（食品科学专业论文）小麦胚芽抗氧化肽的制备以及富集研究.pdf

摘要 摘要 小麦胚芽是小麦加工中的副产品，目前的利用主要是集中在提取小麦胚芽油，但是 对于脱脂后的麦胚的利用则很少。本文就是以脱脂麦胚为原料，通过a l c a l a s e 酶解来制 备具有抗氧化活性的肽。本实验主要内容包括：辅助酶解，抗氧化肽的精制以及精制抗 氧化肽的性质检测。 首先利用物理手段来提高酶解液抗氧化性。超声波辅助酶解是其中重要的处理手 段。在单因素的基础上，通过响应面法考察了超声功率，超声时间和超声温度对于酶解 过程中d p p h 清除率的影响。结果表明，最佳的试验条件是：超声功率2 1 4 w ，超声时间 3 m i n ，超声时的温度为2 5 ，此时d p p h 清除率理论值为6 2 4 ，实际的清除率可以达到 6 1 2 。微波对酶解原料进行处理，只要是利用微波的热效应，提高蛋白反应效率。以 d p p h 清除率作为指标，从而得到微波处理原料的最适作用时间和最适作用功率。结果 表明：微波处理时间为l m i n ，功率为2 0 0 w 时，酶解液的d p p h 清除率最终可达至l j 7 1 2 6 。 对于酶解之后的液体，采用粉末活性炭对溶液进行脱色。以脱色率和氮保留率为指 标，考察粉末活性炭脱色效果。同时，对于脱色之后的酶解液的抗氧化性质做了研究。 结果表明：粉末活性炭用量为2 ，脱色时间3 0 r a i n ，脱色温度5 0 ，酶解液脱色率可 达8 3 9 ，氮保留率为6 0 6 。脱色之后的酶解液d p p h 清除率是2 2 7 ；螯合铁离子 能力为3 1 9 ；还原能力为0 1 6 2 。 样品经超滤处理之后，再用大孔吸附树脂进行脱盐和脱糖。结果表明，精制的抗氧 化肽样品，分子量小于1 0 0 0 的组分占到9 0 4 6 ；脱盐后盐分含量由原来的6 1 7 降至 2 4 2 ；脱糖是实验的主要内容，本实验脱糖主要是通过酸沉以及大孔吸附树脂来进行 的。结果表明，酸沉后，脱糖率达到了3 3 9 2 ，蛋白含量则提高到了5 8 6 9 ；经大孔 吸附树脂处理之后，脱糖率达到了3 5 4 5 ，蛋白含量为5 5 7 3 ；而将两者结合起来， 最终的脱糖率高达4 1 9 3 ，蛋白含量也高达6 5 2 3 。经过精制的抗氧化肽样品的抗氧 化性也有提高，d p p h 清除率从3 6 3 7 提高到了5 9 0 1 ，还原能力从0 2 3 4 增到0 9 7 4 ， 螯合铁离子的能力则从7 2 0 7 增加到了8 8 3 7 。最终精制抗氧化肽的得率是3 。 关键词：脱脂麦胚抗氧化酶解脱色脱糖大孔吸附树脂 a b s t r a c t a b s t r a c t w h e a tg e r mi sab y p r o d u c to fw h e a tp r o c e s s i n g ，a n dt h ec u r r e n tu s ei s m a i n l y c o n c e n t r a t e di nt h ee x t r a c t i o no fw h e a tg e r mo i l ，b u tt h e ya r ev e r yr a r e l yu s et h ed e f a t t e d w h e a tg e r m t h i sa r t i c l eu s ed e f a t t e dw h e a tg e r ma sr a wm a t e r i a lt op r e p a r ea n t i o x i d a t i v e p e p t i d e sw i t ha l c a l a s e 2 4 l t h i se x p e r i m e n ti n c l u d e ：a u x i l i a r ye n z y m a t i ch y d r o l y s i s ，p u r i f y o fa n t i o x i d a t i v ep e p t i d e sa n dd e t e c t i o no ft h ep u r i f i e da n t i o x i d a t i v ep e p t i d e s f i r s to fa l lt h ep h y s i c a lm e t h o d si su s e dt oi m p r o v et h ea n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yo ft h e e n z y m eh y d r o l y s i s u l t r a s o u n d - a s s i s t e de n z y m a t i ch y d r o l y s i si sa l li m p o r t a n tw a y o nt h e b a s i so fs i n g l e - f a c t o rt e s t ，r e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i sm e t h o dw a sa p p l i e dt os t u d yt h ee f f e c t s o fu l t r a s o n i cp o w e r , u l t r a s o n i ct i m ea n du l t r a s o n i ct e m p e r a t u r eo nt h ee n z y m a t i ch y d r o l y s i so f d e f a t t e dw h e a tg e r m t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eo p t i m a lp a r a m e t e r sa r ea sf o l l o w s ：u l t r a s o n i c p o w e r 214 w ：u l t r a s o n i ct i m e3 m i na n du l t r a s o n i ct e m p e r a t u r e2 5 t h ep r e d i c t i v eb e s td p p h r a d i c a ls c a v e n g i n gr a t ei s6 2 4 ，t h ea c t u a ls c a v e n g i n gr a t ei s6 1 2 m i c r o w a v ep r o c e s s i n g f o rr a wm a t e r i a l si st om a k eu s eo fm i c r o w a v et h e r m a le f f e c t sa n di m p r o v et h er e a c t i o n e f f i c i e n c yo fp r o t e i n e f f e c to fm i c r o w a v ep r o c e s s i n gi ss t u d i e dt og e tt h eo p t i m a lt i m ea n d o p t i m a lp o w e ro nt h ed p p hr a d i c a ls c a v e n g i n gr a t e t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：m i c r o w a v e p r o c e s s i n gt i m ef o rlm i n ，p o w e ro f2 0 0 w , t h ed p p hr a d i c a ls c a v e n g i n gr a t eo ft h es o l u t i o n e v e n t u a l l yr e a c h e d7 1 2 6 a f t e rt h eh y d r o l y s i s ，p o w d e r e da c t i v a t e dc a r b o nw a su s e dt ot h es o l u t i o nf o r d e c o l o r i z a t i o n e f f e c t so fd e c o l o r a t i o nw e r es t u d i e do nt h ed e c o l o r i z i n gr a t ea n dt h er e s e r v e d r a t eo fn i t r o g e n m e a n w h i l e ，t h i ss t u d yi n v e s t i g a t e dt h ea n t i o x i d a t i v ea c t i v i t i e so ft h e h y d r o l y s i so ft h ed e c o l o r i z i n gw h e a tg e r m t h er e s u l ts h o w e dt h a tw h e np o w d e r e da c t i v a t e d c a r b o nc o n c e n t r a t i o n2 ，d e c o l o r i z a t i o nt i m e3 0 m i na n dd e c o l o r i z a t i o nt e m p e r a t u r e5 0 ，t h e d e c o l o r i z i n gr a t ew a s8 3 9 a n dt h er e s e r v e dr a t eo fn i t r o g e nw a s6 0 6 a n t i o x i d a t i v e a c t i v i t ye x h i b i t e d6 2 4 ，0 16 2a n d31 9 o fs c a v e n g i n ga c t i v i t i e so nd p p hr a d i c a l ，t h e r e d u c i n gp o w e ra n dc h e l a t i n ge f f e c to nf e r r o u si o nr e s p e c t i v e l y a f t e rt h es a m p l e sw a sd e a l e d b yu l t r a f i l t r a t i o n ，d e s a l t i n ga n dd e s u g a r i n g w i t l l m a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i nw a si n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em o l e c u l a rw e i g h t o ft h ep u r i f i e da n t i o x i d a t i v ep e p t i d e sf o rl e s st h a n10 0 0a c c o u n t e df o r9 0 4 6 ；a f t e rd e s a l i n g ， t h es a l tc o n t e n tc h a n g e df r o m6 17 t o2 4 2 ：d e s u g a r i n gw h i c hw e r et h em a i ne l e m e n t so f t h ee x p e r i m e n t ，w e r eo p e r a t e db ya c i dp r e c i p i t a t i o na n dm a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i n t h e r e s u l t ss h o w e dt h a t ，t h ed e s u g a r i n gr a t ea r r i v e d3 3 9 2 a n dt h ep r o t e i nw a s5 8 6 9 a f t e ra c i d p r e c i p i t a t i o n a f t e rd e a l i n gw i t hm a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i n ，t h ed e s u g a r i n gr a t ea r r i v e d 3 5 4 5 a n dt h ep r o t e i nw a s5 5 7 3 c o m b i n i n gt h et w ow a y s ，t h ed e s u g a r i n gr a t ea r r i v e d 4 1 9 3 a n dt h ep r o t e i nw a s6 5 2 3 m e a n w h i l e t h ea n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yo ft h ep u r i f i e d p e p t i d e sw a si m p r o v e d ：s c a v e n g i n ga c t i v i t i e so nd p p hr a d i c a lc h a n g e df r o m3 6 3 7 t o 5 9 o1 ，t h er e d u c i n gp o w e rc h a n g e df r o m0 2 3 4t oo 9 7 4a n dc h e l a t i n ge f f e c to nf e r r o u si o n i n c r e a s e df r o m7 2 0 7 t o8 8 3 7 f i n a l l y , t h ey i e l do ft h ep u r i f i e dp e p t i d e sw a s3 k e y w o r d s ：d e f a t t e dw h e a tg e r m ，a n t i o x i d a t i v ea c t i v i t y , e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ，d e c o l o r i z a t i o n ， d e s u g a r i n g ，m a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i n i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名：期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、；1 2 编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：邈趣整导师签名：聋型 日 期：上鱼蚪 1 引言 1 引言 1 1 肽的介绍 肽( p e p t i d e ) 是两个或两个以上的氨基酸以肽键相连的化合物，是介于大分子蛋白质 和氨基酸之间的一段最具活性、最易吸收、生理功能效价高的一种崭新营养，是生物体内 一类重要的活性物质。它们的化学结构式如图： - ， i b c 一一矾一c 一“调卜c 一呱 i &l i h hh 其中r 是不同氨基酸的侧链。因氨基酸的组份和顺序各不相同而组成不同的肽。由两个 氨基酸以肽键相连的化合物称为“二肽”，由多个氨基酸组成的肽则称为“多肽”，组成多 肽的氨基酸单元称为“氨基酸残基”。肽键将氨基酸与氨基酸头尾相连。 按照分子量来分，分子量段在5 0 0 0 - - 18 0 之间的才能称为“肽”。其中分子量段在 5 0 0 0 3 0 0 0 之间的肽称为“大肽”；分子量段在3 0 0 0 1 0 0 0 之间的肽称为“多肽 ，分子量 段在1 0 0 0 1 8 0 之间的称为“小肽 、“寡肽、“低聚肽 ，也称为小分子活性多肽，一般 由2 6 个氨基酸组成。 1 1 1 肽的抗氧化作用 生物活性肽是蛋白质中2 0 个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复 杂的线性、环形结构的不同肽类的总称，是源于蛋白质的多功能化合物。活性肽具有多 种人体代谢和生理调节功能，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂 等作用，食用安全性极高，是当前国际食品界最热门的研究课题和极具发展前景的功能 因子。具有抗氧化性质的肽是其中重要的一类。 肽的抗氧化活性与其氨基酸序列、组成有着密切的关系【l 】。有研究表明，含有组氨 酸的肽可能具有螯合金属、猝灭活性氧和清除羟基自由基的能力。有研究报道氨基酸残 基的氧化是抗氧化肽能够清除自由基的原因之一，但是游离氨基酸并没有表现出抗氧化 活性，因为肽的一级结构是构成其具有抗氧化作用的必要因素1 2 j 。s u e t s u n a 等从酪蛋白 水解物中分离出具有清除超氧自由基能力的抗氧化肽，氨基酸序列为 t y r p h e t y r - p r o g l u l e u ，其中c 端i 拘g l u l e u 证明对活性有较大的贡献1 3 1 。肽的分子量大 小也会影响其抗氧化活性的高低。r o b e r t s 等的研究认为分子量较小的肽较容易穿过细胞 膜从而更好的发挥生物活性【4 j 。 根据来源的不同，抗氧化性的肽又分为动物性肽，植物性肽和其它肽类。 关于动物来源的肽类的研究很多。肌肽( c a r n o s i n e ) 是广泛存在于动物的肌肉和脑组 织中的二肽。肌肽在骨骼肌中的含量高于其他组织，占肌肉净重的0 2 0 5 。刘丽等 探讨了饲料中肌肽的添加对奥尼罗非鱼生长、血清激素水平及肌肉组织抗氧化能力的影 响。试验结果表明：在饲料中添加适宜剂量( 5 0 m g k g ) 的肌肽，能改善鱼体肌肉组织的 抗氧化能力，提高血清中相关的激素水平，促进鱼体内物质代谢，对鱼体生长性能产生 江南大学硕士学位论文 积极影响【5 1 。h s u 等通过研究发现，金枪鱼汁水解液中，起抗氧化作用的是由4 1 0 个氨基 酸组成的三种肽，其结构分别为p r o v a l s e r - h i s a s p h i s a l a - p r o g l u - t y r ( 1 3 0 5d a ) ， p r o s e r - a s p h i s a s p h i s g l u ( 9 3 8d a ) ，a n dv a l h i s a s p 研( 5 8 4d a ) 引。张寒俊等以罗非 鱼皮为原料，采用直接酶法提取胶原蛋白肽，结果表明，产品鱼皮胶原蛋白肽具有较强 的抗氧化活性和羟自由基清除能力，特别是水解度4 时，体外试验清除率( 以邻二氮 菲f e 2 + 氧化法测定酶解液h o 清除能力) 超过8 0 t 7 1 。李琳等研究鳙鱼抗氧化肽延缓衰 老的作用【引。结果表明，鳙鱼抗氧化肽可显著延长果蝇的平均寿命和最高寿命，降低致 衰小鼠肝脑组织o o m d a 的含量及脑组织q b m a o b 的活性( p 分离温度 分离压力 萃 取压力。张晓红等【2 4 】用酶法有机溶剂萃取小麦胚芽油，以出油率为标准确定酶解过程的 最佳工艺参数，然后按其参数进行冷榨生产实验研究，确定最佳温度为7 0 。c ，水分含量 为7 ，压力为3 5 m p a ，转速为3 6 r m i n ，最终其出油率可达至l j 4 1 6 。张福琪等【2 5 j 利用 超临界c 0 2 萃取小麦胚芽油，考察了压力、时间、温度、c 0 2 流量及水分含量等萃取的一 最佳条件，结果表明，萃取率可达8 5 以上。左青等【2 6 j 采用4 号溶剂浸出技术提取小麦 胚芽，最终v e 浓度可达6 0 7 0 。这一技术的突出优点是投资低，操作温度低，耗能 少，操作成本远低于超临界c 0 2 浸出。g e l m e z 等1 27 】通过研究发现，超临界c 0 2 在4 4 2 e ( 压 强单位) ，4 2 以及4 2 m i n 时，小麦胚芽油的回收率可达9 1 。利用超临界c 0 2 流体萃取 小麦胚芽油与传统有机溶剂相比，具有工艺简便易分离，无溶剂残留等特点，所得小麦 胚芽油色泽浅、风味好，在我国已经形成了成熟的工业化规模生产。 1 2 2 脱脂麦胚的利用现状 对于脱脂买配的利用，主要还是针对麦胚蛋白。麦胚芽中蛋白含量是面粉的3 倍【2 引， 小麦胚芽蛋白被被认为是明显优于动物蛋白的一类蛋白，同时氨基酸含量丰富，尤其是 必需氨基酸，比如赖氨酸，蛋氨酸以及苏氨酸，而这些氨基酸在很多谷物中是缺乏的1 2 9 】。 1 引言 杨立树从脱脂后的小麦胚芽中提取麦胚蛋白【3 0 l ，结果表明：控制加水量1 5 倍( 原料 量) 、p h9 5 、温度5 0 进行第1 次碱提( 时间6 0m i n ) ，离心，将离心所得沉淀物用5 倍 ( 原料量) 温度为5 0 的水进行第2 次碱提，离心；将2 次碱提的上清液调p h 值到p h4 0 ( 麦胚蛋白的等电点) ，离心，将沉淀物低温干燥即得产品。得率：6 6 7g 1 0 0g 蛋白质 ( 2 3 3 7g l o og 原料) 。 a r s h a d 等研究脱脂小麦胚芽在饼干中代替面粉【3 ，结果表明：脱脂麦胚占到饼干含 量的1 5 时，蛋白效率比，净蛋白利用，生物价以及真实消化率这些指标都与酪蛋白食 物相似。 g e 等研究了将脱脂麦胚和面粉按照一定比例混合，制作营养面条【3 2 1 。结果表明，添 加1 5 的脱脂麦胚，面条的营养含量和品质特性例如拉伸力等是非常好的。周锡源等利 用脱脂麦胚来制作饮料，结果表明，利用脱脂麦胚做蛋白饮料是可行的，各项指标符合 国家规定，且营养及其丰由l 矧。葛毅强等研究了利用脱脂麦胚和花生搭配，来制作花生 酱。结果表明，脱脂麦胚和花生的比例为1 ：3 为最好，可得到风味，色泽，质地和口感 均极佳的产品，其氨基酸含量即平衡得到很大改掣3 4 】。董英等研究了脱脂麦胚蛋白粉对 火腿肠的生产得率，营养组成以及微观结构的影响【3 5 1 ，结果表明，脱脂麦胚蛋白粉代替 3 5 的瘦猪肉是可行的，火腿肠蛋白含量符合国家标准，同时脂肪含量有所降低，火腿 肠得率显著提高。 1 3 本课题研究的意义和主要内容 小麦是世界上最早栽培的植物之一，也是世界上种植最广泛的粮食作物，全世界约 有3 5 4 0 的人口以小麦作为主要粮食作物。据f a o 统计，2 0 0 5 年中国小麦种植面积为 3 89 9 2 万亩，平均亩产2 8 0 公斤，总产量为9 6 1 6 万吨，约占全国粮食作物面积的2 7 5 ， 占全国粮食总产量的2 2 7 ，仅次于水稻占第二位重要粮食作物。 我国的小麦总产量为世界第一位，年总产量约为1 1 0 亿吨，可以开发利用的小麦胚 芽潜藏量高达2 8 0 4 2 0 万吨，目前小麦胚芽年产量可达3 5 万吨。小麦胚芽含有丰富的不 饱和脂肪酸、酶和色素，如果将其混入面粉，不仅会影响面粉色泽，不利于面粉长期储 存，还会影响面粉烘焙品质。由于我国的小麦胚芽的转化利用的研究起步较晚，大部分 的小麦胚芽得不到充分、合理、有效的利用。目前主要的提高其附加值的利用就是制备 小麦胚芽油。脱脂后的小麦胚芽则更是少有人问津。 本课题就是以脱脂的小麦胚芽作为原料，利用碱性蛋白酶酶解脱脂后的小麦胚芽， 来制得具有抗氧化性质的肽类物质。将其作为一种活性成分添加到产品中，提高小麦胚 芽的附加值，所以本课题不仅有着较高的经济效益，更重要的是适应现代人对营养保健 食品的需要，对于缓解我国十分紧缺的蛋白和油脂资源，丰富我国营养、保健与医疗食 品的种类，提高我国人民的膳食营养与健康水平有着十分重要的意义。 本论文研究的主要内容包括： 1 辅助酶解。在料液比一定的条件下，通过多种手段对酶解过程进行处理，以提高 酶解物中活性肽的含量，提高溶液抗氧化性。这些处理手段主要包括：超声波处理，微 江南大学硕士学位论文 波处理等手段。 2 对所得溶液进行精制，通过脱盐、脱色以及脱糖等处理，使得酶解液中的抗氧化 肽得到浓缩，富集。 3 考察经一系列处理之后，所得液体的抗氧化性质以及其他的一些相关性质。 6 2 实验材料与方法 2 实验材料与方法 2 1 实验材料与设备 2 1 1 实验材料 脱脂小麦胚芽粉由河南弥诺食品有限公司提供；碱性蛋白酶a l c a l a s e 2 4 l ( 购于诺 维信) ；3 一( 2 - p y r i d y l ) 5 ，6 一d i p h e n y l - 1 ，2 ，4 一t r i a z i n e - 4 ，4 - d i s u l f o n i ca c i dm o n o s o d i u m ( 菲洛嗪) ( 购于f l u k a 公司) ；d s 2 0 1 c 由江苏苏青水处理工程集团有限公司提供；1 ，1 二苯基2 苦 基苯肼( d p p h ) ( 购于f l u k a 公司) ；其它试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限 公司。 2 1 2 仪器与设备 h h 4 数显恒温水浴锅 p h s 3 型精密p h 计 u v - 2 8 0 0 型紫外分光光度计 k s 9 0 0 超声波细胞粉碎机 j j 1 型定时电动搅拌器 c e n t r i f u g e5 8 0 4 r 冷冻离心机 n j l 0 7 3 型实验专用微波率 冷冻干燥机 电子天平 低速离心机 h d 3 紫外检测仪 d d s 3 0 7 型数显电导率仪 d h l a 电脑恒流泵 2 2 实验方法 2 2 1 超声试验 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司 上海雷磁仪器厂 尤尼柯( 上海) 仪器有限公司 宁波科生仪器厂 金坛市岸头国瑞实验仪器厂 e p p e n d o r f 公司 南京杰全微波炉设备有限公司 l a b c o n c n 公司 常熟市衡器厂 上海医用分析仪器厂 上海沪西分析仪器厂 上海天达仪器有限公司 上海沪西分析仪器厂 脱脂麦胚粉_ 加水配成溶液( 料液比l ：8 ) _ 调p h 至8 0 _ 加酶( 按照蛋白含量的0 4 添加) 一反应5 m i n 后超声处理一加酶后1 h 时，灭酶活l o m i n _ 离心。 超声试验中首先考查超声时间，超声功率，超声温度三个单因素实验，确定各自的 最值为超声时间3 m i n ，超升功率2 1 4 w ，超声温度为4 0 。在单因素实验的基础上，确 定三因素三水平的范围，用中心组合的方法进行数据回归分析以及显著性检验，以清除 d p p h 的能力为指标，以确定超声处理的最优试验条件。 2 2 2 微波试验 将未经酶解的原料溶液，置于实验用微波炉中。首先将功率设置调到3 挡( 2 0 0 w ) ， 江南大学硕士学位论文 调节不同的时问点，分别为3 0 s ，6 0 s ，9 0 s ，1 2 0 s 和1 5 0 s ，考察微波时间对清除率的影响。 其次，在确定下来的最佳时间下，调节微波功率，分别为1 挡( 3 7 w ) ，2 挡( 8 8 w ) ，3 挡( 2 0 0 w ) ，4 挡( 4 6 0 w ) 和5 挡( 6 9 0 w ) ，考察时间一定时，不同微波功率对清除率 的影响。 2 2 3d p p h 清除率试验 以无水乙醇为溶剂，得n d p p 的浓度为o 1 m m o u l 。离心所得上清液取2 m l ，定容 至u 1 0 0 m l ，取2 m l 定容后的溶液，加入配制好的d p p h 乙醇溶液，混合均匀，黑暗处避光 反应3 0 m i n ，以样品+ 2 m l 乙醇混合后的溶液为空白调整仪器的零点，在5 1 7 n m 处读取器 吸光度为a t ，同时，测2 m l d p p h + 2 m l 双蒸水混合后的吸光度为a o 。清除率的计算公式 是：清除率( ) = 【1 一a t a o 】1 0 0 。 2 2 4 脱色试验 将酶解液离心之后，取上清液稀释四倍，以脱色率和氮保留率为指标，考察活性炭 的用量，脱色时间以及脱色温度对脱色效果的影响。在确定活性炭的脱色条件后，对于 未稀释的原液进行脱色，同时以原液清除自由基的能力，螯合铁离子的能力以及还原能 力作为抗氧化性质的评价指标。 2 2 5 脱色率测定和氮保留率的测定 用紫外分光光度计在色素的最大吸收波长处测其吸光度值。结果表明，麦胚酶解物 色素的最大吸收峰在3 7 0 r i m 。脱色前o d a ，脱色后o d b 脱色率( ) = ( o d a o d b ) o d a x1 0 0 含氮化合物在2 8 0 n m 处是其最大光吸收处。脱色前o d l ，氮保留率= o d 2 8 0 o d l 2 2 6 酶解产物螯合铁离子能力的测定 吸取3 m l 定容后的上清液，然后加入0 0 5 m l2 m m o l l 的f e c l 2 溶液( 新鲜配制) ，再 加入0 2 m l5 m m o l f l 的菲洛嗪溶液，混合液在漩涡振荡器上振动3 0 s ，于室温条件下静置 放置1 0 m i n ，在5 6 2 n m 测定反应混合物的吸光度，吸光度越低表明酶解产物对f e 2 + 的螯合 作用越强。 对f e 2 + 的螯合能力( ) = ( a o a i ) a 0 】x1 0 0 ：a o 和a 1 分别代表对照和样品的吸光 值。 2 2 7 还原能力的测定 取一定量的麦胚酶解物( 2 m 1 ) ，用2 5 m l0 2 m 磷酸缓冲液( p h 6 6 ) 溶解，加入2 5 m l 1 铁氰化钾，置于5 0 水浴中反应2 0 m i n ，加入2 5 m l1 0 t c a ，混合后以3 0 0 0 r m i n 离 一i 二, 1 0 m i n 。取上清液5 m l ，加入0 5 m l0 1 氯化铁，混合均匀，静置1 0 m i n 后，测定a 7 0 0 n m 。 2 2 8 大孔吸附树脂实验样品的制备 原料酶解一1 0 0 0 0 转m i n 离心，过滤一微滤，超滤( 截留分子量为1 0 0 0 0 ) ，滤液待 2 实验材料与方法 用。 2 2 9 大孔吸附树脂静态吸附实验 在2 5 0 m l 锥形瓶中加入1 2 9 经过预处理的湿树脂。用乙醇充分溶胀后，用去离子水洗 去无水乙醇。加入5 0 m l 超滤液，于2 5 1 2 在恒温振荡器中振荡。每隔3 0 m i n ，取样测定其 肽的吸光度值( a 2 2 0 ) 。最终吸附1 6 h 。 2 2 1 0 大孔吸附树脂静态解吸实验 取2 5 9 湿树脂置于2 5 0 m l 锥形瓶，加入1 0 0 m l 超滤液，恒温水浴振荡器中吸附2 4 h 。用 去离子水洗干净，取六份，每份2 9 ，加入8 m l 不同浓度的乙醇( 浓度分别为1 0 ，3 0 ， 5 0 ，7 0 和9 0 ) ，静态解吸3 h 。得到解吸液最适浓度，用此浓度的乙醇洗脱静态吸附 试验中的树脂。每5 m i n 坝1 定a 2 2 0 。 2 2 1 1 大孔吸附树脂动态吸附和解吸实验 将处理过的大孔吸附树脂( d a 2 0 1 c ) 用去离子水洗涤干净，然后装入2 5 c m x 3 0 c m 层析柱中，床体积为1 8 0 m l 。于室温下上超滤液，上样速度为1 0 r n l m i n ，每1 5 m i n 取样， 测定电导率以及2 2 0 n m 处的吸光度值a 2 2 0 n m 。当a 2 2 0 n m 达n o 0 5 时，停止上样。这是 可以认为大孔吸附树脂对肽吸附已达饱和。已达吸附饱和的树脂，换用去离子水洗，上 液速度为2 m l m i n ，直至电导率不再变化。动态吸附结束的树脂，换用7 0 乙醇进行动态 洗脱。洗脱流速为2 m l m i n ，当a 2 2 0 接近0 0 5 时开始收集样品，最终当a 2 2 0 不再变化， 则停止收集。所得样品经浓缩蒸去乙醇，冷冻干燥。 2 2 1 2 糖含量的测定 称取标准葡聚糖( 或葡萄糖) 分别配制浓度为0 0 1 ，0 0 2 ，0 0 4 ，o 0 6 ，o 0 8 和0 1 0 m g m l 的溶液，各取l m l ，然后加入6 苯酚1 0 m l 及浓硫酸5 0 m l ，静止1 0 分钟，摇匀，室温 放置2 0 m i n 后于4 9 0 n m 钡l 吸光值，以1 0 m l 水按照同样显色为空白，以横坐标为吸光值， 纵坐标为多糖含量，得到标准曲线。 2 2 1 3 灰分的测定 采用马福炉烧烤测定灰分含量。 3 结果与讨论 3 结果与讨论 3 1 超声波处理单因素实验 利用超声波来处理酶解过程，主要是由于超声波的空化作用能够产生机械效应和活 化效应。机械效应，是指瞬间产生的极强剪切力使蛋白降解或构象改变，其亲水基暴露， 提高蛋白的溶解度，最终提高其酶解效率p6 。活化效应主要表现为空化气泡内高温分解， 化学键断裂及其相关反应【”】。而这两个效应的产生取决于超声波试验中的各个因素的设 置，本文主要考察了超声功率、超声时间及温度对超声波试验效果的影响。 本实验主要的目的是制备抗氧化性质的肽。通过预试验得知，抗氧化性质与其水解 度没有直接的联系。水解度高的，其抗氧化性并不一定高。所以不选水解度作为指标。 同样的，蛋白含量的高低与抗氧化性之间也没有必然联系。例如在蛋白含量相同的情况 下，如果蛋白三级结构被破坏，它内部抗氧化基团就会暴露，抗氧化性质就会提高。所 以这两个指标其实并不能完全反应抗氧化性。本实验选择d p p h 清除率作为评价酶解效 果的指标。 3 1 1 超声功率对d p p h 清除率的影响 在超声时间为3 m i n ，超声温度为4 0 条件下，考察了超声功率对d p p h 清除率的影响， 结果见图1 。 由图1 可见，超声功率对于脱脂小麦胚芽酶解的影响，具有双重效应：较低强度的 超声处理，可以促进酶解，提高清除率；但是高强度的超声处理，容易使清除率下降。 这主要是由于，较低强度的超声处理，对于溶液中的物质传递作用，明显低于高强度的 超声处理，有利于蛋白和酶的结合，所以使清除率增大【3 8 j 。从图1 还可以看出，超声功 率在1 8 0 2 7 0 w 的范围内，d p p h 清除率逐渐增大，这可能是由于减少了底物的抑制作 用，同时减少了依靠氢键结合的分子间的聚集，使得酶可以与底物充分接触，所以这一 阶段清除率逐渐增大【3 9 1 。而当超声功率大于2 7 0 w 时，由于超声的空化作用增强，造成 清除率降低。 图i 超声功率对清除率的影响 f i g 1e f f e c t so fu l t r a s o n i cp o w e ro nd p p hr a d i c a ls c a v e n g i n ga c t i v i t y 江南大学硕士学位论文 3 1 2 超声时间对清除率的影响 6 0 5 0 琶4 0 爵 笾3 0 5 蜓 2 0 1 0 0l234567 8 9 1 0 超声时间( m i n ) 图2 超声时间对清除率的影响 f i g 2e f f e c t so fu l t r a s o n i ct i m eo nd p p hr a d i c a ls c a v e n g i n ga c t i v i t y 在超声功率4 5 0 w 和超声温度5 5 条件下，考察了超声时间对d p p h 清除率的影响， 结果见图2 。 如图2 所见，随着超声时间的增加，抗氧化肽的d p p h 清除率逐渐增大，在3 m i n 时达 到最大。超过t 3 m i n ，清除率并没有随时间的延长而有明显的增加。这主要是由于在3 m i n 前，超声波处理酶解体系，使得整个体系更加均匀，促进了底物与酶的结合【4 0 1 ，反应几 乎达到完全。时间超过3 m i n ，这种增加己达到最大，所以效果并不明显。但是，实际超 声过程中略有下降，这可能是由于超声过程的热效应以及剪切场抑制了酶的活性t 4 。 3 1 3 超声时温度对清除率的影响 簧 、， 爵 篮 蜒 图3 超声时温度对清除率的影响 f i g 3e f f e c t so fu l t r a s o n i ct e m p e r a t u r eo nd p p hr a d i c a ls c a v e n g i n ga c t i v i t y 在超声功率2 7 0 w ，超声时间3 m i n 条件下，考察了超声温度对d p p h 清除率的影响， 结果见图3 。 超声波作为一种能量形式，具有加热作用和空化作用【4 引。低温时，加热作用占主导， 超声场下反应体系吸收超声波能量，加速了反应。随着温度的升高，空化作用逐渐显现， 一方面，当温度超过一定值时，由于酶发生热变性，导致反应速率降低1 4 驯；另一方面， 由于空化作用产生的自由基对酶活中心的破化作用，导致清除率下降。从图3 看出，超 3 结果与讨论 声温度小于4 0 c 时，抗氧化肽的d p p h 清除率随着温度的增大而逐渐增大，在4 0 c 达到 了最值。超过4 0 c ，随着温度的继续升高，d p p h 清除率呈明显的下降趋势。 3 2 超声处理中心组合实验条件优化以及试验结果分析 3 2 1 模型建立 表3 因素和水平设计表 ! 鱼垒：三q 宝i g 丑鱼坠! 呈q i ! 鱼! q 岱垦d dl 曼y 曼i s 水平 超声波功率( w )超声时间( m i n )温度( ) 11 8 0 l2 5 02 7 0 34 0 】 3 6 0 55 5 表3 为单因素的试验结果，参考表3 ，分别取超声时间，超声功率以及超声温度作为 三因素，分别在3 个水平上进行中心组合设计，共1 5 个点，包括三组重复试验。具体见 表4 。 表4 试验设计及结果 t a b 4e x p e r i m e n t a ld e s i g na n dr e s u l t s 利用d e s i g n e x p e r t 软件对实验数据进行多元回归拟合，得到回归分析结果见表5 。 各因素经回归拟合后得到清除率的回归方程： 7 0 8 0 4 + 0 0 5 0 1 0 2 宰x l + 7 7 4 2 木x 2 1 2 6 4 幸x 3 + 5 1 4 e - 0 0 4 + x l x 2 0 0 0 1 4 9 6 3 幸x l 幸x 3 - 0 0 5 5 6 7 幸x 2 x 3 4 1 0 e 0 0 5 * x 1 2 - 1 0 4 4 3 x 2 z + 0 0 1 9 8 2 x 3 z 一 回归方程的复相关系数( i 迎) 为0 9 6 5 7 ，复相关系数越接近于l ，说明回归方程差 异显著，拟合度好；同时模型的p = 0 0 0 3 7 f 模型 93 6 10 3 4 0 1 11 5 6 60 0 0 3 7 x 15 9 6 85 9 6 8 2 33 00 0 0 4 8 x ，1 1 19 81 1 9 84 6 80 0 8 2 9 x ，l1 1 2 0 5 1 1 2 0 54 37 4o 0 0 1 2 x i + x 2 l 0 0 3 400 3 40 0 1 30 9 1 2 5 x x tl1 1 61 1 1 6 43 60 0 9 1 3 x + x 3 11 63 21 63 2矗3 70 0 5 2 9 x ， 104 10 4 10 1 007 0 6 6 x ，1 6 4 4 26 4 4 22 5 1 500 0 4 1 x ，217 3 4 67 3 4 6 2 86 80 0 0 3 l 残差 51 2 8 l25 6 失拟项31 1 5 638 56 1 9 0 1 4 2 3 纯误差2 l2 50 6 2 总和 1 43 7 38 4 3 2 2 响应面分析 图4 至图6 为等高线以及响应面图。图4 中清除率随着时间的增加先增后减，呈现 二次函数关系；随着功率的增大而逐渐减小。图5 中，在所考察的范围内，清除率随着 温度的增减逐渐减小，随着功率的增加也呈下降趋势。图6 中，随着温度的增加，先增 加后减小，随着时间的增加而先增后减，均呈二次函数关系。 固4 y ：i ( x i ，x 2 ) 等高线及曲面图( x 3 = 4 0 c ) f i g4 c u r v e ds u r f a c e p l o ta n dc o r t t o u r l l t l e f o r y = f 。( 1 ，x 2 ) w i t h t e m p e r a t u r eo f 4 0 c 3 结果与讨论 震 2 撤 书燃蠹繁 ! 饧蕾苗遂：一= = 裂： “ 1 。 “ 。三善。、j i ：鬈。e * 一 3 2 3 条件优化以覆验证 对于回归