（食品科学专业论文）嗜酸乳杆菌的分离、鉴定及其在发酵豆乳中生长特性的研究.pdf

浙江工商大学硕士学位论文 嗜酸乳杆菌的分离、鉴定及其在发酵豆乳中 生长特性的研究 摘要 嗜酸乳杆菌是人体肠道内的重要微生物，与人体健康息息相关， 当其达到一定数量时，对维护肠道健康和菌群平衡起着十分重要的作 用，是目前乳酸菌家族中极为重视研究与开发的益生菌之一，被视为 第三代酸乳发酵剂菌种。随着国内外众多学者对嗜酸乳杆菌的生物学 特性、功能性及应用等方面研究的不断深入，人们越来越认识到嗜酸 乳杆菌的益生特性，含有嗜酸乳杆菌的产品目益丰富，包括酸奶、胶 囊、片剂、粉剂及口服液等，但用嗜酸乳杆菌发酵生产的功能性发酵 豆乳制品尚未见商品化生产，关于嗜酸乳杆菌在豆乳中生长特性的研 究报道甚为罕见。 在我国，豆浆既是一种传统食品，又是一种廉价易获取的资源， 但由于受到传统习惯的影响，人们一直未能认识到豆浆的益处，加之 豆奶( 浆) 较重的豆腥味，使得很多消费者，尤其是青少年、儿童对 其的接受程度较低。因此，利用现代生物技术，通过乳酸菌的发酵处 理，研制功能性的发酵豆乳饮料具有十分重要的意义，不仅可以解决 豆奶的口感问题，而且可以为牛奶缺乏的地区提供优质价廉的功能性 植物蛋白饮料。 本研究以健康婴儿的新鲜粪便为材料，经分离、纯化和分子生物 学鉴定获得3 株人源性嗜酸乳杆菌菌株，旨在为发酵豆乳提供生长能 i 浙江工商大学硕士学位论文 力旺盛、活菌数高、产酸能力强的发酵菌种，并探索供试菌株在发酵 豆乳中的生长特性，为发酵豆乳的工业化生产提供一定的理论基础和 科学依据。 通过比较3 株嗜酸乳杆菌的生物学特性，包括生长曲线、产酸能 力、耐胃酸能力、耐胆盐性、抗药性及抑菌能力，选择生物学性状较 优的l a 一5 菌株作为供试菌株，其在m r s 液体培养基中3 7 c 培养 1 4 h ，活菌数可达4 3 3 1 0 1 2 c f u m l ；具有较强的耐酸和抗胆盐特性； 对氯霉素高度敏感，对青霉素g 、利福平和四环素中毒敏感，对卡那 霉素不敏感；在体外对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和柠檬 色葡萄球菌具有较强的拮抗作用。 为研制适合发酵豆乳的嗜酸乳杆菌发酵剂，本研究以豆乳为基础 探索嗜酸乳杆菌l a 一5 的增菌培养基，得到最佳增菌培养基为：l o 豆浆，1 葡萄糖，8 西红柿汁，5 玉米浸出汁，2 胡萝i - 汁，2 平菇浸出汁。嗜酸乳杆菌l a 一5 在增菌培养基中培养时，增菌培养 终止时间为1 0 h ，此时活菌数可达1 7 2 1 0 9 d u m l 。 嗜酸乳杆菌l a 一5 经增菌培养基活化后，按8 接种量接种于发 酵豆乳基质中，3 70 c 恒温、静置发酵2 0 h 后达发酵终点，此时发酵豆 乳p h = 3 5 7 ，滴定酸度为8 5 2 2 。t ，活菌数为3 6 2 1 0 8 c f u m l 。将 发酵豆乳产品转移至4 0 c 条件下冷藏3 0 天，p h 降至3 4 5 ，滴定酸度 升高到9 4 2 9 。t ，嗜酸乳杆菌活菌数减少至7 0 4 1 0 6 c f u ，m l 。 关键词：嗜酸乳杆菌；分子鉴定：筛选：增菌培养基：发酵豆乳； 生长特性 浙江工商大学硕士学位论文 s t u d i e so ni s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u sa n di t sg r o w t h c h a r a c t e r i s t i c si nf e r m e n t e ds o y m i l k a b s t r a c t l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u si sa ni m p o r t a n tm i c r o o r g a n i s mi n h u m a ni n t e s t i n a lt r a c t w h e nt h e r ee x i s tc e r t a i nn u m b e ro f l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u si ni n t e s t i n a lt r a c t ，t h e yp l a ya ni m p o r t a n t r o l et om a i n t a i n h e a l t h y i n t e s t i n a lf l o r ab a l a n c e l a c t o b a c i l l u s a c i d o p h i l u si so n eo fp r o b i o t i c sw h i c hc u r r e n ts c h o l a ra t t a c h e sg r e a t i m p o r t a n c et or e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n t i ti sc o n s i d e r e da st h et h i r d g e n e r a t i o ns t a r t e rf o rf e r m e n t e dm i l k w i t hm o r ea n dm o r ei n d e p t h s t u d i e so nt h eb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，f u n c t i o n a l i t ya n da p p l i c a t i o n o fl a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u sb ym a n ys c h o l a r sa th o m ea n da b r o a d ， p e o p l e h a v e b e e n g r o w i n g a w a r e n e s st ot h i s m i c r o o r g a n i s m s p r e b i o t i c c h a r a c t e r i s t i c s t h e r eh a v eb e e n i n c r e a s i n gp r o d u c t s c o n t a i n i n gl a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ，s u c ha sy o g h u r t ，c a p s u l e ，t r o c h e ， p o w d e ra n d o r a ll i q u i d h o w e v e r , f u n c t i o n a lf e r m e n t e ds o y m i l k t h r o u g ht h ef e r m e n t a t i o no fl a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u sh a v e n tb e e n c o m m e r c i a lp r o d u c e da n dt h e r ea r ef e wr e p o r t so nt h e g r o w t h c h a r a c t e r i s t i c so fl a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u si nf e r m e n t e ds o y m i l k i i i i nc h i n a ，s o y m i l ki sat r a d i t i o n a lf o o d ，b u ta l s oak i n do fc h e a p a n de a s ya c c e s s i b l er e s o u r c e b u td u et ot h ei m p a c to ft h et r a d i t i o n a l h a b i t s ，p e o p l eh a v eb e e nu n a b l et or e c o g n i z et h eb e n e f i t so fs o y m i l k i na d d i t i o n ，s o y m i l kh a sh e a v i e rb e a n yf l a v o r , s ot h a tm a n yc o n s u m e r s ， e s p e c i a l l yt e e n a g e r s a n dc h i l d r e nh a v el o wl e v e lo fa c c e p t a n c e t h e r e f o r e ，t h eu s eo fm o d e mb i o l o g i c a lt e c h n i q u e ，i t i so fg r e a t s i g n i f i c a n c e t o d e v e l o p f u n c t i o n a lf e r m e n t e ds o y m i l kb e v e r a g e s t h r o u g ht h ef e r m e n t a t i o no fl a c t i ca c i db a c t e r i a t h e s eb e v e r a g e sc a n n o to n l ys o l v et h ep r o b l e mo ft a s t e ，b u ta l s op r o v i d eh i g hq u a l i t ya n d i n e x p e n s i v ef u n c t i o n a lv e g e t a b l ep r o t e i nb e v e r a g e f o rt h e r e g i o n s w h i c ha r es h o r to fm i l k i nt h i ss t u d y , l a c t o b a c i l l u ss t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o m f r e s h i n f a n tf e c e s t h e r ew e r et h r e el a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s s t r a i n s t h r o u g hm o l e c u l a r l yb i o l o g i c a li d e n t i f i c a t i o n t h i ss t u d y i sa i mt o p r o v i d el a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s s t r a i n sw i t hs t r o n gg r o w t hc a p a c i t y ， h i g ha c t i v en u m b e ra n ds t r o n ga c i d p r o d u c i n ga b i l i t y f o rf e r m e n t e d s o y m i l k b e s i d e s ，w ee x p l o r e d t h e g r o w t h c h a r a c t e r i s t i c so f l a c t o b a ci l l u s a ci d o p hi l u s i nf e r m e n t e d s o y m il k ，p r o v i d i n g a t h e o r e t i c a lb a s i sa n das c i e n t i f i cb a s i sf o ri n d u s t r i a l i z e dp r o d u c t i o no f f e r m e n t e ds o y m i l k b yc o m p a r i n gt h eb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h et h r e es t r a i n s ， i n c l u d i n g t h e g r o w t hc u r v e ，a c i d p r o d u c i n g a b i l i t y ，g a s t r i c i v 浙江工商大学硕士学位论文 a c i d - r e s i s t a n t c a p a c i t y , b i l e - r e s i s t a n tc a p a c i t y , a n t i b i o t i cr e s i s t a n c e a n da n t i b a c t e r i a lc a p a c i t y ，w ec h o o s e dl a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u sl a 一5 a st e s t e ds t r a i n t h ea c t i v en u m b e ro fl a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u sl a 一5 c a nr e a c ht o4 3 3x10 1 2 c f u m la f t e rc u l t i v a t e di nm r sl i q u i dm e d i u m f o r1 4h o u r s l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u sl a 一5h a ss t r o n ga c i d r e s i s t a n t a n db i l e r e s i s t a n t c a p a c i t y t h e s t r a i ni s h i g h l y s e n s i t i v et o c h l o r a m p h e n i c o l ，p e n i c i l l i ng ，r i f a m p i c i na n da c h e o m y c i n ，b u ti s t s e n s i t i v et ok a n a m y c i n i nv i t r o ，t h em e t a b o l i t e so fl a c t o b a c i l l u s a c i d o p h i l u sl a 一5a r eo b v i o u sa n t a g o n i s mo ne c o l i ，s a l m o n e l l aa n d s t a p h y l o c o c c u sa u r e u sa n ds t a p h y l o c o c c u sc i t r e u s i no r d e rt od e v e l o pal a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u ss t a r t e rs u i t a b l e f o rp r o d u c i n gf e r m e n t e ds o y m i l k ，w es t u d i e do nt h eg r o w t hp r o m o t i n g c u l t u r eo fl a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u sl a 一5b a s e do ns o y m i l k t h e o p t i m a lg r o w t hp r o m o t i n gc u l t u r ec o m p o s i t i o nw a sa sf o l l o w i n g ：1 0 s o y m i l k ，1 g l u c o s e ，8 t o m o t oj u i c e ，5 c o r ne x t r a c tj u i c e ，2 c a r r o tj u i c e ，2 j u i c eo fp l e r o t u ss a p i d u s a c c o r d i n gt ot h eg r o w t h c u r v eo fl a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u sl a 一5i nt h eo p t i m a lg r o w t h p r o m o t i n gc u l t u r e ，t h et e r m i n a lt i m ew a sa t10h o u r s l a c t o b a c i l l u s a c i d o p h i l u sl a 一5g o tt o1 7 2x l0 9 c f u m li nt h ec u l t u r ef o r10h o u r s a t3 7 a f t e ra c t i v a t e di nt h eg r o w t hp r o m o t i n gc u l t u r ef o rt h r e et i m e s ， l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u sl a 一5w a si n o c u l a t e di ns o y m i l kw i t h8 v 浙江工商大学硕士学位论文 i n o c u l u ms i z e a f t e rf e r m e n t e df o r2 0h o u r sa t37 。c ，s o y m i l kr e a c h e d t ot h ef e r m e n t e de n d p o i n t ，a n dt h ep a r a m e t e r so ff e r m e n t e ds o y m i l k w e r ea sf o l l o w i n g ：p h3 5 7 ，t i t r a t a b l ea c i d i t y8 5 2 2 。t ，t h ec e l l s r e a c h e dt o3 6 2 10 8 c f u m l t h ef i n i s h e dp r o d u c tw a ss t o r e df o r30 d a y sa t4 c ，a sar e s u l t ，t h ep a r a m e t e r so ff e r m e n t e ds o y m i l kw e r ea s f o l l o w i n g ：p h3 4 5 ，t i t r a t i o na c i d i t y9 4 2 9 。t t h ec e l l sr e a c h e dt o7 0 4 10 6 c f u m l k e y w o r d s l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ；m o l e c u l a r l yb i o l o g i c a l i d e n t i f i c a t i o n ；s c r e e n i n g ；g r o w t hp r o m o t i n gc u l t u r e ；f e r m e n t e d s o y m i l k ；g r o w t hc h a r a c t e r i s t i c s v i 浙江工商大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得浙江工商大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的 材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 签名短 日期厮肜g 日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解浙江工商大学有关保留、使用学位论文 的规定：浙江工商大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的 复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内 容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名夕经导师签名： 日期：秒犷瑚7 日 浙江1 商大学硬学位论文 第1 章引言 11 嗜酸乳杆菌的研究进展 11 1 嗜酸乳杆菌的生物学特性 嗜酸乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h e u s ) 属乳杆菌科中的乳杆菌属，为革兰氏 阳性杆菌，两端圆，通常为06 09 i56 微米以单个、成双和短链出现， 不运动，无鞭毛，无特有的色素。菌落通常粗糙，深层菌落呈放射或分枝形的不 规则形状i “，如图l l 和图卜2 所示。 f _ | 澎 圈卜l 嗜酸乳杆菌在l b s 琼脂培养基上的茼落形态 f i g 卜1c o l o n i a l m o t d h o l o g y o f l a c t o b a c i l l u s a c i d o p h i l u s 蛐l b sa g a r 图卜2 嗜酸乳杆菌的革兰氏染色镜检和电镜扫描结果 f i g l 一2t h er e s u l t so f g r a ms t a i n i n g m i c r o s c o p i ca n ds c a n i n ge l e c t r o n m i c r o s c o p e o f l a c t o b a c i h u sa c i d o p h h u s 嗜酸乳杆菌是兼性厌氧菌，无氧或较低氧分压环境下在固态基赝表面生长， 5 1 0 二氧化碳可促进嗜酸乳杆菌的增殖i “。最适生长温度为3 5 3 8 ，2 0 以下一股小生长，通常在4 5 u 能牛长，耐热性差，最适p h 为55 60 ，耐酸 性强，能在其它乳酸苗小能生长的环境中生k 繁殖。 浙江工商大学硕士学位论文 嗜酸乳杆菌细胞壁肽聚糖为l - 赖氨酸- d - 天冬氨酸盐型，通常缺乏磷壁酸。 细胞中不含任何可鉴别的己糖和戊糖1 3 1 。菌株在血清上表现不同，类群反应未得 到证实。菌株d n a 的g + c 含量为3 6 7 0 7 f 。嗜酸乳杆菌耐酸、耐渗透压、 耐胆汁盐、同化胆固醇以及水解蛋白等生物学特性对其在发酵食品中的应用起着 决定性的作用。 1 1 2 嗜酸乳杆菌在自然界的分布 嗜酸乳杆菌广泛存在于人及一些动物的肠道中，是一种有益的微生物菌群， 对维持胃肠道的生理功能有重要作用。嗜酸乳杆菌具有很强的宿主特异性，从某 一类动物体内分离到的菌株只对该种动物的消化道具有较强的粘附性，而对其它 种类的动物则表现低粘附性h 引。 1 1 2 1 嗜酸乳杆菌在宿主胃中的分布 一般来说，宿主的胃内p h 小于3 0 ，由于相对很少细菌耐酸，因而抑制了 细菌在胃中的存在。s a v a g e ( 1 9 7 7 ) 从人的胃液中分离出许多菌株，发现主要菌 种由嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌组成。t a n n o c k ( 1 9 9 0 ) 报道了利用自动荚膜技术， 同样证明小肠中的乳杆菌由嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌组成。 1 1 2 2 嗜酸乳杆菌在宿主大肠中的分布 大肠是微生物主要的息居场所。g o r b a c h ( 1 9 7 1 ) 认为，大肠中的微生物菌 群与粪便中微生物菌群是相同的，粪便中微生物菌群主要是厌氧菌1 6 1 。b e n n o 等 ( 1 9 8 9 ) 对2 0 个健康日本人的粪便进行调查，数学统计表明，在被鉴定的1 1 3 种细菌中，嗜酸乳杆菌的数目排列在第2 0 位，其含量占0 4 【7 1 。o o l d i n 等( 1 9 9 2 ) 的研究表明，粪便中乳杆菌通常每克含1 0 4 1 0 9 个，而且主要由嗜酸乳杆菌和发 酵乳杆菌组成嘲。所有这些研究结果都证明，在人体肠道中，嗜酸乳杆菌是主要 菌群之一。 1 1 2 3 嗜酸乳杆菌在人体阴道中的分布 r e d o n d o l o p e z 等( 1 9 9 0 ) 提出，人类阴道菌群中主要菌种是嗜酸乳杆菌( 每 毫升阴道分泌液1 0 5 1 0 7 个) 、罗依氏乳杆菌、干酪乳杆菌亚种和鼠李糖乳杆菌。 阴道中存在的基质糖原可以被利用分解成乳酸，因此阴道中p h 低于4 5 ，低p h 对阻止有害菌的侵入从而保护阴道是非常重要的 9 1 。 2 浙江工商大学硕士学位论文 1 1 3 嗜酸乳杆菌的营养要求 嗜酸乳杆菌营养要求复杂，需要氨基酸、肽、核酸衍生物、盐类脂肪酸或脂 肪酸脂类和可发酵的碳水化合物，能利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖等一些单糖 和寡糖进行同型发酵，产生d l - - 孚l 酸，但因为它不含有分解大分子碳水化合物的 酶系，导致它不能分解淀粉等大分子碳水化合物；蛋白质分解力弱，只能利用 些蛋白质的水解产物。 在培养基中添加降低氧化还原电势的物质( 如抗坏血酸、半胱氨酸等) 以及生 长促进物质，如番茄汁、玉米浸出物、胡萝卜汁、平菇浸出汁、低聚糖等，可促 进嗜酸乳杆菌的生长【| o 川。罗珍兰( 1 9 9 7 ) 研究认为，以大豆为原料的发酵液中 嗜酸乳杆菌活菌数比以玉米和番茄汁为原料的发酵液中的嗜酸乳杆菌活菌数高 一个数量级，这证实大豆低聚糖可以促进该菌增殖f 1 2 1 。嗜酸乳杆菌要求的矿物质， 如磷、硫、钙、钠、钾、镁、锰、铁、锌等，一部分可从有机营养物质中获得， 有的则需要以无机盐的方式提供，而微量元素一般情况下不需要专门供给“3 1 。 对于嗜酸乳杆菌来说，其生长必需的氨基酸有精氨酸、谷氨酸、亮氨酸，异 亮氨酸、色氨酸、酪氨酸和撷氨酸。一些b 族维生素及叶酸也是嗜酸乳杆菌的 生长因子，表1 - 1 表明嗜酸乳杆菌对维生素的需求( 2 l 。 表1 - 1 嗜酸乳杆菌的维生素需求 t a b 1 1t h en e c e s s a r yv i t a m i n eo f l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s 注：e 为必需维生素、n 为非必需维生素、s 为刺激因子 1 1 4 嗜酸乳杆菌的分类 嗜酸乳杆菌分类目前还没有令人满意的方法。g a s s e r ( 1 9 7 0 ) 提出根据细胞 和菌落的形态以及生化实验( 例如分解糖类产酸特征) 对嗜酸乳杆菌分类【1 4 l 。但 p o t 认为这种分类方法不完全准确，因为菌株随机出现的特征有时是相互冲突的， 浙江工商大学硕士学位论文 其不能真正反映出种和株之间的系统发育关系f 1 5 】。近几十年来，一些基因和化学 方法己经被用于嗜酸乳杆菌的分类和鉴定上，例如质粒含量分析、十二烷基硫酸 钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳测定细胞蛋白质和可溶性蛋白质含量，r r n a 序列、限 制性内切酶指纹以及d n a - d n a 杂交等。m a n a e h i n i ( 1 9 8 3 ) 等还提出采用染色 体分类法，这种分类法被认为比细胞遗传分析法有更高的准确度和重现性，但是 在电泳图中，当超过1 0 0 个电泳带时鉴定是比较困难的【1 6 1 。r o d t o n g ( 1 9 9 3 ) 采 用核分法即将染色体、指纹杂交技术同r r n a 探针技术结合起来，对其基因中限 制性片段长度多态性的不同对嗜酸乳杆菌进行分类1 1 7 1 。 除严格意义的嗜酸乳杆菌( l a c i d o p h i l u s ) 外，嗜酸乳杆菌还包括另外5 个 种，从对这6 种乳杆菌描述的时间顺序来看，只有严格意义的嗜酸乳杆菌为人所 知的历史比较悠久。该种最先由m o r o 命名为“b a c i l l u sa c i d o p l u s h i ，后来h a n s e n 和m o q u o t 将其更名为“l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s 。卷曲乳杆菌( l ，c r i s p a t u s ) 在 1 9 5 3 年提出，而其余的4 个种包括格氏乳杆菌( l g a s s e r i ) ，约氏乳杆菌 ( l j o h n s o n i i ) 、食淀粉乳杆菌( 三a m y l o v o r o u s ) 和鸡乳杆菌( l g a l l i n a r u m ) 都只是 在前十几年才被描述。实际上，很多文献中所用的嗜酸乳杆菌，可能其中大部分 都不是严格意义的a c i d o p h i l u s 1 8 】。 1 1 5 嗜酸乳杆菌的益生特性 嗜酸乳杆菌是人体肠道中的重要微生物，与人体健康息息相关，当其达到一 定数量时，可以起到健康促进效果【1 。嗜酸乳杆菌在肠道中发酵，产生乳酸、 过氧化氢及抗菌素，具有整肠作用，对防治和治疗慢性便秘、腹泻等肠道疾病有 一定疗效；研究者还发现嗜酸乳杆菌具有降低血液中胆固醇含量和抑制某些癌细 胞生长的作用【2 2 】。嗜酸乳杆菌在胃肠道中的作用和功能主要如下： 1 1 5 1 营养作用 乳酸菌发酵后产生的乳酸，可提高胃内食物的预消化，提高钙、磷、铁的利 用率和维生素d 的吸收；乳糖分解产生的半乳糖，是构成脑神经系统中脑苷脂 的成分，与婴幼儿出生后的生长有密切的关系；同时产生的大量维生素b 群能 促进人体神经细胞的发育。 1 1 5 2 消除乳糖不耐症 许多人消化乳糖的能力不足，是由于肠道中乳糖酶的活性不足，这一问题在 4 浙江工商大学硕士学位论文 亚洲和非洲人群中普遍存在，欧美人群中也有相当的比例，这一现象称为乳糖不 耐症【2 3 i 。嗜酸乳杆菌能分泌d 一半乳糖苷酶，促进人体对奶质中乳糖的吸收，从 而缓解乳糖不耐症。g o l d i n 等的研究认为在小肠中没有被消化的乳糖进入结肠， 结肠中的微生物将其分解为乳酸、气体和其它物质，这导致正常渗透压平衡度被 改变和液体积累进而引起腹涨、痉挛和腹泻，故使许多人不能摄入乳制品，从而 切断了重要的营养素如优质蛋白和钙的来源f 2 4 1 。m o n t e s 等和g i l l i l a n d 等1 9 7 8 年 证实酸奶是很好的外源性乳糖酶的来源，它可以帮助乳糖不耐症患者消化乳糖， 从而达到缓解乳糖不耐症的效果。不同乳制品改善乳糖不耐症的效率取决于总的 微生物乳糖酶活性，且和肠胃乳糖酶活性的保留密切相关1 2 5 2 7 l 。 1 1 5 3 生物屏障作用 嗜酸乳杆菌与肠粘膜上皮细胞相互作用、密切结合构成了生物学屏障，通过 自身及其代谢产物细菌素、有机酸( 主要是乳酸) 等 2 8 , 2 9 j ，使肠道p h 值降低，从 而阻止致病菌在肠道内生长和繁殖；在体外具有抑制沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄 球菌、变形菌、假单胞菌和大肠埃希氏菌属细菌生长的作用【3 0 , 3 1 1 。大量动物实验 证明了乳酸菌在动物体内的抑菌作用，关于体外抑菌试验也有不少报道。赵瑞香、 李元瑞等通过研究嗜酸乳杆菌的抑菌特性也发现其对致病性大肠埃希氏菌、金黄 色葡萄球菌和炭疽杆菌有拮抗性【3 2 1 。嗜酸乳杆菌产生的抑菌活性物质，其抗菌作 用以及潜在的应用价值引起国内外学者的极大关注f 3 3 1 。v i n c e n t ( 1 9 5 9 ) 首次报道 嗜酸乳杆菌产生细菌素l a c t o c i d i l 3 引。之后又发现了细菌l a c t a c i n b ，a c i d o p h i l u c i n a ， a c i d o c i n 8 9 1 2 t 3 5 1 ；h a r r i s 等发现乳酸杆菌可产生细菌素，抑制有害菌的生长与繁 殖【3 6 j ；那淑敏、贾士芳等发现了该菌产生的一种广谱的抗菌肽a p 3 l l 【3 刀。 1 1 5 4 增强机体免疫力 摄入特定的乳杆菌可以增强机体的免疫反应，增强宿主对肠道感染的抗性。 研究认为摄入的益生菌可以激活巨噬细胞，巨噬细胞可破坏机体中的病源微生 物。免疫系统的增强增加了宿主的防御能力，这是益生菌用于保健食品控制肠道 感染的主要理论依据。 嗜酸乳杆菌在幼龄动物免疫力的发展中起重要的作用，特别是针对抗原引起 的保护性反应肠道炎症。w a g n e r 等证明嗜酸乳杆菌n c f m 对免疫缺陷鼠具有诱 导产生抗体和细胞反应的功能1 3 8 i ；t e j a d a s i m o n 等测定了含有嗜酸乳杆菌n c f m 的酸奶对霍乱毒素免疫鼠膜和系统i g g 、i g a 水平的影响，结果表明喂养这种酸 浙江工商大学硕士学位论文 奶的鼠肠道和血清中i g a 和i g g 的水平较高1 3 9 1 ；p e r d i g o n 等研究证明干酪乳杆菌 能促进肠道分泌免疫球蛋白i g a ，增强宿主肠粘膜的肠道粘膜反应【4 0 】。l e s s a r d 和b r i s s o n 给断奶仔猪饲喂乳杆菌后，接种传染性胃肠炎病毒疫苗，试验组血清 中的特异性抗体i g g 水平显著高于对照组【4 l 】。a l v a r e z 等报道乳酸菌能增强消化 道和呼吸道粘膜系统产生i g a ，进一步研究证实，乳酸菌及其代谢产物刺激动物 机体的免疫系统，其作用与免疫佐剂相似，能诱导动物一些与免疫有关的细胞产 生白细胞介素、促进细胞分裂素、干扰素、肿瘤坏死因子等【4 2 , - - 4 4 1 。 1 1 5 5 抗癌作用 嗜酸乳杆菌抗癌作用是由于肠道菌群的改善，抑制了致癌物质的产生。一般 认为，菌体代谢产物活化了免疫功能，抑制了癌细胞的增殖。g o l d i n 等研究证明， 腐败性细菌作用于食物成分和胆汁酸盐类，能生成亚硝基化合物、胆固醇及胆汁 酸的代谢物、氨基酸代谢物( 酚类、吲哚、硫化氢) 等有机致癌物质。与这些致 癌物质有关的肠内细菌酶有d 葡萄糖醛酸酶、硝基还原酶、偶氮还原酶等。嗜 酸乳杆菌能降低这些细菌酶的活性，从而降低这些酶转变为致癌物的可能【4 s 1 。 t t 5 6 降低胆固醇 血清中总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的减少被认为能减少心血管疾病。 1 9 8 5 年，g i l l i l a n d 和其他研究人员指出，在厌氧条件和含有适量胆盐的高胆固醇 培养基中生长时，嗜酸乳杆菌菌体细胞可以吸收胆固醇而降低介质中胆固醇的含 量，证实了嗜酸乳杆菌有吸收胆固醇的能力，而这两种情况是肠道所具备的【4 6 1 。 t h o m p s o n 等对1 2 个健康人进行了为期9 周的含有嗜酸乳杆菌甜乳喂养实验，证 实含有嗜酸乳杆菌的乳制品对血脂有影响【4 7 】。荷兰一家公司选择一菌株作为生产 商品名为f y s i q 的酸奶，供给高胆固醇的人群食用，可以促进机体内血清胆固醇 的降低。 1 1 5 7 其它功能 人的衰老与肠内有害细菌产生的氨、胺、硫化氢、吲哚、酚、粪臭素等有害 腐败产物有很大关系。嗜酸乳杆菌代谢产生的乳酸抑制了这些腐败物，使机体衰 老的过程变得缓慢。保加利亚人的长寿和长期服用酸奶有关。 嗜酸乳杆菌还可以提高动物消化酶的活性，改善维生素的代谢，防止便秘、 抗辐射、中和肠毒素、降低胺、氨等有害物质的产生。同时它具有治疗和预防尿 路感染的潜在作用。从2 0 世纪8 0 年代起，发达国家用含有嗜酸乳杆菌的乳酸菌 6 浙江工商大学硕士学位论文 类治疗各种阴道炎症( 包括滴虫性阴道炎、细菌性阴道炎、真菌性阴道炎、非特 异性阴道炎等) 就已经取得良好的临床治疗效果1 4 8 1 。嗜酸乳杆菌及其乳酸菌类制 剂的局部应用使阴道p h 值呈弱酸性，造成不利于致病菌生长的阴道内环境；嗜 酸乳杆菌和其它益生菌联合使用对婴儿痢疾的治疗和预防也具有明显的疗效【4 9 1 。 1 1 6 嗜酸乳杆菌增菌培养基的优化 由于嗜酸乳杆菌自身生长要求比较特殊，导致进入市场的产品中活菌含量 低，而其发挥疗效保健作用的前提是在肠道内达到一定的活菌数量。为此，人们 积极探索能够促进其生长的物质，以提高活菌数 5 0 5 2 i 。同时，嗜酸乳杆菌的分离 培养及其酶学研究、发酵剂的制备等都需要有良好的增菌培养基，使嗜酸乳杆菌 得以在最短时间内大量增殖，从而使其在经过喷雾干燥、冷冻、冻干等处理后有 足够的活菌数残存。要达到这一要求，重要的一点就是优化增菌培养基【5 3 1 。 嗜酸乳杆菌除基本的营养需求外，某些天然添加物( 增殖因子) 对提高其活力 和活菌数效果较好。现在认为，西红柿汁、玉米浸出物、胡萝卜汁、低聚糖等物 质对其有促进作用( 葛文光，1 9 8 9 ) i i o 】；罗珍兰( 1 9 9 7 ) 研究认为，以大豆为原料 的发酵液中嗜酸乳杆菌活菌数比以玉米和西红柿汁为原料的发酵液中嗜酸乳杆 菌活菌数高个数量级，这证实大豆低聚糖可以促进该菌增殖f 1 2 1 ；顾瑞霞( 1 9 9 2 ) 考虑添加酵母代谢物较多的啤酒，这些增菌培养基可使活菌数达到1 0 9 c f u m l t 5 4 1 。 据报道，日本养乐多公司用某种海藻提取物作为嗜酸乳杆菌的生长促进剂， 优化出的增菌培养基可使活菌数高达1 0 1 0 c f u m l 以上，但其配方组成都属于专 利文献资料，因此优化、设计嗜酸乳杆菌增菌培养基是一项十分重要的基础研究 工作。嗜酸乳杆菌增菌培养基的优化过程应力求制作简便，用料少，成本低。重 点筛选天然食物提取物作为增殖因子，选择的材料包括西红柿汁、玉米浸出物、 胡萝b 汁、平菇浸出物、低聚糖等物质，确定最佳的添加量，来提高活菌数。 1 1 7 嗜酸乳杆菌的应用 1 1 7 1 在食品中的应用 人们的饮食结构和习惯与科学的发展及社会的进步密切相关，当今世界食品 发展的潮流是营养保健品，在国外称为“健康食品”、“营养食品或“功能食品”。 嗜酸乳杆菌是是人体肠道中的重要微生物，与人体健康息息相关，当其达到一定 数量时，能改善或调节肠道微生物菌群的平衡，增强机体免疫力，降低胆固醇水 7 浙江工商大学硕士学位论文 平，缓解乳糖不耐症以及抑制肿瘤细胞的形成等，即起到健康促进效果。根据 k u r m a n n ( 1 9 8 8 ) 报道，嗜酸乳杆菌产品中发挥功能特性时其活菌数的临界值为 1o f u m l 或10 6 c f u g 5 5 1 。 美国科学家s e l l a r s 先生早在1 9 8 1 年就预言，在今后的二三十年间，嗜酸乳 杆菌的开发、研究及应用将具有强大的生命力【5 6 1 。近几年来，随着人们健康意识 的逐步增强，嗜酸乳杆菌是目前乳酸菌家族中极为重视研究和开发的益生菌，被 视为 第三代乳酸发酵剂菌种 。在欧美、澳大利亚、日本等国己出现多种含有 嗜酸乳杆菌的生物活性奶，见表1 - 2 。在国内，随着人们健康意识的增强，对健 康食品开始重视，但嗜酸乳杆菌的研究和开发较晚，主要用于一些乳制品中，在 其它方面没有得到合理的应用。 表1 - 2 不同国家生产的嗜酸性乳制品 t a b 1 - 2 a c i d o p h i l u sd a i r yp r o d u c t so fd i f f e r e n tc o u n t r i e s 8 浙江工商大学硕士学位论文 1 1 7 2 在医药上的应用 嗜酸乳杆菌在医药上的应用源于其固有的保健作用。在二、三十年代，r e t t g e r 等人在美国对嗜酸乳杆菌的作用及其在临床上的应用做了大量的工作，使人们对 发酵奶产生了更大的兴趣，他们认为发酵奶对便秘、细菌性痢疾、结肠炎、斯普 鲁症乃至湿疹的患者均有或至少暂时的缓解作用【5 7 l ；另一方面，自5 0 年代以来， 抗生素得到了广泛的应用，然而其给人类带来的忧虑也越来越明显，抗生素长期 应用引起肠道菌群紊乱，造成肠道功能失调，由此而来的抗生素伴联性腹泻和超 感染，肠道细菌易位已经成为现时医院中难以解决的问题；尤其是抗生素的使用， 使得耐药菌株增加，耐药因子的迅速扩散，更是用抗生素本身难以解决的问题 5 引。 因此，人们试图求助于生物防治方法，以菌治菌，重新建立起肠道正常菌群的平 衡，调整肠道微生态环境，保证机体正常的功能，达到防病、治病、保健、延年 益寿的目的。 国外乳酸菌制剂的研究较为普及，产品种类繁多，例如德国的l a c t a n a b ， m a l u t k a ，法国的s y n e r l a c ，瑞士的i n f l o r a n b e m a 等适用于不同生理、病理人群， 具有明显的医疗效果f 5 9 l ，其采用的菌种一般有：嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、保加利 亚菌和粪链球菌等。我国最早的乳酸菌药品乳酶生就是粪肠球菌，主要用于 治疗腹泻、便秘和消化不良等消化功能紊乱；还有后来的新表飞鸣，除肠球菌外 又加入嗜酸乳杆菌。也有报道，用嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌冻干剂制成胶囊 “l a c t i n e x ”治疗口腔感染f 6 0 j 。微生态制剂和药物制剂的生产中，我国对嗜 酸乳杆菌的研究及应用相对较少，如能采用现代生物技术筛选出具有优良性状的 菌株，开发出具有明显疗效作用的产品，必将会受到消费者的喜爱，获得良好的 经济效益和社会效益。 1 1 7 3 在工业上的应用 目前在工业生产上的用途主要是生产乳酸。乳酸是具有重要工业价值的有机 酸，广泛用于食品、医药、化工