（食品科学专业论文）空间诱变乳酸菌作为微生态制剂菌株的初步研究.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 口 是否保密 刍 如需保密，解密时间 和o 年6 月r 占日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同x - 作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 碱蚣各罗7 车帅：渺7 年6 月帆 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版 和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传 播学位论文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位论文作者签名：、虿传导师签名：争1 劭色 一 獬日期：1 月f 抽 摊嗍以训年莎肌细 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 前 言1 1 日u 舌 1 国内外研究进展2 1 1 空间诱变手段的进展2 1 2 乳酸菌的研究进展3 1 3 微生态制剂研究进展5 2 课题研究目的及意义9 2 1 优良菌株的选育9 2 2 有效性问题。9 2 3 个体化问题。9 2 4 益生菌本身的问题。1 0 第一章菌种复筛保存及培养基的优化1 1 弓f 言1 1 1 材料。1 1 1 1 主要试剂1 1 1 2 主要仪器1 1 1 3 培养基1 1 2 方法1 2 2 1 菌株复活与传代1 2 2 2 利用s a s 8 0 对m r s 培养基进行优化1 2 3 结果1 4 3 1 回归方程的建立与检验1 4 3 2 回归模型的解析与分析。1 5 3 3 结论。1 7 第二章菌种初步鉴定、耐酸性能研究、生长曲线绘制1 9 弓i 言1 9i 羞j 工y 1 材料1 9 1 1 对照菌种：1 9 1 2 鉴定菌株。1 9 1 3 培养基1 9 1 4 主要试剂1 9 1 5 主要仪器及设备1 9 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 2 方法。2 0 2 1 形态特征观察2 0 2 2 生理生化性状鉴定j 2 0 2 3 耐酸性试验2 2 2 4 生长曲线的绘制。2 2 3 结果与结论。2 2 3 1 形态特征观察。2 2 3 2 生理生化鉴定2 3 3 3 生长曲线2 4 3 4 耐酸性试验二。2 5 第三章空间诱变菌株的免疫功效评价2 9 弓i 言j ：1 9 1 材料。2 9 1 1 实验动物2 9 1 2 主要仪器3 0 1 3 主要试剂及液体配制3 0 2 方法。3 1 2 1 小鼠免疫器官的测定3 1 2 2c o n a 诱导的小鼠淋巴细胞转化试验3 1 2 3 抗体生成细胞检测。3 2 2 4 小鼠碳廓清实验3 2 2 5n k 细胞活性测定j 3 2 3 结果与结论3 4 3 1 免疫器官重量3 4 3 2 脾淋巴细胞结果3 4 4 讨论。3 7 第四章空间诱变菌株对机体细胞因子的影响3 9 引言。3 9 1 材料与方法3 9 1 1 仪器与试剂3 9 1 2 实验材料及分组4 0 1 3 方法4 0 2 结果。4 1 2 1 白细胞介素4 标准曲线绘制4 1 2 2 白介素4 结果4 2 2 3 干扰素丫标准曲线绘制4 2 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 2 4 干扰素y 结果。4 3 3 讨论4 3 第五章调节肠道功能检验分析。4 5 弓l 言4 5 1 材料与方法。4 5 1 1 仪器与试剂。4 5 1 2 实验方法4 6 2 结果与讨论。4 7 2 1 肠道菌群分析结果。4 7 2 2 小肠运动试验结果4 8 2 3 不同菌株对小鼠排便时间，粪便粒数和粪便重量的测定结果。4 9 全文总结。5 0 参考文献5 2 至| 【谢5 6 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 摘要 空间诱变是一种新型的诱变方式，通过对嗜酸乳酸杆菌进行空间诱变育种，得 到一株试验菌株。本课题通过对此菌株的生理生化鉴定及对小鼠免疫学，肠道菌群 功能改善的研究，得知它具有调节机体肠道微生态平衡的作用，在调节功效上与市 售成熟产品合生元无明显差异。 本实验首先对原有的培养基就诱变后菌株的生长情况应用旋转正交方法作了模 拟寻优的调整。其次，对菌株的生理生化检验采用常规微生物检验方法，考察了诱 变后乳酸菌的生长曲线、耐酸碱性、碳源利用、运动性测定、半乳糖苷酶、氨基酸 脱羧试验、丙二酸钠对照试验等试验反映了诱变后乳酸菌的生理生化特性。最后以 肠道菌群检测与免疫学巨噬细胞吞噬功能测定、溶血空斑试验、淋巴细胞转化试验、 n 取自然杀伤) 细胞活性测定及细胞因子测定等方法，初步研究了空间诱变乳酸菌对 小鼠肠道菌群及免疫功能的影响。在动物实验中选择昆明种小鼠，随机分为5 组， 每组1 0 只，即对照组、混合菌株组、诱变菌株组、合生元组，诱变前菌株组进行 2 0 天灌胃饲养。并进一步对模型小鼠的肠道菌群进行分析。 实验结论如下： 1 ) 旋转正交实验模拟寻优得到改良的培养基配方为：葡萄糖2 4 2 0 9 ，蛋白胨1 2 3 6 9 ， 牛肉膏1 6 3 6 9 ，酵母膏5 9 ，吐温一8 0l m l ，k 2 h p 0 4 2 9 ，乙酸钠5 9 ，柠檬酸氢二铵2 9 ， m g s 0 4 7 h 2 00 2 9 ，m n s 0 4 4 h 2 00 0 5 9 ，加蒸馏水至1 0 0 0 m l 。 2 ) 诱变后乳酸菌经染色观察在形态上没有发生改变，菌体大小与原菌株相近。 菌株同m i a 一样有运动性；k j 菌株在o 硝基苯b d 吡喃半乳糖苷酶试验中观察反 应为阳性；氨基酸脱羧敏试验两种菌株相同；碳源利用试验中尉菌株在乳糖利用试 验中呈阳性；在耐盐性方面诱变后菌株呈负突变。 3 ) 诱变前后两株菌生长曲线可以看到，诱变后菌株比原菌株提前2 h 进入对数期， 在对数生长期菌株生长速度大于诱变前菌株；诱变后乳酸菌耐酸性方面呈正突变。 4 ) 免疫学实验中，诱变后菌株实验组小鼠免疫器官胸腺指数和脾脏指数相对于原菌 株有显著提高p 0 0 5 ；小鼠淋巴细胞转化试验中诱变后菌株也有显著提高p o 0 5 ； 诱变组小鼠巨噬细胞吞噬能力也显著提高p 0 0 5 ；n k 细胞活性也有显著提高p 0 0 5 。 5 ) 细胞因子白细胞介素4 和干扰素丫测定使用e l i s a 双抗体夹心法试剂盒测定标准 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 曲线，并用实验组小鼠外周血清作样本测定细胞因子含量，诱变后菌株组相比较原 菌株都有显著提高。 6 ) 肠道菌群分析试验中，诱变菌组小鼠粪便中双歧杆菌和乳杆菌明显增加，产气荚 膜梭菌减少或不增加，肠杆菌和肠胃球菌明显；小肠运动试验中，看到诱变后菌株 组推进率显著高于原菌株组，比合生元组略低，但不存在显著性；小鼠排便时间， 粪便粒数和粪便重量的测定结果可看到诱变后菌株喂养组的小鼠排便状况显著好于 诱变前菌株喂养组。 关键词：空间诱变菌株免疫肠道 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 a b s t r a c t s p a c em u t a t i o ni san e ww a yf o rt h em i c r o o r g a n i s mb r e e d i n g an e ws t r a i ni s s e l e c t e dt h a tl a c t o b a c i u u sa c i d o p h i l u si sm u t a t e db ys p a c ew a y t h ea r t i c l em a i n l ys t u d i e d t h es e l e c t i o na n ds c r e e n i n go ff i n es t r a i na n db i o l o g i c a lt r a i to ft h em u t a t i o nl a c t o b a c i l l u s a c i d o p h i l u s i nc o n c l u s i o n ，t h i ss t u d yh a ss h o w nt h a tt h es t r a i nc a na c c o m m o d a t et h e i m m u n eo r g a n sf u n c t i o n ，h u m o r a li m m u n ef u n c t i o na n dc e l l u l a ri m m u n ef u n c t i o no f m i c e f u r t h e r m o r e ，t h es t r a i nc a na m e l i o r a t et h eb a l a n c eo fi n t e s t i n a lf l o r ao fm i c e t h e s t r a i nh a v es e e mf u n c t i o nw i t ht h ep r o d u c to ff r e n c hh e s h e n g y u a n t h er e s u l ts h o w e di n t h r e ea s p e c t sa sf o l l o w f i r s t ，t h eq u a d r a t i co r t h o g o n a lr o t a t i o nd e s i g nw i t h3f a c t o r sw a su s e dt os t u d yt h e e f f e c to f g l u c o s e ，p e p t o n ea n d b e e fe x t r a c ti nt h ec u l t u r em e d i u m ，t h ef u n c t i o n a lm o d e lo f t h ec u l t u r em e d i u mt o3f a c t o r sw a se s t a b l i s h e db yr s r e gs o f t w a r et ob ep a r to f s a s 8 0 t h ea n a l y s i so nt h i sm o d e ls h o w e dt h a tt h er e g r e s s i o ne q u a t i o ni ss i g n i f i c a n t ， a n dt h em a t h e m a t i c a lm o d e lf o rt h es i m u l a t i o ni sp r e s e n t e da n dt h ee f f e c to r d e ro f3 f a c t o r so nt h ec u l t u r em e d i u mf o r t h em u t a t i o ns t r a i n ：g l u c o s e ，p e p t o n ea n db e e fe x t r a c t s e c o n d l y ，s p a c em u t a t i o ns t r a i ni sn a m e dk ja n du s i n gp o l y p h a s i ct e c h n o l o g y i n c l u d i n gm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i co b s e r v a t i o n , p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lt e s t r e s u l t ss u g g e s t e dt h a tu n d e rl o wa c i d i t y ，t h ea c i d t o l e r a n tk j ，i fe x p o s e dt ot h et o l e r a n t r a n g e ，c o u l dg r o wq u i c k l ya f t e rap r o l o n g e dl a gp h r a s e a tt h et i m e ，m e a ng e n e r a t i o nt i m e w e r ee x a m i n e d ，t h er e s u l ts h o w e dt h a tm e a ng e n e r a t i o nt i m eu n d e ra c i d i cc o n d i t i o nw a s l o n g e rt h a nt h a tu n d e rn e u t r a lc o n d i t i o n ，l o w e rt h ep hw a s ，m u c hl o n g e rt h em e a n g e n e r a t i o nt i m e t h i r d l y ，m u t a t i o ns t r a i nc o u l di m p r o v et h ei n d e x e so ft h y m u sa n ds p l e e n ，t h e r ew a s s i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nc o n t r o lg r o u pa n dt e s tg r o u p ( p 0 0 5a n dp o 0 1 ) ； m u t a t i o ns t r a i nc o u l ds i g n i f i c a n t l yi n c r e a s et h er a t eo fl y m p h o c y t e sc o m p a r e dt ot h e c o n t r o lg r o u p ( p o 0 5a n dp 0 0 1 ) ；t h em u t a t i o ns t r a i nc o u l de n h a n c et h ep h a g o c y t i c a c t i v i t yo fp e r i t o n e a lm a c r o p h a g ea n dc o n t e n to fh e m o l y s i na n dt h el e v e lo fa g g i u t i n i n c o m p a r e dt ot h ec o n t r o lg r o u p ( p x 3 。因此，在后续试验培养基 的配制中遵循此规则。 3 2 2 单因子效应分析 对二次回归模型采用“降维法”，得出单因子对产量的效应方程： y 1 - 3 1 2 6 2 0 + x x x 7 7 7 1 4 6 + ( x l x x l ) x ( - 1 9 3 2 6 6 ) y 2 = 3 1 2 6 2 0 + x 2 x 1 6 9 1 4 9 + ( x 2 x x 2 ) 一1 9 3 2 6 6 ) y 3 - 3 1 2 6 2 0 + x 3 x ( - o 3 4 2 9 9 ) + ( x 3 x x 3 ) ( 一1 0 4 6 8 9 ) 把3 个因子的取值范围固定在1 6 8 、1 、0 、1 、1 6 8 水平时，据上述3 个方程，分 别计算出各因子5 个不同水平的菌落数估计值见表1 - 4 。从表4 可以看出：x 1 对菌落数 的影响最大。分析各因素的影响度。 表1 4 因子不同水平的得率估计值及效应值 t a b l e1 - 4e s t i m a t e dy i e l dv a l u e sa n de f f e c ts i z e so ff i v ef a c t o r sa n dl e v e l s 3 2 3 回归方程的模拟寻优 根据取得的回归方程，通过计算机模拟寻优，得到9 个组合( 结果略) ，对9 个组合 进行频数分析表明，欲达到稳定的7 倍板有3 3 个以上的菌落数，最佳葡萄糖添加量 2 4 2 0 9 ，蛋白胨添加量1 2 3 6 ，牛肉膏添加量1 6 3 6 。 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 3 2 4 响应面图 a e 0 4 2 b 7 9 1 4 7 4 2 e 9 1 b 2 3 1 7 7 ”2 2 2 2 b 7 l e 1 2 1 6 2 x 1 。o 砧 0 5 2 边 。o 5 8 1 6 0 5 口 1 1 2 1 8 2 _ 溉 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 一 一二_ 二- 一 3 3 结论 1 b 2 3 3 13 个因素对菌落数的影响次序为：葡萄糖 蛋白胨 牛肉膏 3 3 2 优化提取参数是：在此条件下，空间诱变后的嗜酸乳酸杆菌在此培养基上的菌 落数在3 3 以上 3 3 3 验证试验：遵从优化提取参数重复1 0 组实验，结果如下： 表1 5 验证试验结果 t a b l e1 - 5p r o o ft e s tr e s u l t _ _ 一 葡萄糖 牛肉膏 蛋白胨 菌落数 一一 1 2 4 2 0 1 6 3 6 1 2 3 6 3 6 2 4 2 0 2 4 2 0 2 4 2 0 2 4 2 0 2 4 2 0 2 4 2 0 2 4 2 0 2 4 2 0 1 6 3 6 1 6 3 6 1 6 3 6 1 6 3 6 1 6 3 6 1 6 3 6 1 6 3 6 1 6 3 6 1 2 3 6 1 2 3 6 1 2 3 6 1 2 3 6 1 2 3 6 1 2 3 6 1 2 3 6 1 2 3 6 1 0 2 4 2 0 1 6 3 6 1 2 3 6 3 5 - 一一一一_ 一 1 7 笛 弘 舛 於 孙 弘 弘 2 3 4 5 6 7 8 9 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 验证试验结果表明，采用本实验室条件，在上述优化培养剂配方参数下诱变后 乳酸菌按一定比例图布在琼脂培养基上，可获得3 3 个以上的菌落数。优化后的葡萄 糖，牛肉膏，蛋白胨的添加量在培养过程中比原有的m r s 培养基更适合诱变后乳酸 菌的生长繁殖。 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 第二章菌种初步鉴定、耐酸性能研究、生长曲线绘制 引言 菌种初步鉴定根据伯杰氏细菌学鉴定手册中有关乳酸菌形态极为生物试验手册 中对生理生化指标和其它有关酸乳菌特定特点报道，对分离出的菌株进行鉴定( 康 白，1 9 9 8 ；杨景云，1 9 9 7 ) 。 生长曲线是微生物菌株生长状况的图表形式，以此筛选出繁殖能力强，成活率 高的菌株。耐酸性是益生菌菌株筛选的首要特征，从生长曲线筛选出的优良菌株在 酸性加强的培养基上进行筛选。 1 材料 1 1 对照菌种 对照菌株为选送空间诱变时同一条件做的对照保存的m 认。 1 2 鉴定菌株 经过空间诱变的突变菌株嗜酸性乳酸菌( l a c i d o p h i l u s ) k j 。 1 3 培养基 鉴定用培养基分别按相关文献配制。 1 4 主要试剂 微生物实验室常用试剂 a l l 1 5 主要仪器及设备 电子天平 蒸汽消毒器 电热鼓风干燥箱 恒温培养箱 恒温水浴锅 j a 2 6 0 3 y q w y 2 1 6 0 0 z b l 0 1 i w s 2 1 3 4 6 5 h hs 2 12 中国上海 中国广州 山东淄博仪表厂 上海市跃进医疗器械一厂 山东医疗器械厂 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 7 2 1 型分光光度计u v - 1 2 0 0 2 j a p a n 光学显微镜o l y m p u s ，c h 2j a p a n 高速冷冻离心机3 k 3 0德国s i g m a 定时微量震荡器m m 3 型江苏姜堰市康键医疗器具厂 电子酸度计p b 一1 0 s a r t o f i u sb a s i c 2 方法 2 1 形态特征观察 2 1 1 个体形态 对日菌株作革兰氏染色，在光学显微镜4 0 0 倍下观察其个体形态，并测量菌体 大小；磷钼酸染色，从培养好的培养皿中切下琼脂块，将有菌的表面朝下，让细菌 粘于玻片上，将琼脂块提起，磷钼酸媒染，甲基绿染色，水洗净后镜检，拍片。 2 1 2 菌落形态 将菌株接种于改良m r s 琼脂培养基上培养，观察菌落形态，并测量菌落大 小；将菌株接种于改良m r s 液体培养基中培养，观察有无菌膜，对培养液p h 值的影响等。 2 2 生理生化性状鉴定 2 2 1 运动性测定 用直针穿刺接种菌株于半固体改良m r s 培养基中，3 7 。c 恒温培养5 6 d 。目 测菌株的生长情况，若只生长在接种的穿刺线上，边缘十分清晰，则表示 菌株无运动性；若培养物由穿刺线向四周呈云雾状扩散，其边缘模糊呈云雾状，则 表示菌株有运动性。 2 2 20 硝基苯b d 吡喃半乳糖苷酶( 0 n p g ) 测定 将o n p g 溶解于1 0 0 m l 磷酸缓冲溶液内，过滤灭菌与3 0 0 m l 蛋白胨水混合，无 菌分装小试管，冰箱保存。挑取幼龄培养物平板一环放于待用的培养基中，适温培 养2 4 h ，观察结果。 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 2 2 3 甲基红试验 据标准方案配制培养基，灭菌待用。接种试验菌与培养基中，每次二个重复，3 7 培养4 天检查，在培养液中加入一滴甲基红试剂，红色为甲基红试验阳性反应，黄 色为阴性( 据甲基红变色范围) ，适当延长阴性反应培养时间，以避免假阴性。 2 2 4 氨基酸脱羧敏试验 据检测标准方案配制培养基灭菌待用，加入各种氨基酸使浓度达到1 ，未加氨基 酸的培养基为空白。幼龄培养物接种，接种后用液体石蜡封油，对照管预测试管同 时接种。每天观察，连续观察7 天或更长时间。指示剂呈紫色或带红色调的紫色为 阳性，呈黄色为阴性。 2 2 5 丙二酸钠对照试验 取丙二酸钠培养基试管，设置空白样，对应将菌种接入，连同空白对照置3 7 培养4 8 h ，观察结果，培养既有绿色变为蓝色者，表明实验结果阳性，培养基不变 蓝色者为阴性。 2 2 6 含碳化合物的利用试验： 据标准配制细菌基础培养基，分别加入葡萄糖，乳糖，蔗糖，做碳源以0 2 劾m 微孔滤膜过滤按2 的比例分别添加指上述细菌基础培养基中，加入0 5 m l 溴甲酚 紫作为指示剂。将诱变后菌株及对照菌株制成悬液接种，3 7 c 培养7 2 h 观察。指示 剂有紫色变为黄色为阳性，绿色为弱阳性。 2 2 7 过氧化氢酶试验 取一干净的载玻片，在上面加一滴5 的过氧化氢，挑取一环培养好的菌苔，在 过氧化氢溶液中涂抹，若有气泡( 氧气) 出现，则为过氧化氢酶阳性反应，无气泡 者为阴性反应。 2 2 8h 2 s 的产生 将菌株纯培养物沿试管壁穿刺，3 7 c 恒温培养2 刁d 后观察，必要时可延长 3 4 d 。培养基变黑色者为阳性反应。 2 2 9 耐盐性试验 耐盐性试验培养基配制灭菌待用，n a c i 浓度设置0 ，3 ，7 ，9 ，1 1 ，接 种试验菌，并设对照空白组，生长一段时间对光观察菌液混浊度，以此观察耐盐性， 2 1 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 浑浊度强于空白的为阳性，否则为阴性。 2 2 1 0 耐碱性试验 将菌株分别接种于p h 值为9 5 和9 8 的m r s 液体培养基中，同时设正 常p h 值的m r s 液体培养基作对照，连续培养4 8 h ，观察细菌生长情况，用分光 光度计测定菌液浓度，确定其生长与否。 2 3 耐酸性试验 “ 用平板计数法测出各个菌株发酵液的含菌数，然后以无菌的m r s 液体培养基调 节茵悬液的菌体细胞浓度为1 0 9 c f u m l 并用0 1 mh c l 或0 1 mn a o h 调节其p h 值 分别为2 、3 、4 、5 、6 在3 7 c 恒温培养室温处理1 h 、2 h 、3 h 、4 h 。于各处理时间 取菌悬液，在5 7 0 a m 下紫外分光光度计比色，设各个不同p h 值为对应菌悬液的对 照，绘制生长曲线。 2 4 生长曲线的绘制 将和m i a 接种在改良m r s 液体培养基上，置于3 7 c 培养，每2 h 在5 7 0 r i m 下测定其吸光值。建立坐标，绘制曲线。 3 结果与结论 3 1 形态特征观察 3 1 1 个体形态特征 零? 二翟j 。? 。，够，j 置! ：和 飞谚毽 ? ，2，掣 ， ； 。冉n - j 荔 褫： 整、 5 鳓 燃 图2 - 1 诱变前显微检测结果 f i 9 2 - 1 ? if 磐。| 荔 tj+ ，i劳 j一 图2 - 2 诱变后显微检测结果 f i 9 2 - 2 谚，i j z一j 节 一 唧 龇 影 秀， 一 锄 叨 一 嚣 - +，。； 锄 妒 霉： 锈 知 图2 - 3 如图2 3 中所示左边的培养皿内为诱变后的菌株，右边的培养皿内为原菌株， 诱变后的菌株在相同的培养基上形成的菌落要略大于原菌株。外形都无显著差异， 在m r s 固体培养基上，菌落都呈针尖状，圆形凸起，较光滑，边缘整齐，直径在 o 矗1 8 m m 内，乳白色，湿润不透明，延长培养时间菌落可扩大，但不超过3 m m ， 茵落大小较均匀一致。在改良m r s 液体培养基中，不形成菌膜，4 8 h 后培养基p h 值下降到3 2 左右。 3 2 生理生化鉴定 表2 - 1k j 菌株和m i a 菌株的生理生化特性 t a b l e2 - 1b i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r so fk js t r a i na n dc o n t r a s ts t r a i nm i a 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 生理生化鉴定结果由表2 - 1 可以看出诱变后的菌株在半乳糖苷酶试验中呈阳性， 在乳糖利用试验中也呈阳性，说明诱变对菌株的产酶及乳糖利用能力有正突变效应。 表2 - 2k j 菌株和m i a 菌株的耐盐性试验 t a b l e2 - 2t h e e x p e r i e n c ea b o u ti n d u r e n c es a l to fk js t r a i na n dc o n t r a s ts t r a i nm i a 从表2 - 2 可以看到，诱变对于菌株的耐盐性能方面起到了负突变作用，在盐浓 度为7 和9 时，诱变后菌株生长繁殖能力低于原菌株。 3 3 生长曲线 通过比较两株菌体的生长曲线可以知道空间诱变后的菌株进入对数生长期的时 间比原菌株有所提前，原菌株为1 4 小时，诱变后菌株为1 2 5 h 。初始的生长素率相差 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 不大，在进入对数期前2 小时诱变后菌株的生长速度明显比原菌株高，在对数生长期 也明显高于原菌株的生长速度。但是就整体而言，在生长曲线看衰亡期是没有太显 著变化的，都是在3 6 h 走向衰亡期。在四个不同的阶段菌株在生长状况方面均比 m 认菌株要更旺盛，结果见图2 3 。 吸光度( 5 4 0 加) 3 ： 0 d 矗 吸光度( 5 4 0 n m ) 慧 0 d & 246 81 01 21 41 61 82 02 22 42 62 83 03 23 43 6 时间( h ) t i m e 2 4 6 81 01 21 41 61 82 02 22 42 62 83 03 23 43 6 时间( h ) t i m e 图2 3 不同菌株在相同培养基不同时间的光密度值 f i 9 2 3o d v a l u ei nf e r m e n t a t i o no ft w os t r a i n si nd i f f e r e n tt i m e 3 4 耐酸性试验 在耐酸性实验中，将空间诱变菌株及对照菌株接种到p h 分别为2 ，3 ，4 ，5 ，6 五个不同梯度的培养基中，观察生长变化差异性。由图2 4 ，2 5 ，2 - 6 中可以看出， 在p h 2 0 条件下，两株菌均不能良好生长，p h 值无太大变化；在p h 3 0 时m i a 产 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 酸能力低于k j 菌株，在生长初期无明显变化是因为在初期菌体是在为细胞分裂做准 备，后期产酸明显有差别，从图中可以看到在p h 3 0 的环境中诱变后菌株不但可以 良好生长，还可以维持并进一步略微降低环境的p h 值：在p h 4 0 的培养基中两株 菌在产酸能力方面有了较明显差异，诱变后菌株降低培养基p h 值时间明显比对照 菌株所用时间更短。可以得到结论在耐酸性能方面空间诱变对菌株起到正突变，诱 变后的菌株比原菌株更耐酸性环境。 3 2 5 2 1 5 3 2 5 p h 2 1 5 2 4 6 81 0 1 21 41 6 1 82 02 2 2 4 2 62 83 0 3 2 3 4 3 6 时间( h ) t i m e 2 4 6 81 0 1 21 41 6 1 82 02 22 42 62 83 0 3 23 43 6 时间( h ) t i m e 图2 - 4 不同菌株在培养基p h 2 条件下不同时间的p h 值 f i g2 - 4 p h i nf e r m e n t a t i o no ft w os t r a i n si np h 2i nd i f f e r e n tt i m e 24 6 81 01 21 41 61 82 02 22 42 62 83 03 23 43 6 时间( h ) t i m e 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 5 5 5 4 5 4 p h3 5 3 2 5 2 1 5 2 4 6 81 01 21 41 6 1 82 02 22 42 62 83 03 23 43 6 时间( h ) t i m e 图2 - 6 不同菌株在培养基p h 4 条件下不同时间的p h 值 f i g2 - 6 p hi nf e r m e n t a t i o no ft w os t r a i n si np h 4i nd i f f e r e n tt i m e 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 引言 第三章空间诱变菌株的免疫功效评价 近年来大量实验表明微生态制剂除了可以改善肠道菌群结构，还可以提高机体机 能，普遍认为是因为提高了机体免疫功能活性，使之更有利于机体健康。故免疫学 评价的结果对于微生态制剂的功效来说成为了一个显著指标。有关免疫功能评价的 研究方法比较复杂，且近年来进展较快，因无论是免疫增强剂或是免疫抑制剂他们 都可能在不同部位的免疫过程起作用，这就给评价目标带来了一定的困难。 非特异性免疫是指无特殊针对性的病原体的天然抵抗力，不只是某个个体所特 有的，而是种系所共有的，可遗传的。在抗感染过程中，它发挥作用快，范围广泛， 是抗感染的第一道防线。非特异性免疫主要包括：皮肤粘膜的屏障作用，淋巴组织 过滤作用、血清体液杀菌作用，单核吞噬系统的吞噬作用及炎症反应的病理防御 作用。小鼠机体主要依靠其非特异性免疫防御系统抵抗入侵的病原生物。 本实验研究方法依据我国保健食品免疫功能评价指标进行，并结合实验中出现 的问题及中药实验原理手册对实验方法进行了部分调整，试验结果相互印证可信。 m t r ( 四唑盐1 比色法是一种检测细胞存活和增殖的常用方法，所用的显色剂是一种 能接受氢原子的化合物m t t ，原理为活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能将淡黄色的 m t r 还原为蓝紫色的结晶，后者的产量与活细胞数成正相关。形成的蓝紫色的结晶 可用d m s o 、无水乙醇或酸化异丙醇等溶解，在酶标仪上以波长5 6 0 r i m 进行比色。 所检测的o d 值的大小可反应细胞代谢活性的强弱。这一方法在多个免疫学评价指 标测定实验中用到。 1 材料 1 1 实验动物 昆明纯种小白鼠，购自南方医科大学动物室，体重1 8 2 2 9 左右，雄性。( 许可 证号2 0 0 5 a 0 4 2 2 0 0 6 b 0 0 8 ，s p f ) 豚鼠，购自南方医科大学动物室，体重3 0 0 9 左右，雌性。( 许可证号 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 2 0 0 6 8 0 0 7 2 0 0 5 a 0 4 1 ) 公鸡，购自市场，雄性。 1 2 主要仪器 电子天平j a 2 6 0 3中国上海 低温冰箱( - 8 0 。c ) 7 0 2 美国t h e r m oe l e c t r o n 电热鼓风干燥箱z b l 0 1 i山东淄博仪表厂 c 0 2 培养箱 3 1 1 1 美国t h e r m oe l e c t r o n 酶标仪m k 3美国m u l t i s k a n 7 2 1 型紫外分光光度计u v - 1 2 0 0 2j a p a n 恒温生化培养箱o l y m p u s ，j a p a n c h 2 高速冷冻离心机3 k 3 0德国s i g m a 定时微量震荡器m m 3 型江苏姜堰市康键医疗器具厂 电子酸度计p b 1 0s a r t o r i u sb a s i c 2 4 孔，9 6 孔培养板c o s t a r 滤器 微孔滤膜 1 3 主要试剂及液体配制 r p m l l 6 4 0 ： 小牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司 c o n a ： 美国s i g m a m t r ： 北京索莱宝生物科技有限公司进口分装a m r c s c o 三联溶解液：s d s1 0 9 ，异丁醇5 m l ，1 0 mh c l0 1 m l 用双蒸水溶解配成 1 0 0 m l 溶液) m t r 液：称取2 5 0 r a gm t r ，放入小烧杯中，加5 0 m l ：p b s ( 0 0 1 m o l l ，p h 7 4 ) 在电磁力搅拌机上搅拌3 0 m i n ，用o 2 2 t i m 的微孔滤器除菌，分装，4 。c 保存。两周 内有效。 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 补体：自制( 豚鼠血清) 完全培养液：r p m i 1 6 4 0 培养液过滤除茵，用前加入1 0 d x 牛血清，1 谷氨酰 胺( 2 0 0 m m o l l ) 、青霉素( i o o u m l ) 、链霉素( 1 0 0 # g l ) 及5 x 1 0 巧m o l l 的2 - 硫基乙醇用无菌的l m o l l 的h c l 或l m o l l 的n a o h 调p h 至7 o - 7 2 无菌h a n k s 液：用前3 5 的无菌n a h 2 c 0 3 调p h 7 2 - 7 4 酸性异丙醇溶液：9 6 m l 异丙醇中加入4 m ll m o l l 的h c l ，临用前配制 灌胃菌业的制备：以培养基为溶液稀世平稳生长期的菌体，活菌数浓度为1 0 7 个l i l l 。 2 方法 2 1 小鼠免疫器官的测定 昆明系小鼠，体重1 8 2 0 9 ，单一性别雄性，每组1 0 1 5 只。实验设四个剂量组 和一个阴性对照组，1 组为原菌株以诱变前菌株配置灌胃材料，2 组为诱变后菌株以 诱变后菌株配置灌胃材料，3 组为合生元组采用药店购买合生元产品配置相应浓度 的灌胃材料，4 组为混合菌株组采用保加利亚菌株和原菌株1 ：1 配置灌胃材料，5 组 为空白对照组。灌胃1 8 天后各组均脱颈处死，摘取