（食品科学专业论文）大豆异黄酮的制备方法及其糖苷水解工艺的研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获德沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签各自编 导师签名： 参多z 时间：多口7 年月吕日 时间：加7 年月彦日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的内容。 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： 缘炀帆一7 年月渗日 时间：2 0 0 7 年6 月矿同 沈阳农业大学硬士学位论文 摘要 大豆异黄酮是大豆生长过程中形成的次生代谢产物，具有多种生物活性。近年来， 大豆异黄酮已成为大豆中最引人注目的功能成分之一，其研究也是食品与营养学研究的 热点之一，有着非常广阔的开发应用前景。本文从实际出发，以综合利用大豆资源和生 产不同含量的大豆异黄酮产品为目的，以脱脂豆粕为原料，通过大量的对比试验，研究了 大豆异黄酹提取、精制、水解的方法，并且对比研究了大豆异黄酮糖苷和苷元的免疫功能。 本文主要研究内容和结论如下： 1 。本试验以脱脂豆粕为原料，通过正交试验及方差分析得出，乙醇回流提取法的最佳 提取条件：即以5 0 的乙醇水溶液，1 ：1 0 料液比，在7 0 下提取3 h 。大豆异黄酮含 量为2 7 5 ，得率为6 2 7 m g g ；超声波辅助提取法的最佳提取条件：即以6 0 的乙醇 水溶液，1 ：8 料液比，在4 0 下超声( 1 8 0 w ，4 0 k 比) 提取3 0 m i n 。大豆异黄酮含量 为2 8 0 ，得率为6 3 5 m g g 。 2 本试验比较1 0 种不同型号的大孔树脂对大豆异黄酮的吸附性质，确定了h p d - 6 0 0 树 脂吸附纯化大豆异黄酮的最佳工艺条件如下：上样液浓度0 1 5 m g m l 、上样液p u g 4 5 、上样m 4 s b v 、吸附流速1 0 m r r a i n 、静态吸附2 5 0 r a i n ，用8 0 乙醇作为解吸 剂，解吸流速为0 5 m 1 m i n ，3 0 b v 的解吸剂即可解吸完全。得到大豆异黄酮粗品含 量为2 0 1 1 ，比粗提物纯度提高了7 1 8 倍。 3 本试验比较了不同溶剂萃取大豆异黄酮的效果，丙酮沸点回流萃取可以得到含量为 4 2 9 1 大豆异黄酮产品，纯度比含量为2 0 1 1 原料提高2 1 3 倍：乙酸乙酯和丙酮组 合沸点回流萃取，可以得到含量为7 0 3 6 大豆异黄酮产品，纯度比含量为4 2 9 1 原 料提高1 6 4 倍。 4 本试验以大豆异黄酮糖苷为原料，通过正交试验及方差分析得出，酸法水解最佳工艺 条件：盐酸乙醇溶液浓度为3 0 m o l 1 , ，水解温度为，水解时间为1 8 0 r a i n ，酸法 水解率为8 1 3 2 ；酶法水解最佳工艺条件：在p h 6 0 的缓冲液体系中，酶解温度为 3 8 ，酶解时间为9 0 r a i n ，加酶量为4 0 m g ( 4 ) ，酶法水解率为8 2 5 5 。结果表 嘎：酶法水解大豆异黄酮糖苷的效果优于酸法水解的效果 5 本试验用大豆异黄酮糖苷和大豆异黄酮苷元喂养小鼠后，其鸡红细胞作免疫原的溶 血素的光密度值比在相同环境下的空自对照组明显增加，这表明大豆异黄酮糖苷和 摘要 苷元都能有效地提高小鼠体液免疫功能，同时发现小鼠对大豆异黄酮苷元的吸收效 果好于大豆异黄酮糖苷，说明大豆异黄酮苷元的免疫功能优于大豆异黄酮糖苷。 关键词：大豆异黄酮，糖苷，苷元，提取，精糊，水解，免疫功能 2 沈阳农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t s o y b e a ni s o f l a v o n ei sf i d eo fs e c o n d a r ym e t a b o l i t e sf o r m e di nt h eg r o w t ho fs o y b e a n , w h i c hh a sb e e np r o v e nt op o s s e s sv a r i o u sb i o l o g i c a l 矾l i “t i 鹤s o y b e a ni s o f l a v o n eb e o o m e s o n eo ft h em o s tr e m a r k a b l ei n n c i t i o n a lc o m p o n e n t s t h ei 伪e a r c h e so ft h e i rp h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n sa r eb e i n gd e v e l o p e de x t e n s i v e l ya tp r e s e n t w h i c ha r ei nt h ef o c u so ff o o da n d n u t r i t i o n a lr e s e a r c hn o w a d a y sd u et ot h e i rn u m e r o u sh e a l t hp r o m o t i n gp r o p e r t i e s s os o y b e a n l s o f l a v o n ec 姐h a v ea b r o a df o r e g r o u n dt ob ea p p f i e da n dd e v e l o p e db ya n db y i nt h i sa r t i c l e ， f r o mt h er e a l i t y , t a k et h ec o m p r e h e n s i v eu t i l i z a t i o ns o y b e a nr e s o u r c e sa n dt h ep r o d u c t i o no f d i f f e r e n tc o n t e n to fs o y b e a ni s o f l a v o u ea sag o a l ，t h es o y b e a nr e s i d u ea sr a wm a t e r i a l s ，s t u d y o i le x t r a t i o n 、p u r i f i e sa n dh y d r o l i s i so fs o y b e a ni s o f l a v o u et h r o u g ht h em a s s i v ec o n t r a s t s e x p e r i m e n t , a n ds t u d yi m m u n i t yf u n c t i o no fs o y b e a ni s o f l a v o n eg i n c o s i d ea n ds o y b e a n i s o f l a v o n ea g l y c o n et h r o u g ht h ec o n t r a s t se x p e r i m e n t t h i ss t u d yi n c l u d et h em a i nc o n t e n t sa n dr e s u l t s 勰f o u o w i n 笛 1 t h es o y b e a nr e s i d u ea sr a wm a t e r i a l si nt h ee x p e r i m e n t t h r o u g ht h eo r t h o g o n a l e x p e r i m e n ta n dt h ev a r i a n c ea n a l y s i s o b t a l nt h eb e s tc o n d i t i o no i lr c t u l ne x t r a c t i o no f a l c o h o l ：t h ec o n t e n ti s2 7 5 a n dt h ey i e l do fi s o f l a v o n ei s6 2 7 m g gw h e ns o y b 啪 r e s i d u ei ss o a k e di n5 0 a q u e o u se t h a n o l1 ：1 0a st h er a t i oo fr a wm a r t i a lt os o l v e n tf o r 3h o u r sa t7 0 t h cb e s tc o n d i t i o no na s s i s t a n c ee x t r a c t i o no fu l t r a s o n i cw a v e ：t h e c o n t e n ti s2 7 5 a n dt h ey i e l do fi s o f l a v o n ej s6 3 5 m g gw h e ns o y b e a nr e s i d u ei ss o a k e d i n6 0 m u c u se t h a n o l ，1 ：8a st h er a t i oo fr a wm a t e r i a lt os o l v e n tf o r3 0m i n u t e su n d e r u l t r a s o n i cw a v ec o n d i d o n ( 1 8 0 w ，4 0 k i - i z ) a t4 0 zs t u d yo nt h ea b s o r p t i o nf r o mi s o f l a v o u eb yr e s i na n ds t a t i ca b s m br e s e a r c hb yt e nk i n d s o fr e s i n si nt h ee x p e r i m e n t t h et e c h n o l o g yo fp u r i f y i n gi s o f l a v o n eb ym a c r o p o r o n sr e s i n h p d 一6 0 0i se s m b i i s h e d t h ep a r a m e t e r sa r ea sf o l l o w s ：t h ec o n c e n t r a t i o no fc r u d e i s o f l a v o n es o l u t i o ni s0 1 5 m g m l ；i t sp hv a l u ei s4 5 ：i t sv o l u m ei s4 5 t i m e s 雒r e s i n b e dv o l u m e ；c r u d ei s o f l a v o n es o l u t i o ni sa d s o r b e da tt h es p e e do f1 0 m lp e rm i n u t e ，t h e n a d s o r b e di ns t a t i cs t a t ef o r2 5 0m i n u t e s ，d e s o r b e d 谢t h8 0 a q o 璐e t h a n o la tt h es p e e d o f0 5 m lp e rm i n u t e i t sv o l u m ei s3 0 t i m e s 勰r e s i nb e dv o l u m e ；a f t e rc o n d e n s e da n d d r ! i c d d e s o r p t i o ns o l u t i o nb e c o m e sp u r i f i e dp r o d u c t t h es o y b e a ni s o f l a v o u ec o n t e n to f w h i c hi s2 0 1 1 e n h a n c e d7 1 8 t i m e st h a nr a wm a t e r i e d 3 c o m p a r e st h ee f f e c to ne x t r a c t i o no fd i f f e r e n ts o l v e n ti nt h ee x p e r i m e n t ，t h er e t u r n 3 第一章前言 e x t r a c t i o no fa c e t o n eb o i l i n gp o i n tt h a th a sb e e na l l o w e dt oo b t a i nt h ec o n t e n ti s4 2 9 1 s o y b e a ni s o f l a v o n ep r o d u c t ，t h ep u r i t ye n h a n c e s2 1 3 t i m e sc o m p a r e dt ot h ec o n t e n t 2 0 1 1 r a wm a t e r i a l s ；t h er e m me x t r a c t i o no fe t h y l a c e t a t ea n da c e t o n ec o m b i n a t i o n b o i l i n gp o i n t , m a yo b t a i nt h ec o n t e n ti s7 0 3 6 s o y b e a ni s o f l a v o n e sp r o d u c t , t h ep u r i t y e n h a n c e s1 6 4t i m e sc o m p a r e dt ot h ec o n t e n t4 2 9 1 r a wm a t e r i a l s 4 皿es o y b e a ni s o f l a v o n eg l u c o s i d ea sar a wm a t e r i a li nt h ee x p e r i m e n t ，t h r o u g ht h e o r t h o g o n a le x p e r i m e n ta n dt h ev a r i a n c ea n a l y s i s ，o b t a i n st h eb e s t c o n d i t i o n0 1 1a c i d h y d r o l i s i s ：t h eh c la l c o h o ls o l u t i o nc o n c e n t r a t i o ni s3 t o o l l , t h eh y d r o l i s i st e m p e r a t u r ei s 8 0 ，t h eh y d r o l i s i st i m ei s1 8 0m i n u t e s ，t h ea c i dh y d r o l i s i sr a t ei s8 1 3 2 ；t h eb e s t c o n d i t i o no ne n z y m o l y s i s ：hp hi s6 0c u s h i o n sh q u i d si sc e n t e r , t h ee n z y m o l y s i s t e m p e r a t u r ei s3 8 c 。t h ee n z y m o l y s i st i m ei s 9 0m i n u t e s ，a d d st h ee n z y m ea d d i t i o ni s 4 0 r a g ( 4 ) ，t h ee n z y m o l y s i sr a t ei s8 2 5 5 t h er e s u l t ss h o w ：e n z y m a t i ch y d r o l y s i so f s o y b e a ni s o f l a v o n eg l y c o s i d e h v t t e rt h a na c i dh y d r o l y s i sr e s u l t s 5 f e e d st h em o u s eo ns o y b e a n s o f l a v o n eg l u c o s i d ea n ds o y b e a ni s o f l a v o n ea g l y c o n ei t h ee x p e r i m e n t i t sc h i c k e nr e db l o o dc e l lm a k e st h ei m m u n i t yo r i o n a lh e m o l y s i no d v a l u ei sm o r co b v i o u si n c r e a s et h a nb l a n kc o m p a r i s o ng r o u pu n d e rt h es a m ee n v i r o n m e n t t h i sh a si n d i c a t e ds o y b e a nl s o f l a v o n eg l u c o s i d ea n dt h ea g l y c o n ec a ne f f e c t i v e l ye n h a n c e t h ei m m u n i t yf u n c t i o no fm o u s e a n dt h ea b s o r p t i o no ss o y b e a ni s o f l a v o n ea g l y c o n e i sb e t t e rt h a ns o y b e a ni s o f l a v o n eg l u c o s i d ei nt h em e a n t i m e ，t h ei m m u n i t y f u n c t i o no ft h es o y b e a ni s o f l a v o n ea g l y c o n ei sb e t t e rt h a ns o y b e a ni s o f l a v o n e g l u c o s i d e k e y w o r d s ：s o y b e a ni s o f l a v o n e , g l u e o s i d e , a g l y c o n e , e x t r a e t i o n , p u r i f l e s , h y d r o l i s i s ， i m m u n i t yf u n c t i o n 4 沈阳农业大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 大豆异黄酮概述 1 1 1 大豆异黄酮的组成及结构 大豆含有大量活性成分，被人们称为“功能性成分的宝库”，大豆异黄酮( s o y b e a n l s o i l a v o n e ) 是大豆生长中形成的一类次生代谢产物，属于黄酮类化合物中异黄酮类成分， 主要是指以3 苯并吡喃酮为母核的化合物，迄今为止从大豆中共分离出1 2 种大豆异黄酮 异构体，分为游离型的苷元( a g l y c o n s ) 和结合型的糖苷( g l u c o s i d e s ) 两类，其中苷元占总 量的2 3 ，包括染料木素( g e n i s t e i n ) 、大豆苷元( d a i d z e i n ) 和黄豆黄素( g l y c i t e i n ) 三 种。结合型糖苷由三种萤元衍生丽成，占总量的9 r 7 9 8 ，主要以染料木苷( g e n i s t i n ) 、 大豆苷( d a i d z i n ) 和6 - o 丙二酰基染料木苷( 6 ，o m a l o y l g e n i s t i n ) 等九种形式存在 ( p h i h p p ee t a l 。2 0 0 4 ：c h u n gh le t a l ，2 0 0 5 ) 。其中主要成分有三种，染料木素( g e n i s t e n ) 、 大豆苷元( d a i d z e i n ) 和黄豆黄素( g l y c i t e i n ) 。它们具有共同的母核结构染料木素为母核 5 、7 、4 位被羟基取代的三羟异黄酮，大豆苷元和黄豆黄素均为7 、4 被取代的二羟异黄 酮，其中黄豆黄素母核6 位存在甲氧基。在天然状态下，这三种异黄酮母核与葡萄糖以b 糖苷键连接，以异黄酮葡萄糖苷形式存在于大豆中，分别称为染料木苷( g e n i s t i n ) 、大 豆苷( d a i d z i n ) 和6 甲氧基黄豆苷( g l y c i t i n ) ，当大豆在加工、发酵或体外水解时，糖苷基 脱离，可释放出游离的异黄酮糖苷配基( 王康成，蔡军，2 0 0 4 ) 。h o s n ym h 等( 1 9 9 9 ) 曾经从大豆醇法提取的乳清中分离鉴定出三种新的异黄酮，使大豆中异黄酮的数量增加 到1 5 种。但是由于它们不是从大豆中直接分离出来的，它们是否是大豆的特征成分还有 待作迸一步证明。大豆异黄酮苷元的结构见表1 1 和图1 1 ，大豆异黄酮稽苷的结构见表 1 2 和图1 2 ( 崔洪斌，2 0 0 1 ) 。 袭1 - 1 大豆异黄酮苷元的结构 t a b l e1 - 1s t r u c t u r eo f a g l y c o n s 第一章前言 图1 - 1 大豆异黄酮苷元的结构 f i gi - is t r u c t m eo f a s l y c o n s 衰1 2 大豆异黄酮糖苷的结构 t a b k1 - 2s t n l c t u r eo f o l u c o s d c s 图1 - 2 大豆异黄酮疆苷的结构 f i 9 1 - 2s l m a u r e o f g l u c o s l d e s 1 1 2 大豆异黄酮的来源及分布 大豆异黄酮是生物黄酮中的一种。自然界中异黄酮的资源十分有限，主要来源于豆 科植物的荚豆类、葛根等少数植物中，其中大豆中的含量较高，其含量为0 1 0 5 ， 而大豆又是唯一含有异黄酮且含量在营养学上有意义的食物资源，其变化范围约为0 5 o 7 m g 干大豆，不同大豆品种中大豆异黄酮含量不圆。大豆异黄酮在大豆中主要分布 于大豆种子的子叶和胚轴中，子叶中约为0 1 o 3 ，胚轴中所含异黄酮种类较多且浓 6 沈阳农业大学硕士学位论文 度较高，所占比例却很少( 1 0 2 0 ) ；种皮中异黄酮含量极少( 梁慧珍等，2 0 0 5 ) 大豆种子中异黄酮的成分见表1 - 3 ( 李里特，2 0 0 2 ) 。 裹1 3 大豆种子中异黄酮的成分( ，桃) t a b l e1 - 3i s o t l a v o n cj n 掣口凼姐协o f s o y b e a ns e e d ( u g g ) 异黄酮类 室温( 提取2 4 h )( 提取1 5 1 1 ) g o 出v o n cc i a 罄t h e o mt e m p e r a t m e ( e x 扛a c t i o n2 4 h ) 8 0 塑【缸8 c l i o n1 5 坠 胚轴子叶胚轴子叶 啦型型业堂!啦丝塑型鲤塑 d a 胁3 2 0 4 58 3 81 4 5 g 蛹缸1 1 8 8 02 4 62 1 0 g l y c e r i n 4851004 6 ”o - a c e t y d a i d z i a 225 78 6 - o - a c e t y 蛐 1 0 513 91 6 - o - a c e t y g l y c i t i a 689 疗协i d a l o n y d a i d z m 4 2 3 7 083 酽o m a l o y l g e n i s t i a 1 4 4 1 1 74 6 - o - m a l o y l g l y c i f i n 4451 1 一。 d a i d z e i n1 0 25 33 51 1 g 即_ i s e i n3 54 81 61 4 glycikin 一 15 t o t a lq u a n t 姆2 1 8 53 9 62 3 6 2 3 9 2 研究表明，不同大豆品种的大豆异黄酮含量显著不同；同时，大豆异黄酮含量与生 长环境、田问管理、基因型有关，而且也受到栽培时期、地理环境、生长期等多种内外 因素的影响，其中遗传因素是重要的影响因子之一( p a t e lrpe t a l ，2 0 0 1 ；k m t _ rm se t a l ， 2 0 0 2 ：k r i t z - s i l v e r s t e i nde t a l ，2 0 0 2 ) 。 1 1 3 大豆异黄酮的理化性质 纯大豆异黄酮是无色、有苦涩味的晶体状物质，染料木素为无色片状结晶，大豆苷 元为无色针状结晶，工业上的大豆异黄酮产品为白色或淡黄色粉末，品尝时具有苦味、 收敛性和于涩感觉。大豆异黄酮苷元，尤其是染料木素和大豆苷元比糖苷具有更强的不 偷快风味。合成的大豆苷元的熔点为3 2 0 3 2 1 c ，合成的染料木素的熔点为2 9 5 2 9 6 ， 合成的以及从大豆胚芽中提取的黄豆黄素的熔点为3 3 7 3 3 9 。常温下大豆异黄酮性质 稳定，易溶于醇类、酯类、酮类溶剂和稀碱中，不溶于水，难溶于石油醚、苯、正己烷 等非极性的有机溶剂( 井乐刚，张永忠，2 0 0 6 ) 。大豆异黄酮中的葡萄糖苷在高温强酸 或酶存在的条件下水解去掉葡萄糖基而转变成葡萄糖苷配基形式。大豆异黄酮对盐酸 镁粉或钠汞试剂呈鲜红色、紫色或黄色，与金属盐试剂如铝盐、铬盐、铅盐等可生成带色 的络合物。大豆异黄酮的苷元具有多酚羟基结构从而发挥还原效应( 金俊艳，郝为民， 7 第一章前言 2 0 0 7 ) 。 1 1 4 大豆异黄酮的生理功能 ( 1 ) 抗癌及预防作用 美国科学家于1 9 8 6 年发现大豆异黄酮的抗癌作用，1 9 9 0 年美国国家癌症研究院肯定 了大豆异黄酮是最佳的天然抗癌物质。h u a c h e nw e i 等( 2 0 0 3 ) 认为染料木素在细胞增 殖过程中有力的抑制酪氨酸蛋白激酶( t p k ) 活性，拓扑异构酶，核糖体s 6 激酶，从而 防止新血管的生成而达到防癌的作用。目前提出的大豆异黄酮抗癌的作用机制主要有以 下几个方面：类雌激素样作用，能抑制一些依赖于雌激素生长的肿瘤的增殖：抑制 肿瘤细胞合成过程中所需的酶，如酪氨酸蛋白激酶、拓扑异构酶等；抗氧化作用，能 减轻活性氧、自由基对细胞的损伤，防止细胞突变和肿瘤发生；调节细胞周期蛋白及 凋亡相关蛋白的表达，使细胞周期停滞于某一时相及诱导细胞凋亡；在肿瘤细胞增殖 转移阶段，大豆异黄酮能明显抑制肿瘤血管生成，间接抑制肿瘤细胞生长( e a s o nr re t a l ， 2 0 0 5 ；a g u e r om ee t a l ，2 0 0 5 ；刘寒强，2 0 0 5 ) 。目前普遍认为单独服用异黄酮或配合 化疗可能是一种有效的抗癌方法。研究表明，各种癌症，包括乳腺癌、前列腺癌、结肠 癌、直肠癌、胃癌以及肺癌等发病率都与大豆的摄取呈负相关性( w a n gt c e t a l ，2 0 0 5 ： 李玉珍等，2 0 0 5 ) 。 ( 2 ) 抗心血管疾病作用 目前，心血管疾病已成为危害人类生命的高发性疾病。流行病学调查证实，人们长期 摄食大豆制品能延缓动脉粥样硬化发生，有效预防心血管病( s i r t o f ie t a l ，2 0 0 1 ) 。近年 来，研究者对大豆异黄酮在预防心血管疾病中的作用机制进行了大量研究，目前比较成熟 的机制有以下几种：大豆异黄酮可使低密度脂蛋白0 u d l ) 受体发生正向调节，从而促 进胆固醇的清除；防止低密度脂蛋i ! t ( l d l ) 过度氧化，染料木素对脂质过氧化体系中的 脂质自由基有显著的清除作用：抑制血管平滑肌细胞的增殖；抗血栓生成，染料木素 可通过对酪氨酸激酶的抑制作用来抑制血小板激活和凝聚( 杨茂区等，2 0 0 6 ) 。 ( 3 ) 抗骨质琉松症 2 0 世纪9 0 年代初科学家研究证实大豆异黄酮具有防治骨质疏松症的功效。近年来， 大豆异黄酮对预防骨质疏松效果的研究取得显著进展。研究发现，大豆异黄酮既可刺激 骨的形成也可抑制骨的再吸收。异黄酮能激活雌激素受体以提高成骨细胞的活性，并能 促进胰岛素样生长因子( i g f - i ) 的产生，而i g f - i 能提高人体成骨细胞的活性( 蔡健，2 0 0 4 ) 。 8 沈阳农业大学硕士学位论文 临床研究显示，大豆异黄酮能促进腰脊柱骨的更新并减少骨损失。研究已证实，i g f - i 含量与绝经前、绝经期和绝经后妇女的骨骼质量呈正相关关系( a i j m a n d ib h e t a l ， 2 0 0 2 ) 。对9 0 名4 7 5 7 岁绝经后妇女的临床试验结果证实，大豆异黄酮能减少绝经后妇 女骨质的再吸收并增加骨的形成( m o r a b i t on e t a l ，2 0 0 2 ) 。总之，免疫学研究以及动 物试验证实大豆异黄酮具有明显的预防骨质疏松症效果( 刘阳，2 0 0 4 ) 。 ( 4 ) 抗妇女更年期综合症作用 更年期综合症是由于妇女绝经后卵巢分泌的各个时期的分泌的雌激素减少而造成 的，可出现情绪低落、精神沮丧、面部潮垃、多汗、心悸等紊乱症状。大豆异黄酮具有 雌激素活性，能缓解妇女更年期因雌激素的分泌量的急剧下降而引起的更年期综合症 ( v a n t y g h e ms ae t a l ，2 0 0 5 ) 。临床调查显示：日本女性更年期综合症与欧美国家女性相 比较，其症状较轻微。这是因为日本女性血液中异黄酮类物质含量高于欧美国家的女性， 而大豆异黄酮能够缓解因雌激素分泌不平衡所形成的临床症状。c a v a z z a 申请了一个可 作为膳食补充物或药剂来治疗骨质疏松和绝经期症状产品的专利。该产品的活性成分是 i 广肉毒碱和大豆异黄酮，具有极低的毒性。e m p i e 和g l l g g e r j 丕申请了用该混合物治疗妇 科病，如瞬间热、绝经期症状、睡眠紊乱或其他与性激素减少和黄酮可减少月经有关的 症状的专利( g u oj me t a l ，2 0 0 4 ；崔旭海等，2 0 0 5 ) 。 ( 5 ) 其他生理功能 大豆异黄酮还具有抗氧化作用( l e ey be t a l ，2 0 0 5 ；郑灵芝等，2 0 0 6 ) ，抗早老年 性痴呆( 黄艺丹，陈正礼，2 0 0 6 ) ，抗机体免疫力下降，抗菌消炎( l e ec he t a l ，2 0 0 5 ) ， 抗机体功能衰老抗溶血等作用( 房岩等，2 0 0 6 ) 。此外，大豆异黄酮的生理功能还包括： 作为a 葡萄糖苷酶抑制剂，能有效改善代谢紊乱( l e ed i - l e t a l , 2 0 0 1 ) 能提高加压 素水平，因而具有抗利尿作用，而对下丘脑的r 内啡肤分泌没有影响( s c a l e r 八c e t a l ， 2 0 0 3 ) ；可减轻斑形脱发的易感性( m c e l w e ek j e t a l ，2 0 0 3 ) ；能改变脑的形态学 参数和生殖内分泌参数，并使视网膜增厚等( l u r i dt d e t a l ，2 0 0 3 ：高荣海等，2 0 0 6 ) 。 1 2 大豆异黄酮的提取、分离及检测方法 1 2 1 大豆异黄酮的提取方法 大豆异黄酮的提取方法很多，主要是根据大豆异黄酮糖苷和苷元的性质及伴存的杂 质来选择合适的方法，如溶剂萃取法、超声波和微波提取法、超临界流体提取法等。溶 剂萃取法是目前最常用的提取大豆异黄酮的方法，该法的优点是提取率高且产品不易变 9 第一章前言 性。所选用的有机溶剂有乙酸乙酯、丙酮、乙醇和甲醇等。杨阳等( 2 0 0 6 ) 通过试验确 定含水乙醇为溶剂提取大豆异黄酮的最佳条件。超声波辅助提取快速、价廉、提取率高。 在各种样品中，无论是对有机物还是无机物，超声波辅助提取都有较广泛的应用。但这 种应用目前还多是手工操作，而且主要用在小型实验室。a c h o u r ia 等( 2 0 0 5 ) 和m a u r i c i o a 等( 2 0 q 3 ) 分别等通过试验证实在提取溶剂、温度、时间相同条件下，超声波辅助提 取大豆异黄酮比溶剂提取具有更高效率。肖虹等( 2 0 0 6 ) 通过试验确定超声乙醇法提取 大豆异黄酮的最佳条件。微波萃取技术应用于大豆异黄酮提取工艺中，可加快传质速率， 提高提取率，有效缩短萃取时间，但此技术尚未实现工业化，还仅是实验室的小型研究 阶段。张永忠等( 2 0 0 3 ) 通过试验确定微波法预处理提取大豆异黄酮工艺条件。超临界 流体萃取法提取大豆异黄酮，具有提取率高、产品纯度好、流程简单、能耗低、无有机 溶剂残留等优点，但对设备要求较高，不易形成工业化生产。魏立文( 2 0 0 5 ) 已经申请 了超临界c 0 2 萃取高纯度大豆异黄酮工艺的专利，萃取所得灰白色粉末，即为纯度9 0 以上的大豆异黄酮。 1 2 2 大豆异黄酮的分离方法 为了得到高纯度的大豆异黄酮及其单体成分，需要对大豆异黄酮粗提物进行分离纯 化。目前，大豆异黄酮的分离方法主要有：柱层析法，姚开等( 2 0 0 4 ) 比较了硅胶柱、 聚酰胺柱、葡聚糖凝胶柱层析法对大豆异黄酮单体分离效果，从而得到结论：硅胶柱层 析对大豆异黄酮苷元的分离效果好；聚酰胺柱层析对大豆异黄酮糖苷的分离效果好；葡 聚糖凝胶柱层析可以使大豆异黄酮中的染料木苷和大豆苷得到最好的分离；高效液相 色谱法f f i p l c ) ，杨学东等( 2 0 0 6 ) 利用制备高效液相色谱法，从大豆总异黄酮提取物中 制备出了纯度均达到了9 9 以上的大豆苷、黄豆苷和染料木苷；高速逆流色谱法 ( h s c c c ) ，江和源等( 2 0 0 4 ) 采用高速逆流色谱法分离纯化大豆异黄酮中的大豆苷和染 料木苷，纯度分别达到9 8 2 和9 9 2 ；固相萃取( s p e ) ，m a u r i c i oa 等( 2 0 0 5 ) 对大豆样品进行固相萃取，分离出大豆产品中异黄酮的成分，s a t t e r f i e l dm ( 2 0 0 1 ) 等 采用固相微萃取与高效液相色谱联用技术对生物样品中的大豆苷元和染料木素进行了 检测( 邓琳等，2 0 0 4 ；曲丽萍等，2 0 0 6 ) 。 1 2 3 大豆异黄酮的检测方法 大豆异黄酮的定性定量检测方法很多( 高荣海等，2 0 0 6 ) ，主要有：紫外分光光度 法，付钰洁等( 2 0 0 5 ) 采用紫外分光光度法以葛根素为标准品，在其紫外最大吸收 1 0 沈阳农业大学硕士学位论文 峰2 5 0 r i m 处测定超声波循环提取液中大豆异黄酮的含量：魏福华等( 2 0 0 6 ) 以染料木素 为标准品，利用三波长紫外分光光度法，分别在2 4 0 r i m ，2 6 0 r i m ，2 8 0 r i m 三个检测波长 处，对东北大豆的1 1 个品种进行了异黄酮含量的测定；高效液相色谱法0 n , i c ) ，阮 洪生等( 2 0 0 6 ) 采用r p i - i p l c ，测定豆粕中染料木素和大豆苷元的含量，刘涛等( 2 0 0 6 ) 以大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素四个标样为标准品，对保健食品中大豆异黄 酮的进行检测；高效液相色谱质谱法0 i p t c - m s ) ，董怀海等( 2 0 0 2 ) 建立的h p l c - m s 法，能够方便快捷地确认大豆异黄酮各组分在液相色谱图中各峰的归属；气相色谱法 ( g o ，l i g g i n sj 等( 2 0 0 0 ) 采用毛细管气- 质联用测定大豆中大豆黄素和染料木素的总 含量，孙艳梅( 2 0 0 3 ) 采用气相色谱法，确定了大豆苷元的保留时间和标准工作曲线方 程；毛细管电泳法( c e ) ，吴同等( 2 0 0 3 ) 运用毛细管电泳法成功地同时分离大豆异黄 酮当中的4 种成分；薄层扫描色谱法( 1 r ic s ) ，赵胜利等采用硅胶g 薄层板，扫描测 定了大豆黄素的含量。孟祥颖等采用双波长薄层扫描法首次分离并测定葛藤与葛根中3 种异黄酮化合物的含量。赵世萍等采用硅胶g 薄层板，分离了大豆苷元、大豆苷等4 种成分( 杨晓文，2 0 0 6 ) ；双向纸层析色谱法，彭义交等( 2 0 0 4 ) 采用双向纸层析方 法对豆粕甲醇提取液中的大豆异黄酮成分进行分析；医学上检测方法，时间分辨荧光 免疫分析法( t r f i 舢和酶联免疫吸附法( e l i s a ) ( 蒋蔡滨，2 0 0 6 ) 。 1 3 大豆异黄酮糖苷水解的研究进展 1 3 1 大豆异黄酮糖苷水解的方法 大豆异黄酮糖苷水解的方法主要有：大豆异黄酮糖苷的酸水解，丁芳林等( 2 0 0 6 ) 研究了乙醇水体系提取大豆异黄酮后，再经酸水解的最优工艺条件。酸水解的效率很 高，但是酸性条件下大豆异黄酮苷元的稳定性值得怀疑。另外，强酸条件下不易进行工 业化生产；大豆异黄酮糖苷的酶水解，谢明杰等( 2 0 0 4 ) 由a b s i d i as p r 菌株通过液体 发酵的方法得到大豆异黄酮糖苷的水解酶，并确定了酶法水解的最佳条件。酶的专属性 很强，酶水解条件温和，多采用弱酸性的缓冲溶液，大豆异黄酮苷元不易变性，酶法水 解是工业上制各富含大豆异黄酮苷元产品的十分有青途的途径；大豆异黄酮糖苷的其 他水解方法，碱水解和s m i t h 降解( 韩锋，翟桂香，2 0 0 4 ：高荣海等，2 0 0 6 ) 。 1 3 2 大豆异黄酮糖苷水解的意义 近年来，随着大豆异黄酮保健作用研究开发的不断深入，大豆异黄酮的存在形式及 生理功能的机理正逐渐被人们认识。研究表明，天然存在的大豆异黄酮有9 7 9 8 是 第一章前言 以b 葡萄糖苷的形式存在，只有将近2 3 是以游离型苷元形式存在，包括染料木素、 大豆苷元和黄豆黄素。据研究大豆异黄酮苷元比糖苷形式具有更高的生物活性，且起主 要作用的是染料木素和大豆苷元。大豆及大豆食品中的大豆异黄酮主要以糖苷型形式存 在，人体一般较难吸收此种形式的异黄酮，若将其水解成相应的苷元则易被人体有效吸 收利用。因此，将大豆异黄酮糖苷水解为异黄酮苷元具有重要的意义( 张晓红等，2 0 0 6 ) 。 1 4 大豆异黄酮的研究现状 1 4 1 大豆异黄酮的国外研究现状 大豆异黄酮是一种天然植物保健品，正处于开发阶段，其市场前景很大。近年来， 美国、日本、德国、英国出现了大豆异黄酮热，美国和日本对大豆异黄酮开展了大量的 研究工作。1 9 9 5 年1 1 月，世界上第一个以大豆异黄酮为主要原料的功能性食品在芬兰市 场上出现。1 9 9 6 年，美国f d a 批准大豆异黄酮作为健康食品上市。美国a d m 公司1 9 9 9 年在加州建立了第一家大豆异黄酮生产厂，推出了纯度为3 0 的大豆异黄酮原料。目前 以大豆异黄酮为主要成分的保健食品已成为一种新型畅销食品，国外市场上含有大豆异 黄酮的保健食品达数百种之多，如含有大豆异黄酮的片剂、口服液、粉剂等，高纯度的 大豆异黄酮已应用于医药产品的开发。资料显示，目前美国市场上已经有3 0 0 多种大豆 异黄酮功能食品，年销售额近6 0 亿美元，据c m r f 古计，全球各种大豆异黄酮食品总销售 额已达7 0 亿8 0 亿美元，该类产品最大的生产厂家是a d m 公司。1 9 9 8 年世界大豆异黄 酮生产能力仅为3 0 吨年，1 9 9 9 年达到7 0 吨年。当前国际市场对大豆异黄酮的年需求量 已达1 5 0 0 吨，但实际年产量仅为5 0 0 吨，可见其需求增长很快( 梁敏，邹东恢，2 0 0 5 ) 。 1 4 2 大豆异黄酮的国内研究现状 近几年来，我国对大豆异黄酮的研究已经成为热点。在国内的大豆异黄酮作为食品、 保健品、特别是医药的中间体，也被用作食品添加剂、保健食品和药物组分。近两年大 豆异黄酮保健食品的概念开始升温，黑龙江九三油脂、山东三维油脂、华北制药、辽阳 博丰等十几家企业加入到大豆异黄酮产品行列。据了解，目前，商业化生产的大豆异黄 酮原料纯度为4 0 左右。也有部分企业为满足市场需求已生产出含量不等的多层次大豆 异黄酮产品，目前在全球范围内，大豆异黄酮类产品基本是以功能食品的身份在市场上 销售，而我国近9 0 的大豆异黄酮作为原材料出口，仅有约占1 0 的产出量在国内被转 化为终端产品。因此，国内食品科研部门已经立项多开发大豆异黄酮产品，这不仅能填 补国内市场的空白，还能提高大豆产品的附加值( 蔡健，2 0 0 4 ) 。 沈阳农业大学硕士学位论文 1 5 论文研究的意义 鉴予大豆异黄酮对人体保健及疾病防治的重要性，及其在食品保健及医药卫生事业 中的广泛应用。随着科技的进步、社会的发展，对大豆异黄酮研究