（食品科学专业论文）水稻颖壳异常发育突变体Oseg1和Oseg2的基因图位克隆及基因功能分析.pdf

上海大学硕士学位论文 水稻颖壳异常发育突变体o s e g l 和o s e 9 2 的 基因图位克隆及基因功能分析 摘要 利用水稻小花各轮器官发育异常的突变体来研究单子叶植物花器官发育的 分子调控机制是目前植物分子遗传学的研究热点。本研究将粳稻品种9 5 2 2 进行t 射线诱变，从m 2 代突变体库中筛到两个颖壳发育异常的突变体，分别命名为 o s e g l ( _ o r y z a s _ a t i v a e x t r a o r d i n a r y g l u m ej ) 和o s e 9 2 ( _ o r y z a s a t i v ae n l a r g e d g l u m e 2 ) 。在营养生长时期，这两个突变体与野生型相比，没有明显发育异常。 进入生殖生长后，o s e g l 花的退化颖壳( r u d i m e n t a r yg l u m e ) 比野生型的退化颖壳 明显增长；护颖( e m p t yg l u m e ) 和野生型相比也异常增长；雄蕊数目减少。o s e 9 2 突变体的护颖也异常增长，一次枝梗形态弯曲，数量增多。利用电子显微镜对 o s e g l 和o s e 9 2 的表型特征进行了细致的分析，表明o s e g l 和o s e 9 2 的突变影响水 稻小穗顶端分生组织正常发育，造成小穗原基发育异常。分别对这两个突变体进 行的遗传学分析结果表明这两个性状各受一对隐性基因控制。 为了对o s e g l 和o s e g 2 进行基因定位，分别将o s e g l 和o s e 9 2 纯合体与籼稻品 种广陆矮4 号杂交，建立f 2 代群体，筛选f 2 代中的突变株，利用已公布的水稻r m 系列s s r 标记及自行设计i n d e l 标记，应用图位克隆技术，对o s e g l 和o s e 9 2 位点 进行遗传定位。我们将o s e g l 进行了初定位和精细定位，最终将o s e g l 定位在4 号染色体上i n d e l 标记o s 4 0 7 与w h m 0 4 6 6 之间，遗传距离分别为2 0 c m 和1 o c m ， 为进一步克隆o s e g l 基因和研究水稻小穗器官发育的调控机理奠定了基础。 另外，我们将o s e g 2 精细定位在3 号染色体上s s r 标记r m 5 8 1 3 和i n d e l 标记 w h m 0 3 1 2 之间，遗传距离0 2c m ，物理距离1 3 3k b 的区段范围内。对其中两个 可能与花发育相关的基因进行测序，测序结果显示其中一个m a d s b o x 转录因子 基因发生突变，命名此基因为o s e g 2 。随后，提取野生型和突变乖奉m r n a ，p c r 扩增m r n a 全长后测序，证明o s e 9 2 突变体中伪匹回基因内含子剪切异常，造成 移码突变。在此基础上，我们又利用r n a 干扰的方法，证明了水稻野生型的o s e g 2 v 上海大学硕士学位论文 基因沉默后可以产生o s e 9 2 突变体的表型，证明确实由于o s e g 2 基因的突变产生 o s e 9 2 的表型。将o s e g 2 基因在野生型水稻中过量表达后，我们观察到伪段珏过 量表达的转基因植株产生了新表型：一次枝梗数目减少，小穗夕f 稃顶端长出刺状 器官。为研究o s e g 2 的表达特性，我们提取了野生型水稻植株的根、茎、叶、穗、 幼苗的r n a ，以a c 瞒因作参照，利用r t - p c r 分析了o s e g 2 在水稻生长过程 中的表达情况。结果表明伽瓜刀可以在水稻根、茎、叶、穗、幼苗中表达。我们 还构建了仉曰g 2 基因的原核表达载体，高效表达了o s e g 2 蛋白，并免疫法制备了 o s e g 2 抗体。这些工作为进一步研究o s e g 2 在水稻小穗形态建成过程中发挥的功 能奠定了良好的基础。 关键词：水稻( o r y z a 删缸口l ) ；护颖；退化颖壳：o s e g l ：o s e 9 2 ：基因定位；功能分析 v i 上海大学硕士学位论文 p o s i t i o n a lc l o n i n ga n df u n c t i o n a la n a l y s i so fr i c eg l u m e d e v e l o p m e n t a lr e l a t e dg e n e s ，o s e g la n do s e g 2 a b s t r a c t i nt h el a s t1 6y e a r s ，k n o w l e d g eo ft h em o l e c u l a ra n dg e n e t i cm e c h a n i s m st h a t u n d e r f i e sf l o r a li n d u c t i o n , f l o r a lp a t t e r n i n g ，a n df l o r a lo r g a ni d e n t i t yh a se x p l o d e d t o f a r t h f f t r e v e a lt h eg e n e t i cm e c h a n i s mo fr i c ef l o w e rc o n t r o l ，t w or i c em u t a n t s _ o r y z a s _ a t i v ae x t r a o r d i n a r yg l u m e l ( o s e 9 1 ) a n do s e 9 2 ( _ _ o r y z as _ a f t r ae n l a r g e d g l u 聊2 ) w i t h j a p o n i c ac u l t i v a r 9 5 2 2b a c k g r o u n d , w e r ei d e n t i f i e df r o mt h em 2m u t a n tp o o l m u t a g e n i z e db y6 0 c o ? - m y c o m p a r e dw i t ht h o s eo fw i l dt y p ep l a n t s ，o s e g l d e v e l o p e dl o n g e re m p t yg l u m e sa n dr u d i m e n t a r yg l u m e s ，t h es i b n l e nn u m b e rw a s d e c r e a s e d o s e 9 2h a sa b n o m a li n f l o r e s c e n c ea n de n l a r g e de m p t yo u m e s u s i n g s c a n n i n ge l e c t r o nm i e r o g r a p h , w ea n a l y z e dp r i m o d i ad e v e l o p m e n tp r o c e s so ft h e s e t w om u t a n t s g e n e t i ca n a l y s i si n d i c a t e do s e g la n do s e 9 2w c r er e s u l t e df r o m r e c e s s i v eg e n e t i cl o c u s t oc l o n et h e s eg e n e s ，t h ef 2p o p u l a t i o nw a sc o n s t r u c t e db yac r o s sb e t w e e nm u t a n t q a p o n i c a ) a n dc _ a m a g l u a i 4 ( i n c 矗c a ) t oc l o n et h em u t a n tg e n e w eu s e dm a p - b a s e d c l o n i n ga p p r o a c ht of i n e - m a pt h e s et w og e n e su s i n gt h ef 2m u t a n tl i n e sa n dt h e d e s i g n e ds s rm a r k e r sa n di n d e lm a r k e r s u l t i m a t e l y , t h eo s e g lw a sm a p p e do n c h r o m o s o m e4 ，b 前w e c ni n d e lm a r k e ro s 4 0 7a n dw h m 0 4 6 6w i t hg e n e t i cd i s t a n c e o f 2 0 c ma n d1 o c mr e s p e c t i v e l y t h e s er e s u l t sa 托u s e f u lf o rf t l l 恤e rc l o n i n ga n d f u n c t i o n a la n a l y s i so f t h eo s e g lg e n e t h eo s e g 2w a sm a p p e do nc h r o m o s o m e3 ，b e t w e e ns s rm a r k e tr m 5 8 1 3a n d i n d e lm a r k e rw h m 0 31 2w i t hg e n e t i cd i s t a n c eo 3 c ma n d p h y s i c a ld i s t a n c e13 3 k b w es e q u e n c e dt w og e n e si nt h i sr e g i o na n df o u n do n em a d s - b o xg e n ew a s m u t a t i o n e d c o m p a r i s i o nw i t hw i l d - t y p e ，t h ee d n ao fo s e g 2h a dam u t a t i o ni n e x t r o n - i n t r o ns p l i d n gs i t e r n a iv e c t o ra n da n t i - s e n s ev e c t o rw e r ec o n s t r u c t e da n d v h 上海大学硕士学位论文 t r a n s f o r m e di n t ow i l d - t y p ep l a n t s t h er n a i t r a n s g e n ef l e e ss h o w e dp h e n o t y p e st h a t w e r es i m i l a rt ot h o s eo fm u t a n t a l s oo v e r e x p r e s s i o nt r a n s g e n i cp l a n ts h o w e dn e w p h e n o t y p e s ：t h ep r i m a r yb r a n c h e sw e r ed e c r e a s e d ，a n dt h e r ee x i s t e das t i n gf l o w e r o r g a na tt h ee n do fl e m m a t oa n a l y z et h ee x p r e s s i o np a t t e mo fo s e g 2 ，r n aw e r e e x t r a c t e df r o mr o o t , s t e m ，l e a f , s p i k e l e t sa n ds e e d l i n go fw i l d - t y p e9 5 2 2 ，a n da c h n u s e da sa ni n t e r n a lc o n t r 0 1 r t - p c rm s m ts h o w e dt h a to s e g 2w b se x p r e s s e di na l l t h e s et i s s u e s i na d d i t i o n , w ec o n s t r u c t e dp r o k a r y o t ae x p r e s s i o nv e c t o ro fo s e g 2a n d t h er e c o m b i a n to s e g 2p r o t e i nv c a su s e df o rp r e p a r i n gt h ea n t i b o s y t h e s ep r o v i d ea g o o db a s i sf o rf u r t h e rr e v e a l i n go s e g 2g e n ef u n c t i o nd u r i n gr i c ef l o w e rd e v e l o p m e n t a n dc o n s u m m a t i n gt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo ff l o w e ro r g a n d e v e l o p m e n to f m o n o c o t k e y w o r d s ：r i c e ( o r y z as a t i v a l ) ；e m p t y g l u m e ；r u d i m e n t a r y g l u m e ；o s e g l ；o s e 9 2 ；p o s i t i o n a l c l o n i n g ；g e n ef u n c t i o n v 1 1 1 上海大学硕十学位论文 原创性声明 本人声明：所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作。 除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己发表 或撰写过的研究成果。参与同一工作的其他同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：至盘拉日 本论文使用授权说明 瓤：瑚鑫p 6 本人完全了解上海大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留论文及送交论文复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可 以公布论文的全部或部分内容。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：至匆二移导师签名： i i 搬日期：逊z ! ：髟 上海大学硕士学位论文 第一章综述：植物花器官发育的研究进展 1 t 双子叶模式植物拟南芥和单子叶模式植物水稻的花器 官结构 双子叶模式植物拟南芥，花辐射对称，第一轮是4 片萼片( s e p a l ) ，第二轮 为4 片花瓣( p e t a l ) ，第三轮为6 枚雄蕊( s t a m e n ) ，第四轮为2 心皮( c a r p l e ) 所构成的复雌蕊。 、单子叶植物早在1 2 1 8 亿年前就和双子叶植物开始分开进化【”，发展到 今天，花器官形态已经发生了很大差异。一般认为水稻颖花( f l o r e t ) 包括1 片 外稃( 1 e m m a ) 和1 片内稃( p a l e a ) ，1 对浆片( 1 0 d i e u l e ) ，6 个雄蕊( s t a m e n ) 和1 个心皮( c a r p e l ) ( 图1 ，c ) 。稃片下有一对护颖( e m p t y g l u m e ，图l ，b ) ， 与颖花共同构成一朵完整的小穗( s p i k e l e t ) 。小穗下方还有两片退化颖壳 ( r u d i m e n t a r yg l u m e ，图l ，b ) 。护颖和退化颖壳相当于双子叶植物的苞叶( b r a c t ) 【2 】，其研究由于缺乏相应的突变体而受到限制。 图1 拟南芥花和水稻颖花的形态比较 r g , r u d i m e n t a r yg l u m e 退化颖壳；e g , e m p t yo u m e 护颖；l e ，l e m m a # b 稃；聘p a l e a 内稃；l o d i c u l e , 浆片；s t a m e n , 雄蕊；c a r p e l ，心皮；s t i g m a s ，柱头 1 2 双子叶模式植物花器官发育模型 拟南芥是研究双子叶植物花器官发育分子调控机理的模式植物，花由花萼、 上海大学硕士学位论文 花瓣、雄蕊和雌蕊4 轮花器官组成。通过对拟南芥突变体的研究，人们发现拟 南芥中有一系列能控制花器官相互转化的基因。a p l 和一p 2 这两个基因只要有 一个缺失，花萼和花瓣就不能正常发育，花萼位置处发育出变形的雌蕊，花瓣 位置处发育出雄蕊( 图2 ，a ，b ) ，部分发育出了新的小花ia p 3 和中之一 发生突变都会导致花瓣转变为花萼，雄蕊变成心皮( 图2 ，c ，d ) 。a g 突变中， 雄蕊和雌蕊无法发育，雄蕊位置处发育出花瓣，雌蕊位置处发育出花萼( 图2 ， e ) 。在b 类基因和c 类基因双突变体中，a 类基因在各轮花器官中都具有活性， 使四轮器官均变为萼片( 图2 ，g ) 。在a 类基因和c 类基因双突变体中，b 类 基因在各轮花器官中都具有活性，产生两轮花瓣和两轮雄蕊( 图2 ，h ) 。在a 类基因、b 类基因和c 类基因三突变体中，花的各轮器官都转变成了叶状结构 ( 图2 ，i ) 。通过对这些基因的研究，人们提出了关于花器官发育决定的a b c 模型理论( 图2 ，f ) ，来揭示双子叶植物花器官发育的遗传控制机理【3 - ”。即在 拟南芥中，花萼形态由a 类基因调控，花瓣形态由a 类和b 类基因共同调控， 雄蕊形态由b 类和c 类基因共同调控，雌蕊形态由c 类基因调控。其中，a 类 基因和c 类基因的活性相互抑制，a 类基因抑制c 类基因在第一轮花器官和第 二轮花器官中的表达，c 类基因抑制a 类基因在第三轮花器官和第四轮花器官 中的表达【s 】。三类基因的活性与它们在花中的位置无关。 上海大学硕士学位论文 圈2 根据对拉南芥同源异型突变体的研究提出了a b c 模型 a ：a p e t a l a 2 ( a p e ) m u t a n t ；b ：a p e t a l a l ( a p l ) m u t a n t ；c ：p i s t i l l a t a ( 国m u t a n t ；d ：a p e t a l a 3 ( a p 3 ) m u t a n t ；e ：a g a m o u s ( 唱) m u t a n t ；f ：a b em o d e l ；g ：a p 3 a gd o u b l em u t a n t ；h ：a p la gd o u b l e m u t a n t ；l ：a p la p 3a gi r i p l em u t a n t 金鱼草也是研究双子叶植物花发育分子控制机理的模式植物，s q u a m o s a ( s q u a ) ，d e f ，g l o b o s a ( g l o ) 和p l e n a ( p l e ) 分别是拟南芥中a p l ，a ”， 和a g 的同源基因，a b c 模型对双子叶植物花发育的调控具有保守性。 1 9 9 5 年人们从矮牵牛( p e t u n i ah y b r i d a ) 中克隆到了专地在胚珠原基、 珠被和珠柄中表达的f b p 7 和用驴j j ，发现了调控胚珠发育的d 类基因【9 ，1 0 l 。 过量表达f b p j l ，转基因植株的第一轮花器官和第二轮花器官上形成了异位胚 珠【l l 】。抑制f b p 7 和f b p l l 表达，在野生型植株形成胚珠的地方发育出心皮状 或形似叶状的结构，命名为d 功能基因。之后，人们在拟南芥中克隆到了与f b p 7 上海大学硕士学位论文 和只炉j j 行使相同功能的s t k 基因，证明了d 类基因在双子叶植物中的保守 性。此后，这样经典a b c 模型被扩展为a b c d 模型。 一 如果说a b c 类基因对花发育是充分条件的话，那么在任何器官中将a b c 类基 因表达，都应该能够产生花的表型。事实上，人们将a b c 类基因在叶中异位表达， 无法产生花的器官【6 ”】。因此，a b c 类基因对花发育只是必要条件，不是充分条 件。所以还存在着其他未发现的花诱导必需因子。后来，在2 0 0 0 年人们通过寻找 能够与a b c 模型中的m a d s b o x 蛋白相互作用的蛋白的方法，发现了参与花瓣、 雄蕊和雌蕊3 轮器官发育的e 类基因【1 3 ，1 4 1 ，e 类基因由艇p ( 也n q a g l 2 ) 、s e p 2 ( 也n q a g l 4 ) 、s e p 3 ( 也n q a g l 9 ) 和s e p 4 ( 也叫4 g 上3 ) 组成，彼此之间存在功 能冗余。e 类基因与a 、b 和c 类基因共同作用，参与花器官的发育调控。至此， 四因子模型应运而生( 图3 ) 。该模型假设4 种花同源异形基因的不同组合决定不 同花器官的特征。蛋白复合物a p l 一a p l 一? 一? 决定萼片形成，a p 卜a p 3 - p i s e p 决定花瓣形成，a p 3 一p i a g - s e p 决定雄蕊形成，a g - a g - - s e p s e p 决定心皮形 成( 图3 ) ，这些蛋白质复合物通过粘着在特异目标基因的启动子上激活或抑制不 同的器官特征基因发挥功能。不同蛋白质复合物和d n a 序列之间亲合力的不同 和不同基因启动子区域的不同决定了蛋白质复合物和目标基因的相互选择。 上海大学硕士学位论文 图3 控制双子叶植物花器官发育的a b c d e 模型【引自】 5 上海大学硕士学位论文 值得注意的是，除了一朋，控制双子叶植物花器官发育的a b c d e 模型中的这 些基因都有一个命名为m a d s 域的保守的d n a 结合域，属于m a d s - b o x 基因家族 的成员。 1 3 调控单子叶植物花器官发育的分子机理的研究进展 通过研究水稻中一些与双子叶植物a b c 模型基因同源的m a d s 盒基因， 人们已经克隆了一些与水稻花器官发育相关的基因，初步分析了控制水稻花器 官发育的分予机理。 a 类基因：水稻中与a p l 相似性最高的基因是r a p l a ( 也叫删傩，5 ) 【l “，特异在幼嫩花序及小穗分生组织中表达。小穗器官分化后，在内外稃和浆 片中表达，在护颖中也有微弱表达 3 1 。o s m a d s l 4 ( 也叫f d r m a d s 6 、r a p i b ) d i 和o s m a d s l 8 ( 也叫f d r m a d s 7 ) 1 7 】与a p l 序列相似性也很高【1 8 1 。o s m a d s l 8 在水稻小穗所有部位都表达，小穗成熟后，在浆片和颖片中检测不到其表达。 o s m a d s l 4 起初在颖片、内外稃中表达，小穗成熟后，只在雄蕊和心皮中检测 到表达【1 9 1 。尽管o s m a d s l 8 和o s m a d s l 4 与a p l 序列相似性很高，表达模式 却大不相同。0 姒列a 钳j 表达模式与五p ，相似，还需要功能分析来确定是否一朋 在水稻中的同源基因。o s m a d s l 早期在花原基各处表达，后期只在内外稃和胚 珠中表达1 2 0 ，突变体l h s l 内外稃和浆片转化成叶状，部分小穗产生了新的小花 【2 ”，说明o s m a d s l 有花分生组织决定作用。这个表型与a p i 相似，但是 o s m 2 t d s l 是否是a 类基因仍然需要鉴定。 b 类基因：根据序列相似性，o s m a d s 2 和o s m a d s 4 是g l o - l i k eg e n e 2 2 ， o s m a d s l 6 是d e f - l i k eg e n e 【2 3 j 。研究证实，o s m a d s l 6 ( 突变体命名为s p w l ) 和o s m a d s 4 可以调控水稻花的浆片和雄蕊的特征，b 类基因在双子叶植物和 单子叶植物进化过程中的保守性已经被证明讲，圈，浆片被认为与双子叶植物中 花瓣同源m2 6 1 。 c 类基因：研究证明，0 姒纠d | 野( 也叫删g ) 在只在雄蕊和雌蕊中表达， 调控雄蕊和心皮的特征，属于c 类基因瞄l 。c 类基因在双子叶植物和单子叶植 物中是保守的。在胡突变体中，心皮被同源异型转化为雄蕊。在花发育中，d l 基因的表达开始于心皮原基起始的区域，并且在心皮原基中持续表达。因此， 上海大学硕士学位论文 d l 基因仅特化一轮花器管的特性。从这个方面讲，a b c 模型在水稻中被修改 了。近期研究证明，单子叶植物和双子叶植物分开进化后，c 类基因在单子叶 植物中发生了复制，功能分离，o s m a d s 5 8 和o s m a d s 3 在水稻中共同行使了c 类基因功能刚。 d 类基匿乱o s m a d s l 3 与f 8 p 7 和f b p i i 具有7 4 序列相似度叨，表达方 式相似，在胚珠和心皮内层表达。与f b p 7 和f b p l l 一样，o s m a d s l 3 能够结 合特异s e p - l i k e 基因，来行使基因功能b 3 i 。说明d 类基因行使基因功能的方式 在双子叶植物和单子叶植物中是保守的。 e 类基因：系统进化分析显示，o s m a d s 2 4 ( 也叫o s m a d s 8 ) 、o s m a d s 4 5 ( 也叫o s m a d s 7 ) 、仇朋脚4 、o s m a d s l 、o s m a d s 5 与s e p 基因同组，亲 缘关系较近田】，最近的是o s m a d s 2 4 和o s m a d s 4 5 ，早期在浆片和雄蕊原基分 生组织中表达，后期在浆片、雄蕊和雌蕊原基中表达，是e 类基因在水稻中的 候选基因。o s m a d s l 由于具有分生组织决定性，也是e 类基因在水稻中的候 选基因。”。 1 4m a d s - b o x 基因家族 除了丘船，几乎所有a b c 基因都是高度保守的，含有m a d s b o x 保守结构域， 属于m a d s - b o x 基因。m a d s 来自m c m l ，a g a m o u s ，a r g 8 0 ，d e f i c i e n s a 及s r f 蛋白的首字母。m c m l 是酵母细胞类型的调节因子，a r g 8 0 是酵母精氨酸 代谢基因的调节因子，a g a m o u s 与d e f i c i e n s a t 匀是花器官类别基因产物， s r f 则是人血清应答因子( s c r u l n m s p o s e f a c t o r s ) 。d e f 和s r f 两个d n a 结合蛋白 均识别c a r g b o x 靶序列 c c ( a z o6g g 】。该序列编码一个与特定d n a 序列结合的 转录因子功能的结构域。对于维管植物而言，m a d s - b o x 基因编码的转录因子具 有保守结构特性，也称之为m c 切e 结构域【2 9 ，3 0 1 ，即包括m a d s ，i n t e r v e n i n g ( i ) ， k e r a t i n - l i k e ( k ) 和c - t e r v e n i n g ( c ) 域。( 1 ) m a d s 结构域是由5 5 5 8 个氨基酸 残基组成的高度保守的区域，是与d n a 结合的主要决定因素。它形成二聚体调 节与d n a 的结合。该区域可部分的折叠，形成由n 螺旋所形成的反向平行的螺旋 卷曲螺旋，平躺于d n a 的小沟中。它识别c c ( v d 6 g g 特征序列，该序列称为c a r g b o x ( c c a - f i c h - g g ) ，它存在于许多基因的启动子区域内，因此m a d s - b o x 蛋白 7 上海大学硕士学位论文 可能通过对c a r ( b o x 的调控来调节基因的转录。( 2 ) k 结构域是一段约7 0 个氨基 酸残基的片段，与角蛋白( k c r a t i n ) 部分同源，至今在动物和真菌中还未被发现。 二级结构分析表明k 结构域含有3 个a 螺旋k 1 ，k 2 和k 3 ，与疏水残基有保守的整 齐间距，能在蛋白二聚体中形成两亲和性螺旋结构，调解蛋白质之间的相互作用 3 q 。( 3 ) 在m a d s 结构域和k 区域之间存在一段3 1 3 5 个氨基酸的i 区域，含有 较多亲水残基的非保守区域，帮助转录因子蛋白二聚体与d n a 结合形成复合体。 ( 4 ) k 结构域下游的非保守的c 端主要由疏水氨基酸组成，约3 0 个氨基酸长度的 富含疏水残基的非保守区域，可能作为m a d s - b o x 基因的转录激活区域，与 m a d s - b o x 多聚体高级结构有关【3 2 】。编码具有这些区域的基因被称为m i k c 型 m a d s - b o x 基因。此外，在少数m a d s 区上游还有一个延伸的n 区，具有这种结 构的基因被称为n m i k c 型。如人的s r f 在m a d s 区前就有一段较长的n 延伸区。 通过对人s r f 的x 。射线晶体衍射研究发现，s r f 的两个单体以二聚体形式结 合在一起，核心区由m a d s 结构域5 6 个氨基酸和延伸的约3 0 个氨基酸组成，二聚 体分成三个结构单元叠加在一起。第一个结构单元是d n a 结合区，由分别来自 两个单体的旺螺旋形成的一个反平行的螺旋卷曲螺旋。这两个c 螺旋平行于其识别 的c a r g - b o x 的d n a 双螺旋的小沟，并与d n a 的磷酸骨架接触，d n a 分子包裹在 螺旋卷曲螺旋的周围，两个a 螺旋的链端即两个单体的n 段插入c a r g - b o x 的d n a 双螺旋的小沟内和d n a 分子相结合。第二个结构单元式四段反平行的b 折叠，由 m a d s 结构域c 端和延伸的一段氨基酸组成( 对应于植物m a d s b o x 蛋白i 区) 。第 三个结构单元即顶部，位于b 折叠上方，是由一个不规则的螺旋卷曲螺旋紧接着 一个短的a 螺旋组成。由于s r f ，a r g 8 0 和m c m l 在此部分结构相似，又称之为 s a m 结构。由于m a d s 结构与在氨基酸组成上的高度相似性，对s r f 作用机理的 分析也同样适用分析植物中的m a d s - b o x 蛋白。r i e c h m a m n 等发现，植物m a d s 结构组成在功能上的分配也是和s r f 相似的：n 端进行d n a 结合，c 端主要起到 形成二聚体的作用，k 区x 寸m h d s b o x 蛋白形成二聚体是必不可少的。 1 5 水稻花序原基分化过程 植物发育的模式与动物相比具有显著的差异。在动物的个体发育过程中，其 形态的建成发生在胚胎发生阶段( e m b r y o g e n e s i s ) ，与器官形成相关的细胞分 上海大学硕士学位论文 裂和分化活动集中出现在这一阶段。在胚后的发育阶段，虽然仍然有细胞分裂和 分化的发生，但这些细胞的分裂和分化的作用主要是维持器官的正常功能。而植 物的形态建成主要通过分生组织( m e r i s t e m ) 的分裂和分化活动，在一个相当长 的时期内完成。分生组织是一群未分化的、不断分裂的细胞。在植物的胚胎发生 阶段，植株就形成了根端分生组织( r o o ta p i c a lm e r i s t e m ) 和茎端分生组织( s h o o t a p i c a lm e r i s t e m ) ，在胚胎发生后的发育过程中，顶端分生组织不断的分化形成 新的侧生器官 3 3 】。一方面，分生组织能够根据外界环境的刺激及内部遗传因子的 控制，不断的分化出根、茎、叶、枝、花等器官，以保证植物能够完成整个生命 周期；另一方面，分生组织能够不断的分裂，以填补由于器官形成过程中所消耗 的细胞，以保持自身的完整性【3 4 】。 营养生长阶段，茎端分生组织不断分化产生叶原基( 图4 ，a ) 。进入生殖 生长后，茎端分生组织分化产生初级枝梗分生组织( 图4 ，b ) 。之后，初级枝 梗分生组织分化产生小穗枝梗分生组织( 也p q - - 级枝梗分生组织) 、终端穗分生 组织和侧生穗分生组织( 图4 ，c ) ，穗分生组织分化产生小穗原基。小穗原基 依次分化产生外退化颖原基、内退化颖原基、外护颖原基、内护颖原基、外稃 原基和内稃原基( 图4 ，d ) 。原基逐渐发育成器官，内外稃闭拢，包住内部花 器官，形成完整小穗( 图4 ，e ) 。一个发育成熟的水稻花序示意图见图4 ，f 。 9 上海大学硕士学位论文 a 赢：虢p 融：翼蜘 图4 水稻茎端分生组织( s a m ) 发育示意图【引自叻 l p 1 e a f p r i m o r d i u m 叶原基；p b m , p r i m a r yb r a n c hm e r i s t e m 初级枝梗分生组织；t s m ，t e r m i n a l s p i k e l 既m e r i s t e m 终端穗分生组织；l s m ，l a t e r a ls p i k e l e tm e d s t e m 侧生穗分生组织；s b m , s p i k e l e t b r a n c hm e r i s t e m d x 穗枝梗分生组织；o r g , o u t e rr u d i m e n t a r yn u m e ，b n 化颖；i r g ，i n n e r r u d i m e n t a r yg l m e 内退化颖；o e g o u t e re m p t yg l u m e # b 护颖；i e g , i n n e re m p t yg l 啪e 内护颖；i ， l e m m a ， - 稃；p ，p a l e a 内稃；m a , m a i na x i s 主轴；p b ，p r i m a r yb r a n c h 初级枝梗；s b ，s e c o n d a r yb r a n c h 二级枝梗；t s ，t e r m i n a ls p i k e l e t 终端穗；l s ，l a t e r a ls p i k e l e t 侧生穗；却，d e g e n e r a t ep o i n t 退化点 1 0 趴 上海大学硕士学位论文 第二章控制水稻护颖发育的o s e g 2 基因的图位克隆 及功能分析 2 1 材料和仪器 2 1 1 水稻材料的种植及突变体来源 用”c o t 射线诱变粳稻9 5 2 2 种子，处理剂量为2 8 0g y 。在m 2 代分离群体 中获得一株颖壳异常发育的突变体，将该突变体与9 5 2 2 野生型回交3 代，获得 隐性单基因控制的的突变体o s e 9 2 。所有植物材料种植于上海市农业科学院实 验基地。 2 1 2 突变体的遗传分析和定位群体的构建 将突变体与籼稻品种广陆矮4 号杂交，获得f 1 代。f - 代自交获得f 2 代， 大田种植，出现表型后，选择其中的突变植株作为定位群体。本研究中筛选到 定位群体1 7 3 8 抹。 2 1 3 水稻植株的表型观察 大田种植o s e 9 2 植株。待植株抽穗后，对野生型9 5 2 2 和o s e 9 2 突变体进行 观察拍照。 2 1 4 实验试剂及配方 本实验所用的引物由上海博亚( 英骏) 生物工程技术服务有限公司合成。 t r i s 、e d t a 和s d s 等购自s i g m a 公司。 h i g r o w 水稻培养基购自g i b e o b r l 。 其余试剂为国产分析纯产品。 ( 1 ) 1 5 x c t a b c t a b1 5 t r i s - h c l ( p h 8 0 ) 7 5m m 1 l 上海大学硕士学位论文 e d t a ( p h 8 0 ) n a c l ( 2 ) 氯仿：异戊醇 氯仿：异戊醇的体积比为2 4 ：1 ( 3 ) 6 聚丙烯酰胺母液 丙烯酰胺 n , n 一亚甲双丙烯酰胺 尿素 1 0 t b e 加水至 ( 4 ) 硝酸银染色液 在8 0 0 毫升水中加入0 8 9 硝酸银。 ( 5 ) 显影液 在4 0 0 m l 水中加入： n a o h 四硼酸钠 3 7 甲醛 ( 6 ) f a a 固定液 无水乙醇 冰醋酸 3 7 甲醛 水 ( 7 ) m s 基础培养基： 母液1 ：1 0 x 大量元素( 1l ) k n 0 3 n h 4 n 0 3 m g s 0 4 7 h 2 0 母液2 ：1 0 ) ( 钙盐( 1l ) c a c l 2 。2 h 2 0 1 2 1 5m m 1 0 5 m 3 0 0g 1 6 9 6 0 0 9 4 8 0 m l 4 8l 6 9 0 0 7 6g 1 6 m l 5 0 m l 5m l 1 0 m l 3 5m l 1 9 9 1 6 5g 3 7g 4 4g 上海大学硕士学位论文 母液3 ：l o x 钾盐( 1l ) k h 2 p 0 4 。母液4 ：1 0 0 x 微量元素( 1l ) 。 m n s 0 4 4 h 2 0 、 z n s 0 4 。7 i - 1 2 0 h 3 8 0 3 n a 2 m 0 0 4 2 h 2 0 c u s 0 4 5 h 2 0 c o c h 6 h 2 0 母液5 ：1 0 0 维生素( 5 0 0m l ) 甘氨酸 盐酸硫胺素 盐酸吡哆素 烟酸 肌醇 母液6 ：2 0 0 x 铁盐( 5 0 0m l ) 1 7 9 2 2 3 0 n a g 8 6 0 n a g 6 2 0 n a g 8 3m g 2 5 m g 2 5 m g 2 5 m g 2 0 0n a g 4 0 n a g 5 0 m g 5 0 m g 1 0 0 0 0n a g n a 2 - e d t a 3 7 3 0n a g f e s 0 4 7 h 2 0 2 7 8 0r a g 配制1l m s 培养基时分别加入母液1 、2 、3 各1 0 0 m l ，母液4 、5 各1 0 m l 和5 m l 母液6 ，另加入3 蔗糖，调节p h 值至5 8 ，高压灭菌( 固体培养基加o 7 的琼脂) 。 ( 8 ) m d 2 ： 在m s 基础培养基中添加以下物质： 干酪素5 0 0 m e c l 蔗糖 3 0 9 ，l 2 , 4 d2 m g l g e l r i t e2 5g ，l 调节p h 值至5 8 ，高压灭菌。 1 3 上海丈学硕士学位论文 ( 9 ) m d 2 5 ： 除了2 , 4 d 的浓度为2 5m g l 外，其余同m d 2 。 ( 1 0 ) 血s a s 液体培养基： 在m s 基本培养基中添加： 干酪素 5 0 0 m g l l a r g2 2 5 m 扎 l g l u 8 7 7m g l l - a s p 2 2 6m e d l 蔗糖 6 8 5g ，l a s ( 乙酰丁香酮)2 0 0 洲 调节p h 值至5 2 ，高压灭菌。 ( 1 1 ) m s 2 - a s ： m d 2 中加入1 0 0 “m 乙酰丁香酮。 ( 1 2 ) m d 2 d h 2 5 ： m d 2 中加入6 0 0m g l 的头孢氨苄，2 5m e ) u 的潮霉素。 ( 1 3 ) m d 2 d h 5 0 ： m d 2 中加入4 0 0m g l 的头孢氨苄，5 0m g ，l 的潮霉素。 ( 1 4 ) h i g 1 ： 在2 0 0 m l 含有5 0 0m gg e l r i t e 的水( 灭菌) 中添 j i l h i g r o w 溶液14 m l h i g r o w 溶液24 m l h i g r o w 溶液34 m l 头孢氨苄 3 0 0 m 舡 潮霉素 5 0 m g l ( 1 5 ) m s h ： 在m s 基础培养基中添加： 干酪素 2 5 0 m e j h 6 - b a 2 m g l 玉米素( z t ) 0 2 r d e j l 1 4 上海大学硕士学位论文 激动素 n a a 头孢氨苄 潮霉素 c j e l r i t e 蔗糖 山梨醇 调节p h 值至5 8 ，高压灭菌。 ( 1 6 ) m s n h ： 在m s 基础培养基中添加： 干酪素 n a a 潮霉素 头孢氨苄 g e h i t e 蔗糖 0 5 m g l 0 5 m g l 2 0 0 m g l 5 0 m g l 2 5 9 l 3 1