（食品科学专业论文）植物乳杆菌素的纯化及其对单核细胞增生李斯特氏菌作用机理研究.pdf

摘要 在已有研究基础上，本课题以一株抗单核细胞增生李斯特氏菌的产细菌素植物乳杆菌为试 材，对其产生的细菌素进行了提取纯化、理化特性及环境因素对其抑菌效果影响的研究。在此基 础上重点探讨了该细菌素对单核细胞增生李斯特氏菌的作用机理，以期为天然的食品防腐剂的研 制与开发提供理论依据及技术支持。 1 植物乳杆菌素l 1 的提取纯化研究表明：经7 0 硫酸铵盐析、s ps e p h a r o s ef a s tf l o w 阳 离子交换树脂层析可得到纯化的细菌素，通过t r i c i n e s d s 。p a g e 电泳初步估测出分子量大小在 1 4 2 0 0 d a 左右。 2 植物乳杆菌素l 1 理化特性研究表明：该细菌素耐热性良好，经1 2 1 c 处理1 5 r a i n 后仍残 留1 2 5 的活性；在p h4 1 0 的范围内活性稳定，p h3 和1 1 时，仍残留5 0 活性；吐温8 0 、吐 温2 0 、司本8 0 、尿素四种表面活性剂对其活性没有影响，s d s 可导致7 5 的活性丧失；该细菌 素可被胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶k 、胃蛋白酶、中性蛋白酶完全失活，a _ 淀粉酶、酸性蛋 白酶、溶菌酶不能使其失活：对受试的乳杆菌属、链球菌属、李斯特氏菌属、芽孢杆菌属、假单 胞菌属的菌株及金黄色葡萄球菌有不同程度的抑制作用，对4 株大肠杆菌中的1 株有抑制作用， 但对沙门氏菌和其他3 株大肠杆菌没有抑制作用。 3 。食品加工中的环境因素对植物乳杆菌素l - 1 抑菌效果影响的研究表明：7 下该细菌素在 1 4 4 h 内将活菌数控制在初始水平，温度较高的情况下( 1 5 。c 、3 0 c 、3 7 c ) 则可以在短时间内迅 速降低活菌数；培养基起始p h 为7 0 时植物乳杆菌素l - 1 的抑菌效果最好；盐对该细菌素具有 一定的拮抗作用，不同盐之间和同种盐不同浓度之间差异不显著；低p h ( 5 0 - 5 5 ) 下，植物乳 杆菌素l - 1 不能吸附在单核细胞增生李斯特氏菌上，而p h 6 0 - - 7 5 下有5 0 吸附在指示菌上，盐 对该细菌素吸附单核细胞增生李斯特氏菌没有影响。 4 植物乳杆菌素l 一1 对单核细胞增生李斯特氏菌的作用方式在6 4 a u m l 的浓度下是杀菌。 该细菌素作用后的单核细胞增生李斯特氏菌细胞，其胞内k + 、无机磷离子、乳酸脱氢酶、紫外 吸收物质及a t p 含量发生不同程度外泄，同时破坏了l i t 和部分h p h ，引起p m f 的耗散，最终导 致细胞的死亡。综合所测指标，可以推测植物乳杆菌素l 1 对单核细胞增生李斯特氏菌的作用机 理主要是对细胞膜的破坏，通过形成非选择性孔洞使得选择性离子和小分子生命物质流失，打破 原有平衡，从而导致细胞的衰亡。 关键词：植物乳杆菌素，纯化，理化特性，作用机理，单核细胞增生李斯特氏菌 a b s t r a c t t h i sp a p e rs t u d i e dt h eb a e t e r i o c i np r o d u c e db yl a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u ml - 1f o c u s e do nt h e p u r i f i c a t i o n ，p a r t i a lc h a r a c t e r i z a t i o na n dm o d eo fa c t i o n ，e t c ，i nh o p eo fo b t a i n i n g s o m ev a l u a b l e i n f o r m a t i o nw h i c hc a l ls u p p o r tt ot h ed e v e l o p m e n to fm o r es a f ea n de f f e c t i v ef o o dp r e s e r v a t i v eo r s t a r t e r t h em a i n l yr e s u l t ss h o w e dt h a t ： 1 p l a n t a r i c i nl 一1w a sp u r i f i e db y7 0 a m m o n i u ms u l p h a t ep r e c i p i t a t i o n ，f o l l o w e db ys p s e p h a r o s e f fc a t i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y t h eb a c t e r i o c i nw a sw a s h e dw i t h0 0 2 ma c e t a t eb u f f e r c o n t a i n i n go 1 mn a c l ( p h 5 5 ) a t1 0 m l m i n ，t h em o l e c u l a rs i z ew a se s t i m a t e dt o b ea b o u t 14 2 k d aa c c o r d i n gt ot r i s - s d sp a g e 2 t h ei n h i b i t o r ya c t i v i t yw a sh e a t - s t a b l e ，a n ds t i l lr e m a i n e d1 2 5 a f t e r1 5 m i na t1 2 1 t h ea c t i v i t y r e m a i n e du n c h a n g e da tp hv a l u e sf r o m4t o10 ，b u tr e d u c e d5 0 a tp h3a n dp h11 t w e e n8 0 ， t w e e n2 0a n du r e ad i d i n td e c r e a s et h ea c t i v i t y , h o w e v e r s d si n d u c e d7 5 a c t i v i t yl o s s p l a n t a d c i nl 一1c a nb ei n a c t i v a t e db yp e p s i n ，p r o t e i n a s ek ，t r y p s i n ，p a p a i n ，n e u t r a ip r o t e i n a s e ，b u t a - a m y l a s e ，l y s o z y m e ，a c i dp r o t e a s ed i d n ta f f e c tt h eb a c t e r i o c i na c t i v i t y p l a n t a r i c i nl 一1h a da b r o a ds p e c t r u m ，i n c l u d i n gs e v e r a ls t r a i n sf r o ml a c t o b a c i l l u s ，s t r e p t o c o c c u s ，s t a p h y l o c o c c u s a l a e u $ , e c o 髓b a c i l l u s ，l i s t e r i a , p s e u d o m o n a s , h o w e v e r ，s a l m o n e l l aw a sn o ti n h i b i t e d 3 t h ee f f e c to fd i f f e r e n tt e m p e r a t u r ea n dp ho np l a n t a r i c i nl ls h o w e dt h a t ：a t7 c ，t h ei n h i b i t i o n c a nl a s t1 4 4 h ，h o w e v e r ，a th i g h e rt e m p r e t u r e ( 1 5 。c 、3 0 c 、3 7 。c ) ，t h el m o n o c y t o g e n e sc e l l sc a n b ed e c r e a s e dw i t h i n3 - 一6 h t h eo p t i m u mi n i t i a lp hv a l u ef o ri n h i b i t i o nw a s7 0 d i f f e r e n ts a l t sa n d d i f f e r e n tc o n c e r t r a t i o n so ft h es a m es a l th a dt h es a m en e g a t i v ee f f e c to np l a n t a r i c i nl - 1 ，b u th a dn o e f f e c to na d s o r p t i o nt ol m o n o c y t o g e n e s5 0 p l a n t a r i c i na d s o r p e dt ol m o n o c y t o g e n e sa t p h 6 0 7 5 ，a n dh a dn oa d s o r p t i o na tp h5 o 5 5 4 t h em o d eo fa c t i o nw a sb a c t e r i c i d a la t6 4 a u m l l e a k a g eo fk + i o n s ，i n o r g a n i cp h o s p h a t e ，l d h ， u v - a b s o r b i n gm a t e r i a l sa n dt h ei n t r a c e l l u l a ra t pd u et ot h ep r e s e n c eo fp l a n t a r i c i nl - lw a s o b s e r v e d ，a n dt h ea c t i o nr e s u l t e di nt h ed i s s i p a t i o no ft h eal l ra n da p hc o m p o n e n t so ft h ep m e t h ed a t as u g g e s t e dt h a tt h ep r i m a r ys i t eo fa c t i o no fp l a n t a r i c i nl 一1w a st h ec y t o p l a s m i c m e m b r a n e ，i n d u c e dt h ec e l l sd e a t hb yf o r m e dt h en o n s e l e c t i v ep o r ew h i c hd e s t r o y e dt h eb a l a n c e k e yw o r d s ：p l a n t a r i c i n ，p u r i f i c a t i o n ，c h a r a c t e r i s t i c ，m o d eo fa c t i o n ，l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s a t c c a u b c e c f b l m 英文缩写词 a b b r e v i a t i o n a m e r i c a nt y p ec u l t u r ec o l l e c t i o n a c t i v i t yu n i t 2 ，7 一b i s - ( 2 - c a r b o x y e t h y l ) 5 ( a n d - 6 一) - c a r b o x y f l u o r e s c e i n b i m o l e c u l a rl i p i dm e m b r a n e c c g m cc e m e rf o rc o l l e c t i o no fg e n e r a l m i c r o b i o l o g i c a lc u l t u r e s c f c f u i i j l d h m i c p e g p m f r p m w h o c a r b o x y f l u o r e s c e i n c o l o n yf o r m i n gu n i t i n h i b i t o r yu n i t l a c t i cd e h y d r o g e n a s e m i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n s p o l y e t h y l e n eg l y c o l p r o t o nm o t i v ef o r c e r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e w o r l dh e a l t ho r g a n i z a t i o n v 美国标准菌种保藏所 活力单位 羧基荧光素 双分子脂膜 普通微生物菌种保藏管 理中心 羧基荧光素 菌落形成单位 抑菌单位 乳酸脱氢酶 最低抑菌浓度 聚乙二醇 质子动力势 辕? 食 世界卫生组织 独创性声明 y 9 3 9 5 4 0 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证h 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： ) 司卡 时凤 知年莎月如f = | 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 研究生虢i 司 导师签名： j j 易 乡 时问： 2 衫年占月2 p 日 髓阃：。 年髓f 和 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 第一章绪论 1 1 立论依据 1 1 1 研究意义 食品的卫生状况与人民健康的关系极为密切，近年来，随着经济的发展、生活节奏的日益加 快，即食食品和冷冻食品由于其方便性、营养性，愈来愈受到广大消费者的喜爱，但同其他食品 一样也存在着食用安全隐患，其中由微生物污染引起的食物腐败与中毒居首位。微生物是影响食 品安全性的重要因素，由于微生物具有个体小、分布广、繁殖快和代谢强度高等特点，食品从原 辅料、生产到消费的各个环节都可能受到微生物的影响，引起食品腐败和带毒，最终安全性受到 影响，如微生物可通过食品传播疾病；微生物可在食品中大量增殖或分解某些食品成分产生有毒 物质导致摄食者发生食物中毒等疾患。 许多病原、腐败微生物如单核细胞增生李斯特氏菌( l i s t e r i am o n o c y l o g e n e s ) 、肉毒梭状芽 孢杆菌( c l o s t r i d i u mb o t u l i n u m ) 、金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 、沙门氏菌( s a l m o n e l l a ) 、 假单胞菌( p s e u d o m o n a s ) 、大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o t i ) 等污染食品后均可引起食品腐败并产生毒素 ( 郝记明等，2 0 0 4 ) 。由肠出血型大肠杆菌引起的食源性疾病，在过去的几十年里，虽然发病率很 低，但免疫力弱的人群感染后有致命的后果，致病性大肠杆菌的爆发主要与牛肉、芽菜、生菜和 果、菜汁有关。沙门氏菌病是绝大多数国家的一个主要问题，它是由细菌引起的，造成其爆发的 主要食物有鸡蛋、家禽和其它肉类、生乳和巧克力( 于辉等，2 0 0 4 ) 。c d c 估计美国每年因沙门 氏菌感染有1 8 0 0 0 病例住院，1 0 0 0 病例的死因与沙门氏菌感染有关( 高光，2 0 0 3 ) 。 单核细胞增生李斯特氏菌是一种能引起人畜共患病的食源性致病菌，它在自然界中分布极 广，如土壤、污水、人和动物的粪便、饲料以及多种食品中( 潘玉钦等，2 0 0 3 ) 。人们食用被单 核细胞增生李斯特氏菌污染的食物后，会导致脑膜炎、骨髓炎、心肌炎、孕妇流产以及产褥感染 等疾病，由李斯特菌引起感染的疾病死亡率极高，可达3 0 - 一7 0 ( k e r r ，1 9 8 8 ) 。在欧美、日本 由该菌造成的临床疾病和食物污染问题，已超过在细菌性食物中毒中占第1 位的沙门氏菌( 冯晓 明，1 9 9 3 ) 。我国的香港、福建、辽宁、云南等地先后也有因该菌引发疾病而住院和死亡的报道。 由于易受单核细胞增生李斯特氏菌污染的食品种类很多，而且其引起的食物中毒危害日趋严重， 因此在2 0 0 0 年被who 食品安全工作计划列为重点检测的食源性致病菌( 沙门氏菌、大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌) 之一( 沈晓盛等，2 0 0 4 ) 。据报道，易受单核 细胞增生李斯特氏菌污染的食品种类很多，其中肉制品、乳制品和水产品受污染的程度最高，其 检出率分别达到1 5 3 0 、5 1 0 和4 8 ( 张顺合，2 0 0 0 ) 。由于该菌在4 1 2 的环境中仍 可生长繁殖，能在家用冰箱冷藏室条件下较长时间生存繁殖，通常存在于未杀菌的生冷食物中， 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 是冷藏食品如冰淇淋、雪糕、雪条等食品的主要病原菌。 面对食品的这些微生物性不安全因素，尤其是单核细胞增生李斯特氏菌的潜在危害，人们曾 经试图通过化学防腐剂来达到控制与消灭的目的，但同时也发现化学防腐剂对人体都会有或多或 少的毒害作用，对自然界的生态环境也会造成不利的影响，并且其防腐效果受溶解度、食品微生 物种类、p h 值等因素影响。所以目前广大科学工作者将研究热点转向了天然食品防腐剂的研究 与开发上，即采用具有拮抗特性的微生物或它们的代谢产物来作为食品生物防腐剂，通过抑制和 杀死食品中这些腐败微生物和病原微生物的生长和存活来达到真正提高食品安全性的目的。 众所周知，乳酸菌及其活性代谢产物与人类的健康密切相关，常常被有意识地引进食品产品 或自然地发生在食品中，从而使食品拥有人们渴望的风味、结构、营养及健康的特征。乳酸菌细 菌素是乳酸菌在代谢过程中合成并分泌到环境中的一类具有抑菌活性的多肽或前体多肽，具有很 强的拮抗其它微生物生长的特性，其抑菌范围不仅仅局限于同源的细菌。细菌素蛋白质的特性使 得其在人体内可以被降解掉，因而无毒、无残留，并且具有高效、耐酸、耐高温、无抗药性、大 部分基因位于质粒上、分子量小、含修饰氨基酸、结构复杂等，这些特征除了使得乳酸菌细菌素 成为天然防腐剂的代表之一，也使其成为分子遗传、基因工程、蛋白质工程和化妆品、皮肤保健 和调节肠道菌群的好材料( 宋连花等，2 0 0 4 ) 。 近几年，有关细菌素对其他细菌拮抗作用的机理研究最多的就是乳酸菌素，这是由于乳酸菌 产生的乳酸菌素被认为是一种“天然”的食品添加剂而容易为人们接受。国外关于乳酸菌素的报 道很多，早在1 9 2 8 年r o s e r s 发现一些乳链球菌产生的代谢产物( 后被命名为n i s i n 、乳链菌肽) 可 抑制其他乳酸菌的生长，1 9 5 1 年h i s h 提出将n i s i n 用于食品保藏，1 9 6 9 年w h o 批准将n i s i n 作 为食品添加剂，1 9 7 1 年g r o s s 和m o r e l l 阐明了乳链菌肽分子的全结构，1 9 8 8 年b u c h m a n 等克隆 了编码乳链菌肽前体的结构基因并测定了d n a 序列( 宋连花等，2 0 0 4 ) 。至此，国外学者对乳酸 菌素展开了较为深入的研究，到目前为止已描述了4 0 余种乳酸菌细菌素，分别是由乳球菌、片 球菌、明串珠菌、乳杆菌、双歧杆菌、肠球菌、链球菌、肉食杆菌等属的菌株产生的( 宫正等， 2 0 0 4 ) ，它们的分子量、分子结构、理化性质、抑菌谱及作用方式各不相同，随着新型细菌素的 不断发现，对其研究已深入到分子及基因结构方面。在国内尽管人们早已认识到它们在食品发酵、 食品保藏和肠道生态中具有重要的作用，但一直未能引起高度的重视。只有n i s i n 研究较为广泛， 目前主要集中在不同分离纯化方法、作为防腐剂的应用( 宁喜斌等，2 0 0 1 ；师敏，2 0 0 5 ) 、基因 构建与表达( 周绪霞等，2 0 0 5 ；还连栋等，1 9 9 9 ；陈秀珠等，2 0 0 0 ；陈秀珠等，2 0 0 1 ) 几个方面， 其它乳酸菌细菌素的研究则多限于筛选优化及一般特性的描述，对其作用机理等的研究国内还未 见报道。所以开发新的乳酸菌细菌素作为天然食品防腐剂、饲料添加剂、发酵剂和医药用剂，成 为许多研究工作的热点。 植物乳杆菌广泛用于青贮饲料、腊肠制品、干酪及蔬菜制品的发酵，是目前公认的安全菌。 本实验室从中国云南传统发酵宣威火腿中分离到几株产细菌素的乳杆菌，吕燕妮对其中的戊糖乳 2 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 杆菌3 1 1 进行了产细菌素的系统研究，包括效价分析、发酵条件优化、提取纯化及理化特性研究 ( 吕燕妮等，2 0 0 5 a ：吕燕妮等，2 0 0 5 b ；吕燕妮等，2 0 0 3 ) ，得到了细菌素效价分析、提取纯化及 理化特性研究的方法。本课题在北京市自然基金的资助下，拟对其中一株植物乳杆菌所产细菌素 进行纯化，探索纯化后的理化特性及其在食品加工中应用的潜力，并进一步研究该细菌素对单核 细胞增生李斯特氏菌的作用机理，这在国内细菌素研究领域中是首次对作用机理进行深入的研 究，因此本项研究不仅拓展了国内细菌素的研究方向，而且对其将来在食品、天然水产、畜禽制 品中的防腐应用具有实际意义，还可为将来的构效研究打下基础。 1 2 国内外研究现状分析 1 2 1 乳酸菌细菌素的物理化学特性及其分类 大部分细菌素都表现出高度的疏水性、阳离子性、高等电点，细菌素对热和酸的稳定性却有 很大不同，而且随着纯度的增加细菌索的稳定性降低。 许多乳酸菌所产细菌素的一个主要特征即是对热稳定，其范围很广，从6 0 1 0 0 超过 3 0 m i n ( 如l a c t o c i n2 7 、l a c t o c i ns 、c a m o b a e t e r i o e i n s a & b 等) 到高压1 2 1 灭菌1 5 - - 一2 0 m i n ( 如 l a c t a c i nb 、l a c t a c i nf 、n i s i n 等) 。这种热稳定性可能是由于其小的球形结构、高度疏水性区域( 如 l a c t a c i nf 、l a c t o c o c c i n a 、n i s i n ) 、稳定的交联结构( 如n i s i n 、l a e t i c i n4 8 1 、l a c t o c i ns ) 、高甘氨酸 含量( 如d i p l o c o c c i n 、l a c t a c i nf 、l a c t o e i n2 7 、l a c t o c o c c i n a ) 等因素造成的( r a l p he t a l ，1 9 9 5 ；n e t t l e s e ta 1 ，1 9 9 3 ；h o o v e re ta 1 ，1 9 9 3 ) 。许多乳酸菌产生的细菌素仅在酸性或中性p h 条件下才稳定，甚至 在高于8 0 的条件下即失活( 如n i s i n 、l a c t o s t r p c i n s 、p e d i o c i n a c h 、l e u c o c i n a u a l1 8 7 ) 。另据 报道，许多细菌素在低p h 值下具有较强的抑菌活性，这可能是由于p h 环境会使细菌素的蛋白 质构象发生变化，因而引起抑菌活性的变化( r a l p he ta 1 1 9 9 5 ；k l a e n h a m m e r , 1 9 8 8 ；n e t t l e se t a 1 ，1 9 9 3 ) 。 对蛋白酶的敏感性是一种抑菌物质被鉴定为细菌素的一个关键标准。既然细菌素被定义为一 种蛋白类物质，它们应可被一系列的蛋白酶失活，如胰蛋白酶，胃蛋白酶，蛋白酶k ，等。而且， 由于不同细菌的细菌素对蛋白酶的敏感性不同，对不同蛋白酶的敏感性可以说明每一种细菌素的 独特性，相反，对蛋白酶敏感方式的相似性也说明不同细菌素之间的相似性。另外，对胃、胰源 的蛋白酶敏感性通常与细菌素应用于食品和饲料中的生物防腐剂相联系，因为这意味着它们的消 化吸收不影响胃肠道中的正常微生物群。然而，有些细菌素似乎对某些蛋白酶不敏感，可能是由 于这些细菌素包含有很小一部分蛋白质的成分。事实上，有的细菌素包含有碳水化合物、脂肪或 磷酸成份，这些非蛋白成份部分的出现可由这些细菌素对糖酵解酶( 洳淀粉酶) 、脂酶( 酯解酶) 和磷酸酯酶( 磷脂酶) 的敏感性来证实。b a c t e r i o c i n4 6 6 ( d ek l e r ke ta 1 ，1 9 6 7 ) 和l a c t o c i n2 7 ( u p r e t i e ta 1 ，1 9 7 3 ) 是典型的这种糖脂复合蛋白，然而l e u c o n o c i ns ( 1 e w u se ta 1 ，1 9 9 2 ) 表现为糖蛋白。大部 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 分已被鉴定的乳酸菌细菌素表现为强烈的疏水性、阳离子性，高的等电点。 根据乳酸菌细菌素的基本结构、分子量及对热的稳定性，k l a e n h a m m e r ( 1 9 8 8 ) 把其分为4 类( k l a e n h a m m e r , 1 9 8 8 ；s a i de ta l ，2 0 0 0 ) ： i 羊毛硫抗生素( l a n t i b i o t i c s ) ，指含有稀有氨基酸残基，包括羊毛硫氨酸( l a n t h i o n i n e ) 或1 3 一甲基羊毛硫氨酸，脱氢丙氨酸等具有膜活性的小肽( 分子量 撕一l “霹 埘龇扑b “城1 紫弋夕b 悠- “h 1 2 2 细菌素的纯化 乳酸菌细菌素的纯化一直是一个重要且艰难的任务，在纯化过程中所遇到的问题通常和这 种分子与其它分子物质的联系如疏水作用力有关。另外，因为细菌素是很大一群异种的物质， 4 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 常规的纯化步骤一般需要从实际经验来设计每一种细菌素的提纯方案。也许正是由于这个原因， 至今为止只有很少一部分细菌素被纯化至均一同质：如n i s i n ( b e r r i d g e ，1 9 4 9 ；c h e e s e m a ne t a 1 ，1 9 6 8 ) ，b a c t e r i o c i n4 6 6 ( d ek l e r ke ta 1 ，1 9 6 7 ) ，l a c t o c i n2 7 ( u p r e t ie ta 1 ，1 9 7 3 ) ，d i p l o e o c c i n ( d a v e ye t a 1 ，19 81 ) ，l a c t a c i nb ( b a r e f o o te ta 1 ，19 8 3 ) ，h e l v e t i c i nj ( j o e r g e re ta 1 ，19 8 6 ) ，p e d i o e i na c h ( b h u n i ae t a 1 ，1 9 8 8 ) ，l a c t a c i nf ( m u r i a n ae ta 1 ，1 9 9 1 ) ，l a c t o c o c c i na ( h o l oe ta 1 ，1 9 9 1 ) ，l a c t o c i ns ( m o r t v e d te ta 1 ， 1 9 9 1 ) 等。 目前有许多种技术可以纯化或部分纯化乳酸菌细菌素，最终的纯度取决于该细菌素应用的目 的和要求，如氨基酸测序就需要高纯度的细菌素蛋白，而某些用途如作为食品防腐剂则不需要非 常高的纯度。纯化过程包括一系列的步骤，这个过程可由检测分析纯度的方法来跟踪( 如 s d s p a g e 、w e s t e r n 印迹法) 蛋白质的量，而用细菌素活力单位( 总a u 或a u m l ) 的高低来 跟踪纯化效果。 由于细菌素是分泌到发酵液中的，大部分的纯化过程都遵循以下流程：1 浓缩蛋白，如真空 浓缩或过滤、沉淀。2 分离细菌素，用盐析、酸沉、有机溶剂等方法分离有抑菌活性的蛋白。3 透析和超滤，除去其它盐类物质及杂蛋白，以利于下一步的纯化。4 提纯，去除杂蛋白，通常用 层析的方法，如凝胶层析、离子交换层析、疏水作用层析( 反相色谱) ，此外，还可以运用高压 液相色谱( h p l c ) 等进行微量的提纯( 凌代文等，1 9 9 9 ；p a r e n t ee ta l ，1 9 9 9 ；v e m a e t a 1 ，1 9 9 7 ；g o n z a l o ，2 0 0 2 ) 。5 鉴定纯度，用s d s p a g e 鉴定细菌素的纯度及分子量。近年来，质谱 分析在蛋白、多肽分析中已经得到了广泛应用。 n e s 等研究者提出一套用来纯化低分子量乳酸菌细菌素的常规程序，包括以下四步：1 硫酸 铵沉淀；2 阳离子树脂层析；3 疏水作用层析；4 反相高效液相色谱。在硫酸铵沉淀离心后，能够 看见流体状的物质，这种疏水的流体状蛋白物质含有大部分细菌素活性( m u r i a n ae t a 1 ，1 9 9 1 ；m o r t v e d t e t a l ，1 9 9 1 ) 。应用阳离子树脂和疏水作用层析是由于大部分乳酸菌细菌素含有一 个阳性的氨基酸残链以及强烈的疏水构型。已经有很多种细菌素应用此套方法得到纯化： l a c t o c o c c i na ，l a c t o c i ns ，c a m o c i nu14 9 ，p e d i o c i np a - 1 ，c u r v a c i na ，s a k a c i n 只l a c t o c o c c i ng s a k a c i n a 和n i s i n 。h a s t i n g s 等人( 1 9 9 1 ) 提出了另一套纯化方案：低p h 沉淀，凝胶过滤，疏水作用层析。 在纯化过程中应避免离子交换层析、渗析和高p h 条件，因为它们会引起活性的很大损失。 v e m a ( 1 9 9 7 ) 提出的方案是：1 冷的乙醇沉淀；2 制备性等电点电泳。近来，g u y o n n e t 等( 2 0 0 0 ) 在 研究a 类细菌素时提出的提纯方案是基于细菌素通常被所产生菌细胞所吸收的特性，调节产生 菌的发酵液的p h 值，以使最大量的细菌素吸附在细胞表面( 通常p h 6 o ) ，然后用离心等分离方 法从发酵液中收集吸附有细菌素的菌体，随后改变p h ( 低p i l l 5 2 0 ) ，使细菌素选择性地从细胞 表面释放，这种方法得到的细菌素具有较高的浓度。 1 2 3 细菌素的作用机理 目前作用机理的研究主要集中在i 类和类细菌素上，类和类细菌素由丁分子量较大及 5 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 结构复杂，对其作用机理的研究较少，所以下面详细介绍一下i 类和类细菌素的作用机理。 1 2 3 1i 类细菌素的作用机理 关于细菌素作用机理的报道最早出现在1 9 5 3 年，r a m s e i e r 通过观察发现，经n i s i n 处理的细 菌很快泄漏出胞内紫外吸收物质如核酸，他把这种现象描述为类似去污剂的膜破坏作用。后来研 究发现，n i s i n 对细胞壁的合成有抑制作用，这种作用主要是由羊毛硫抗生素和膜上细胞壁前体脂 质体i 和脂质体的相互作用引起( r a r n s e i e re ta 1 ，1 9 8 0 ) 。然而，接下来的研究清楚地表明：伴 随着细胞膜瞬间的去极化、胞内物质的泄漏和生物合成过程的完全停止，大部分细胞都被杀死 ( r u h re ta 1 ，1 9 8 5 ；s a h le ta 1 ，1 9 8 7 ；s a h le ta 1 ，1 9 8 2 ) 。 根据对n i s i n 的研究结果，目前有两种模型解释了形成孔洞的机制：1 “桶- 板模型”( b a r r e l s t a v e m o d e l ) ：也称之为“插入模型”( i n s e r t i o nm o d e l ) 。该模型认为溶液中的细菌素分子最初结合于阴 离子膜表面，导致高度局部浓缩和脂质动力学的紊乱，随后当存在一个阈值水平以上的av 值时， 细菌素分子成跨膜方向翻转，这些插入膜中的细菌素分子像桶板一样成圆形排列在一个中心孔洞 的周围，所以称之为“桶板模型”。2 另一个称之为“楔形模型”，这个模型想象细菌素分子粘 附于膜表面，引起磷脂分子极性基团的局部紊乱，当存在一个高的v 时，可能改变了细菌素分 子相对于膜平面的方向，细菌素与磷脂共插入到膜中，使得脂质表现弯曲，形成一个类似楔形的 孔洞。 上述两个模型都认为孔洞的形成有一个能量需求，一些研究工作揭示，在1 0 - - 一4 0 m v 这样一 个低v 情况下，细菌素并不诱导人工膜的通透性，而在5 0 - - 一8 0 m v 之间的阈值时，可使通透性增 加好几个数量级。孔洞的直径范围o 2 1 2 n m ，将允许分子量高达0 5 k d a 的亲水溶质通过。孔 洞的寿命一般是几毫秒( 千分之一秒) 到几秒钟( 还连栋等，1 9 9 7 ) 。 关于n i s i n 杀菌作用的分子特性，不同解释间的差异直到最近才得到解决，合并成一种作用 模型( b r o t z e t a l ，1 9 9 8 ；b r e u k i n ke t a l ，1 9 9 9 ；w i e d e m a n ne t a l ，2 0 0 1 ) 。有关研究显示n i s i n 和e p i d e r m i n 主要把脂质体作为船坞分子形成高效、有目标的孔洞，同时通过捕获膜上的前体物质而阻止细 胞壁的合成。此外，像以前报道的那样，n i s i n 也可以形成无目标的孔洞( m o l le ta 1 ，1 9 9 6 ) ，尤其 对葡萄球菌作用时，它能激活细胞壁水解酶的活性( b i e r b a u me ta 1 ，1 9 8 5 ；b i e r b a u me ta 1 ，1 9 8 7 ) 。因 此，它的抑菌作用基于功能的多样性，这些不同的功能也许根据不同的目标菌而特异性结合，这 也解释了不同细菌种类间敏感的范围。以目前研究的最为透彻的羊毛硫抗生素为例，其个别功能 主要有以下几方面： ( 1 ) 能形成目标独立型孔洞的双亲离子羊毛硫抗生素( a 类) 离子双亲性肽类在自然界中广 泛分布。在整个生物界，微生物产生这种肽来抵抗竞争者，植物、昆虫和脊椎动物产生这种肽作 为抵抗微生物感染的效应分子。双亲性物质对带有阴性表面电荷膜的破坏性作用早已为人所知， 而关于人工合成多肽和天然多肽的生物物理性质也有大量的资料报j 酋( o r e ne ta ，1 9 9 8 ) 。根据 r a r n s e i e r 早期的观察，起初认为n i s i n 和相关的羊毛硫抗生素都一样分解细胞膜。大量的报道认 6 中国农业大学硕士学位论文第一犟绪论 为这些肽类通过干扰细胞质膜上能量的转导而杀死细胞，n i s i n 和其它a 型肽的加入可立即阻止 d n a 、r n a 、蛋白质和多糖等大分子的生物合成，而且细菌细胞不能有效地吸收氨基酸并泄漏出 无机离子和小分子代谢产物( r u h re ta 1 ，1 9 8 5 ) 。能量依赖活性的概念是根据细胞囊泡和带有模型细 胞膜的完整细胞的实验推出来的，用人造双分子膜( 厚脂膜) 测得的电导率和用完整细胞及生理 膜测得的结果非常一致( s a h le ta 1 ，1 9 8 7 ；b e n ze ta 1 ，1 9 9 1 ) 。在一定电势下，大型膜没有导电性，不 同肽的最低电压为5 0 - - - 1 0 0 m v ，孔洞直径一般在l n m ( n i s i n ) 至2 r i m ( s u b t i l i n ) 之间，通常几 毫秒内形成终生的空洞( b e n ze ta 1 ，1 9 9 1 ；b o h e i m ，1 9 7 4 ；r i z z oe ta 1 ，1 9 8 7 ) 。 起初认为“桶板模型”足以描述这些羊毛硫抗生素的作用了。在“桶板模型”中，甜螺旋 双亲肽通过静电作用结合到外部的小叶上，与膜表面方向平行，这已被b o h e i m ( 1 9 8 7 ) 举例证实， 其他人( r i z z oe t a l ，1 9 9 8 ) 证实了丙氨酸的此作用。为了避免极性残基在脂酰链上形成没用的位置， 几个单体肽不得不集合起来形成一束螺旋。这些肽插入到膜上之后，肽的非极性端链和膜的疏水 脂质体作用，亲水端链则伸向外部，这导致形成一个充满水的孔洞。“桶板”通道的大小和稳定 性依赖于参与孔洞形成的肽的数量。 用核磁共振研究n i s i n 对膜微囊泡的作用，根据其构象数据提出一种关于羊毛硫抗生素孔洞 形成的模型一“楔形模型”( h o o v e ne t a l ，1 9 9 6 ；d r i e s s e ne t a l ，1 9 9 5 ) 。这个模型考虑到a 类羊毛硫 抗生素在水溶液中比较柔韧易变，确定了小硫醚环中的结构元素( l i a ne ta t 1 9 9 1 ；v a nd ev e ne t a 1 ，1 9 9 1 ) 。在接触膜前，多肽采取一种双亲构象，即带电残基排列在分子的一面，疏水残基排列 在另一面。离子肽通过离子动力和磷脂头部基团相互作用，引起双分子层结构的局部紊乱，同时 疏水残基插入到膜中。 对n i s i n 的研究表明c 端区域和膜的整个阴性表面电荷一样对孔洞的形成和结合起重要作用 ( d e m e le ta 1 ，19 9 6 ；b r e u k i n ke t a 1 ，19 9 7 ；v a n k r a a i je ta 1 ，19 9 8 ；g i f f a r de ta l 。19 9 6 ；w i n k o w s k ie t a 1 ，1 9 9 6 ) 。根据上述研究推测，为了形成孔道几个分子不得不和膜相连，因为羊毛硫抗生素太短 了不能立即转变膜；另一方面，对b m l 的研究发现几种跨膜片断对直径1 n m 或更大的孔洞的形 成是必要的。孔洞的形成导致膜电势的丧失，并引起小分子代谢产物如氨基酸或a t p 的快速外泄， 这反过来又立即阻止了上面提到的所有胞内生物合成过程。 ( 2 ) 高亲和力间接目标孔洞的形成上述模型也许描述了多肽在单独的双分子层中的行为， 这需要高浓度的肽才能起作用，而且这些微生物的杀菌作用具有微摩尔级的最低抑菌浓度( m i c ) 也许同样基于这种机制。然而，n i s i n 和一些相关细菌素经常在毫微摩尔浓度范围内就杀死细菌， 表明也许有副作用或特定目标的参与。既然a 类羊毛硫抗生素能对人造膜起作用，那么以前对膜 的作用中并未考虑到特定目标折椅概念。对n i s i n 来说，已经观察到几个结合位点和不活泼的n 端片断l 一1 2 引起n i s i n 的特定抵抗作用，表明一个特定的结合位点也许被这些片断封锁( c h a r tp t a 1 1 9 9 6 ) 。考虑到这点，有必要回头看看l i n n e t t 和s t r o m i n g e r ( 1 9 7 3 ) 以前发表的文章，报道了 n i s i n 能阻止肽聚糖的合成，而且这和膜结合肽聚糖前体所谓的脂质体联合起来发挥作用。 7 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 这些报道强调了脂质体也许参与到孔洞形成的观点，这随后在n i s i n 和e p i d e r m i n 用脂质体 补充脂质体的实验中得到证实( b r o t ze ta 1 1