（食品科学专业论文）猪血多肽的发酵法制备及其ACE抑制活性研究.pdf

猪血多肽的发酵法制备及其a c e 抑制活性研究 摘要 我国猪血资源非常丰富，每年由屠宰生猪而产生的副产物猪血总量约1 5 亿公 斤，但是国内对猪血深加工或综合利用的研究进展缓慢，资源利用率低，既浪费 了宝贵的生物资源又造成严重的环境污染。目前，利用不同蛋白资源开发功能多 肽已成为研究热点，本文对猪血粉蛋白制备猪血活性肽进行了研究，并对其血管 紧张素转化酶( a c e ) 抑制作用进行了探讨。 对三株不同的枯草芽孢杆菌进行了透明圈实验和产蛋白酶活力比较，选用 d c 值较大和产酶能力较强的b 3 菌株以猪血粉为原料进行发酵。结果发酵后猪血 粉的蛋白质含量下降了2 4 0 5 ，氨基态氮含量分别增加了4 4 4 倍，可溶蛋白含量 上升了5 3 7 7 ，说明枯草芽孢杆菌b 3 是发酵猪血粉的优良菌株。 利用b 3 菌株进行发酵猪血粉条件的单因素和正交优化实验，考察温度、摇 瓶转速、起始p h 值、接种量、时间对发酵液水解度的影响。结果确定发酵血粉 制备猪血活性肽的最佳水解条件为：温度3 0 0 c 、转速1 6 0 r p m 、p h7 5 、接种量6 、 发酵时间5 0 h ，得到最大水解度为3 2 3 。 采用微滤膜和不同截留分子量的透析袋对b 3 菌株猪血粉发酵液进行分离， 冷冻干燥制备猪血活性肽粉。t r i c i n e s d s p a g e 电泳图谱表明，未经处理的发酵 液和经过0 2 2 9 m 微孔滤膜处理的肽粉分子量分布广泛，经透析袋分离的组分级效 果明显，三者的分子量分布呈现递减趋势，可以分离得到较小分子量的多肽，且 分子量明显小于珠蛋白的分子量1 4 4 k d a 。 氨基酸分析表明，猪血多肽和猪血粉相比，组成氨基酸种类发生了变化，猪 血粉、大于1 0 k d a 、l k d a - - - 1 0 k d a 、小于l k d a 猪血多肽的氨基酸组成分别为1 3 种氨基酸和4 种未知寡肽、1 3 种氨基酸和4 种未知寡肽、1 2 种氨基酸和6 种未 知寡肽、8 种氨基酸和7 种未知寡肽，随着水解度增大、分子量减小呈现氨基酸 构成种类减少和寡肽数增加。猪血多肽含有甲硫氨酸，而猪血粉中未检测出该种 氨基酸，猪血多肽中均未检出苯丙氨酸，在分子量介于l k d a - - 1 0 k d a 样品多肽 中未检出精氨酸、分子量小于l k d a 样品多肽中未检出天冬氨酸、苏氨酸、丝氨 酸和精氨酸。 利用高效液相色谱法( h p l c ) 澳q 定了猪血多肽对a c e 的抑制效果。结果表明， 大于1 0 k d a ，l k d a 、一1 0 k d a ，小于l k d a 不同分子量段的多肽对a c e 抑制率均随浓 度增加呈现增长趋势，同时得到其i c s o 值分别为4 9 9m g m l 、3 2 8m g m l 、1 8 3 m g m l 。 关键词：猪血粉枯草芽孢杆菌猪血多肽血管紧张素转化酶 s t u d yo np r e p a r a t i o na n da c ei n h i b i t o r ya c t i v i t y o fp e p t i d e sf r o ms w i n eb l o o dm e a lb yf e r m e n t a t i o n a b s t r a c t t h eb l o o do fs w i n ew a sv e r ya b u n d a n ti no u rc o u n t r y a b o u t1 5b i l l i o n k i l o g r a m ss w i n eb l o o dw e r ep r o d u c e db ys l a u g h t e re v e r yy e a r t h es t u d y o n c o m p r e h e n s i v eu t i l i z a t i o n & d e e pp r o c e s s i n go fs w i n eb l o o dm a k e ss l o wp r o g r e s s ， l o wr e s o u r c eu t i l i z a t i o nr a t e ，e t c n o to n l yw a s t e dt h es o u r c e s ，b u ta l s os e v e r e c o n t a m i n a t i o ns u r r o u n d i n g s a tp r e s e n t ，t h ee x p l o i t u r eo ff u n c t i o n a lp e p t i d eh a sb e e n ar e s e a r c hf o c u s i tw a ss t u d i e di nt h i sp a p e rt h a tt h es w i n eb l o o dm e a lw a su s e dt og e t p e p t i d e s a tt h es a m et i m e ，i tw a ss t u d i e dt h a tt h ei n h i b i t i o no fa n g i o t e n s i n i - c o n v e r t i n ge n z y m eb yp e p t i d e s i nt h i sp a p e r ，t h et r a n s p a r e n tc i r c l em e t h o da n de n z y m ea c t i v i t yo ft h e i rp r o t e a s e w e r eu s e df o rb a c i l l u ss u b t i l i s t h es t a i nb 3w a ss e l e c t e dt of e r m e n ts w i n eb l o o dm e a l w h i c hh a sal a r g e rd cv a l u ea n dh i g h - y i e l d i n ge n z y m ec a p a c i t y t h er e s u l tw a st h a t t h ep r o t e i no fp o w e rf r o ms w i n eb l o o dd e c r e a s e d2 4 0 5 ，t h en i t r o g e no ff r e ea m i n o a c i d si n c r e a s e d4 4 4t i m e sa n dd i s s o l v i n gp r o t e i ni n c r e a s e d5 3 7 7 ，a 儿t h e s e d e m o n s t r a t e dt h a tb 3w a saf i n es t r a i nt of e r m e n ts w i n eb l o o dm e a l t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fb 3w e r es t u d i e d b yu s i n gs i n g l e f a c t o r e x p e r i m e n ta n do r t h o g o n a lm e t h o d a f t e rt h ec r o s se x p e r i m e n tt of e r m e n ts w i n e b l o o dm e a lb yb 3 ，t h eo p t i m a lc o n d i t i o nt op r o d u c ep e p t i d ef r o ms w i n eb l o o dm e a l w i t ht h eh i g h e s td e g r e eo f3 2 3 w a su n d e rc o n d i t i o n so f3 0 0 cf e r m e n t a t i o n t e m p e r a t u r e ，16 0 r p m r o t a t i o n s p e e d ，7 5p hv a l u e ，4 i n o c u l u m ss i z e ，6 0 h f e r m e n t a t i o nt i m e t h em i c r o f i l t r a t i o nm e m b r a n ea n dd i a l y s i sb a g sw i t l ld i f f e r e n tm w c ow e r e u s e dt oc l a s s i f yt h es w i n eb l o o dm e a lb r o t hf e r m e n t e db yb 3 a f t e rt h a tt h ep e p t i d e w a so b t a i n e db yv a c u u mf r e e z e d r y i n g t 1 1 et r i c i n e - s d s p a g es h o w e dt h a tt h e u n t r e a t e df e r m e n t a t i o nb r o t ha n dp e p t i d ep o w d e rd e a l tw i t l l0 2 2 u nm i c r o f i l t r a t i o n m e m b r a n ew i t hab r o a dm o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o n , t h ec l a s s i f i c a t i o nb yd i a l y s i s b a g sw a sa p p a r e n t l ya n dt h em o l e c u l a rm a s so fs m a l lm o l e c u l a rw e i g h tp e p t i d e sw a s o b v i o u s l yl e s st h a ng l o b i n sf r o ms w i n e b l o o d t h ea n a l y s i so fa u t o m a t i ca m i n oa c i ds h o w e dt h a ta m i n oa c i dc o m p o s i t i o n so f p e p t i d e sf r o ms w i n eb l o o dm e a lc h a n g e d t h i r t e e na m i n oa c i d sa n d4u n k n o w n o l i g o p e p t i d e sw e r ed e t e c t e di ns w i n eb l o o dm e a l t h ec o m p o s i t i o n so fa m i n oa c i do f d i f f e r e n tm w c op e p t i d e s ( 10 k d a , 1k d a - - - 10 k d a ， v a s o d i l a t i o n ( 血管扩张) d e c r e a s e dp e r i p h e r a l v a s c u l a rr e s i s t a n c e 碱小外围血管收缩阻力 l d e c r e a se db l o o dp r e s s 矗是( 血压降低) 图l - 2 血管紧张素酶对血压的调节作用 f i g1 - 2t h er e g u l a t i o ne f f e c to f a n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m e ( a c e ) o nb l o o dp r e s s u r e a c e 酶在血压调节过程中起关键作用，在人体内通过肾素一血管紧张素系统 ( 简称r a s ) 和激肽释放酶一肽酶系统( 简称k k s ) 参与血压的调节。a c e 酶可把无 活的血管紧张素( a n g i ，十肽) 水解后生成有强烈的收缩血管和升压活性的血管紧 张素i i ( a n g i i ，八肽) ，并能促进肾上腺皮质球状带释放醛固酮，增加钠在远曲小 管的重吸收，使血容量增加，血压升高。同时，a c e 酶在激肽一激肽释放酶系统 ( k k s ) 中同样起着关键的作用。k k s 系统是人体内的一个降血压系统。激肽原在 激肽释放酶的作用下生成舒缓激肽，舒缓激肽是具有扩张血管与降血压作用的活 性肽。a c e 对舒缓激肽有灭活作用，抑制其扩张血管功能。 1 5 2 降血压肽的作用机理 降血压肽是一类具有a c e 抑制活性的多肽物质，属于竞争性抑制剂。由于 a c e 在r a s 系统和k k s 系统中对血压调节起重要作用，抑$ 1 j a c e 的活性对降低高 血压将有着积极的影响。降血压肽与a c e 的亲和力比血管紧张素i 或舒缓激肽更 强，而且也较不容易从a c e 结合区释放，从而阻碍a c e 催化水解血管紧张素i 成 为血管紧张素i i 以及催化水解舒缓激肽成为失活片断的两种生化反应过程，起降 血压的作用。1 9 7 7 年，c u s h m a 等根据竞争性抑制剂与a c e 活性的结合位点提出 了降压肽作用机理的模型假说，该模型后来一直被许多研究者用来解释降压肽的 作用机理。 1 5 3 食品蛋白来源的a c e 抑制肽的研究 1 9 6 5 年f e r r e i r a t 4 9 1 首? r 在南美茅头蝮蛇( b o t h r o p sj a a r a c a ) 毒液中发现了a c e 抑制肽，能够增强缓激肽的作用，故称其为缓激肽增强因子( b r a d y k i n i n p o t e n t i a l i n gf a c t o r s ，b p f s ) 。1 9 7 9 年o s h i m a 等【5 0 】从明胶酶解液中提取t a c e 抑制 肽，第一次报道了源于食品蛋白质的降血压肽。1 9 8 2 年m a r u y a m as 等从牛酪蛋 白的胰蛋白酶水解物中分离出一种能抑隹j i j a c e 活性的1 2 肽，接着又从中分离出五 肽与七肽，随后又在1 9 8 7 年从0 【酪蛋白中获得一种强活性的六肽t 5 1 - 5 3 j 。m a r u y a m a s 课题组的研究成果再次向世人证明，食品蛋白中确实存在某些具a c e 抑制活性 的序列。1 9 8 6 年，s u e s u n a 和o s a i i m a 等【5 4 5 5 l 最先报道了沙丁鱼和带鱼的水解物中 含有a c e 抑制肽，并测得其分子量在1 0 0 0 2 0 0 0 范围内。1 9 8 8 年，s u e t s u n a 等p o j 人用胃蛋白酶酶解1 5 种鱼贝类肌肉获得了不同抑制活性的肽类。1 9 9 4 年， m a t s u f u j i 等【5 7 】利用碱性蛋白酶水解沙丁鱼获得1 1 种链长为2 4 氨基酸的a c e 抑制 肽，其中抑制活性最强的肽为l y s t y r 。u k e d a 【5 副研究发现沙丁鱼的胃蛋白酶水解 物可产生最强的a c e 抑制成分，对沙丁鱼在蛋白酶水解之前进行热处理，所产生 的肽具有更强的抑制活性( i c 5 0 = 0 0 3 i t g m l ) ，但从其水解物中分离出的3 种a c e 抑 制肽，在体外的a c e 抑制活性较弱；f u j i t a l 笔j 9 5 9 】报道其酶解消化液表现出较强的 a c e 抑制活性( i c 5 0 = 2 9 肛g m l ) ；以5 0 m g k g 剂量喂给原发性高血压大白鼠( s h r ) ， 有降血压作用。 m i y o s h i 等 删从天然0 c 玉米蛋白嗜热菌蛋白酶水解物中分离出的抑制肽多数 为三肽，研究发现这些三肽的n 末端为亮氨酸，比n 末端为丙氨酸时的抑制活 性强。a n n ep i h l a n t o 等【6 l 】研究了马铃薯不同分子量段肽a c e 抑制活性，结果表明， 可以从马铃薯中分离和纯化出活性物质。福建大学的张荣真等【6 2 】贝0 从福建老酒 中分离出了有a c e 抑制活性的物质。人们又相继从大豆、小麦胚芽、荞麦的酶解 产物中分离出高活性的a c e 抑制肽 6 3 - 6 5 】。n a k a s h i m a 掣6 6 】首次报道了从家畜 猪肌球蛋白的酶解产物获得了令人满意的降压效果。这些表明a c e 抑制活性物质 在食品中广泛存在，可以从食品蛋白质中通过降解的方法获得抑制a c e 的活性 肽，这将成为预防或治疗高血压的途径。 日本是研究降血压肽最多的国家，目前降血压肽的开发以大豆蛋白、乳蛋白、 6 蛋清蛋白为主，尤以乳蛋白水解物和活性肽的研究开发最为深入，近年来有关畜 血、水产蛋白水解物和活性肽产品研究和开发也日益增多1 6 7 , 6 8 】。我国的蛋白水解 物和活性肽的研究相对滞后，有关这方面的研究才刚刚起步，一些高校和研究机 构已开展了有关大豆蛋白、酪蛋白，乳清蛋白水解物的研究工作，但对猪血蛋白 水解物的研究很少，以猪血蛋白水解物为基料的医药品和食品鲜有报道。 1 5 4 猪血多肽的研究进展 以猪血为蛋白源的酶解活性肽是通过现代生物技术将猪血中的球蛋白转化 为小分子肽。有资料报划6 9 , 7 0 】，小分子猪血肽具有溶解性好、粘度低、抗凝胶形 成和体内消化快的特点。在欧洲、日本等发达国家和地区，猪血的利用率己达5 0 以上，他们主要是开发肽类试剂、肽类药物以及功能食品和食品添加剂。我国湖 南农业大学方俊等【_ 7 1 】通过筛选高产酶菌株发酵制得猪血多肽，并对其清除活性 氧能力、降血脂活性做了相关研究。汪学荣等1 7 2 j 利用碱性蛋白酶酶解猪血粉， 探讨了脱色、脱盐和超滤工艺对制备猪血多肽的影响。 1 6 研究的主要内容与意义 1 6 1 研究的主要内容 试验以猪血粉为原料，筛选出降解猪血蛋白能力强的枯草芽孢杆菌菌株，利 用发酵技术直接发酵猪血粉获得低分子量的猪血多肽，通过分级分离制得不同分 子量段猪血多肽产品，并对其a c e 抑制活性进行研究，以期为更广泛地利用猪血 蛋白和猪血多肽的开发提供理论依据。 1 通过筛选比较，确定高产中性蛋白酶枯草芽孢杆菌菌株。考察影响发酵液 水解度与发酵温度、摇瓶转速、起始p h 值、接种量和发酵时间的关系。采用正 交试验进行发酵条件的优化，确定最佳发酵工艺参数。 2 在最佳发酵工艺条件下，以猪血粉为蛋白源发酵制备猪血多肽。采用截留 分子量为l k d a 、10 k d a 的透析袋对发酵液进行分级分离，制得不同分子量段猪血 肽，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳( t r i c i n e s d s ra g e ) 考察不同处理条件下猪血多 肽的分子量分布。 3 比较分析猪血粉与猪血多肽主要成分及得率，并进行氨基酸组分和含量分 析，测定猪血多肽的紫外吸收波长，对其理化特性进行探讨。 4 通过测定马尿酸( h i p ) 和马尿酰一组氨酰一亮氨酸( h h l ) 吸收波长，确定高 效液相色谱法( h p l c ) 检测波长，利用h p l c 法对制备猪血多肽血管紧张素转化酶 ( a c e ) 体外抑制活性进行研究，并确定各自i c 5 0 值。 1 6 2 研究的意义 人们已经逐步认识到猪血的营养价值和潜在的开发利用前景，并对其基本性 质、用途以及深加工等方面进行了一定的研究。目前，国外对利用动物血液中不 同种类蛋白质水解制备a c e 肽的研究有不少报道【7 3 7 7 】，包括血红蛋白、血浆混合 7 蛋白、血红素、血浆白蛋白和血浆球蛋白等血液中几类主要的蛋白质，而国内多 集中在利用化学、酶解或微生物发酵方法从猪血中提取血红素、凝血酶以及食用 蛋白粉方面的研究；对于猪血活性肽的研究较少，除方俊1 7 引外，以猪血粉为原 料，通过微生物发酵方法制备降血压肽的研究鲜有报道，对于发酵制备猪血粉多 肽抑审t j a c e 活性的研究更是凤毛麟角。随着我国农业结构调整、可持续发展计划 的提出，以及蛋白资源充分利用的迫切需要，动物血液综合利用问题越来越受到 人们的关注。本研究以猪血粉为蛋白源，以枯草芽孢杆菌为发酵菌株，为研究微 生物发酵猪血粉制备多肽奠定基础，并为猪血多肽a c e 抑制活性研究提供理论依 据，同时提高了猪血利用率和附加值，减少污染，保护环境。 8 第二章枯草芽孢杆菌比较及发酵血粉条件的优化 猪血是极具开发利用价值的动物性蛋白，本研究利用微生物发酵过程中分泌 蛋白酶的特性降解猪血蛋白。本实验以猪血粉为原料，以枯草芽孢杆菌为发酵菌 株，研究发酵猪血粉制备多肽的工艺参数。通过筛选产酶活性较高、降解猪血粉 蛋白能力较强的发酵菌株和优化发酵工艺条件的研究，为发酵血粉制备猪血活性 肽的工业化生产和大规模应用提供相关参考依据。这对综合利用和开发我国畜禽 废弃物，尤其是血液，丰富国内生化医药及功能性食品的种类，以及优化生态环 境和繁荣地区经济等都具有十分重要的意义。 2 1 材料与方法 2 1 1 试验材料与主要仪器 2 1 1 1 材料 枯草芽孢杆菌b l ( 本实验室保存) ； 枯草芽孢杆菌b 2 ( 实验筛选获得) ； 枯草芽孢杆菌b 3 ( 编号g z m l 1 3 5 ，广东省微生物保藏中心) ； 表2 1 材料与试剂 t a b l e 2 - 1m a t e r i a la n dr e g e n t sf o rp e r i m e n t s 9 2 1 1 2 主要仪器 表2 2 主要仪器 t a b l e 2 2i n s t r u m e n t sf o re x p e r i m e n t s 实验仪器生产厂家 高压灭菌器 电子天平 t g l 1 6 c 台式离心机 z k 8 2a 型电热真空干燥箱 h h - 2 孔数显水浴锅 s h a c 水浴恒温振荡器 涡旋振荡仪 7 2 1 型分光光度计 紫外分光光度计 酶标仪3 1 8 m c 上海医用核子仪器厂 o h a u sc o r p p i n eb r o o k , n j ，u s a 上海安亭科学仪器厂 上海实验仪器厂有限公司 江苏金坛市环宇科学仪器厂 江苏金坛市金城国胜实验仪器厂 上海琪特分析仪器有限公司 上海精密科学仪器有限公司 上海医用核子仪器厂 上海三科仪器有限公司 2 1 2 试验方法 2 1 2 1 培养基制备和培养方法 ( 1 ) 细菌分离培养基：牛肉膏5 0 9 ，蛋白胨l o 0 9 ，氯化钠5 o g ，蒸馏水1 0 0 0 m l ， p h 7 2 ，o 10 m p a ，灭菌2 0 m i n 。 ( 2 ) 透明圈筛选培养基：改良察氏培养基加1 2 9 l 干酪素。 ( 3 ) 细菌种子培养基：牛肉膏4 0 9 ，蛋白胨5 0 9 ，酵母膏5 0 9 ，氯化钠5 o g ， 蒸馏水10 0 0 m l ，p h 7 2 ，0 10 m p a ，灭菌2 0 m i n 。 ( 4 ) 摇瓶培养基：蛋白胨5 0 9 ，可溶性淀粉l o 0 9 ，十二水磷酸氢二钠4 o g ， 磷酸二氢钾0 3 9 ，氯化钙1 0 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h 7 2 ，0 1 0 m p a ，灭菌2 0 m i n 。 2 1 2 2 菌种的筛选1 8 】 在以猪血粉为唯一氮源的平板培养基上培养3 6 h ，从中挑选生长旺盛的菌株， 转接到酪素平板培养基上，培养3 0 h 和6 0 h 后，测定其透明圈直径、菌落直径及菌 落直径比值( d c ) 。 2 1 2 3 标准曲线的绘制 准确称取酪氨酸2 9 ，加入o 1 n 氢氧化钠1 0 m l ，水浴加热溶解，然后用p h 7 2 的磷酸缓冲液定容至10 0m l ，冷藏备用。 取6 支试管，编号，按表2 3 和表2 4 操作。将各管摇匀，4 0 0 c 水浴保温发 色2 0 m i n ，6 8 0 n m 波长下测定各管吸光度，用l 号管为参比，分别测定其余各管 吸光度。以吸光度为纵坐标，酪氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。 l o 表2 3 不同浓度酪氨酸溶液的配制 t a b l e 2 3d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no f t y r o s i n es o l u t i o n 2 1 2 4 蛋白酶活力的测定 福林酚法( f o l i n 酚) 测定【_ 7 9 1 蛋白酶活力，将菌株接种到放大培养基培养2 4 h ， 转接至摇瓶培养基，3 0 0 c ，2 0 0 r p m i n 培养1 0 0 h ，4 0 0 0 r p m 离，i 二, 1 0 m i n ，取上清液 6 8 0 n m 处测其o d 值，计算蛋白酶活力。 酶活力定义：l g 固体酶粉( 或l m l 酶液) ，4 0 0 c ，p h7 2 条件下，l m i n 水解 酪蛋白产生1 烬酪氨酸为1 个酶活力单位，酶活力p a u g ( u m l ) 表示。 蛋白酶活力的计算：每克发酵产物中的酶活( t t g ) = a x k x 4 x n x l 1 0 a “8 0 胁处所测的o d 值( o d 样品- - o d 对照) n 一酶液的稀释倍数 l 卜反应的时间k 反应试剂的总体积 2 1 2 5 蛋白质含量测定 总氮含量测定：微量凯氏定氮法【8 0 l x ：( v l - v 百0 ) c i x 0 t 0 1 4 f 1 0 0 m 1 1 0 1 0 0 l f ：氮换算为蛋白质的系数 酸性可溶性氮测定：三氯乙酸( t c a ) 法【8 1 1 在1 0 m l 猪血粉发酵液中加入1 0 m l1 0 - 氯乙酸溶液，涡漩振荡1 5 s ，静置 3 0 m i n ，1 2 0 0 0 r p m 、4 0 c 离, t , l o m i n ，用半微量凯氏定氮法测定上清液中氮含量。 氨基态氮测定：甲醛值滴定法【8 2 l