（食品科学专业论文）天然食品防腐剂人溶菌酶编码基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达.pdf

中文摘要 人溶曲酶是存在于人体正常体液和组织中的一种非特异性免疫因子。它对人体完全无毒副作 用，同时具有抗苗、消炎、抗病毒、抗肿瘤等作用，可被开发成口含片、胶囊、口香糖及口腔喷 雾剂等产品形式。 由于人溶菌酶来源有限，因此本研究提出通过遗传工程方法，利用毕赤酵母细胞生产人溶菌 酶，一方面解决了人溶菌酶资源稀缺的问题，另一方面则能创造更大的经济效益。由于人胎盘组 织中富含h l z m 基因的m r n a ，因此从人胎盘组织中提取细胞总r n a 作为模板，根据g e n e b a n k 中已发表的h l z m 基因的c d n a 序列，设计合成特异引物，经逆转录合成h l z m 基因的e d n a 序 列，并以此c d n a 序列为模板，经p c r 扩增h l z m 编码基因。经d n a 序列分析证明与己发表 的h l z mc d n a 序列完全一致。 通过e c o ri 和n o ti 双酶切作用，将h l z m 的编码基因按照质粒阅读框的转译方向插入到表 达质粒p p i c 9 k 的m c s 中，构建重组表达质粒p p i c 9 k h l z m 。利用电转化方法转化表型为h i s 一 的宿主菌k m 7 1 ，利用m d 培养基筛选到近12 0 0 个h i s + 转化子。再经g 4 1 8 抗性的二次筛选， 获得1 5 株含高拷贝人溶菌酶基因的重组毕赤酵母转化子。当以甲醇进行诱导表达时，成功获得 了1 株高效分泌表达的重组苗株p p l 3 5 ，其表达量为3 1 7 m g l ，酶活性为3 2 0 3 5 u m l 。 菌株p p l 3 5 经甲醇诱导，可将人溶菌酶分泌到培养基中，因此可在发酵上清液中直接检铡到 人溶菌酶的活性。该检测采用以溶壁微球菌( m i c r o c o c c u sl y s o d e i k t i c u s ) 为试验菌的琼脂平板扩 散法。研究发现培养基b g m m 、b m m 、m m c 等均能诱导菌株p p l 3 5 表达人溶苗酶，由于培养 基b g m m 和m m c 中存在干扰溶菌酶纯化的杂蛋白，并使溶苗酶产品带有异味和色素，因而确 定利用b m m 培养基进行重组菌株p p l 3 5 的诱导表达。实验最终获得3 8 l m e c l 的表达量，若继续 优化发酵条件，还有可能进一步提高菌株p p l 3 5 的表达水平。 本研究为人溶菌酶的工业化规模生产奠定理论基础，这对带动人溶茵酶的规模化生产具有特 殊意义，其推广应用将给社会带来相当的经济效益。 关键词：人溶菌酶( h l z m ) ，巴斯德毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i s ) ，分泌表达质粒p p i c 9 k a b s t r a c t h u m a n l y s o z y m e ( h l z m ) i s ak i n do fu n s p e c i f i ci m m u n a lf a c t o rc o n s i s t i n gi nn o r m a lh u m a n b o d yl i q u i d sa n dt i s s u e s i tw a sc o m p l e t e l yn oh a r m f u la n ds i d e e f f e c tt oh u m a nb o d y ，a n dh a st h e f u n c t i o no f a n t i b a c t e r i a l ，a n t i - i n f l a m m a t o r y , a n t i - v i r a la n da n t i - t u m o r t h e r e f o r e ，l y s o z y m eh a da l r e a d y b e e nm a d ei n t om u l t i f o r mp r o d u c t ss u c ha sw o c h ek e e p i n gi nm o u t h ，c a p s u l e ，c h e w i n gg u ma n d s t o m a t i t i sa e r o s o l s d u et ol a c k i n gh u m a n l y s o z y m e l s o u r c e si nn a t u r e t h er e s e a r c hw h i c hp r o d u c et h i sl y s o z y m eb y p i c h i a p a s t o r i sw a s c a r r i e do u tb yag e n e t i ce n g e e r i n gm e t h o d i tw i l lb es e t t l ef o ru n e n o u g ha m o u n to f h u m a n l y s o z y m e r e s o u r c ei na p p l i c a t i o n ，a n dw i l lb em a d em o r ee c n o m i cp r o f i t st os o c i e t y b e c a u s eo f t h e m r n ao f h l z m a b o u n d i n g i n h u m a n p l a c e n t a t i s s u e ，t h e t o t a l r n a w a s e x t r a c t e d f r o m p l a c e n t a t o b eu s e da s t e m p l a t ef o ri n v e r s et r a n s c r i p t i o n a ls y n t h e s i so fh l z me d n as e q u e n c e a c c o r d i n gt o p u b l i s h e dh l z m e d n a s e q u e n c ei ng e n e b a n k ，t h es p e c i a lp r i m e r sw e r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d f o r l e a d i n ga m p l i f i c a t i o no f h l z me n c o d i n gs e q u e n c eb yp c r t h e o b t a i n e ds e q u e n c ew a s p r o v e dt h a t c o m p l e t e l yi d e n t i c a lw i t ht h ep u b l i s h e dh l z m e d n a s e q u e c e c u t t i n gb ye c o r ia n dn o tit h eh l z me n c o d i n gs e q u e n c ew a si n s e r t e di nm c so fp p i c 9 k a c c o r d i n gt ot h er i g h tr e a d i n gf r a m e t r a n s l a t i o n a ld i r e c t i o n t r a n s f o r m i n gh i s p h e n o t y p ek v 1 7 1w i t h r e c o m b i n a n tp l a s m i dp p i c 9 k h l z mb ye l e c t r o p o r a t i o n ，1 2 0 0h i s + t r a n s f o r m a n t sw e r ea c q u i r e db y m d p l a t e s r e e n i n gb yg 4 1 8s e c o n d l y ，1 5r e c o m b i n a n t t r a n s f o r m a n t sw i t hm u l t i p l ec o p i e so f h l z m g e n ew e r eo b t a i n e d a f t e ri n d u c i n gb ym e t h a n o l ，o n eh i g h l e v e le x p r e s s i n gs t r a i np p l 3 5w a s s u c c e s s f u l l yo b t a i n e d ，a n di t se x p r e s s i o nl e v e l w a sa m o u n tt o3 1 7 m g lw h i c he n z y m ea c t i v i t yw a s 3 2 0 3 5u m l s t r a i np p l 3 5c a ns e c r e t eh u m a nl y s o z y m ei nm e d i aw h e ni n d u c i n gb ym e t h a n o l ，s oi tc a nb e d e t e r m i n a t e df o rh u m a nl y s o z y m eb a c t e r i o i y t i ea c t i v i t ys t r a i g h t l yi nf e r m e n t a t i v es u p e m a t a n t sb ya g a r p l a t ed i f f u s i o nm e t h o d w h i c hu s e dm i c r o c c o u sl y s o d e i k t i c u sa st h et e s tb a c t e r i u m i tw a sf o u n dt h a tt h e m e d i as u c ha sb g m m ，b m ma n dm m ca l l c o u l di n d u c es t r a i n p p l 3 5 t o e x p r e s s i o n h u m a n l y s o z y m e b e c a u s eo fm e d i ab g m m a n dm m cb e i n go fs o m ep r o t e i n sw h i c hc a ni n t e r f e r et h e p u r i f i c a t i o no f l y s o z y m e a n de n d u i n gt h e p r o d u c t w i t ho d o u ra n d p i g m e n t ，f i n a l l yt h em e d i a b m mw a s c o n f i r m e dt oi n d u c ee x p r e s s i o nh l z mo f t h es t r a i np p l 3 5 t h e r e s u l ts h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i n gl e v e l w a s 3 8 1 m g l ，a n dt h ep p l 3 5 h a st h ep o t e n t i a lt oc o n t i n u a l l yi n c r e a s et h ee x p r e s s i n gl e v e lw h i c h w i l lb e a c h i e v e db y o p t i m i z i n g t h ef e r m e n t a t i o nf a c t o r s t h i sr e s e a r c hw i l lm a k ea na c a d e m i cb a s ef o ri n d u s t r i a ls c a l ep r o d u c t i o no f h u m a n t y s o z y m e i t w i l lb es i g n i f i c i a n tt od r i v et h ed e v e l o p m e n to fs c a l ep r o d u c i n gh u m a nl y s o z y m e t h es p r e s d i n ga n d a p p l i c a t i n go f t h i st e c h n i c sw i l lb ec o n s i d e r a b l e l yb e n e f i t t ot h ew o r l d k e y w o r d s ：h u m a n l y s o z y m e ( h l z m ) ，p i c h i a p a s t o r i s ，s e c r e t e de x p r e s s i n gp l a s m i dp p i c 9 k u 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谓 的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名时间：2 0 0 3 年5 月3 0 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 导师签名 芦“肚 时间：年月日 时间：弘卯；年占月z z - h h l z m c l m h 皿 d e p c d d h 2 0 c d n a p c r l p t g x g a l t a q t e 州s t a e t b e t r i s c l m o p s 盯p c r t d - p c r e c i t a a o x s o d h b s a g + n f h s a p a r s h i s 4 g a p p g k 5 u t r d a s p e p 4 m c s b s a s d s p a g e d t t t e m e d y n b - a a ，a s y p d v i 英文缩写( a b b r e v i a t i o n ) h u m a nl y s o z y m e e g gw h i t el y s o z y m e m o l o n im o u s el e u c o c y t h e m i av i r u si n v e r s et r a n s c f i p t a s e d i e t b y l p y r oc a r b o n a t e d i s t i l l e dw a t e rt r e a t e db yd e p c c o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d p o l y m e r a s ec h a i nr e a n t i o n i s o p r o p y l i - t h i o - b d g a l a c t o s i d e 5 - b m m o - 4 一c h o l o r o - 3 i n d o l y l 1 3 d - g a l a c t o s i d e t h e r m o s a q u a t i c u sd n a ( p o l y m e r a s e ) t r i s e d l ab u f f e r t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h e a e t r i s a c e t a t “( b u b r e d ) t r i s b o m t ee l e e t r o p h o r e s i s ( b u f f e r ) t r i sb y d r o c h l o n d e 3 一( n - m o r p h o l l n o ) p r o p a n es u l p h o n i ca c i d r e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n t o u c h - d o w np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d a l c o h o lo x i d a s e s u p e r o x i d ed i s m u t a s e h e p a t i t i sbs u r f a c ea n t i g e n t e t a n u st o x i nf r a g r u e mc h u m a ns en l ma l b u m i n p i c h i aa u t o n o m o u sr e p l i c a t i o ns e q u e n c e s h i s t i d i n o ld e h y d r o g e n a s e g l y c e r a l d e h y d e - 3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a e s p h o s p h o g l y c e r a t ek i n a z e 5 - u n t r a n s l a t l o nr e g i o n d o w n s t r e a ma c t i v a t i o ns e q u e n c e p r o t e a s e l e f i c i e n t m u l t i p l ec l o n i n gs i t e b o v i n es e r u ma l b u m i n s o d i u md o d e c y ls u l f a t e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s d i t h i o t h r e i t o l n ，n ，n ，n 一t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i e m i a e y e a s tn i t r o g e nb a s ew i t h o u ta m i n o a c i d so ra m m o n i u ms u l f a t e y e a s t p e p t o n e 2 d e x t r u s e ( m e d i u m ) 人溶菌酶 鸡蛋清溶菌酶 莫洛尼鼠自m 病病毒反转录酶 焦碳酸二乙酯 用d e p c 处理过的水 互补d n a 聚合酶链反应 异丙基硫代8 d 半乳糖苷 5 溴4 - 氯3 吲哚_ b 一琉代半乳糖苷 柄热水生菌d n a 聚合酶 t r i 旺d t a 缓冲液 三( 羟甲基) 氨基甲烷 t r 乙酸电泳缓冲液 t r i s ，硼酸电泳缓冲液 i r i s 盐酸盐 3 ( n 吗啉代) 丙磺酸 反转录聚合酶链反应 降落p c r 乙二胺凹乙酸 乙醇氧化酶 超氧化物歧化酶 乙肝病毒表面抗原 破伤风霉素蛋白c 人血清白蛋白 毕赤酵母自主复制序列 组氨醇脱氢酶 磷酸甘油酸脱氢酶 磷酸甘油酸激酶 57 非翻译区 下游激活序列 蛋白水解酶摹因缺失突变形 多克隆位点 巾血清白蛋白 十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 二硫苏糖酶 n ，n ，n7 ，n 四甲基乙二胺 无氪基酸及硫酸胺的酵母氮源 酵母提取物，置自靳葡萄精( 培养基) 中国农业大学博士学位论文第一章；l 言 1 1 概述 第一章引言 回顾二十世纪，全球环境污染及食品安全闷题已成为人类最为关注的热点问题。各国人民对 食品安全的呼声与日高涨。当前，绿色健康消费已成为新的消费时尚，选择绿色天然食品的观念 已在消费者心中根深蒂固。食品中一些必用的添加剂、防腐剂也在向着安全、营养、无公害的方 向发展。 在食品领域内，各类食品的防腐保鲜始终是一个亟待解决的重要问题。据估计，每年全世界 约有1 0 2 0 的食物损失于各类腐败。而在我国，由于农产品的采后储藏以及深, 0 h i 技术还与 世界水平存在一定差距，因此食品腐烂变质的状况更为严重。每年我国约有3 0 左右的新鲜果蔬 损失于腐烂变质，腐烂变质不仅会使食品丧失营养价值，严重时甚至会导致食品中毒。 导致食品腐败变质的原因是多方面的，但微生物的作用是最赢接和最主要的。于是，为了在 生产、运输、销售和贮存过程中保证食品的品质，延长食品的货架期，人们采用了冷冻干燥、气 调贮藏、辐射保藏及微波杀菌等手段来抑制微生物的生长、甚至使其灭活，但这些新技术耗能大、 投资成本高，使用起来也有一定的局限性，不能适用于所有食品。因此向食品中添加防腐剂这种 既简便、又行之有效的方法愈发受到青睐，并对食品工业今后的发展具有更深远的意义。 食品防腐剂的使用效果通常会受到温度、溶解度、p h 值、食品成分以及微生物种类等许多 因素的影响。但归根结底，其作用的机理都可归纳为三个方面：作用于微生物的细胞壁和细 胞膜系统；作用于微生物的遗传物质或遗传微粒结构；作用于微生物的功能蛋白。进一步的 深入研究指出，防腐剂主要抑制了微生物的呼吸作用，致使其细胞内a t p 和n a d h 等能量物质 溃乏，进而阻遏了微生物细胞的正常合成代谢，从而使细胞膜不能维持其原有的完整结构，细胞 质外流，最终导致菌体细胞自溶、死亡。所以，在实际应用过程中，只要将抑制不同呼吸途径的 防腐剂配合使用，必然会产生明显的抑菌效果。 在我国，对防腐剂的使用有着严格的规定，食品工业中使用的防腐剂必须符合以下标准： 合理使用对人体健康无害；不影响消化道菌群；在消化遭内可降解为食物的正常成分；不 影响药物抗菌素的使用；对食品热处理时不产生有害成分。根据这一规定，目前我国己批准使 用了3 2 种食品防腐剂，其中以化学防腐剂苯甲酸、山梨酸及其钠盐和对羟基苯甲酸酯类最为常 见。苯甲酸的毒性比山梨酸大，抑菌效力却只有山梨酸的三分之一，但苯甲酸及其钠盐价格低廉， 因此在我国仍作为主要防腐剂使用。山梨酸是种不饱和脂肪酸，可参与人体的正常代谢，在体 内能够转化为二氧化碳和水，现在很多国家都己逐步改用了山梨酸。 随着科技的进步以及分析检测手段的不断完善，人们逐渐发现在过去认为安全的一些化学防 腐剂实际上也具有致癌或潜在致癌的可能性，如用于肉类着色和防腐的n a n 0 3 在消化系统中很 容易与脯氨酸形成一种强致癌剂n 一弧硝胺类化合物。于是，寻找并开发一些天然高效、安全无毒、 性能稳定、广谱杀菌的食品防腐剂正逐渐成为食晶科学研究领域中的一大热点。因此，一些源自 中国农业大学博士学位论文第一章引言 i i 动物、植物或微生物的新型天然防腐剂应运而生，如溶菌酶、鱼精蛋白、壳聚糖、蜂胶、茶多酚、 植物香精油、果胶分解物、乳酸菌、乳酸链球菌肽( n i s i n ) 等悄然出现，其中溶菌酶、葡萄耱氧 化酶、乳酸菌、壳聚糖、粟胶分解物等作为食品防腐剂已被国家批准使用。在研究中人们还发现 有些天然防腐剂如溶菌酶不仅对人体健康无害，而且还具有一定的营养价值。此外，人溶菌酶作 为一种存在于人体正常体液和组织细胞中的非特异性免疫因子，与自然界中其它溶菌酶相比具有 最强的酶活性。它对人体完全无毒副作用，可_ j 丁消炎、消肿、凝血、止血等医用，同时还具有 抗感染、抗病毒、抗肿瘤等多种药效，可广泛应用于食晶、医药、保健及饲料等多个领域，并可 开发成防腐剂、口含片、胶囊、1 2 1 香糖、1 2 1 腔喷雾剂及饲料添加剂等多种产品形式，应用前景十 分广阔。所以，对溶菌酶的深入探究在我国已掀起了食品、医药科学领域内的一个新浪潮。 1 2 溶萄酶的研究进展 1 2 1 溶菌酶的理化性质 溶菌酶( t y s o z y m e ，l z m ) ( e c 3 2 1 1 7 ) ，系统名为n 一乙酰胞壁质肽聚糖水解酶( p e p t i d o g l y c a n n - a c e t y l m u r a m o y l h y d r o l a s e ) ，简称胞壁质酶。其纯品为白色、微黄或黄色晶体或不定型粉末，无 臭，味甜，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚等有机溶剂。 溶菌酶是一种碱性蛋白质。在酸性条件下该酶具有较好的热稳定性，如在p h3 0 时，9 6 * ( 2 处 理1 5 r a i n 仍能保持8 7 的酶活性“。在自然条件下，大多数溶菌酶化学性质稳定，即使当p h 值 在1 2 1 1 3 范围内剧烈变化，既不会改变酶结构也不会影响酶活性。但碱很容易使酶活性遭到 破坏，当处于碱性n h 值范围时，溶菌酶的热稳定性就很差。如在p h7 0 时，1 0 0 处理1 0 r a i n 即失去酶活性1 3 ) o 由于溶苗酶分子中含有较多的碱性氨基酸残基，因而其等电点为p h1 0 7 1 1 0 。 溶菌酶的最适反应温度是5 0 ，最适反应p h 是6 0 4 7 0 。溶菌酶种类不同其是适反应条件也 略有不同。 氧化剂对溶菌酶活性有阻遏作用，而n a c i 对酶恰好具有激活作用。溶菌酶的热变性是可逆 的，其变性温度通常不高于7 0 0 c 。溶菌酶干粉的理化性质更稳定，若在低温、干燥状态下进行贮 存，其性质几乎永远不变”。即使在中性水溶液中，溶菌酶的活性也可在数天内维持不变”1 。然 而反复冻融对溶菌酶的活性影响较大，事实上冻融1 次，其活性的损失接近5 0 。 1 2 2 溶菌酶的分布 自1 9 2 2 年英国人f l e m i n g 首次在人的鼻粘液中发现溶菌酶，到1 9 3 7 年a b r a h a m 和r o b i n s o n 从卵蛋白中最先分离出溶菌酶晶体“j 人类从此揭开了研究溶菌酶的历史篇章。目前已知溶菌酶 在自然界中分布的极为广泛，研究人员已经发现在鸟类、家禽的蛋清，哺乳动物的眼泪、唾液、 乳汁、血液、淋巴液、孕妇尿液、白细胞、胎盘和肝、肾组织等细胞中，许多植物如木瓜、凤梨、 芜菁、大麦、无花果以及绝大多数微生物中均有溶菌酶的存在，只是其含量差异较悬殊( 表1 一1 ) 。 中国农业大学博士学位论文第一章引言 表1 - 1 溶菌酶的分布 t a b i - 1d i s t r i b u t i o no f l y s o z y m e 鸡蛋清 3 m g m l 人初乳 0 4 m g m l 人血清o0 0 6 0 0 1 m g m l 人眼泪 7 m g m l 人尿0 5 一l2 天 牛乳013mgml 垂垄墨 ! ：生! ：! 巴型g 1 2 2 1 动物溶菌酶 自然界中，鸡蛋清溶菌酶的含量最丰富，约为3 5 ，即使在蛋壳膜中也含有1 3 的溶菌酶。 目前，由食品厂废弃蛋壳的残留蛋清中提取溶菌酶，回收率可达2 5 2 8 ，溶菌酶产品的活 性为1 50 0 0 u r a g ，最高时可达1 8 0 0 0 u m g 。鸟类如鹌鹑蛋清溶菌酶的活性与鸡蛋清溶菌酶非常相 似。目前从牛乳、马乳、羊乳中也分离出了溶菌酶，其理化性质类似于人溶菌酶。不同的是，鲜 牛乳中几乎检测不到牛溶菌酶的活性，而人乳中溶菌酶的最高含量可达o ，1 2 乩”j 。 1 2 2 2 植物溶菌酶 植物中的溶菌酶通常比动物来源的溶菌酶具有较火的分子量( 表i - 2 ) 。除了表中植物，人们 还在萝h 叶”1 和橡胶。3 中发现了溶菌酶。 表1 - 2 植物中的溶菌酶 t a b 1 - 2 l y s o z y m ei np l a n t s 表示来查到 1 2 2 3 微生物溶菌酶 目前在大多数微生物中都发现了溶菌酶，按照酶的作用方式不同可大致分为以下七类： ( 1 ) 内n 一乙酰己糖胺酶，作用同于鸡蛋清溶菌酶，能破坏细菌细胞壁肽聚糖的b 1 , 4 糖营键 中国农业大学博士学位论文 第一章引言 ( 2 ) 酰胺酶，能切断细菌细胞壁肽聚糖中n a m 与肽尾之间的n 一乙酰n a m - l 一丙氨酸连键： ( 3 ) 内肽酶，可使细菌细胞壁中肽尾或肽桥内的肽键断裂： ( 4 )b 一1 , 4 或b 一1 , 6 葡聚糖酶和甘露聚糖酶，主要分解酵母菌细胞壁； ( 5 ) 壳多糖酶，主要分解霉菌细胞壁： ( 6 ) 磷酸甘露糖酶，与葡甘露糖酶共同作用可分解原生质； ( 7 ) 噬菌体溶菌酶，如t 4 、t 7 溶菌酶均为特异性酶，只在受感染的宿主细胞内被诱导产生。 来源不同的溶菌酶，其生物活性各不相同。其中，以人溶菌酶的活性最高，分别是鸡蛋清溶 菌酶活性的3 倍，山羊乳溶菌酶活性的16 0 0 倍，牛乳溶菌酶活性的30 0 0 倍。植物溶菌酶对溶 壁微球菌的活性只有鸡蛋清溶菌酶的l 3 ，但对胶体状甲壳质的活性则是鸡蛋清溶菌酶的1 0 倍。 1 2 3 溶菌酶的分型 按照蛋白质的一级结构通常可将溶菌酶分为三种类型( 表1 3 ) ：即c 型，主要代表是鸡蛋清 溶菌酶( c h i c k e ne g g - w h i t el y s o z y m e ，c l ) ；g 型，主要是鹅蛋清溶菌酶( g o o s ee g g w h i t el y s o z y m e ， g l ) i i oj 噬菌体溶菌酶型( 1 l l 。存在于自然界中的大部分溶菌酶都属于c 型，人溶菌酶也是其中 之一。 表1 3 三种类型溶菌酶的比较 t a b 1 - 3 c o m p a r i s o no f t h r e ek i n d sl y s o z y m e 整堕堕! 型g 型堕堕簦型 氮基酸残基数目 1 3 01 8 51 6 4 相对分子量 1 47 0 02 10 0 01 87 0 0 堕重堡：空 旦! ：! ! 翌垒：翌型! ：! ! 翌坐：堑 鱼! ：! ! 翌垒1 2 ：! ! 表1 - 3 显示这三种类型溶菌酶的活性中心均由g l u 残基和a s p 残基组成，区别仅在于残基存 在的位点不同。经x 射线衍射试验证实c 型溶菌酶的活性中心与g 型溶菌酶的同源“”。噬菌体 溶菌酶存在于各种噬菌体颗粒内，能够溶解宿主菌的细胞壁，尤其在噬菌体侵染和释放过程中发 挥了重要作用。它在序列上与c 型溶菌酶的同源性较差，但它们的主要结构、底物结合位点及对 底物催化的特异性均比较相似，就连酶的活性中心也相对应“”。自然界中除了以上这三种类型 的溶菌酶之外，j o l l e s 还证明有其它少数类型的溶菌酶存在“。 1 2 4 溶菌酶的空间结构 在过去的很长一段时问中，溶菌酶一直被当作一种理想的模型，用于蛋白质的空间构象、酶 动力学及分子进化等方面的研究，其中有许多关于蛋白晶体研究及蛋白质结构与功能关系研究进 展都是利用溶菌酶获得的“5 。1 ”。其中，c l 是酶学领域中研究得晟透彻的一个蛋白质分子。它由 4 中国农业大学博士学位论文 第一章引言 1 k ! l n 蔓! 皇曼曼皇量量曼皇! 皇曼! 曼! 曼曼曼曼曼詈曼! ! 曼! ! 曼! 曼! 曼皇曼! 曼曼曼冀! ! 曼! 曼曼! 曼! 曼曼曼! 曼! ! 皇! 曼曼皇蔓曼曼! ! ! ! ! 曼 1 8 种氨基酸共1 2 9 个残基编码而成单肽链，分子量为1 44 0 0 。有生物活性的溶菌酶分子在空间构 象上紧密缠绕成球形，因其分子内富含半胱氨酸，所以具有4 个二硫键。球状结构共分为2 个结 构域，由7 个a - 螺旋、3 个b 折叠和1 4 个转角结构组成。鸡溶菌酶也是蛋白质热力学稳定性研 究领域中最好的模式蛋白。通过氨基酸的定点突变研究，发现溶菌酶的热力学稳定性与氨基 酸残基侧链的大小和疏水性密切相关。 人们发现当溶菌酶形成结晶时，它通常以四面体形式存在( 图l - 1 ) 。而当h l 内第5 6 位和 6 7 位上的残基i l e 和a s p 发生突变时。可能会导致某些系统性疾病如a l z h e i m e r 氏和 c r e u t z f e l d z - j a k o b 疾病发生，这些疾病的症状是蛋白质以纤维化形式沉积在许多不同的组织中， 进而影响机体的正常生理功能。 图1 - 1 溶菌酶蛋白质晶体结构 f i g 1 1 t h ec r y s t a ls t r u c t u r eo f p r o t e i nl y s o z y m e 1 2 5 溶菌酶的基因及其与空间构象的关系 研究表明溶菌酶的基因含有4 个外显子和3 个内含子。”，虽然成熟的溶菌酶基因只编码1 3 0 个氨基酸残基，但溶菌酶的前体基因结构则较为复杂。2 1 ( 图1 2 ) 。 内舍子1内含干2 内含千3 编码氪基酸残基序号j始j 9 0 28 3 l o g 1 0 91 3 0 图i - 2 溶茁酶的前体基因 f i g 1 - 2 t h ep r e c u r s o rg e n eo f l y s o z y m e 在外显子l 之前是一段编码信号肽的前导序列，外显子1 编码第l 至2 8 个氨基酸残基，外 显子2 编码第2 9 至8 2 个氨基酸残基，外显子3 编码第8 3 至1 0 8 个氨基酸残基，而外显子4 则 中国农业大学博士学位论文第一章引言 编码第1 0 9 至1 3 0 个氨基酸残基。在相邻的外显子间共存在3 个内含子。溶菌酶前体基因序列的 长度是成熟m r n a 序列长度的7 倍。 从对c l 的研究中发现，在外显子与溶菌酶的空间结构之间存在着密切的对应关系”。溶苗 酶的氨基酸序列共分为四段：分别为a 段，1 3 9 ：b 段，4 0 8 5 ；c 段，8 6 1 0 0 ；d 段，1 0 1 1 2 9 。蛋白氨基酸序列结构上的a 段与外显子1 的编码区域不对应，网为内含子1 的插入位点是 第2 8 位氨基酸残基，而非第4 0 位，在空间结构中内含子l 存在于溶菌酶第2 4 3 4 位氨基酸形 成的螺旋内。除了a 段结构外，其他外显子所编码的蛋白质片段各自构成一个空间结构成分， 独立存在，很少相互嵌插。 目前已从鸟类蛋清和哺乳动物中分离出超过2 0 种氨基酸排序的溶菌酶，其中有8 种动物溶 菌酶已经由x - 射线晶体学方法确定了其三维空间结构。对c l 的空间结构研究。”表明，其三维 结构是一个紧密的椭球状分子，该分子被一条包含酶活性中心的裂缝分成了两半，一半由1 3 - 片层 折叠结构组成，并含有酶括性中心，另- - - i 二则由a 段和d 段末端的螺旋组成，最后由c 段的 螺旋将酶分子的两半连接起来构成一个整体。酶的催化活性中心由残基g l u 一3 5 和a s p 一5 2 及其所 在的缝隙两侧的重要功能基团组成，主要由外显子2 编码，并包含有部分底物结合位点，便于酶 进行催化作用。外显子3 编码的片段与外显子2 编码的片段相连，也含有部分底物结合位点，可 使酶活性中心的结构更完整。外显子2 所编码的蛋白产物决定了酶分子的糖苷酶活性，而外显子 3 编码的蛋白质产物则决定了酶分子与底物的特异一l 生结合，当这两部分产物相连接时，酶对底物 的特异性结合以及催化作用均有所提高。外显子1 和4 负责编码m r n a 上的转译信号序列，该 序列位于溶菌酶的两端( c 端和n 端) ，它们之间通过二硫键紧密相连，虽然二硫键不参与酶反 应，但对维持酶活性的稳定及未知的生物学功能有重要作用。 1 2 6 溶菌酶的活性中心 多数溶菌酶的活性中心由残基g l u 3 5 和a s p 5 2 组成，此外，t r p 6 2 、a s p 1 0 1 、t r p 1 0 8 和a r g 1 1 4 等氨基酸残基对“底物酶复合物”的形成也起着重要作用( 2 3 1 通过定点诱变研究，发现残基g l u 3 5 和t r p 1 0 9 之间的范德华力对维护人溶菌酶的生物活性具有重要作用1 。当以a s p 取代残基 g l u - 3 5 后，f l l 只保留了很弱的一点儿酶活性，而当以a l a 进行取代时，1 1 l 则完全丧失了酶活性。 因此，在溶菌酶活性中心第3 5 位氨基酸残基上的侧链基团对维护溶菌酶的活性具有重要作用。 若残基t r p 1 0 9 为p h e 或a l a 所取代，则导致h l 分子的结构发生重大变化。所以残基g l u 3 5 和 v r p 1 0 9 之间的范德华力决定了人溶菌酶的生物活性。 木瓜溶菌酶的活性中心除包括g l u 3 5 、a s p 一5 2 外，还需要一个c y s ，而残基t r p 并不参与酶 与底物的结合。木瓜溶菌酶受组胺强烈抑制，同时也受n 乙酰葡糖胺的强烈抑制，这一点与c l 的性质相近”。易继财利j = = jp h 动力学和化学修饰等方法对萝b 溶菌酶的活性中心进行了初步研 究，表明萝b 溶菌酶的活性中心由g l u 、a s p 残基的羧基( c o o h ) t r p 及h i s 残基共同构成， 巯基s h 不参与酶活性中心的形成。与c l 的特性不同的是，萝h 溶菌酶受组胺显著抑制，但基本 上不受n 乙酰葡糖胺的抑制“。 6 中国农业大学博士学位论文 第一章引言 1 2 7 溶菌酶的抗菌谱 溶菌酶是一种有效的抗菌剂。可以通过其肽链中g l u - 3 5 和a s p 5 2 所构成的活性中心水解细 菌细胞壁肽聚糖上n 乙酰胞肇酸( n a m ) 的c l 与n 一乙酰葡萄糖胺( n a g ) 的c 4 之间的b 1 ，4 糖苷键，从而使肽聚糖骨架结构断裂，细胞壁损伤，接着细菌因渗透压不平衡而引起破裂，最终 导致菌体细胞溶解，直至死亡。如果按照溶菌酶的作用对象进行划分，通常可将其分为细菌细胞 壁溶解酶、酵母细胞壁溶菌酶和霉菌细胞壁溶菌酶等三大类。大部分植物溶菌酶多属于霉菌细胞 壁溶菌酶类型。 一般地，溶菌酶对革兰氏阳性菌的抑菌效果最为显著，已有研究证实它对溶壁微球菌 ( m i c r o c o c c u sl y s o d e i k t i c u s ) 、黄色八叠球菌( s a r c i n a f l a v a ) 、巨大芽孢杆菌( b a c i l l u sm e g a t e r i u m ) 、 枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 、地衣型芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) 、丁酸梭菌( c l o s t r i d i u m b u t y r i c u m ) 、生孢梭菌( c l o s t r i d i u ms p o t o g e n e s ) 、酪丁酸梭菌( c l o s t r i d i u m t y r o b u t y r i c u m ) 等有良 好溶菌作用。其中，溶壁微球菌是目前用来检测溶菌酶生物活性的模式试验菌株。 溶菌酶的抗菌谱还不广泛，若单独使用则对革兰氏阴性菌的抑制作用势不明显。如果能将溶 菌酶与乳酸链球菌素、卵运铁蛋白、葡聚糖、甘氨酸或e d t a 等结合使用，则对抑制或杀灭单核 细胞增生李氏菌( l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s ) 、大肠杆菌( e c o l d 、普通变形杆菌( p r o t e u sv u l g a r i s ) 、 副溶血孤菌( h b r i o p a r a h a e m o l y t 把w ) 等有显著作用。 1 2 8 溶菌酶的应用 1 2 8 1 溶菌酶在食品工业中的应用 由于溶菌酶本身是一种天然蛋白质，无毒副作用。经口饲喂大鼠的l d s o 为2 0 9 ，5 0 k ，因此 被认为是一种很安全的食品添加剂( g e n e r a l l yr e c o g n i z e da s ；s a f e ，g r a s ) 。由于其具有选择性抑 菌的特点，目前已被许多国家和组织( 美国日本、f a o w h o 及中国) 批准作为食品防腐剂或 保鲜剂使用。 1 2 8 1 i 食品防腐剂 溶菌酶通常被用作水产品、糕点、奶酪、香肠等熟肉制品以及清酒、茶饮料等食品的防腐剂。 如： ( 1 ) 在蒸煮后的鱼肉中添加0 0 5 的溶菌酶，于9 0 。c 加热1 5 分钟保存或用l 明胶和o 0 5 的溶菌酶混合液浸泡鱼肉1 0 秒后再保存，结果9 天内杂菌数没有明显增加，而未经处理的则增 加3 5 个数量级。 ( 2 ) 当把新鲜的海胆、虾和蛤蜊放入含有0 1 m 甘氨酸、0 0 5 溶菌酶和3 食盐混合液中浸泡 5 分钟，除去水分，保存在5 的冷库中，9 天后可直接供食用，无异昧、无馈烂、色泽无变化。 若仅用食盐浸渍处