（食品科学专业论文）功能性食药用菌蛹虫草的开发技术研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及墩得的罨器 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其德 人已经发表或撰写过的磅究成果，也不包含为获褥湖南农业大学或其它教育枕构 的学位或证书丽使耀过的材料。与我一同工作的同志对本研究所撇的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生虢期 乏手 时间：2 0 0 4 年6 月3 圈 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保簌、使用学位论文的觏定，即：学校有权 绦甓送交论文酌复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阕，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以罔不同方式在不嗣 媒体上发表、传播学位论文麴全部或部分内容。 保密的学链论文在解密蜃应遵守此协议) 研究生签名：期。豆午 时阆： 扣呼年多月盘同 导师签名： 时潮：丫年6 月u 7 圜 功能性食药用菌蛹虫草的开发技术研究 摘要 本文对蛹虫草的人工栽培技术和液体深层发酵的条件进行了研究。 首先通过探讨种源、营养条件( 碳源、氮源、料液比) 、环境因素( 温度、 湿度、光照、通气) 对蛹虫草人工栽培的影响表明：栽培出优质、高产的蛹虫草 需要优质的种源，最佳碳源为淀粉，最佳氮源为硝酸钾，大米与营养液的最佳比 例为1 ：1 2 ，其菌丝体需要完全避光培养，在温度2 0 2 5 、相对湿度为5 5 7 0 的环境中生长状况最佳；待菌丝体吃透培养基后应进行光照刺激，诱导子实体产 生，此时培养温度为1 5 2 0 ，相对湿度为7 肚8 5 ，还要采取通气措施促进生 长。 在摇瓶液体深层发酵试验中，通过探讨营养条件( 碳源、氮源、无机盐) 对 蛹虫草发酵的影响，结果表明发酵培养基的最佳组成为：大米粉4 ，大豆粉2 ， 磷酸二氢钾o 1 5 ，硫酸镁o 2 ；通过对蛹虫草摇瓶发酵条件下的工艺条件 研究发现：接种量4 ，菌龄4 8 h ，装液量1 0 0 i n 坨5 0 m l ，起始p h 7 o 7 5 ，消 泡剂0 1 0 0 1 5 ，摇床转速为1 8 0 r p m ，培养温度为2 4 ，发酵7 8 h 的蛹虫 草的菌丝体和胞外多糖的产量为最高。 在l o l 发酵罐中进行的扩大培养表明，当罐压为0 0 5 0 0 7 m p a ，通风量 为1 ：0 0 5 ( v m i n ) ，搅拌速率2 0 0 r p m 时，发酵效果最好。 关键词：蛹虫草，栽培，深层发酵，菌丝体，多糖 a b s tr a c t i nt h i sp a p e r ， t e c h n i q t l eo fa r t i f i c i a lp l a n t i n ge | 。删弦p s 厨l ? 毒a r j p s a n dc o n d i t i o no fd e e p1 i q u i df e r m e n t a t i o no fz 爻，r 嗣阳t 曼p s 蒯- j 六e l 一聍sw e r e s t u d ie d f i r s t l yw ep r o b e di n t ot h ee f f e c t so na r t i f i c i a lp 王a n t i n g 国州粥 ：f 裕 朦j l ? 砉鑫“8 s b r o 毽g h tb ys e e d ，n o 娃r 主s 蕊e n 专( c 鑫嚣b o ns o 毽r e e ，鞋i 弋r o g e ns o u r e e ， p r o p o r t i o no fn u t r 主e n 乞王i q 娃主da n d 瓶a t e r 童a 1 ) ，e n v i r o n m e n t ( t e l 嚣p e r a t u r e ， h 娃激童d 主乞y ，羔i g h t ，v e n t 主捻g ) 。t h er e s u l t s 至稳d 主e 8 专e d 专h a 专b e s t q 娃氇王主t ys e e d w 8 s 疆e e 惑e d 譬o rp 王8 n t 主n gh 主g hg r | 吕畦e 氇歉dh 主g hy i e 王d ( 套咖t 詈：；塔j ，癌j j 参舌最三0 8 舅t h e o p t i m u mc a r b o ns o u r c ew a ss t 8 r c ha n dt h eo p t 主m u mn 主t r o g e r ns o u r e ew 8 sl ( n 毯 t 魏eo p t 主瀑u 激p r o p o r t i o 珏q fn 毽t r 主e n 专羔熏g u 主d 氇黔纛r 主e ew 氇sl ；1 2 王h e 疆y e e 圭主娃掇 o f ( 1 ) r c 咖l 雪i p s j 露f - 歹毒芒量2 8 sc o u l dw e ll g r o w i nt h ed a r k ，n o wc u l t u r e 屯e 糟p e r a t u r e w a sa t2 0 2 5 a n dr e 王8 t i v e h 醢毪l 主d 主t y 5 5 ? 0 。g 主v e 转 i 1 1 u m i n a t i o ns t i m u l a t i o na f t e rt h e m y c e l i u mh a d h a d e n o u g h c u l t u r e m e d 主u m ，w h i e hw o u l dg u i d et h ef r u i t b o d y sf o r 趣主n g t h ec u 王t 娃r et e n 零e r a t u r e w a sa t1 5 v 2 0 a n dr e l a t i v eh u m i d i t y7 0 培5 v e n t i n gw o u l dp r o m o t et h e g r o w t ho ff r u it b o d y s e c o n d l y ， i n e x p e r i m e n to fd e e p 1i q u i df e r m e n t a ti o no f c c 州粥t 三：秘 掰j l ，春a r ? 学s ，t h eo p t 氮融u ml i q u i de u l t u r ec o n d i t i o nw a 8 ：r i c em e a l4 ，s o y b e a n m e a l2 ，k h 2 p 0 4 0 1 5 ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 2 t h ep r o c e s sc o n t r 0 1 w a s ：p i t c h i n g 4 ， 乏喀e o fp u r ec u 王t u r e4 8 h ，f i 王l i n gl i q u i dl o f ) 蕊王2 5 0 m 王，i n i t i a lp 毛7 o 一7 5 ， a n t i f o a m e r0 1 0 o 1 5 ， s t i r r i n gr a t e1 8 0 r p m ， c u l t u r et e m p e r a t u r e2 4 ， f e r 掇e n t 氇屯i o n7 8 h 。 o n t h eb a siso fa b o v er e s u its ， z 冀州粥9 ：芦谬旃l j 芑r z 8 s w a sf u r t h e r e 娃王t 娃r e d 主论圭o 乙s 专主r r e d乞a n kf e r 蒜e n 专a t 主o na 瓣dt h es u i 乇a b 主ec u 王专醚r e e o 秘d i t i o nw 鑫s g o t 8 sf o 王王w s ： p i e z o t 8 n k0 。0 器0 0 7 酗a ， v e n 乇i l i a t i o n q u a n 乞i t y l ：o 。0 5 ( v v 。搬主n ) ， s t i r r 主n gr 8 t e2 0 0 r l 攒 | ( e y 辫o r d s ：爻删y o 9 j p s 露瞄j j 甚r z 8 s ，p 王a 靛弋主疑g ，d e e 羚王主键u 童df e r 撒e 魏专巍专主o n ， m y c e 】i u m ，p o l y s a c c h a r 主d e s 2 - j _ _ 刖蓦 蛹虫孳( 幻一蹲够筇应l j 君嚣矗s ( 乙) l i 珏k 。) 又名北虫草、蛹荤、北冬虫夏草。 属子囊菌贬门、核茵纲、球壳菌目、麦角茵科、虫草属，是与冬虫夏草极为相 似的一个种。广泛分布于世界各地，在我国吉林、辽宁、河j 艺、陕西、甘肃、安 徽、山东、湖北、湖南、四川、贵州、福建、广东、广西、云南等地均有发现。 蛹虫草豹寄圭不十分专一，多在春季发生于阏叶林或混交林地上或树皮缝内的鳞 翅目蛹上。也有发现感染鞘翅目和双翅目等昆虫的蛹、茧、成虫或幼虫体乜1 。 l 蛹虫草的化学成分及其功能 。 蛹虫草的化学成分 蛹虫革含有虫荜菌素拍“1 ，也称虫革素，化学结构为3 一脱氧腺营，是一种 具有抗生作用或抑制细胞分裂作用的与核酸有关的物质。含有的虫草多糖随和 虫革酸( 也称甘露酵) h 3 是能提高人体免疫机能的生物活性物质，其他主要成分 如氨基酸、有机酸、糖类、生物碱、甾醇及酚类等，与冬虫夏革基本相似，但蛋 皇质、虫革素、维生素、腺嘌呤的含量蛹虫草明显高于天然冬虫夏草溆轨埘，丽 且蛹虫草还含有3 0 多种人体所需的微量元素，其中p 的含量是冬虫夏革的3 5 倍，z n 、c u 、f e 的含量是2 8 种补益药平均值的1 8 、2 1 和8 8 倍，s e 的含 量与黄芪的含量相当阳一“幢1 。另外，蛹虫革还含有超氧化物岐化酶( s o d ) 等生物 活性物质。因此，国内外的科学界对虫革的选育与栽培都有浓厚的兴趣。 1 2 蛹虫草的药理作用 蛹虫草“性平、味甘、益肺肾、补精髓、止血化痰 “扪，能治疗肺结核等 病；它可作为强壮剂、镇静荆，用于虚劳病后虚弱症，脯结核吐血，老人衰弱的 畸形咳喘、盗汗、豳汗、贫血等症。其虫草素能干扰r n a 、d n a 的合成，对蚕蛹 虫草进行药化药理表理分析测定，表臻人工培育的蚕蛹虫草不仅无毒蔼虽具有明 显的镇静、抗疲劳、抗肿癌、抑制癌细胞及雄性激素作用，可增强机体免疫力等 功能。总的来看，虫革的具体药理作用如下： 3 1 2 1 虫草对免疫系统的增强作用 虫草及虫草菌丝制剂能明显提高机体的免疫功能“射，可使肝、脾增大，胸腺 缩小，能促进肝枯否氏细胞吞噬功能增强及吞噬细胞增殖。从虫革中提取的虫草 多糖，对网状内皮系统及腹腔巨噬细胞有明显的激活作用，能促进淋巴细胞的转 化。但是，虫草多糖的免疫作用与分子大小有关n 司，分予量下降，分支减少，对 巨噬细胞吞噬功能的促进作用亦有下降趋势。研究表明，虫草多糖能促进脾脏 d n a 的合成，加速脾细胞的分裂与增殖，从而促进单细胞的吞噬功能n 刨。 1 2 2 虫草的抗肿瘤作用 虫革真菌培养液中含有虫革素，体内外试验n 铂证明其能抑制小鼠肿瘤细胞系 的核酸合成，即能起到抑制肿瘤细胞m r n a 的作用。试验证明，从虫草中提取的 虫草多糖与虫草水测抗癌作用相似，对s 1 8 0 抑制率为2 8 3 0 ，虫草皮下注射 抑制率为3 0 4 0 ，腹腔注射抑制率为4 3 ，但出现毒性反应。虫草能增强环磷 酰胺的抗癌作用，虫草水剂还可增强6 巯基嗓呤的抗癌作用。虫草水提物抑癯 率为6 7 ，虫草菌丝水提物抑瘤率为5 9 6 6 。关于虫革抗肿瘤的机理，多数学 者认为，虫革中含有大量的哪露酵及多糖类物质，两此类物质是一种非特异 性免疫增强及调节剂，它可激活机体的免疫活性细胞，从而攻击靶细胞，发挥其 抗肿瘤作用。另终，通过抑制核酸、蛋自质的合成或葡萄糖跨膜转运，可直接抑 制肿瘤细胞的生长，而且虫革多糖能促进免疫细胞的增殖、分泌，增强免疫细胞 的功能，通过宿主介导而发挥抗肿瘤作用n 钔。 1 2 3 虫草的镇静作用 虫草和虫草菌丝均能减少小鼠自发活动，具有较强的镇静作用。青海虫草n 们 具有镇静、抗烟碱，明显增强戊巴比妥钠对中枢神经的镇静作用，具有催眠效果。 虫草蓥醇提物5 2 0 9 k g 皮下注射可对抗烟碱引起的小鼠强直性惊厥，减少死亡 率。 2 4 虫荤的广谱抗菌性 程显好啪等对冬虫夏革菌丝体及发酵液中的抗菌活性物质进行了定性测定 及初步分离，发现蔼丝体及发酵液对细菌有广谱抗性，对原核生物中的革兰氏阴 性及阳性菌、对芽孢菌和非芽孢菌，对放线菌种的链霉菌都可以拮抗，对酵母及 丝状真菌没有抗性，对枯草杆菌有掷毽作用。同时还发现对须疮癣菌、石膏样小 4 花胞菌、羊毛状小芽孢菌、絮状素皮瘤菌、肺炎球菌、链球菌、鼻疽杆菌、猪出 血性败血症杆菌等有不同程度的抑菌作用，但对金黄色葡萄球菌及溶血性链球菌 无抑制作用。此外，虫草还能对由二甲苯诱发小鼠耳部炎症、蛋清诱发大鼠足趾 纾炎症有抗炎作用心。 1 2 5 虫草对心脑血管的作用 虫草醇提物可明显对抗乌头碱和氯化钡引起的麻醉大鼠心律失常，能提高豚 鼠心脏哇巴因中毒的耐受量，能使麻醉大鼠和豚鼠心律减慢，并能降低离体豚鼠 心肌收缩力。虫草茵丝提取物还具有明显增加麻醉犬心输出量，冠脉血流量，增 强心脑供血，降低冠脉、脑及外围血管阻力的作用。楼雅卿乜2 1 等用人工虫草菌丝 体醇提取物和发酵液进行了麻醉兔和大鼠及离体兔心房试验。证明其具有负性频 率作用，能明显降低小鼠异丙肾上腺素引起的耗氧量增加，能提高小鼠常压心肌 耐缺氧能力，对垂体后叶素引起的兔急性心肌缺氧及甲状腺素加去甲肾上腺素引 起的大鼠应激性心肌梗塞有一定的保护作用；具有一定的抗心率失常作用；能够 增加心脑供血量；明显对抗胶元和a d p 钠盐诱发的兔血小板聚集作用。 1 2 6 虫草对肾脏的作用 虫草能防止肾上腺和胸腺萎缩，使去势雄性小鼠精囊腺和包皮腺增重，使正 常雄性幼鼠包皮腺、睾丸肾上腺和体重增强，使正常雌性幼鼠子宫、肾上腺和体 重增强，提示雄激素样作用，使小鼠血浆皮质醇和醛固酮增多船3 1 。能改善细胞免 疫功能不全的进展，减轻肾毒损害，并促进细胞修复，对庆大霉素、卡那霉素造 成的肾功能衰竭有明显的保护作用，减轻肾小管的损伤，其机制可能是保护或减 轻肾小管溶酶体对肾小管毒性损伤，保护细胞膜a t p 酶，减少细胞脂质氧化，并 促进肾小管上皮细胞d n a 、r n a 的合成n 引。 1 2 7 虫草对呼吸系统的作用 虫草具有镇咳、松弛气管、祛痰( 强度超过桔梗) ，对肾上腺素引起的小鼠急 性肺水肿有保护作用，对离体豚鼠支气管有显著的收缩和扩张作用。对乙酰胆碱 诱发豚鼠哮喘，虫草和虫草菌丝l d 翮1 2 0 的量，均可明显增大引喘潜伏期差值， 表明有平喘作用；l d 翮1 2 0 的量可协同氨茶碱平喘作用，能使支气管平滑肌松驰 痰作用心 。 1 2 8 虫草的降血糖作用 人工虫革菌丝的水提取物以5 0 0 搬g k g 的裁量给正常小鼠翻服，经过3 6 小 时后发现其血糖和对照组相比有一定的下降，而且降糖作用可持续到2 4 小时； 如果用虫革多糖水提取物对正常小鼠进行腹腔注射，血糖则会显著的下降，同时 血清中胰岛素无明显的变化瞳“2 副。此外虫革提取物能降低胆固醇和甘油三酯含 量。 1 2 9 虫草对肝脏的作用 虫草能提高鼠肝匀浆中超氧化物歧化酶( s ) 酶含量，抑制脂质过氧化物 ( l p 0 ) 的生成，有护肝作用，阻止肝纤维化船刚。 1 2 1 0 虫草对代谢系统和内分泌系统的作用 虫草能明显促进大鼠红细胞糖酵解生成a t p ，增加能量生成量；可增高血浆 皮质醇和肾上腺胆圆醇含量，使肾上腺增重；能增强肾上腺皮质功能，促进脾脏 r n a 、d n a 和蛋白质的生物合成n 钔。 2 11 虫草的延缓衰老作用 。 李连德嘲对虫革发酵液提取的1 4 种虫草进行生物活性试验，果蝇抗衰老试 验表现：不同来源的虫草多糖对果蝇有不同程度的延缓衰老作用，有的效果很好， 而且随纯度增大抗性提高。 1 2 2 盘革的抗放作用 虫草多糖能选择性地增加脾脏营养性血流量，药理实验表明，虫草多糖能使 脾脏弱显增重，脾中浆细胞赣显增多，具有一定的抗放作用，并能对抗可的松及 环磷酰胺所致的脾脏及白细胞下降蝴1 。 1 2 谨其他作用 除以上功能外，虫草多糖还具有解毒、抗疲劳、抗缺氧、抗炎、抗流涎和多 种保护作用嘲。 2 液体培养的国内外动态及趋势 液体培养是指仿自然界把食药用菌所需要的糖类、有机和无机氮素化合物、 无机盐和一些微量元素等即食药用菌在生育过程中的必要营养物质混合在水溶 液中，通气供氧进行菌丝大量培养繁殖。液体培养根据其所用的培养容器及供氧 方式，可分为摇瓶振荡培养、浅盘静止培养、发酵罐深层培养和发酵罐密闭气培 6 养等呻1 。液体培养属于生物工程内容之一。据资源报道，最早的是1 9 4 8 年美国 的h h u m f e l d 等对蘑菇进行的深层发酵研究。1 9 5 8 年j s z u e c s 第一个用发酵 罐来培养羊肚菌，食用菌的培植开始从农业生产跨进了工业生产的领域口。国内 较早的报道是1 9 6 0 年陈美聿等人进行的香菇深层发酵研究。此后有食药用菌深 层发酵技术的扩大试验的报道口副。1 9 7 9 年杨庆尧开始研究香菇等的液体培养， 并研究了液体培养基的粘度与菌球的关系。8 0 年代后，国内外纷纷开展了这一 技术的研究引，食药用菌的液体培养之所以越来越受到人们重视，是由于该技术 比传统的固体发酵生产方法有明显的优越性。 第一，菌丝生长速度快，菌丝体产量高。在液体培养中，液体培养基的营养 成分分布均匀，利于菌类营养体充分接触和吸收。菌丝细胞能在反应器内处于最 适温度、酸碱度、氧气和碳氮比等条件下生长，呼吸作用所产生的代谢废气又能 及时排放，因此新陈代谢旺盛，菌丝生长分裂迅速，能在短时间内产生大量的菌 丝体。 第二，提高食药用菌代谢产物的产量。食药用菌菌体发酵的代谢产物可以分 为初级代谢产物( 如氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、类脂、多糖类、有机酸类 等) 和次级代谢产物( 如抗菌素、生物碱、色素、植物生长因子等) 两大类。这两 类代谢产物在营养与医疗上都具有重要作用。例如，食药用菌多糖类无任何副作 用，可以作为一种高效低毒药物。如果从食药用茵子实体中提取代谢产物，不仅 劳动量大，耗时多，而且产量低。若改用液体培养，就能够克服上述缺点。 第三，利用液体培养制备液体菌种时能有效减少污染。液体菌种接入固体培 养料时，具有流动快，易分散，萌发快，发菌点多等特点，使袋栽食用菌接种污 染得到较有效控制。 第四，便于工业化生产。食药用菌液体培养技术的发展，使得食药用菌的生 产实现了工业化。在生产上主要是利用发酵工程方法获得菌丝体所产生的代谢产 物。液体培养之所以能够使食药用菌培养工业化，主要是因为其理化条件易于控 制，便于机械化操作，其生产工艺规范，生产周期短，产品质量稳定，产量高。 另外，一些食药用菌，如冬虫夏草、灵芝、羊肚菌、蜜环菌等难于在人工培养基 上产生子实体。这样可以利用发酵产物作为代用品，部分代替子实体的食药用价 值。还有资料报道汹1 ，深层发酵得到的菌丝体不但具有与子实体相当的营养及药 7 用效果。还可以得到胞外多糖等子实体所不具备的营养保健成分。此外，液体培 养还有利于从发酵液孛提取代谢产物。 3臣的和意义 尽前，困际国内医药保健晶原材料市场需求旺盛。由于生长地理条件的特殊 要求以及严格的寄生特性，使得野生冬虫夏革资源越来越稀缺，导致冬虫夏草的 价格十分昂贵，在国内其价格为2 4 万元公斤，丽在国际市场，虫革素的价格 更高达5 万元竞。露前随着人们对虫革认识领域的不断扩大，对虫蕈的需求也 翳趋扩大，常常出现供不斑求的现象。在星际国内市场，虫草每年有近王o o 亿元 人民币的市场分额，丽仅仅依靠自然采收远远满足不了市场需求，所以人工蛹虫 革及其液体深层发酵制品有着巨大的市场空间。同时，由于蛹虫草既是药用真菌， 又是高档滋补食用菌，不仅具有极高的营养价值，蔫且具有完美的保健功能，在 霉内菜品市场有着惊人的空阕，因此推广蛹虫革的人工种植技术及其相关产品， 也燕我嚣调整农业产业结构，提高农民收入的重要途径。但是在蛹虫萆的人工种 擅栽培中还存在种源退化、“囱脸”现象( 即在北虫革栽培中特有的菌丝不转色 或菌丝转色都徒长两导致不蹬草的现象) 严重、崎形予实体产生较多等因素两导 致其产量较低渊，同时对蛹虫草的栽壤技术并没有进行科学的规范，也影响了蛹 蛊革人工种植的推广。 本课题将全蕊、细致地研究蛹虫革人工栽培的条件，找出栽培蛹虫革的最佳 营养条件、环境因素，为规藏蛹虫革人工栽培技术提供理论基础和实践依据。 食药用真菌的多糖发酵王艺近年来研究较多，对灵芝多糖、海藻多糖等都有 诸多文献参考，国内上世纪8 0 年代开始将液体培养( 发酵) 技术应用予冬虫夏 革，僵蛹虫革的液体培养却鳟有报道，更别说对其进行大规模的工业优生产。 本课题还将全面、细致地研究蛹虫苹的液体培养条件，找出蛹虫孳液体深层 发酵缒最适碳源、氮源、秃枫盐营养以及温度、翊馕等培养条件，为以后的中 试及工鼗纯生产提供比较全面的理论基础和实践依据。 g 第一章蛹虫草人工栽培条件的研究 l 材料与方法 材料 1 1 。1 菌种及英来源 l 号菌种由四| | 农业大学提供。 2 号菌种氐潮北农科院提供 1 。1 2 主要仪器与设备 x y q s 泓6 2 8 型高压蒸汽灭菌锅( 辽宁省丹东霉用五金厂) s w c g b 型超净工作螽( 苏州安泰空气技术公竭) 秘g 3 0 3 4 a 型电热恒温培养箱( 南京实验仪器厂) l o l 忿型干燥箱( 上海实验仪器总厂 l 琵q 型恒温震荡器( 哈尔滨市东联电子技术厂) 2 x z o 5 旋片式高真空泵( 浙江黄岩求精真空泵厂) 8 3 5 5 0 型氨基酸舞动分析仪( 圈本掰立公司 a e 1 型电予天平 ，葡萄糖2 铅，磷酸二氢钾1 5 9 ，硫酸镁2 9 ，蛋骞胨 0 + 5 9 ，牛肉膏l g ，琼脂2 魄，p h 自然，水l o o 渊 9 1 1 3 2 液体种子培养基 马铃薯2 0 0 9 ( 煮汁) ，蔗糖2 0 9 ，无糖奶粉1 0 9 ，磷酸二氢钾1 5 9 ，硫酸镁 2 9 ，p h 自然，水1 0 0 0 “ 1 1 1 3 罐头瓶栽培培养基 大米( 5 0 9 ) + 营养液 营养液：基础营养物质为马铃薯2 0 0 9 ( 煮汁) 、磷酸二氢钾1 5 9 、硫酸镁 2 昏p h 自然、水1 0 0 0 “ 1 2 方法 1 2 1 栽培步骤 1 2 1 1 菌种活化 将斜面培养基制作成短斜面和长斜面两种固体培养基，经灭菌、冷却，接入 保藏的菌种，2 2 恒温培养7 1 0 天。短斜面菌种放入冰箱冷藏保藏，长斜面菌 种待用。 1 2 1 2 菌种扩大培养 用2 5 0 i i d 的三角瓶装1 0 0 i n l 种子培养基，灭菌冷却后接入活化的长斜面菌种 ( 1 支试管菌种接种5 瓶) ，2 2 恒温震荡培养5 天待用。 1 2 1 3 装料与封口 以5 0 0 “罐头瓶为栽培容器，每瓶加5 0 克大米和一定量营养液，用 1 2 c m 1 2 c m o 0 4 c m 的聚丙烯薄膜覆盖瓶口，然后用橡皮筋套住封口。 1 2 1 4 灭菌与接种 1 2 1 灭菌3 0 分钟，冷却到2 5 以下接入扩大菌种，接种量一般为5 m l 瓶。 1 2 1 5 菌丝体培养 将接种后的罐头瓶置于2 呲5 、湿度为5 5 7 0 的环境中绝对避光培养。 l o 1 2 1 6 诱导子实体形成 待菌丝体吃透培养基后移入1 5 2 0 的环境中进行光照培养，要求环境中光 线充足，光线最好是从瓶的顶部射入，当菌丝变为桔红色，在薄膜上扎小孔进行 通气，并要对环境进行喷雾洒水，以保持湿度为7 0 8 5 为宜。 1 2 1 7 采收 待子实体长到5 c m 左右，其顶部出现许多小刺时，表明蛹虫草已经成熟， 即可采收。 1 2 2 种源、营养条件、环境因素对蛹虫草栽培的影响 1 2 2 1 种源对蛹虫草栽培的影响 将两种菌种活化、扩大培养进行栽培，在栽培过程中仔细观察菌丝体的生长 状况、吃透培养基的能力、形成子实体比例及其生长状况以及栽培周期的长短。 1 2 2 2 营养液用量对蛹虫草栽培的影响 将大米与营养液按l ：o 8 ，1 ：1 ，1 ：1 2 ，1 ：1 4 的不同比例进行配合， 在栽培过程中仔细观察茵丝体的生长状况、吃透培养基的能力、形成子实体比例 及其生长状况以及栽培周期的长短。 1 2 2 3 碳源、氮源对蛹虫草栽培的影响 将优质菌种接入不同碳源、氮源配比的培养基中进行栽培，仔细观察菌丝体 的生长状况、吃透培养基的能力、形成子实体比例及其生长状况以及栽培周期的 长短。选用碳源、氮源的情况如下： 碳源：甘露醇，葡萄糖，麦芽糖，可溶性淀粉用量2 氮源：牛肉膏，蛋白胨，硝酸钾，柠檬酸三铵用量0 5 1 2 2 4 温度、湿度对蛹虫草栽培的影响 在栽培过程中，观察不同温度段、湿度段对菌丝体、子实体生长状况的影响。 各温度段、湿度段如下： 温度：1 0 1 5 1 5 2 0 2 0 2 5 2 5 3 0 湿度：4 0 5 5 5 5 7 0 7 0 8 5 8 5 10 0 1 1 1 2 2 5 温差、光照、通气进行交叉分组，诱导促进子实体生长试验 待菌丝体在完全避光条件下吃透培养基后，进行子实体诱导试验，促进子实 体生长。仔细观察形成子实体比例、生长状况及整个栽培周期。 温差：恒温( 1 5 2 0 ) 与温差( 白天置于恒温中栽培，晚上置于自然温度 1 0 1 5 下栽培) 光照：避光与光照( 每天至少光照1 0 个小时，白天自然光照，晚上采用日 光灯进行光照) 通气：密闭与通气( 在覆盖薄膜上钻8 1 0 个1 2 1 1 1 i i l 的小孔用于透气) 1 2 3 蛹虫草氨基酸成分分析与测定啪1 1 2 3 1 样品处理 将蛹虫草的菌丝体和子实体经8 0 恒温干燥箱干燥，然后捣碎研磨制成菌 粉。 1 2 3 2 称样 准确称取3 9 样品，然后放入试管中。 1 2 3 3 水解 在试管内加入6 m o 儿h c l l 肚1 5 m l ，加入新蒸馏的苯酚3 4 滴，再将试管放 入冰箱中冷冻3 5 n 洫，再接到真空泵上抽真空，并充入氮气；再抽真空充氮气， 重复三次后，在充氮气的状态下封口；将已封口的试管放在1 0 0 士1 的恒温干燥 箱内，水解2 2 h 后，取出冷却。 打开试管，将水解液过滤后，用去离子水多次冲洗试管，将水解液全部转移 到5 0 m l 容量瓶内，用去离子水定容，吸取滤液1 n d 子5 1 1 1 l 容量瓶内，用真空干 燥器在4 0 5 0 下干燥，残留物用1 2 m l 去离子水溶解，再干燥，反复进行两次， 最后用1 m l p h 2 2 的缓冲液溶解，供仪器测定用。 1 2 3 4 测定 准确吸取o 2 0 0 m l 混合氨基酸标准液，用p h 2 2 的缓冲液稀释到5 1 1 1 l ，作 为上机测定用的氨基酸标准，用氨基酸自动分析仪以外标法测定样品液的氨基酸 1 2 含量( 送农科院现代化所检测) 。 1 2 4 甘露醇含量测定 按1 9 9 0 年版中华人民共和国药典规定的甘露醇测定方法，采用高碘酸钠、 硫代硫酸钠滴定法测定删。 1 2 5 虫草多糖测定 将1 0 9 子实体( 或菌丝体) 捣碎，于2 0 0 n d 蒸馏水中浸提2 4 h 后过滤，在滤 液中加入等体积无水乙醇，产生的絮状多糖沉淀经收集干燥后用葸酮硫酸加热法 n 0 3 测定虫草多糖含量。 2 结果与分析 2 1 种源对蛹虫草生长的影响 种源受转代、保藏时间的影响较大，具体表现在随着代数的增加，子实体产 生率下降，子实体形成不理想，生长缓慢、周期长。种源的优劣直接影响蛹虫草 的栽培。 表1 1 种源对蛹虫草生长的影响 t a b l e l 1t h ee 毹c to f 斌d s0 n 硼丘c i a lc 帆r o f c d 协c 唧所f ，f 姗括 注：+ k 势弱、零乱+ + 长势茂盛+ + + 长势茂盛、均匀+ + + + 长势茂盛、均匀、壮实 “白脸”现象为菌丝体不转色 “徒长”现象为菌丝体转色但不产生子实体 从表1 1 可以看出：1 号种培植周期长，形成子实体比例低，且子实体状 况不理想( 局部生长，不规则) ，“白脸”“徒长 现象严重。2 号种活性强，产 生子实体高达1 0 0 ，不过子实体状况有所欠缺( 密集、细长、不饱满) ，由于时 问紧张此问题有待继续研究探讨( 以后的试验均以2 号种作为种源) 。1 号种出 现的“白脸徒长”现象，据有关资料“”可进行搔茵处理，刮掉表层菌丝体， 刺激其再次生长，产生子实体。 2 2 营养液用量对蛹虫草生长的影响 将适量的营养液加入到大米中，灭菌后的培养基应松软适口，气味芬芳，用 手一抓，粒粒在手，轻轻一捏，又能紧合成团。如果太湿，菌丝生长后难以吃透， 仅在表层生长，久之离壳、停顿。如果太干，菌丝生长缓慢，瓶内小气候湿度不 够，菌丝纤细脆弱“”。从表1 2 可以看出，大米与营养液的配比以l ：1 2 为 最佳。 表1 2 营养液用量对蛹虫草生长的影响 t a b l e l 2 t h ee 瓤to fd i f f 阳n m e d i 啪v o i 啪eo n 砌c mc u l n | e ro f c 0 咖唧埘l 脚担 津：+ 长势弱、零乱+ + 长势茂盛+ + + 长势茂盛、均匀+ + + + 长势茂盛、均匀、壮实 “白脸”现象为菌丝体不转色 “徒长”现馨为菌丝体转色但不产生予实体 2 3 碳源、氮源对蛹虫草生长的影响 碳源、氮源是蛹虫草生长的必需营养。碳源是其生长的物质和能量基础，蛹 虫草对单糖、双糖、多糖均能利用，但利用程度不同。氮源是细胞生长和生殖生 长所必需的大量的营养物质，是细胞酶和核酸蛋白质等的重要组成部分。所以碳 源、氮源的好坏，直接影响蛹虫草的生长状况“3 “。 根据表1 3 可知，在菌丝体生长状况和培养基吃透时间方面，柠檬酸三铵+ 甘露醇、柠檬酸三铵+ 麦芽糖、硝酸钾+ 葡萄糖、硝酸钾+ 淀粉最适宜蔼丝体生长； 从整个栽培状况来看，对蛹虫草栽培作用较好的配比应属柠檬酸三铵+ 甘嚣醇、 闻紧张此阀题有待继续研究探讨( 以屠的试验均以2 号种作为种源) 。l 号种出 现的“白脸徒长”现象，据有关资料叭1 可进行搔越处理，荆掉表层菡丝体， 索| j 激萁秀次生长，产生子实体。 2 2 营养液用量对蛹虫蕈生长的影晌 将适量的营养液加入到大米中，灭菌后的培养基应松软适豳，气味芬芳，用 手一抓，粒粒在手，轻轻一捏，又能紧合成团。如果太湿，菌丝生长后难以吃透， 仅在表层生长，久之离壳、停顿。如果太干，菌丝生长缓慢，瓶内小气候湿度不 够，菌丝纤细脆弱脚3 。炊表1 2 可以看出，大米与营养液的配院以l ：1 2 为 最佳。 表1 2 营养液耀量对蛹虫革生长的影响 ! 垫堕! ：竺! 坚! 壁壁垒塑垫蟹掣g 唧i u m v o l u m eo na r t i 蠡c i a lc u l 瓴l e ro f 函嘲心弓秽埘潮甜趣 注：+ 故势弱、零飘+ + 长势茂盛+ + + 长势茂壤、均匀+ + + 长势茂盛、均匀、糖实 “由脸”现象为菌丝体不转色 “犍长”现馨必蔼丝体转戆但不产叟子实体 2 3 碳源、氮源对蛹虫草生长的影响 碳源、氮源是蛹虫革生长的必需营养。碳源是其生长的物质和箍量基础，蛹 虫革对单糖、双糖、多糖均能利用，僵利用程度不同。氮源是细胞生长和生殖生 长所必需的大量的营养物质，是细胞酶帮核酸蛋鑫质等的重要组成部分。所以碳 源、氮源的好坏，蛊接影响蛹虫革的生长状况h 3 钔。 根据表1 3 可知，在菌丝体生长状况和培养基吃透时间方面，柠檬酸三铵+ 甘嚣醇、柠檬酸三铵+ 麦芽糖、硝酸钾+ 葡萄糖、硝酸钾+ 淀粉最适宜菌丝体生长； 从整个栽培状况来看，对蛹虫革栽培作用较好的配比应属柠檬酸三铵+ 甘露醇、 1 4 硝酸钾+ 葡萄糖、硝酸钾+ 淀粉等。但从经济角度来考虑，使用甘露醇、葡萄糖会 提高生产成本，降低经济效益，而硝酸钾和淀粉的价格都比较低且便于采购，所 以采用此种配比比较理想。 表1 3 不同碳源、氮源配比对蛹虫草生长的影响 t a 【b l e1 3t h ee a e c to fd i 毹r e n tc a r b o ns o u r c e sa n d i l i 仃o g e ns o u r c e s o nt h es o u r c e s o n 枷f i c i a l 训t i l e ro f c d 吻c 缈朋订f 姗捃 注：+ 长势弱、零乱+ + 长势茂盛+ + + 长势茂盛、均匀+ + + + 长势茂盛、均匀、壮实 2 4 温度、湿度对蛹虫草生长的影响 从表1 4 、表1 5 可以看出温度、湿度对蛹虫草栽培的影响十分明显。菌 丝体在温度2 0 2 5 、相对湿度5 5 7 0 时生长状况最佳，而子实体在温度1 5 2 0 、相对湿度7 0 8 5 时生长状况最理想。当温度低于1 0 时，菌丝体冻伤， 影响子实体的形成及生长溺3 ，此时阿采取摄蔺处理，刮掉表层菌丝体，刺激其荐 次生长，产生予实体。栩对漫度在5 5 以下，培养蒸内部失水予枯，影响螭盎摹 盼栽培；舔温度离予2 5 、湿度大予8 5 时，菌丝体、予实体表面凝结永珠， 形成一种茶色承滴渗透劐培养基海，使菌丝体、予实体腐烂死亡，并发出一股瘸 臭味，这种现象国璐可麓是由子温度嵩、湿度大面导致容易感染其她细藏丽弓| 起 的“。 表1 4 温度对蛹虫草生长灼影确 珏b l e i 4 i 轴拯c t o f d 主蜘搬矬p e r a t 醢r e o n 锄越c 心u e r o f 国哟馏举 m i l 程徽堍 往：+ 妖势弱、零飘+ + 长势茂盛+ + + 长势茂盛、筠匀十+ + 长势茂盛、瀚匀、特实 表l 。5 湿度对蛹虫荤生长的影响 嘞l e l 5 强ee 鬣c to f c l i 翁融e 嫩酶戚纛姆。鼓矗瓶蠡c 磁蒯锄e ro f o 哟雠矽m 溯甜括 浪：十长势猫、襻鬣+ + 诞势茂盛+ + + 长势麓虢、均匀+ + + 十艇势茂盛、均匀、壮实 2 5 温差、光照、通气对蛹虫蕈生长的影响 从表l 。6 可以看出，温蒺、光照、通气对蛹虫草熬影喻对蛹虫辈予实体培 植存在着很大的影响。完全避光培养，不光照，诱导不出子实体，而且光线最好 礞帮射入 a e 1 0 0 型电子天平( 梅特勒托剩多上海公司) 5 2 a 低速离心机( 北京医用离心机厂) + 2 p 4 5 0 摇瓶机( 江苏金坛市医疗仪器厂) p h s 3 e 精密酸度计( 上海雷磁仪器厂) 1 。1 3 培养基 1 。1 3 1 斜面种予培养基 马铃薯2 0 0 9 ( 煮汁) ，葡萄糖2 罐，磷酸二氢钾2 9 ，硫酸镁l g ，蛋自胨o 5 9 ， 牛浅膏l g ，琼脂2 键，蝉皇然，承1 0 畦 1 1 3 2 液体种予培养基 大米粉2 蟾，大豆粉l 豫，磷酸二氢钾l 。靼，硫酸镁2 9 ，蝉逸然，承i 眺l l 1 1 3 3 发酵培养基 大米粉4 0 9 ，大豆粉2 0 9 ，磷酸二氢钾1 5 9 ，硫酸镁2 9 ，p h 自然，水1 0 0 0 m l 1 2 方法 1 2 1 总糖( t s ) 测定 采用苯酚硫酸法h 。 1 2 1 1 配制6 苯酚【5 0 】 准确称取苯酚2 0 0 9 ，加铝片o 2 9 和n a h c 0 3 0 1 9 ，蒸馏，收集1 8 2 馏 分，称取9 9 加水1 0 0 m 1 溶解，转至1 5 0 “容量瓶中定容，盛于棕色瓶在冰箱中 保存，备用。 1 2 1 2 配制葡萄糖液晦“ 精密称取干燥至恒重的葡萄糖l o o m g ，定容至1 0 0 眦。吸取1 0 i n l 再定容至 1 0 0 m l ，得到0 1 m 酌眦的葡萄糖标准溶液。精密吸取葡萄糖标准溶液o 2 m i 、 0 4 m 1 、o 6 m l 、0 8 m l 、1 0 “、1 2 m l 精密加去离子水至2 i i l l ，再加6 苯 酚1 m l 摇匀，迅速加5 m l 浓硫酸冷却至室温，在4 9 0 姗波长处测定吸光度a 值， 并以a 值为纵坐标、溶液中葡萄糖浓度为横坐标绘图，得到标准曲线。 1 2 2 多糖( p s ) 的提取与测定 取一定体积的发酵液在3 0 0 0 r p m 下离心1 0 m i n ，取2 0 r n l 上清液加3 倍体积 的乙醇沉淀1 2 h ，3 0 0 0 印m 下离心1 5 m i n ，沉淀用7 5 的乙醇洗至m o l i s h 陋却反应 阴性，离心，沉淀用6 0 热水充分溶解，离心去沉淀，上清液定容于1 0 0 m l 容 量瓶。按标准曲线制作方法测定多糖的含量。 1 2 3 残糖( s ) 的测定 s = t s p s 1 2 4 发酵液菌丝干重的测定 取发酵液1 0 0 m l ，在3 0 0 0 印m 下离心1 5 m i n ，倾去上清液，菌丝于8 0 烘干 至恒重，然后用电子天平称重。 2 l 1 2 5p h 值的测定 用p h s 一3 c 精密酸度计测定。 1 2 6 培养条件 培养温度为2 4 ，摇床转速为1 8 0 r p m ，装液量为1 0 0 m 抛5 0 m l 三角瓶，培 养1 2 0 h 。 1 2 7 发酵培养基的优化 1 2 7 1 碳源试验 碳源主要是提供微生物生长、合成物质及能量。保证发酵培养基的其他成分 不变，改变培养基中碳源的种类，经过摇瓶发酵后，确定蛹虫草生长的最适碳源。 本试验分别以2 的大米粉、红薯粉、蔗糖、葡萄糖为碳源，以蛹虫草的菌 丝体量和胞外多糖量为指标，确定适宜的碳源。 其中红薯粉经煮沸2 0 l i l i n 后用四层纱布过滤，滤液配培养基；大米粉经煮沸 糊化后，加淀粉酶液化3 0 i 血，然后用四层纱布过滤，滤液配培养基；蔗糖、葡 萄糖直接溶解配培养基。 1 2 7 2 氮源试验 氮源的基本作用是为微生物生长所需的核酸和蛋白质的合成提供原料。保持 发酵培养基中的其他组分不变，改变培养基中的氮源种类，以确定蛹虫草生长的 最适氮源。 本试验分别以1 的大豆粉、麸皮、蛋白胨、硫酸铵为氮源，以蛹虫草的菌 丝体量、胞外多糖量和残糖量为指标，确定适宜的氮源。 其中大豆粉用少量水浸泡一段时间，用组织捣碎机打成浆，加水煮沸2 0 m i n 后用四层纱布过滤，滤液配培养基；麸皮加水煮沸2 0 m i l l 后用四层纱布过滤，滤 液配培养基；蛋白胨、硫酸铵直接溶解配培养基。 1 2 7 3 发酵培养基组成的正交试验 为确定蛹虫草摇瓶发酵培养基的最佳配方，以大米粉、大豆粉、k h 2 p 0 4 、 m g s 0 4 四个因子按l 9 ( 3 4 ) 强加正交表来设计，正交因子和水平表如表2 1 。 表2 。l 最佳配方选择试验的因素和水平表 t 芒出l e 2 1 觚r sl e v e lo f 日1 ee x p 髓o f t h eo p 戗黼a l 戚x t u r e 1 。2 8 蛹虫革发酵工艺的优化 。2 。8 。 接种爨对蛹蛊摹发酵麴影晌 接种是必了在发酵过程中提供生长旺盛、拦辕豹微生物种子接种量的大小对 予发酵周期具有碉显豁影响，为确定最佳酶接种爨，戬2 、4 、6 、8 豹不 同接种爨进行试验。 。2 。8 + 2 装液豢对蛹塞蕈发酵龚奄彰羹舞 在2 5 烈三角瓶中分凳装入s q 越、7 5 鹾、l 粗、1 2 5 斌、l5 0 越酶种子培 养莲，灭蓥蘑接入糖藁薰魏液体种子。 1 。2 8 。3 接种蘸龄对蛹虫革发麟的影睫 在种子臻养过程中，每隔6 小时取样接入发酵培养基中，培养稽闯酶时间， 以确定慧种菌羚对蟋虫革发黪豹影穗。 、 。2 。8 4 起始州值对蛹熹草发酵豹影晌 按稀予培养基配方配制好的培养基霜5 的n a 。 芰或l m & c i 分鄹调节奎 p 麓5 。5 、6 o 、6 5 、7 ，o 、7 5 、8 o 。 。2 8 。5 培养温度对蜗斑蕈发酵豹影睛 不同培养温度对微生物的生长和代谢产物的影成有重要影响，因此本试验确 定培养湿度梵2 2 、2 4 、2 6 c 、2 8 。 1 2 8 6 消沲剂用量对蛹蛊草发酵的影晌 将配制好的发酵培养基分别加入o 、o 1 0 、o 。1 5 、o 。2 0 、o 。2 5 、 q 。3 的菜油。 1 2 。8 ，7 援廉转速对蛹 嫩萆发酵的影响 将接入菌； 申鹣发酵培养蒸分别暨予1 2 钢摊、1 5 0 脚睁、1 8 钧p m 、2 l o 臻m 的摇 床上进行振荡培葵。 。2 ，8 ，8 发酵黠阖对螭斑萆发酵瀚影晌 程其戆繁绺瞅溅融骶铺6 蠢灏糯泼酵液嘲煦凝鲻鞘澎潦瑚魑 。2 。g 菌丝体舞效成努的测定 。2 孽。1 首瓣醇 采阚高碘酸铺、硫代硫酸钠滴定法测定( 阑第一章) 。 。2 。2 臆肉多糖 用蒽酮硫酸加热法测定虫草多糖禽爨( f 阁第章) 。 。2 ：3 懿基黢 震氮基酸爨动分析仪默辨标法测定( 同第一牵) 。 2 结果与分析 2 碳源对蛹蠢草发酵麴影响 融袭2 2 雕歙，以大米粉作为碳源对，螨虫革液体发酵的蔚照产量和多瓣 产薰都最离，藏大米粉来源广泛，价格低廉，遮念徽大艇模工韭化黛产