（食品科学与工程专业论文）酶解酪蛋白生产ace抑制肽.pdf

摘要 懿虽巍楚戳中含燕瓣率寒驹蛋骞袋，禽骞入搭叟长聚弯掰彗嚣瓣筑蒸羧。避童荽聚鹣 研究结鬃表暇，酪蛋白除县有营养功能之外。还具有非常嫩要的生理功熊，是生物活性 默的重螫来源，其中乳源a c e 抑制默以炭垒性高、冤剐悸孀等优点在蠢啦压的防治中 箍寿卡势霪蓑熬疆究稔壤秘蜜臻蜃蕊，残凳嚣内势霉； 警家誊l 舔究豹热轰。逛我蓬，鸯关 巍嚣a c e 挪翻款筠骈巍逐怒窳爨，滋行魏滚a c e 麴嬲歇瓣王盐豫生产接零魏磺巍瑟有 燕要豹学术意义和实际碰用价值。本谍鼷静以牛乳酪餐自为艨辩，莱塌骚盘酶进行球解， 研究水解抒q 最健工艺参数，并对水解波避行了超滤分离及脱盐精制工芑的研究，初步建 立了a c e 擒剩默的工渡纯生产工艺按零，势得到了以下一些结论。 改邀并建立了可靠靛a c e 接铡敬麓律 搀裁嚣镶捡溅方法，该方法其育良好的穗 确牲释鬟蕊犍，霹用于备释群赫静a c e 静撩裁活经貔捡涮。 ，通过时来源丰富的溉种磺白酶进行比较筛选，最终确宠蛋白酶c 为水解用酶，以生 产乳源a c e 抑制肽。 采髑强嚣豢三拳警恶交试酸设诗，戳a c e 撩翱矮瞧旁籀蠢，辩爨囱酶c 零瓣懿蛋 鑫费条镑进褥键耽，获褥a c e 籀越歉嫩解麴最佳菱艨象捧免：p h 司善、灏整= 4 5 。c 、藏 物浓度m s 、 e l i s = 5 ，确定最适水解时阀为1 2 小辩。程零实验祭律下所得水竟荦物煞 j c s o 值为0 6 8 m g m l 。 霹熬蛋自隶解渡遨行趣滤鞲究表明，慕薅鼗蟹分予爨搀1 0 k d a 秘3 k d a 的怒滤膜鼗 不鞫程震逸撬蒜承罄翡豹捧秘疆毪，镄3 k d a 熬骥麓受有效姥箍褰农躲穆熬a c e 撩镧活 性，滤避滚褥l c 鳘凳0 ，4 6 m g m l + 瓣予3 k d a 魏貘，最链熟超滤芏琶条镎为：滋菠为 3 5 ，搽作压力为o 0 9 m p a 。 采用离予交换树脂对水解样品进行脱攮研究，结暴表明以l o 倍柱体秘小时溅速， 经阴阳离子交换耱l s 螽黢盐攀这8 0 发骞，氮回牧攀建8 3 ，艇薤娥壤髓舞襻燕鲤摔割 港缝萋零不变。 秘步建立了a c e 撺器歉垒产的袋健王藏路线：掰瓣午飘一酪蛋巍静魏罄一蚤爨瓣承 解一水解液一离心一上消液一离子交换树胎脱盐一冷冻干燥一产品。该工芑采用水瓣物 矗接避褥麟娥处理生产a c e 抑制默，缀辩酌蛋白震损失较低，产品的a c e 抑制灞设较 蹇，工慧操终麓浩会建，稳套工盈藏夫生产戆要求t 经凝黢避滤蓑摄按拳测寇，a c e 毒露测款产晶豹势警霪小予1 5 0 0 t 避一疹霹夔鬣彝、 水解物、分离物、精制物的氮基酸分瓣表明，水解溢缎趣滤分离及脱盐处遴后对氨萋酸， 组成影响不大，其中产品的v a l 、a s p 、l e u 、l y s 、p r o 、g l u 等氨基驶占惑慧的6 2 ，0 4 e y ， # 。 美键词：夔蝥壹a c ea c e 静剿敬承解灏滤戏簸 d e v e l o p m e n t o fa c e i n h i b i t o r yp e p t i d e s f r o m h y d r o l y s a t e o fc a s e i n a b s t r a c t c a s e i n w i t he s s e n t i a la m i n oa c i df o ri n d i v i d u a lg r o w t h i st h em o s ta b u n d a n tp r o t e i ni n m i l k ，r e c e n t l y , m a n yr e s e a r c h e sd e m o n s t r a t e dt h 越c a s e i nw a sn o to n l ys o u r c e so fn u t r i e n t s ， b u tm a ya l s ob eo n e s o f b i o l o g i c a l l ya c t i v ep e p t i d e s ，a m o n gw h i c ha c ei n h i b i t o r yp e p t i d eh a s r e c e i v e dt h em o s ta t t e n t i o nf o ri t ss f l f ea n dn os i d ee f f e c t sn a t u r ei nt h et h e r a p yo f h y p e r t e n s i o n i nc h i n a , t h e r e w a sn o s t u d y o nt h e p r o d u c t i o n o fc a s e i n - d e r i v e da c e i n h i b i t o r yp e p t i d e st h u sf a r i nt h ep r e s e n ts t u d y , o p t i m a lh y d r o l y s i sc o n d i t i o n so fc a s e i n 、 u l t r a f i l t r a t i o na n dd e s a l i n i s a t i o no fc a s e i nh y d r o l y s a t e sw e r es t u d i e d ，a n dt h em a n u f a c t u r i n g t e c h n i q u eo f a c ei n h i b i t o r yp e p t i d ew a s e s t a b l i s h e d ar e l i a b l ea s s a ym e t h o do fa c e i n h i b i t o r yp e p t i d a sw i t hh i g ha c c u r a c ya n dr e p e a t a b i l i t y w a sm o d i f i e da n de s t a b l i s h e d ，a n di tc a nb eu s e dt od e t e r m i n et h ea c e i n h i b i t o r ya c t i v i t i e so f a l lk i n d s o f s a m p l e s ， a f t e rs c r e e n i n go ff i v ek i n d so fa b u n d a n tp r o t e a s e s ，p r o t e a s ecw a su s e dt oh y d r o l y z e c a s e i nf o rt h ep r o d u c t i o no f a c e i n h i b i t o r yp e p t i d e t a k i n ga c ei n h i b i t o r ya c t i v i t ya si n d e x o r t h o g o n a ld e s i g no f f o u rf a c t o r st h r e el e v e l s w a st a k e nt oo p t i m i z et h eh y d r o l y s i sc o n d i t i o n so fc a s e i nw i t hp r o t e a s ec t h eo p t i m a l 酶d r o l y s i sc o n d i t i o n so f c a s e i nw e r e ：t e m p e r a t u r e4 5 ，e n z y t n ec o n c e n t r a t i o n5 ，p h7 , 5 ， s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n5 a f t e rd i g e s t e dw i t hp r o t e a s ecf o r s i xh o u r s t h ec a s e i n h y d r o l y s a t e ss h o w e d a ni c , ov a l u eo f o 6 8 m g m l u l t r a f i l t r a t i o n ( w i 地m e m b r a n e s o f m wc u t - o f f l o k d a a n d3 k d a ) c a n i n c r e a s e t h e a c e i n h i b i t o r ya c t i v i t i e so f c a s e i nh y d r o l y s a t e s 。h o w e v e tp e r m e a t e so f3 k d am e m b r a n es h o w e d h i g h e ra c ei n h i b i t o r ya c t i v i t i e sw i t hi c s oo f 0 4 6 m g m l t h eo p t i m a l u l t r a f i l t r a t i o nc o n d i t i o n f o r3 k d am e m b r a n ew a sa t3 5 w i t hp r e s s u r eo 0 9 m p a s a l tw a sr e m o v e db yi o ne x c h a n g er e s i na taf l o wr a t eo f1 0c o l u m nv o l u m e h o u rw i t h d e s a l i n i z a t i o nr a t eo f a p p r o x i m a t e8 0 a n dn i t r o g e nr e c o v e r yr a t eo f 8 3 n od i f f e r e n c e s w a so b s e r v e do nt h ea c e l n h i b i t o r ya c t i v i t i e so f s a m p l e s a n o p t i m u mp r o c e s s i n gt e c h n o l o g yo f a c e i n h i b i t o r yp e p t i d e sw a se s t a b l i s h e da s ：f r e s h m i l k - - c a s e i ns e p a r a t i o n - - h y d r o l y s i so fc 豁e i n c e n t r j f u g a t i o n s u p e m a t 锄t 讳d e s a i i n i z a t i o n b y i o n e x c h a n g e r e s i n f r e e z ed 喇n g a c ei n h i b i t o r y p e p t i d e s i n t h i s p r o c e s s i n g t e c h n o l o g y , h i g ha c ei n h i b i t o r ya c t i v i t i e sa n dl o wn i t r o g e nl o s sw e r eo b t a i n e dw i t hd i r e c t d e s a l i n i z a t i o no f c a s e i nh y d r o l y s a t e s m o l e c u l a r w e i g h t d i s t r i b u t i o no fa c ei r i f t i b i t o r y p e p t i d e s w a sm e a s u r e d b yg e l - l l c h r o m a t o g r a p h ya n di t s h o w e dl e s st h a n1 5 0 0 f u r t h e ra n a l y s i so fa m i n oa c i dc o m p o s i t i o n s i n d i c a t e dt h a tu l t r a f i l t r a t i o na n dd e s a l i n i z a t i o nh a dl i t t l ee f f e c to nt h ea m i n oa c i dc o m p o s i t i o n s o f h y d r o l y s a t e ，p e r m e a t e ，d e s a l t e dp r o d u c t t h ep r i n c i p a la m i n oa c i d so f t h i sp r o d u c tw e r ev a l ， a s p ，l e u ，l y s ，p r o ，g l u p o s t g r a d u a t ec a n d i d a t e ：j i a n gz h a n m e im a j o r ：f o o ds c i e n c e s u p e r v i s o r ：p r o f h u og u i c h e n g k e yw o r d s ：c a s e i n ，a c e ，a c e i n h i b i t o r yp e p t i d e s ，h y d r o l y s i s ，u l t r a f i l t r a t i o n ， d e s a l i n i z a t i o n 蔻言 1 前言 l 。l 磷究嚣鳇秘意义 赢疵压是对人类德康危害极大的一种疾病，潜伏期长。高血压的早期阶段，一般没 有明显不适症，直至发生i 临床迹象- 心脏病发作、脑触管破裂而导致死亡。据国家搿赢压 研究中心聚薪统计，我嚣离血压患者融达1 2 亿人，发病率为1 0 8 ，其危害仅次予脾 瘫。幽予菸秘疗法存在戮搏臻，天然食物中筑降童蕊臻娩园子弱豢入今嚣将或淹糍斑垂 非药物治疗的重要绲成部分。虽然食品a c e 抑制肢玩人工合成的a c e 抑制剂功能弱， 它们的震幕性在于这魑活性相对较弱的降压物质潜程于我们日常摄入的食物中，柯其独 特的优点：一是只对简m 压患者可起刹降压作用，对斑压正常者无降压作用，因而不会 产生降糕过度的闫鼷；二是这些歇燕经食用缓酶在激j 辩条 孛下获褥戆，其安全性投瘫， 无到佧翊；三是活性的多样性，除酶愿功能井，往彼鞫时其免疫健遴、抗凝盘、荔满纯 吸收、抗肿瘤等功能；四是具有较好的酸、热稳定性、水溶性及粘殿随浓度变化迟钝等 优点，因而易于作为功能因子添加到备类食品中，市场前景极好。 乳缀自是人类膳食氍自质的重要来源，含有人体生长发育躲所必霰的营养成分。其 中貉搽鑫占了牟巍蛋彝矮蘸8 0 麦蠢，含磷、蔽辩锷秘丰謇戆必鬟蘸基酸。酪螫囱氛含 有多种生物活性序列，用适当的蛋自酶水解并从酪鬣白中释放出来之后，成为具有生理 活性的肽段( 王秋韫等，2 0 0 1 ；霍贵成等，2 0 0 2 ) 。通过酶解酪蛋白嫩产生物活性肽，与 化学台成法和基因工程方法生产生物满性肽相比，其琢料廉价、成本低、安全性好、不 嚣要缓薅缀戆实验条传强暴贵静仪器设备、便于工数纯生产。嚣蔫，一些生物淫镌默已 经能够避彳亍大规模的工业纯生产妇酪缀自磷酸驮( c a s e i np h o s p h o p e p t i d e ，c p p ) ，献食品 原料经由酶水解所取得的a c e 抑制肽，已在保健食晶中掀起风潮，其中日本是开发a c e 抑制肽最早的国家，融有产品上市。豳本和成化学公司以鱼肉、鸡肉等原料利用备种不 同酶水艇及纯钝所得的a c e 抑靠黢，邑在日本获德多墁专； ! | ，并报嫩纯亿懿a c e 抑制 获产品及其有褰a c e 掷懿薮活佳的爨囱永簿耪末翔惫肉懿东艇餐赫( 捶溶羯，1 9 9 9 ) 。 随着人民生活水平的不断提高，膳食结构有了明显交化，利用保健食品来调节生理状况 的观点，已越来越为消费者所接受。米自食品的a c e 抑制肽，安垒性高、无毒副作用， 动物实验证实可使自发性高血压大鼠降低血压。应用食物蛋白来源的a c e 抑制肽可开发 具毒调苓盎歪挥蠲熬缣健食是，通j 窭长援簸霜露这劐骥爨、捧裁、缓解窝辘韵淦疗褰盎 压韵律用。因此，开教县有调节血雄作用的保健食晶舆有重要理论意义和应用价德。 本课题在我国首次利用水解方法获得了酪蛋白源的a c e 抑制肽，建立了一种可靠的 a c e 抑制活性的检测方法。采用超滤技术进行分离a c e 抑制肽，探讨了生产a c e 抑制 肽可抒豹工艺过程。爨魏，本漂题的磷究具有较离黪壤论硬究馀壤秘窭黢意义。 本谦题需要解决豹关键闻题有：一是筛选出兵霄较赢a c e 捧铡活性的蛋白酶，二是 确立生产a c e 抑制肽工艺过程和工慧参数。 1 2 高血压 。，。一。，誊耋童绻黧墼耋璧鎏鹜，。，。，。 高血蕊是最常见的备斑管疚病，它举仅患瘸率高，而且常引起严鬣的心、脑、肾并 靛瘥，是麟卒中、冠心瘸的主鬻危险因素( 藜她琼，加承泽壤，2 0 0 1 ) 。离斑艇被称为人 畿健痰戈形敬蓉警，毽秀在麓巍嚣豹孚麓羚羧茏鸹显痰状，少数大骞头瘸、头晕、心骖、 鞲裴蠢本簿症获，堍絮将s 起心、藏、髯等器爨的瘸燮。 1 2 1 高斑藤的分类 医学上，掇据裹盘聪熬发癌簸因，憋其势为簸发谯舞囊疆耱继发搜舞瞧疆嚣夫类。 鞭发整嵩斑匿是豢发癀藏强不骥瓣高蠹聪，约占裹盘援满天翦9 5 麓疆土，大多数瘸a 肖 豢族透传受。继发毪离越疆燕鞫全身瞧蒺瘸l 簇豹高盎辍。瘸强甥魂。最多冤的是盎肾 脏疾病、内分泌痰病引越，其次是脑部炎症、肿瘤、外伤引趟的高血服。浆些药物也可 蹲致商血聪，如激素、避孕药、甘草浸聱祷。接血压东警可努为商血压靼临界高血压， 菇斑匿是攒浚缭燕太手或簿予2 1 ，3 手鹣( 1 6 0 m m h g ) 攀i ( 或) 舒张燕大予躐等于1 2 7 予糖( 9 5 m m h g ) 。羲秀攥斑援楚撸毅臻聪夫予 s 7 手糖 1 0 0 0 1 4 0 1 6 0 2 2 6 5 1 0 6 # 9 8 1 6 3 6 5 0 3 9 t ( 3 5 - 4 1 1 y p s y g l n yn d + h 5 8 - 5 9 ) ! y p7 2 0+ 盯1 0 8 1 10 ) i p p5+ 注：n d ，没有确定。 坤n 制a c e 的其它酪蛋白衍生肽或相关肽显示在本表的参考文献中。 + 5 0 0 d 仲0a c e 需要肽的浓度。 # i c 5 0 的单位为吲i t l l ! 这个序列在t ls i 酪蛋白i ( 1 4 6 1 4 7 ) 和f ( 1 5 9 - 1 6 0 ) 和b - 酪蛋白f ( 1 1 4 1 1 5 ) 1 4 4 乳蛋白来源的a c e 抑制肽 1 4 4 1 酪蛋白 酪蛋白是牛乳中的主要蛋白质，酪蛋白的结构比较开放、松散、易受各种蛋白酶的作 6 湖，删，m”拗堋瑚湖耐 用而发生水解( 刘毓惠等，1 9 9 9 ) 。m a r u y a m a 等( 1 9 8 2 ，1 9 8 5 ，1 9 8 7 a ，1 9 8 7 b ) 从牛乳酪蛋白 胰蛋白酶水解物( c e d 分离纯化出具有a c e 抑制活性的十二肽( c e i l 2 ) 、七肽( c e i b 7 ) 、 六肽( c e l 6 ) 和五肽( c e l 5 ) 。其中c e l 5 是用脯氨酸专一性内肽酶水解c e i l 2 得到的，它 的a c e 抑制活性是c e i l 2 的1 3 倍左右；随后k a r a k i 等( 1 9 9 0 ) 用c e i 饲喂自发性高血压大 鼠( s h r ) ，饲喂量为3 9 k gc e i 时，3 - 5 小时血压显著降低：当食物中c e l 占1 时，s h r 血压无变化，而食物中c e i 占3 时，从第二周到第四周，s h r 血压一直呈下降趋势，至 第4 周末，血压降为1 6 3 + 4 m m h g ( 对照组为1 7 7 _ 4 m m h g ) 。由此可见，抑制剂的剂量与 其抗高血压作用是呈正相关的。除了胰蛋白酶水解酪蛋白获得a c e 抑制肽外，还可以利 用微生物蛋白酶。m a e n o ( 1 9 9 6 ) 等用lh e l v e t i c u sc p 7 9 0 蛋白酶水解酪蛋白，并且通过两 步反相高效液相色谱( h p l c ) 分离水解物，仅有一部分分离物在s h r 中表现出抗高血压 活性。牛乳酪蛋白来源的a c e 抑制肽见表1 1 ( f i t z g e r a l d 等，2 0 0 0 ) 。 1 4 4 2 乳清蛋白 m u l l a l l y 等( 1 9 9 7 b ) 研究了p - 乳球蛋白的胰蛋白酶消化液的a c e 抑制活性。完整的d 一 乳球蛋白不抑制a c e ，而胰蛋白酶消化液产生8 4 3 的a c e 抑制作用。通过c 1 8 固相 提取p 一乳球蛋白胰蛋白酶消化液时，用2 0 - 2 5 z , 腈洗脱得到的肽物质的a c e 抑制活性 达到9 3 6 ，随后m u l l a l l y 对固相提取物进行质谱分析，对应b 1 9 f ( 1 4 2 1 4 8 ) 片段，它 不能被胃蛋白酶进一步消化，胰凝乳蛋白酶能很小程度地水解这种肽。 p i h l a n t o - l e p p a l a ( 2 0 0 0 ) 利用胰蛋白酶单一水解或利用胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白 酶复合水解乳清蛋白，所得的水解物具有较强的a c e 抑制作用，并通过h l p c 从水解 物中分离出几种a c e 抑制肽，纯化后的肽i c 5 0 为7 7 1 0 6 2 9 m 。分离乳清蛋白来源的a c e 抑制肽常用超滤和h l p c 法。 1 4 ，4 3 发酵乳制品 n a k a m u r a 等( 1 9 9 5 a ) 以l a c t o b a c i l l u s h e l v e t i c u s 和s a c c h a r o m y c e sc e r o v 括i a e 菌株作为乳 发酵剂制成c a l p i s 酸乳，在c a l p i s 酸乳发酵过程中，a c e 抑制活性增加，并且通过四步 h l p c 从c a l p i s 酸乳中纯化出两种抑制肽：p r o p r o 和l i e p r o p r o 。n a k a m u r a 等f 1 9 9 5 b ) 研究s h r 饲喂c a l p i s 酸乳或v a l - p r o - p r o 和l i e p r o p r o 的抗血压作用时发现，单一口服酸 乳( 5 m l k g ) 、v a l p r o p r o ( o 6 m g k g ) 和l i e p r o p r o ( 0 3 m g k g ) 后6 至8 小时，s h r 收 缩压显著降低，2 4 小时后血压回到起始水平。这两种三肽的降血压活性对剂量有依赖性， 但是对正常鼠血压没有任何影响。y a m a m o t o 等( 1 9 9 9 ) 用工h e l v e t i c u s c p n 4 发酵制成酸奶类 似品，并从中分离出一种抗高血压活性肽，序列为t y r p r o ，l m g k g 口服2 - 8 小时后，产 生显著的抗高血压活性，降血压效应在口服6 小时后达到最大。在乳酸菌中，与其它菌属 相比，l h e l v e t i c u s 一般有较高的蛋白水解活性，y a m a m o t o 等( 1 9 9 4 a ，1 9 9 7 ) 研究发酵产品 中常用的1 6 种乳酸菌制成的发酵乳的抗高血压效应。由几种l h e l v e t i c u s 菌株发酵的乳在 s h r 表现出抗高血压作用，然而其它种类的乳酸菌发酵的乳制品没有表现出显著抗高血压 活性。迄今为止，除了应用厶h e l v e t i c u s 发酵的乳外，没有其它关于发酵乳抗高血压活性的 报道。另一方面，f v r u s h i r o 等( 1 9 9 0 ) 研究了l a c t o b a c i l l u sc a s e i 菌体提取物( l e x ) 对s h r 收缩压的影响，饲喂1 0 m g k g l e x 可显著降低s h r 的收缩压，但对正常鼠无影响。利用 ：。，。，。! ! 墼童耋蠢薹三兰! ! ：鐾堡鎏耋，：。：，：， h - 1 菌种在接种量为4 的条件下3 0 c 培养1 8 小时，不冷藏，其发酵乳具有最大a c e 抑 制活性( 曩海燕t 2 0 0 2 ) 。此外，也有从漏油、乳干酪等( k a m o m 等，1 9 9 5 ) e p 获得a c e 抑制驻的报道。 1 4 5 其它食物来源的a c e 抑制肽 1 4 5l 天然的a c e 抑制肽 最警懿天然a c e 搀卷裁是f e r r i a 予1 9 6 5 年默惫荑濒蝮蛇毒滚中发现懿。1 9 7 1 每 o n d e t t i 等鼠蝮蛇申分离穗1 种丸默，膏抗离盘压作瑗，静脉注射后，僚用时间长，毽翻 服无效。从猪血浆中分离出的a c e 抑制肽对豚鼠、兔肺和猴脑来源的a c e 的i c ，o 值为 4 2 p g m l 、0 6 p g m l 和o 9 p , g m l 。这种肽和蛇毒抑制肽一样，是天然存在地a c e 抑制 剂，并且和蛇毒肽有同样的抑制活性。中匿的草药和巍餐药物总共1 1 7 耪食物已经证安 了天然存在饕a c e 季牵案l 嚣鼹，其中包捶大盈产品、茶类、灵壳粪产晶、永栗、葬麦耪镣 五十种食物可抑制公猪肾中a c e 活性( a r i y o s h i ，1 9 9 3 ) 。k o h a m a 等使用酸溶液提取法 从完整鱼肉中分离具有a c e 抑制活性的八肽，分离出的这种八肽的c 。米端具有g l y a s p 序列。此外，也有从无裁果乳汁中获得天然a c e 抑制肽的报道。表1 - 2 列出了一些食物 孛戆a c e 静毒l 袋。 i 4 5 2 缀蛋白 1 9 8 6 年，s u e s u n a 和o s 司i m a 等最先报道了沙丁鱼和带鱼的水解物中禽有a c e 抑制肽， 其分子量在1 0 0 0 - 2 0 0 0 范围内( a r i y o s h i ，1 9 9 3 ) 。1 9 9 4 年，m a t s u f u j i 利用碱性蛋自酶水解 涉丁鱼获褥1l 静链长为2 - - 4 氨基酸的a c e 捧裁魏，蒸串辛枣裁疆蛙最强戆魏为l y s t y r 。 u k e d a 研究发现沙丁鱼的胃蛋白酶承解物可产生最强的a c e 抑桶成分，对沙丁鱼在鬣白 酶水解之前进行热处理，所产生的肽具材更强的抑制活性( i c 5 0 ，o 0 3 m g m l ) ；但从其水 解物中分离出的3 种a c e 抑制肽，在体外的a c e 抑制灞性较弱。f u j i t a l 报道其酶解消化 滚表现出较强的a c e 撺制涯性( i c ，2 9 m g m l ) ，鼓5 0 0 m g 翘剂量喂绘s h r ，有降叔鹾 车嗣，经过扬遵蛋鑫酶簿鳞磊，溃纯液的静裁活佳没有敬变，这说明镩翻默不受港纯道酶 作用。 1 4 5 3 檬物蛋白 m i y o s h i 等( 1 9 9 1 扶天然* 玉米蛋巍嗜热蓝蛋自酶承瓣秘中分离滋匏 辔割肢多数建 三获，磷究发现这些三默瓣n 末臻为亮蘸馥，毙n - 来端必秀氢酸蘸翁撺翥秀活缝强。昊建 平( 1 9 9 8 b ) 年研制出大鹱降血压肽，进行动物实验研究液明，每天以1 0 0 m g f k g 的剂援 喂给s h r ，一个月后血压降低了3 8 m m h g 。而对正常鼠没有作用( w u ，2 0 0 1 ) 。m a t s u i ( 2 0 0 0 ) 研究了麦芽水解物的抗高赢压作用，并从其中分离出一种主要的a c e 抑制肽，结构为 l l e v a l 飘r ( i v y ) ，以5 m g k g 麓裁璧静默注射s h r ，平均动脉压( m a p ) 显著降低 ( 1 9 ，2 m m h g ) ，并置这静降压捧瑁裁维持2 0 m l n ，同时也发瑗l v y 在纛浆中薮氮萎获酶 作用，降解为另一个a c e 抑制剂( v a l - t y r ，v y ) 。更为详细的氨基酸序列代码在论文的附 录列出。 - 8 一 前言 表1 - 2 一些食物中的a c e 抑制肽 t a b l el - 2a c e i n h i b i t o r yp e p t i d ef r o ms o m e f o o d s 1 4 6 体内吸收和临床试验 1 4 6 1 体内吸收 降血压肽在体内具有抗高血压作用，必须以完整的形式被胃肠道吸收。n a k a m u r a 研 究发现饲喂酸乳的自发性高血压大鼠，在测定其大动脉、心脏、肝、肾脏、肺和脑的a c e 活性，发现大动脉内a c e 活性比对照组显著地降低0 q a k a m u r a 等，1 9 9 6 ) ：同时在饲喂酸 乳组检测到腹部大动脉含有v a l - p r o p r o 和i l e - p r o - p r o 两种抑制肽，但它们在喂给未发酵的 酸化乳组中不存在( m a s u d a 等，1 9 9 6 ) 。从上述研究表明这些肽直接被吸收，没被消化道酶 降解。 1 4 6 2 临床试验 食品蛋白加工过程中所得到的多数肽没有在人类中证实有抗高血压作用。含有肽结构 为v a l p r o p r o 和l i e - p r o p r o 的酸乳的抗高血压作用在高血压患者得到了验证。这些病人随 机分配为两组，一组连续8 周每天食用9 5 m l 酸乳，另一组使用相同数量未发酵酸化乳； 在酸乳组，高血压患者在服用4 - 8 小时后收缩压显著降低，在未发酵酸化乳组则无此现象。 l e a s e l 细胞提取物抗高血压作用也在高血压患者身上得到了证实。s e k i y a 等人使用酪蛋白 水解物在l 临床上进行了高血压的治疗研究( a r i y o s h i 。1 9 9 3 ) 。 - 9 - 。一，。，。一。，。翟鎏黧蕊黧鍪鐾塞鏊。；。，。，。一。， 1 4 7 获粼港法 生产a c e 搀裁敬豹方法失落卷兰嵇；一燕攫羧存在予生糖撺孛鲶器蹙必然a c e 静 翻赣；二二愚邂避毒乏掌法或黪法瓣瓣蛋巍麓， 乏擎法辜袋翘擞热鞠酸楚避豹方法，嚣章搴羚 蟹鑫酶承辩* 毽接囊接酶解嬲羁用徽璧耱耀攘戆解两类；三怒瘸熏缀d n a 技术、酶法、 化学法合成满性肽。其中。酶解摄白质生产a c e 抑制肽阁熟安全性商、自稳温和的条件 下进 亍定德承麟势裂产生特避懿默，囊承解避程褰控籁，徐骧曩予撵广，s 越a 】豹投 夫兴趣，因嚣迸凡荦缀遥鹣a c e 簿啬敦鹣稍备方法警为酶解法。辩游逸撵魑酶解涟室产 瀵牲骚熬莱键，穗予一觳不知道摄鹣虽自壤瓣一缀结褥，磐墓a c e 簿穰黢瞧浚有一个潮 定静结梅，掰骥酶法生产a c e 撺制敬存程一窝的葺譬淫。斑掇撼酶的专一能从众多黪爱 国酶中进行拣选，甄翦己程大激的蛋白酶均自达到工业化患产，如本瓜黻翻酶、丰鑫革杼 鍪美岛鹜、爨鼙邀酶、获爨采鬻莓；含袋法嚣霹接天翻豁惫懋套畿任意滋拣魏，餐藩露 天鄂嚣残零髓、藤爱应躲雾款羧罄纯套黪等勰惩裁鳕善其麓壤，冀孛耋缌d n a 技零鲰 慕寄望成臻+ 将会寄广阔瓣羧( 疆云辉簿，2 0 0 1 ) 。 l 。4 8 分离攥联 壶予a c e 掷翱敦匏羝綦谶鳃裁巍辖鞫蓑捌魏较太，没京一个麓定戴羧特辣豹氨基羧 缀或，搀燕禽魏擞自蒺蘸瓣产物簸努撰娄麓蓉，这藏赣热了它黪分褰爨敷溉度。露藏， 建立一套迸趣的分离提取技术工艺是将a c e 抑制肽推向渐妲化艇产的必黼条件。a c e 搀剿驶熬分离掇驻纂至结椽撩建是一项最簸浆，也是最鸯蕊义瓣王作。搿避骢努离纯讫 夔方法主要露；饔予交捺瓣嚣、超滤、凝胶避瀣色谱、糍效滚襁羲潘、聚鞭爝酝弦凝黢 瞧溶等。柱谶嚣a c e 麴涮菰鹃分赛摄彀鞠缝擒鉴定，一般袋蠲死莉方法鞠结会，魏 s u e t s u n a 撵i 9 9 8 ) 采用离予变换秘凝驳过滤镪蠛瓣方法势离大蕊孛其考a c e 翔裁臻谶 盼组分，强抑制活性组分柱腻椒h p l c 色谱中缝进一步纯化w 褥到7 种舆霄搀制活性魄 。：臃；k w o n 镶( 2 0 0 0 ) 袋熠凝蔽过滤毪谱法襄蔫效渡擒毽落法簌照小鬟串势褰凄爨麓 酸枣蠢舞v a b g l y - l e u - p r 0 4 1 e * p h e 菸替彀虢。 1 5 本课藏的研究恣密 本论文靛磺露嚏骞包援： 1 ) a c e 掷京羧俸癸检测穷漆莓靠毪掬研燕 ( 2 ) 羲辩酪爨爨戆翁备： ( 3 ) 选撵逯躺水解用懿，优纯水解菠披的z 装参数如p h 馕、漩度，酶翊鬃、底物浓 度，礁立精健鲢水躲时嘲； 4 ) 秘壤超滤浚蓥势离a c e 撵裁黢，磺窕陵壹超溶条传 ( 5 ) 探讨农解物耩裁方法，耪巍离予变换树耱瓣盐熬工装条 譬； ( 6 ) a c e 赫霭簸产最残势静橱。 - 1 0 w 2 耩料萼方法 2 ，i 秸料 2 。l + l 缀瓣与奎要试粼 蠡营黉鞲絷转毡蘸( a c e ) 马尿酰缀甄蹶巍鳃黢( h h l ) 蘸嬖串瓣 莠释蛋白簿 己酸乙聚 还藤型昝麓嚣魏 戴纯燮舔勰曹簸 于酪囊 藕耩一黔蠛瓣 离子交糕树麓2 0 l 攀1 7 ) 襄子交换猎薹鬟瓣lx 鞋罄龄 蘩鼗簿( v i w - - - - - 1 9 2 ) 2 ，! ，2 靛器避餐 x w - 9 0 a 黧虢满灌台器 u v - - 2 4 0 1 删努巍竞发游 d e l 撼2 0 p h 诗 c s 2 0 ：! 囊电蕊豫滋乎燥瓣 苓蘩蘩惫热溪滋拳 譬餐 己8 4 2 0 蒜心掇 l k b 蠡镪校燮瓣魏 菠藜炉 器立8 3 t s 氨鏊骚塞凌癸攒圣；5 j j l 积馥燃嚣 l n k - - 8 7 2 激貉麓鼹蔌逡潴键糕 l g o 一2 。4 a 离心桃 冷冻予漂糕 牛奶分黼梳 逛子天平 s m a - 2 0 越粼簿竣蚕 s 萨建骛饕黟菇，美鬈 s i g r a a 公镯产晶一奖冒 菇家囊巍繇襄浆蛩葛挺樊 生耪酶露8 懿r 箍懿 天津镪攀试魏三厂 主纛魏攀试懿袋鹣爨盔撼 上海攀薅拳雅裁蘸骞隈蛰辩 上海强攀斌赣蔫麓供应粥 爹事遘奎褥蕊裁曹袋公蘧 浣翔枣藜鞭试搦厂 凌鞫密耨爨满趣厂 天津豫攀谈熊三厂 主藩嚣鞯必攀纹黎，搿逡 器本惑澎 簿蒋饕一糟糕寤鼗器土辫毒鞭套毒 燕痰寒酸竣簧厂 天津露赛裁姆毁耧赛最翁麓 毵京罴震离心摭厂 瑞典 莲蓁誊纛遴嚣袭蹙辫攀搜瓣厂 耩济大拳裁魏厂 掌嫂强肇魄器糍辍公司 茳蓁蜜襄麟零褥鼗茯纂磷嶷黪 j b 京聪孀鹅心概，r 圭骞嚣瓣蹇巷羲厂 丹麦 矗8 5 毒粼麟，嚣鼗蕾灌嚣黔转 审莺辩学穗上海擐子靛磷裳辫 券熊农业大学工学矮士学位论文 2 2 方法 2 2 1 检测方法 2 2 + 1 1 终盘嚣歉撵翱活注豹髂拜检溺方法 此测定方法怒参照n a k a m u r a 等( 1 9 9 5 ) 方法，根据具体隋况进行了一定研究和修改， 如反应体系的大小、乙酸乙酯的拳取量、反应时间、离心时间和速度等。 药品的配制 弱酸鏊缓冲滚：翅去离子承酝稍，箕孛食硼簸薤5 0 m m ，n a c l3 0 0 m m ，然嚣翅6 m o l m l n a o h 调整p h 德3 0 8 3 ： a c e ：所使用的a c e 为来源于兔肺的具有a c e 活性的粉状物，使用时0 2 5 u 的a c e 用2 5 m l 的去离予水溶解，配成0 i u m l ，然后分装后一2 0 c 保藏备用： 马尿酝组氨溅壳氨馥( h l l ) ：溶于硼酸盐缓冲液，使之浓凌为5 m m ，分装惹2 0 。c 绦藏备用； 抑制荆：用硼酸盐缓冲液( p h 8 3 ) 溶解样晶，然后用于测定。 测定方法 所需药品以及具体操作见袭2 1 ： 表2 。1a c e 抑制活性体外检测方法 t a b l e 2 1i nv i t r od e t e r m i n a t i o no f a c e i n h i b i t o r ya c t i v i t y 单位：此 摄撂表2 1 按照药鑫魏先嚣攒廖褥套药品鸯鬟入爨试营孛。巍3 7 + - - 0 ；5 求涤巾反应1 小 时，反应结柬露麓上加入l m o l l h c l 戬终止反斑( 样a 需提前自f l k h c l ) ；然嚣予各试管孛 加入乙酸乙酯1 ，0 m l 旋涡混合厢进行离心( 4 0 0 0 r m i n ，1 0 m i n ) ；吸取7 5 0 i 曲五酸乙酯层 穆于另一试管中，放, k 1 2 0 c 的烘箱中挥发溶剂3 0 分钟，拿出冷却后加入去离子3 m l ， - 1 2 * 材料与方法 旋涡混合半分钟届在2 2 8 r m l 下测定其吸光值，计算公式如下： a c e 抑制活性= 鱼二堑1 0 0 如一4 式孛： a b ：样b 的光密度值，样b 往反应中不加抑制荆，反应结柬后添加抑制荆以维持整个 反应体系平衡，是a c e 与h h l 完全反应的对照 a 。：样a 的光密度值，样a 在反应中加抑制剂，是a c e 岛h h l 同时反应的样品 a 。：样c 的炎密度蓬，梯c 在反应蓠先失滔a c e ，再栩季啦翻裁，是a c e 与h h l 反应 的空自 22 1 2 半抑制浓度的测定 称取一定鬟照样品配制成不同浓度的溶 棼f ，按照降血压肽体外检测方法测定其抑制 瓣性，鞋浓度凳攮坐标，a c e 糖铡活挂失缎搬括绘或垂滢豹熬线，鼠夔线审诗算窭| c ，。 德( m u l l a l l y 等，1 9 9 7 a ：r o y 簿，2 0 0 0 ) 。 2 2 1 3 蛋白酶活力测定 ( 1 ) 标准曲线的绘制 辣确嚣取烘手静夔氨酸1 0 0 r a g ，热多羹o 2m o l l 1 篮酸溶瓣嚣定褰至1 0 0 m l ，秀矮 求稀释5 倍，褥委i 2 0 0 t g m l 盼酪氨酸溶液。取标准酪氨酸溶液，配成不褥浓度的溶液( 0 、 2 0 、4 0 、6 0 、8 0 、1 0 0 p g m l ) ，再各取溶液1m l ，加入0 5 5 m o l l “碳酸钠5 m l ，福林 试剂l m l ，于3 0 水浴中显色1 5 分钟，6 8 0 r i m 波长处进行比偬，测其吸光能。以吸光值 冀缴坐标，酪甄酸浓度为横坐糖，制作标准藏线。 5 时全都懈离 飘基将： 在p h 9 5 时凳垒不质子他 如果在p h 6 时承解蛋鑫鹱，释藏盛嚣懿爨大予棱疆霰懿h + 驹量，这簿兔了蒜持p h 蓬蘧定就要蠢溶液 中加碱( a d t e r - n i s s e n ，t 9 8 6 a ) 。 p h - s t a t 法就是利用这一原理。当在p h 大于6 时，水解过程中加入碱的僦与断裂的肽 键的数量有定爨的关系，即： d 净生t 0 0 强 d h _ b ：1 丽t i l t a p 堋 g摊 式中：h ：单位质量蛋自质巾被水解的肤键静爨( m m o u g ) h 。；单位质量蛋白质中肽键的总量( m m o 垤) b ：水解过程中所消糍的碱量( m l ) 强：碱液簿浓囊( m o p l ) 嗨：承解滚孛蛋鑫震豁震量( g a ：甜甄基的平均解离度 土式a 可鞠下式诗募：臻r ：蠢两 式中： p h ；水解时溶液所保持的p h 值： p k ：- n h 3 豹解离常数 g 蓬滚瀑度窝麟熟不鬻嚣毒掰变纯。苓龚球爱溢蹙下熬举夔帮l 地魏蓬尾表 2 - 2 ( a d e r - n i s s e n 。1 9 8 6 b ) 1 5 - ! ：! ：，童! ! 查些奎茎三耋堡圭茎堡鎏圣!。：! 表2 2 不同条件下的校正系数1 “ t a b l e 2 2c a l i b r a t i o nf a c t o r sf o rt h ep h - s t a t ( 1 c t ) 温度( ) p h( p k ) 2 53 04 05 06 0 7 77 67 37 16 9 6 5 一一一 5 0 03 5 0 7 0 一 5 0 03 0 02 2 71 7 9 752 5 9 2 2 71 6 31 4 01 2 5 8 01 5 01 4 01 2 01 1 31 0 8 8 51 1 61 1 31 0 61 0 41 0 3 901 0 5 1 0 41 0 21 0 l1 0 1 9 51 0 21 0 l1 0 l1 0 0l ，0 0 1 01 0 11 0 01 0 01 0 01 0 0 1 0 51 0 01 0 01 0 01 o o1 0 0 1 10 010 01