测定5 6 3 4 4 核磁分析与结果5 7 3 5 讨 念6 2 3 6 j 、结6 3 4 结j 吾6 4 5 论文创新点6 6 6 后期工作设想6 7 参考文献6 8 个人简历7 8 致谢7 9 j r a h n e l l as p p j t 0 9 胞外多糖的发酵条件与结构分析 0 前言 0 1 多糖研究概述 多糖又称为多聚糖( p o l y s a c c h a r i d e s ，p s ) ，是由醛基或酮基通过糖苷键连接 的极性复杂的高分子聚合物，聚合度大于1 0 ，其分子量达数万甚至数百万，是 构成生命的四大基本物质之一。多糖是自然界中含量丰富的生物聚合物，广泛存 在于动植物及微生物中。目前已发现的活性多糖有数百种，按其来源不同可分为 植物多糖、动物多糖和微生物多糖三大类。多糖具有多种生物活性，与维持生物 体机能密切相关。多糖与蛋白质、脂类形成的糖蛋白、脂多糖在细胞的识别、分 泌以及蛋白质的加工和转移方面起着不容忽视的作用 1 】。 自从2 0 世纪5 0 年代末人们发现真菌多糖具有抗肿瘤活性以来，多糖的研究 受到越来越广泛的重视。此后，l a n d s t e i n e r 于1 9 0 1 年发现了人类血型，并荣获 了1 9 3 0 年的诺贝尔生理和医学奖。该项医学革命的科学基础涉及天然抗糖抗体、 血型糖抗原的表达、糖基转移酶基因的多态性等多项糖生物学研究领域。中国对 多糖的研究始于7 0 年代，由于我国具有丰富的中草药资源和经典的传统中医药 理论，近年来对植物多糖的研究发展很快，其中对免疫活性和抗肿瘤作用的机理 的研究已经达到分子水平。植物多糖因其独特的功能和无细胞毒性，已成为当今 新药的发展方向之一【2 】。进入2 1 世纪以来，化学糖生物学( c h e m i c a lg l y c o b i o l o g y ) 兴起，在2 0 0 1 年“s c i e n c e 期刊推出的“碳水化合物与糖生物学专辑中【3 j ， 特别刊登了由b e r t o z z i 和k i e s s l i n g 撰写的题为“c h e m i c a lg l y c o b i o l o g y ”的综述 文章【4 】，为糖类的研究揭开了新的篇章。人类对糖类化合物的认识不仅是能量来 源、结构骨架及保护等作用，糖类化合物的重要生物学作用也越来越被人们所关 注，糖类药物的研究也不断深入。 动物多糖广泛分布于动物结缔组织基质和细胞间质中，是脊椎动物组织胞外 空间的特征成分。很多动物多糖具有提高免疫力、抗肿瘤、抗氧化、降血脂、抗 凝血和抗炎等作用，如多糖有鲨鱼软骨多糖、海星粘多糖、海参多糖及鲍鱼多糖 笙f 5 j 可o 微生物多糖的种类繁多，依生物来源分为细菌多糖、真菌多糖和藻类多糖， 按分泌类型分为胞内多糖与胞外多糖。从开发生产微生物多糖的角度出发，比较 上述类型的微生物多糖，培养细菌与真菌更为容易，提取胞外多糖更为便捷。与 r a h n e l l as p p j t 0 9 胞外多糖的发酵条件与结构分析 植物多糖和动物多糖相比，微生物多糖具有产糖量较高、质量稳定，且受环境因 素影响较小等优势。细菌胞外多糖作为微生物多糖的一种，具有独特的理化性质 和流变性质以及良好的生物兼容性、生物可降解性，已作为纺织品、去污剂、胶 凝剂、成膜剂、保鲜剂、乳化剂等广泛应用于食品、医学、制药、农业、石油、 化妆品等多个领域，市场需求量不断增加。 近年来，国内外对微生物多糖的研究主要集中在产生茵的开发、流变学特性、 生物学活性、构效关系等方面，在此基础上对生产菌株选育，发酵条件和提取工 艺、加工技术以及活性多糖的应用等进行研究。 0 2 细菌胞外多糖的研究背景 0 2 1 细菌胞外多糖的定义与分类 细菌胞外多糖( e x o p o l y s a c c h a r i d e s ，e p s s ) ，是指细菌在生长代谢过程中分泌 到细胞外的多糖类物质，包括革兰氏阴性菌细胞膜外的多糖成分以及革兰氏阳性 菌的肽聚糖。细菌胞外多糖的分类方式有两种，按照细菌胞外多糖的分类方法有 两种。按照胞外多糖在基质中的存在形式分为荚膜多糖( c a p s u l a rp o l y s a c c h a r i d e ， c p s ) 和粘液多糖( s l i m ep o l y s a c c h a r i d e ) 两类：多糖通过分子间氢键及其它非共价 键的形式与细胞壁间形成坚韧的外膜粘附于细胞表面，通常称为荚膜多糖；粘液 多糖是分泌到培养基中的结构松散粘液物质【卯】。另一种分类方法是按照多糖的 单糖组成分类：多糖只含有一种单糖时称为同质多糖( h o m o p o l y s a c c h a f i d e s ) ， 如右旋糖酐、果聚糖、甘露聚糖、纤维素、茁霉多糖等；含有两种或更多不同单 糖组分称为异质多糖( h e t e r o p o l y s a c c h a r i d e s ) ，如结冷胶、黄原胶、透明质酸、 鼠李胶等。细菌产生的异质多糖中，单糖单位通常以固定的形式有规律的重复排 列，即所谓的重复单元。同质多糖和异质多糖可以是线型的，也可以是带有支链 结构的。异质多糖还可分为中性多糖、含有糖醛酸或丙酮酸残基的酸性多糖以及 硫酸基多糖、氨基多糖。 0 2 2 细菌胞外多糖的生理功能 糖类是一切细胞和生物在结构、能源和信息三个方面均占有重要地位的物质 载体。在核酸、蛋白质、脂类和糖类这四大类生命的核心分子中，糖类起着联系 其他三大类生物分子的枢纽作用。糖类化合物在生物体内的基本功能之一就是参 2 r a h n e l l as p p j t 0 9 胞外多糖的发酵条件与结构分析 与细胞和细胞、细胞和分子间识别和黏着、细胞的分化及细胞与外部的相互作用 等。糖类作为生物缀合物，在生命的起源和演化过程中始终扮演着重要角色。随 着糖生物学的发展，糖类作为信息分子和调节分子在生物体的各项正常生命活动 和病理状态下所发挥的作用不断被阐述【引。 细菌胞外多糖的形成与其产生菌的生长环境密切相关，不仅为菌体生长提供 生命活动所需的能量及营养物质，还对菌体起到保护作用及其他特殊的生理功 能，同时也对其周围的环境与生物体产生相互作用。通常认为细菌胞外多糖的生 理功能主要有： ( 1 ) 提供能量：糖类物质是重要的能量储备载体，为微生物的生长及代谢 提供所需的能量。 ( 2 ) 促进营养吸收：具有糖醛酸或有机羧基的多糖类物质具有吸收或供给 菌体营养物质和无机盐的作用。 ( 3 ) 保护作用：胞外多糖的存在可能是菌体对环境中普遍存在的抗菌物质 的反应，如表面活性物质、细菌毒素、溶菌酶、噬菌体、抗生素、抗体以及吞噬 细胞等。当遭遇外源病原物的侵袭时，外膜包被着具有粘液状的胞外多糖能够保 护菌体免受原识别或吞噬，所以包被于野生菌株表面的胞外多糖对细菌的粘附以 及在竞争环境中的存活和生长都具有重要的作用网；当茵体在极端条件时，如干 燥、高温或冷冻条件，菌体可以利用具有高亲水性的胞外多糖间质存留的水以起 到保护菌体的作用【1o 】；胞外多糖还能与重金属离子的结合，使菌体细胞免受毒 素影响【l l 】。 ( 4 ) 黏附作用：胞外多糖的形成有利于菌体对其他动植物及微生物的黏附， 形成菌膜。此外，胞外多糖还可以使微生物与土壤颗粒或其它物质粘接起来，有 于协调微环境。 ( 5 ) 致病作用：有些胞外多糖在微生物的致病性上发挥重要作用，胞外多 糖与菌体的毒力和入侵能力有关。但胞外多糖单独并不足以致病，也不是微生物 致病的必要条件，许多非致病菌可以产生胞外多糖，并在食品及其他领域得到广 泛的应用【1 2 j 。 r a h n e l l as p p j t 0 9 胞外多糖的发酵条件与结构分析 ( 6 ) 识别作用：噬菌体可以识别并吸附到细菌表面特异的多糖分子上，随 后分泌内切糖苷酶打开糖链，便于噬菌体与胞壁多糖的识别。 ( 7 ) 生物学活性：研究表明，多种天然来源的多糖可以通过增强机体免疫 能力，而具有抗菌和抗肿瘤活性及抗病毒活性【1 3 - 1 4 1 。近二十年来，越来越多的微 生物多糖被确认对机体免疫反应的调节有着极为重要的意义。早期研究证明【1 5 】， 在菌体表面组装成荚膜多糖复合物能调节腹腔内脓毒症伴随性脓肿的形成。日本 于1 9 8 6 年上市的具有1 3 一( 1 ，3 ) 分支结构的葡聚糖是另一类免疫调节剂。研究表明， 1 3 ( 1 ，3 ) 葡聚糖能调节淋巴细胞和单核细胞中促免疫细胞因子的产生【1 6 1 。 o 2 3 胞外多糖产生菌及菌种筛选与鉴定 o 2 3 1 胞外多糖产生菌 许多细菌可以产生胞外多糖。目前研究的产胞外多糖的细菌主要有醋酸杆菌 ( a c e t o b a c t e r ) 、假单胞菌( p s e u d o m o n a s ) 、鞘氨醇单胞茵( s p h i n g o m o n a s ) ，根瘤菌 ( r h i z o b i u m ) 、动胶菌( z o o g l o e a ) 、肠膜状明串珠菌( l e u c o n o s t o cm e s e n t e r o i d e s ) 、唾 液链球菌 s a l i v a r i u s ) 、克雷伯氏菌( k l e b s i e l l a ) l 肠系膜状白捻珠菌 ( l m e s e n t e r o i d e s ) 、粘细菌( m y x o b a c t e r i u m ) 、芽孢杆菌( b a c i l l a c e a e ) 、链球菌 ( s t r e p t o c o c c u s ) 、乳球菌犯口c 幻淞) 和乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s ) 等【1 7 之1 1 。 0 2 3 2 菌种筛选 发酵工业生产的第一步就是以特定产物为目标进行菌种的分离筛选。菌种的 选育是对工业化生产非常重要。育种的目的是筛选性能好、性状稳定的菌种。目 前，胞外多糖的工业投产所遇到的问题是：产量低、用于通氧搅拌的能源高，提 纯用有机溶剂耗量大。如果能够从生物技术的角度，通过物理或化学诱变、细胞 融合、基因重组等技术得到多糖高产菌株，降低生产成本，那么，胞外多糖的生 产及应用前景将无可限量。常用的菌种筛选方法包括常规筛选、诱变和基因工程。 0 2 3 2 1 常规筛选 自然界最丰富的微生物菌库。从土壤、水体等环境中可筛选到细菌多糖的 高产菌株。筛选菌株的方法主要有以下几种： ( 1 ) 形态学的方法：根据菌落特征如菌落大小、颜色、粘度、凹凸程度、 4 r a h n e l l as p p j t 0 9 胞外多糖的发酵条件与结构分析 有无荚膜等进行筛选。但由于不同菌种的产胞外多糖的能力受培基成分及培养条 件影响，这种筛选方法工作量很大。 ( 2 ) 生理学的方法：这种方法主要是根据菌株特殊的营养要求和生理特征寻 找选择性或抑制性因素，以此来设计筛选培养基，使目的菌株大量生长，成为优 势菌，而其他杂菌被抑制或杀死。此外，根据不同菌株对不同底物利用的差异性， 以特异性的营养物为底物，进行菌株的筛选。 0 2 3 2 2 诱变育种 采用物理和域化学诱变等方法可对现有菌株进行改良，选出性能稳定、高产 的菌株瞄】。紫外诱变、对氨基苯丙氨酸、亚硝基肌及对氟基丙氨酸等诱变剂会 增加磷酸甘露聚糖异构酶、g d p 岩藻糖合成酶及u d p 半乳糖异构酶的活性，从 而促使糖基核苷酸的合成。通过诱变方法定向筛选可以得到产糖能力高、性状 稳定的菌株，可以保证工业化生产的质和量的要求。 o 2 3 2 3 基因重组选育 高产、优质的胞外多糖生产菌最理想的方法是采用基因重组技术定向构建所 需的菌种工程菌，获得高产、优质的胞外多糖产生菌最佳的方法。随着基因 工程、细胞工程、酶工程技术的不断发展和完善，固定化和基因重组技术极大的 推动了微生物转化法和酶法在多糖制备中的应用。固定化酶和细胞固定化培养可 以实现连续化、大型化和自动化生产，将产物及时分离，减小或避免高浓度产物 对底物的反馈抑制作用，也在一定程度上避免了游离细胞连续反应器中容易发生 的杂菌污染的问题。通过基因工程方法提高代谢途径中酶的表达量，进而提高胞 外多糖的产量，是众多研究者追求的目标。通过研究基因结构与功能的关系及并 其遗传背景，可为通过基因工程方法获得高产优质的胞外多糖产生菌奠定基础。 0 2 3 3 菌种的鉴定 对于细菌种属鉴定一般采用形态学观察作为初步鉴定，包括革兰氏染色、荚 膜、鞭毛、运动性观察，以及在特定培养基上形成典型的特征菌落，包括菌落大 小、颜色、干燥或湿润，凹凸性、边缘整齐性等。然后进行生理生化实验做进一 试验等一系列生理生化实验研究。基于菌株生 5 r a h n e l l as p p j t 0 9 胞外多糖的发酵条件与结构分析 理生化反应特征而发展起来的b i o l o g 系统鉴定、法国梅里埃半自动细菌鉴定系统 等，为细菌的快速鉴定提供了方便快捷的途径。根据简明第八版伯杰氏细菌鉴 定手册、伯杰氏细菌鉴定手册第九版( 英文) 和常见细菌系统鉴定手册 对菌株进行初步分类。最后进行1 6 sr d n a 序列分析进行分子水平的鉴定。一般 认为1 6 s r d n a 同源性大于9 0 可以确定到属，大于9 7 可认为属于同一菌种 【2 3 】 o o 2 4 细菌胞外多糖的分离纯化 0 2 4 1 分离和纯化 为了获取均一多糖需要对提取到的多糖进行分离和纯化。实验室及工业生产 中最简单的分离提取方法就是利用多糖在乙醇中的溶解度不同而进行分级分离。 向提取到的粗多糖饱和溶液中加入乙醇，使乙醇的终浓度依次达到4 0 、6 0 、 7 0 、8 0 ，；离心每次所得沉淀可得到不同的多糖。经过s e v a g 法、酶解法、三 氟三氯乙烷法或三氯乙酸法去蛋白【2 0 】。天然多糖的分离提纯可以按照分子的大 小和形状选择分级沉淀、柱色谱或透析、超滤的方法，也可以按照分子的性质差 异而选择区带电泳方法进行分离，如聚丙烯酰胺凝胶电泳、醋酸纤维素膜电泳。 实验室中对多糖的纯化最常用的纯化方法是色谱法。包括有分子筛作用的凝胶色 谱( 如s e p h a d e x 、s a p h r o s e 、b i o g e l ) 和离子交换色谱。离子交换色谱这种分离 方法不仅具有分子筛效应，同时也按照多糖电荷性质的不同进行分离。利用填料 对不同种类糖的吸附作用不同而将使各种多糖彼此分离。因此，要根据不同多糖 的性质来选择合适的色谱柱。通常需要考虑填充材料的类型、型号、洗脱液种类、 p h 值、洗脱流速以及柱温等因素。将粗多糖经色谱柱洗脱，洗脱曲线反应了多 糖的均一性。按照洗脱曲线的不同峰收集各个均一多糖组分。 0 2 4 2 纯度测定 多糖纯度是指一定分子量范围的均一组分，代表相似链长的平均分布，将粗 多糖各组分分离后，还要测定各组分是否均一或为纯多糖。测定多糖纯度的方法 有功能团分析、比旋光度、纸色谱、高效液相色谱、高压电泳等，其中最常用的 是色谱法和电泳法。常用的色谱法为柱色谱和高效液相色谱。若为纯品，则在色 谱柱中洗脱后得单一对称峰。 6 r a h n e l l as p p j t 0 9 胞外多糖的发酵条件与结构分析 o 2 5 多糖结构分析 多糖结构分析主要包括单糖组分的鉴定、糖的连接位点及、链连接顺序以及 苷键构型和氧环的确定。多糖结构的分析方法包括化学法、仪器分析法和生物法。 化学法包括高碘酸氧化、s m i t h 降解和甲基化等。仪器分析主要包括红外光谱、 拉曼光谱、气相色谱、高效液相色谱、质谱、n m r 核磁共振以及色谱质谱联用 技术等。目前多糖结构鉴定最常用的方法是n m r 、质谱及色谱质谱联用技术。 o 2 5 1 单糖的鉴定 多糖水解，然后用纸色谱或t l c 薄层色谱检测单糖组成，也可采用高效液 相色谱( h p l c ) 或气相色谱法对单糖组分进行定性定量分析，测定各单糖组分 之间的比例。 0 2 5 2 糖的连接位点的确定 采用甲基化法分析糖的连接位点，即将多糖样品甲基化之后，水解所有的苷 键，用气相色谱对水解产物定性定量分析。通常具有游离羟基的位置即糖的连接 位点，全甲基化的单糖即是末端糖。 o 2 5 3 糖链连接顺序的确定 传统方法是通过缓和水解、稀酸水解、酶解等方法来推测。现在还可通过质 谱分析来解决。在了解了糖的组成之后，根据质谱中的裂解规律和该化合物的裂 解碎片推测糖链的连接顺序。但其中的糖不能是同一类的糖，以免因它们丢失的 质量相等而无法推测糖的连接顺序。 o 2 5 4n m r 技术在多糖结构分析中的应用 核磁共振( n m r ) 方法引入多糖结构分析之后，尤其是2 dn m r 的出现和发展， n m r 在解决多糖的糖苷键构型、氧环大小、优势构象、糖的种类、糖与糖之间 的连接位置及顺序等方面具有重要的作用四1 ( 见表o 1 ) 。 7 r a h n e l l as p p j t 0 9 胞外多糖的发酵条件与结构分析 表0 11 dn m ra n d2 dn m r 技术测定多糖糖链结构 t a b l e0 - 11dn m ra n d2 dn m r t e c h n i q u eu s e df o rd e t e r m i n a t i o no f s t r u c t u r eo f p o l y s a c e h a r i d e sc h a i n s 0 2 6 细菌胞外多糖的研究现状 细菌胞外多糖具有产糖量较高、质量稳定、生产周期短、成本低且受环境因 素影响较小等优势。近年来，细菌多糖以安全、无毒且独特的理化性质及生物活 性，使它在食品和非食品工业倍受青睐，尤其是在医药领域所具有的巨大应用价 值引起了人们的广泛关注。目前为止，已大量投产的细菌胞外多糖有葡聚糖 ( g l u c a n ) 、黄原胶( x a n t h a ng u m ) 、结冷胶( g e l l a ng u m ) 、热凝多糖( c u r d l a n ) 和透明 质酸( h y 栅o m ca c i d ，h a ) 等【2 5 - 2 9 。 0 2 6 1 葡聚糖( g l u c a n ) 葡聚糖是以葡萄糖为组成糖的多糖的总称，广泛存在于多种植物、动物和微 8 尺口砌p 肠s p p j t 0 9 胞外多糖的发酵条件与结构分析 生物中。葡聚糖的发现和研究历史【3 0 】：1 9 5 7 年，b e n a c e r r a f 和s e b e s t y n 就发现 了静脉注射来自酵母细胞壁的酵母聚糖对吞噬细胞活性有影响。随后人们对酵母 聚糖进行了分离和纯化，1 9 6 1 年r i g g i 确定了酵母聚糖中这种活性成分是葡聚 糖。酵母葡聚糖作为第一个被发现具有免疫活性的葡聚糖开创了其作为免疫活性 物质研究的新纪元。1 9 6 9 年c h i h a r d 等人又从香菇中分离得到了香菇多糖，并 证明了它的抑瘤作用。1 9 8 0 年以后，由于它的天然无毒性、生物活性的优越性， 用途的广泛性以及资源的丰富性等使得其应用更为广泛。因此，世界各国都开展 了从筛选菌种到生产应用的多领域研究。目前用于临床试验和应用的葡聚糖有右 旋