（食品科学专业论文）淀粉类食品中丙烯酰胺的HPLC检测方法及其在烧饼中形成规律研究.pdf

四川农业大学硕士学位论文 摘要 以油炸、焙烤淀粉类食品薯片、油条、烧饼、饼干等为研究对象，探讨该类食 品中丙烯酰胺( a a ) 离子交换高效液相色谱( 玎 l c ) 检测方法和溴化衍生h p l c 检 测方法的建立，并且选取目前国内外研究较少的烧饼为研究对象，对其丙烯酰胺的形 成规律进行了初步的研究。 建立了淀粉类食品中a a 的离子交换h p l c 测定方法。样品中的从用8 0 甲 醇溶液提取，氮吹浓缩后经o a s i sh l b 固相萃取( s p e ) d , 柱净化，0 0 0 5m o l l 硫酸为 流动相在h c 7 5i - f 阳离子交换柱上分离，二极管阵列检测器( d a d ) 在2 0 0n m 波长进 行定性、定量分析。检测限( l o d ) 为3 0g g k g ，添加回收率( r e ) 在9 2 - - - , 1 0 4 ，相 对标准偏差( r s d ) 9 。对油炸薯片、饼干、油条、烧饼等食品检测的结果与文 献报道值吻合。 建立了另一种检测方法一溴化衍生h p l c 。该方法采用了气相色谱法( g c ) 的 溴化衍生前处理方法，将极性较强的从转变成极性较弱的2 ，3 一二溴丙酰胺( 2 ， 3 - d b p a ) ，并进一步将2 ，3 - d b p a 转化为更稳定的分析物2 一溴丙酰胺( 2 - b p a ) ，用 d a d 检测器2 1 5i l m 波长进行定量、定性分析，l o d 为1 0i i t g k g ，r e 在8 9 1 0 9 ， r s d m s - 】s l c - m s i c e c r 2 ( 或r ) 符号说明 丙烯酰胺 高效液相色谱法 亲水亲脂平衡 固相萃取 二极管矩阵检测器 最低检测限 最低定量限 相对标准偏差 标准偏差 回收率 气相色谱一质谱分析法 二溴丙酰胺 溴丙酰胺 保留时间 标准样品 国际癌症研究机构 美国食品药品监督管理局 世界卫生组织 液相色谱 气相色谱 紫外线 质谱 液相色谱一串连质谱法 液相色谱一质谱分析法 离子色谱法 欧盟 相关系数 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个 人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机 构的学位或证书所使震过的材料。与我一溺工作的同志对本研究所做麴任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：施犯 。面g s 甓毒置 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有 关部门或枫构送交论文的复固俘_ 鞫电子舨，允许论文被查阙和借溺，可以采阁影印、缩印或扫攒 等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传援学 位论文的全部或部分内容。 研究生签名：荔蒙 名：赁煲 劫多年石月形日 珈垆钐叫甚 四川农业大学硕士学位论文 1 文献综述 聚丙烯酰胺在工业上得到广泛应用【l 】，它是目前世界上应用最广、效能最高的水 处理絮凝剂，但是其单体丙烯酰胺被世界各国列为危险化学品【2 】，是公认的神经性致 毒剂和准致癌物质，对人类健康危害极大。2 0 0 2 年4 月，瑞典国家食品局( t h es w e d i s h n m i o n a l f o o da d m m i s 仃a t i o n ：n f a ) 和斯德哥尔摩大学( s t o c k h o l mu n i v e r s i t y ) 的科学 家联合公布了他们的研究结果：在油炸薯条、土豆片等淀粉类食物中，检测出有致癌 可能性的丙烯酰胺( a c r y l a m i d e ) 【3 】。报告一经发表，立即引起了世界各国食品业界的 广泛关注。随后世界上许多国家纷纷对此问题展开了研究和讨论，结果一致认为大部 分的淀粉类食品经过煎、烤、炸等高温烹调后会产生含量不等的丙烯酰胺，且其含量 随加工温度的升高而增加。2 0 0 2 年6 月，世界卫生组织( w h o ) 召开关于丙烯酰胺专 家会议，与会专家一致认为研讨食物中丙烯酰胺问题十分重要，迫切需要针对有关食 品中丙烯酰胺的问题做更加深入细致的研究。因此开展食品中丙烯酰胺的研究具有重 要的意义。 1 1 丙烯酰胺的基本特性及危害 1 1 1 基本特性 丙烯酰胺( a c r y l a m i d e ，简称a a ) c a s 编号为：7 9 0 6 1 ，化学分子式为： ch 2 = ch co nh 2 ，分子量为：7 1 0 8 ，沸点：1 2 5 ，熔点：8 4 5 ，比重： 1 1 2 2g c m 3 。丙烯酰胺是一种不饱和酰胺，其单体为无色透明片状结晶，无味，有 毒，易溶于水( 2 1 5 5g l ) 、甲醇( 1 5 5 0g l ) 、乙醇、二甲醚、丙酮、氯仿等溶剂【4 】， 在稀酸性溶液中稳定，在碱性条件下分解，但当处于熔点或以上温度、氧化条件以及 在紫外线的作用下很容易发生聚合反应。因此配制的溶液应避光保存。当加热使其溶 解时，丙烯酰胺释放出强烈的腐蚀性气体和氮的氧化物类化合物【5 1 。 1 1 2 丙烯酰胺的用途及来源 丙烯酰胺是一种重要的有机合成原料，可以作为医药、农药、染料和涂料等物 质合成的中间体。目前，丙烯酰胺主要用于高分子量的聚合物，其中9 0 为聚丙烯酰 胺，这些聚合物被广泛应用于工业领域【6 】，可以作为市政供水处理中的絮凝剂，工业 废水处理时去除悬浮固体，石油回收操作和造纸工业的交联剂，还可以用作生产食品 包装材料，用作建设坝基、隧道和污水管的浆料以及肥皂和化妆品的增稠剂。在生物 化学领域，丙烯酰胺还被用于核酸和蛋白质的凝胶电泳测定0 1 。 四川农业大学硕士学位论文 环境中存在的丙烯酰胺主要来自污水处理过程和一些工业源( 如塑料生产和加 工行业可释放大量的丙烯酰胺) ，一些含高淀粉的食品经过煎、烤、炸等高温烹调后 也会产生丙烯酰胺。 1 1 3 丙烯酰胺的危害 丙烯酰胺具有较强的渗透性，可以通过未破损的皮肤、粘膜、肺和消化道吸入 人体【删，并能通过胎盘屏障，一旦进入人体，它可以快速分布于全身的组织中，例如 肌肉组织、肝脏、血液、皮下组织、肺部和脾脏等。从口摄入被认为是人体吸收丙烯 酰胺最快速和最完整的途径。日常生活中，食品和饮用水是人体摄入丙烯酰胺的主要 来源，食品包装材料中丙烯酰胺的迁移也是丙烯酰胺来源之一。 丙烯酰胺具有神经毒性，且具有累积性，人和动物大剂量暴露于丙烯酰胺后，引 起中枢神经系统的改变。在人类经呼吸道的丙烯酰胺急性暴露中，观察到中枢和周围 神经系统损伤的症状，如头晕、幻觉等【1 1 , 1 2 ；动物慢性( 长期) 经口给予丙烯酰胺，可以 观察到腿脚麻木、无力等神经损伤表现【1 3 1 ，而经皮肤的长期暴露则可导致人的皮肤产 生红疹【1 4 1 。 丙烯酰胺还对动物有生殖毒性，可导致细胞d n a 的损伤，并对啮齿动物具有致 癌性。目前还没有流行病学的数据表明丙烯酰胺对人类也具有致癌性，因此国际癌症 研究机构( 心，全称：i n t e m a t i o n a la g e n c yf o rr e s e a r c ho i lc a n c e r ) 将丙烯酰胺列为 “人类可能的致癌物 ( i i a 类) 【1 5 1 。 1 2 国际国内研究概况 在过去几年时间里，欧、美等国的研究人员就丙烯酰胺的检测方法、暴露水平及 食品中的含量水平、形成机理以及降低措施等方面开展了大量的研究工作。 1 2 1 食品中丙烯酰胺的检测方法 自从2 0 0 2 年发现淀粉类食品中含有丙烯酰胺以来，许多方法被用来分析各种不 同类型食品中丙烯酰胺的含量。这些方法尽管在样品前处理( 提取、净化步骤) 不同， 但大多采用气相色谱( g c ) 或液相色谱( l c ) 分离，质谱( m s ) 进行定性、定量分 析，有良好的准确性和灵敏度。 气相色谱一质谱分析法( g c - m s ) 1 6 - 1 9 通常需要衍生步骤，以提高被测物的挥发 性，衍生化过程对样品同时具有净化作用【2 0 】。丙烯酰胺的衍生可以通过丙烯酰胺双键 的溴化形成2 ，3 一二溴丙酰胺实现，也可以通过氨基的硅烷化形成n 二二( 三甲基硅 四川农业大学硕士学位论文 烷基) 丙烯酰胺实现。不通过衍生直接分析丙烯酰胺也是可行的，但由于丙烯酰胺可 以在进样口人为形成，直接气相色谱一质谱分析法( g c - m s ) 获得的丙烯酰胺结果可 能会高于衍生化g c - m s 或l c _ m s 。另外，必须避免在萃取过程中，尤其是在低水 分( 如甲醇) 、长时间回流条件下丙烯酰胺的人为形成。 相对于气相色谱一质谱分析法( g c - m s ) 而言，液相色谱一质谱分析法( l c m s ) 【2 1 2 3 】是更好的选择，可以利用丙烯酰胺易溶于水，在水溶液中可以充分萃取的特点【2 l 】。 潜在的缺点是，样品萃取液杂质干扰多以及在常规固定相中丙烯酰胺的保留时间不理 想，这一点对于基质复杂的样品尤其显著。要获得理想的灵敏度和准确性，大量繁琐、 耗时的样品前处理工作是必要的。r o s 6 n ，j 等【2 2 】建立的l c - m s 用于所有相关食品中 丙烯酰胺的分析，获得了较好的灵敏度和选择性，检出限5 1 0 “g l ( g ，对谷类食品、 面包屑、土豆片、咖啡等食品而言，其精密度令人满意，相对标准偏差o 9 - - 6 9 。 但咖啡由于难以获得基线分离而被认为是难以处理的样品，近期的研究对此予以了广 泛的关注，建立并验证了咖啡及咖啡饮料中丙烯酰胺的分析方法。 离子色谱法( i c ) 是由经典的离子交换色谱发展而成的新的液相色谱分析技术【2 3 1 ， 且具有快速、灵敏、选择性好的优点，能测定无机或亲水性有机阴离子， s i l v a n o c a r a t l i 1 6 】等曾报道i c 测定食品中丙烯酰胺，此法纯化已经可以达到分析要求， 从而样品处理方法更加简便、快速。色谱参考条件【2 0 】：柱i o n p a c l c e - - a s i ，4m 2 5 0 mm x 7 5p m ，s p 6 0 0 3 ：流动相0 0 0 3m o l l 甲酸+ 3 0 丙酮，流速0 1 5m l m i n ， 进样量2 5p l ，紫外可见检测波长2 0 2n m 可用u v 或m s 检测器，方法线性范围1 0 1 0 0 0p g l ，r = o 9 9 6 、检出限1 0 l g l ，最低检出量为5 0n g ，该法可用于各种食品中 丙烯酰胺的测定，样品处理简便、重现性好。 为了验证不同分析方法，欧盟( e c ) 开展了对饼干、黄油食品中丙烯酰胺分析的 实验室之间的比对试验，共有6 2 家实验室参加1 2 4 1 。结果表明，分析技术对分析结果 有着显著影响，很大比例的结果超出了满意范围，尤其是对饼干样品。 1 2 2 暴露水平及食品中的含量 富含淀粉的食品如 2 5 , 2 6 3 ：炸土豆、炸薯条、炸薯片及薄脆饼干等，都含有相当高 水平的丙烯酰胺，油炸食品中丙烯酰胺含量一般在1 0 0 0l l g k g 以上，炸透的薯片高达 1 2 8 0 0p g k g ，而油炸肉制品【琊7 】( 猪肉、鸡肉、牛肉、香肠、汉堡包) 中丙烯酰胺的 含量很低约5 - - 5 0 “g k g 。面包( 尤其是面包屑) 、谷物食品、咖啡及其替代品也含有 高水平的丙烯酰胺。钟南京【2 8 】等测定表明，我国传统食品油条中丙烯酰胺的含量为3 1 0 t g k g 。除土豆外，特定的谷物食品、咖啡及薄脆饼干被认为是丙烯酰胺饮食暴露的主 要来源，因为这些食品被广大的消费群体日常消费 2 9 1 。此外美国食品与药品管理局 ( f d a ) 还验证了婴儿食品中也有含量不等的丙烯酰胺，世界卫生组织( w h o ) 对从 四川农业大学硕士学位论文 饮水中摄入的丙烯酰胺标准为成人 9 9 美国，s i g m a 公司 甲醇3 4 8 6 0 ( 0 6 0 8 0 4 )色谱纯美国，s i g m a - a l o r i c h 公司 乙酸乙酯( 2 0 0 6 0 7 0 7 )分析纯上海化学试剂有限公司 磷酸二氢钠( 2 0 0 0 0 5 0 7 )分析纯上海新华化工厂 氢氧化钠2 0 0 3 0 7 1 0 5 6 0分析纯南京化学试剂一厂 硫酸( 9 8 ) 2 0 0 6 0 2 0 8分析纯上海化学试剂有限公司 硫酸锌( z n s 0 4 7 1 - 1 2 0 ) 2 0 0 2 0 7 0 6分析纯上海金山化工厂 亚铁氰化钾 k 4 f e ( c n ) 6 3 h 2 0 】2 0 0 2 0 4 0 4 分析纯上海化学试剂一厂 无水硫酸钠n a 2 s 0 4 ( 2 0 0 6 0 8 2 9 )分析纯广东汕头市西陇化工厂 正己烷 ( 2 0 0 6 0 4 0 6 )分析纯上海化学试剂有限公司 硫代硫酸钠n a 2 s 2 0 3 ( 2 0 0 1 0 8 0 4 )分析纯南京化学试剂一厂 溴化钾( 2 0 0 6 0 6 1 7 )分析纯上海凌峰化学试剂有限公司 溴酸钾 ( 2 0 0 2 0 9 0 6 )分析纯上海恒信化学试剂有限公司 乙酸 ( 2 0 0 6 0 8 0 7 )分析纯广东汕头市西陇化工厂 硫酸( 2 0 0 6 0 2 0 8 )分析纯上海化学试剂有限公司 3 2 3 样品制备 样品制备：烧饼、油条、薯片等，自己烤制或者超市购买，粉碎后备用。 四川农业大学硕士学位论文 3 3 试验方法 3 3 1 主要溶液的配制 丙烯酰胺储备液、丙烯酰胺标准工作液、c a r r e zi 试剂和c a r r e zi i 试剂的配制 方法见2 2 1 。 1 0 h 2 s 0 4 ( v 1 0 ：吸取l om l 浓硫酸加入1 0 0m l 水中混匀。 萃取液：正己烷与乙酸乙酯体积比v v = i ：4 溴化钾及无水硫酸钠6 0 0 烘一夜备用。 3 3 2 色谱条件 检测器：二极管矩阵检测器( g 1 31 5 b ，d a d ) 色谱柱： o d s 3c 1 8 ( 2 5 0 0m l i l 木4 6m m 日本，i n t e r s i l 公司) 检测波长：2 1 5n m 柱温： 2 5 流动相：0 0 2 5m o l ln a i l 2 p 0 4 ：c h 3 0 h = 9 1 5 - 8 5 ( 流速：1 0m l m i n 进样量： 2 0p l 3 3 3 样品前处理 第一步：2g ( 薯片1g ) 粉碎样品称入5 0m l 离心管+ 丙烯酰胺标准液5 0 、1 0 0 、 2 5 0 _ t g k g ( 薯片添加2 0 0 0 g k g ) 做回收率检测； 第二步：加入1 9m l 水+ o 5m l c a r r e zi + 0 5m lc a r r e zi i 涡旋混匀； 第三步：超声波提取1 5m i n ，在4 1 5 0 0 0r m i n 离心1 5m i n ，迅速吸取1 0m l 上清液入1 2 5m l 萃取瓶( 如有混浊，上清液可经普通滤纸过滤) ； 第四步：萃取，加入1 0m l 正己烷，充分振荡1m i n ，萃取收集下层水相入棕 色容量瓶中待进一步处理； 第五步：取上述1 0m l 下层萃取液，加入o 6m l1 0 h 2 s 0 4 ( r z ) 混匀，立 即置于4 c 冰箱，预冷1 5m i n ； 第六步：加入衍生试剂：2 5gk b r + 1m l0 1m o l lk b r 0 3 涡旋混匀，然 四川农业大学硕士学位论文 后立即置于4 。c 冰箱避光衍生4 5 6 0m i n ： 第七步：衍生终止，加入1 0 滴左右0 1m o y ln a 2 s 2 0 3 至无色( 中和余溴) ，转 入1 2 5m l 萃取瓶； 第八步：加入1 0m l 萃取液：正己烷乙酸乙酯( v v = i ：4 ) ，充分振荡，萃取收 集上层有机相； 第九步：加入2g 无水硫酸钠振荡干燥1m i n ，将全部干燥液入5 0m l 细颈圆 底烧饼，4 0 1 4 0m b a r 旋转蒸发至干； 第十步：残留物用o 7m l0 0 0 5m o y ln a 0 h 充分摇匀溶解，并加入o 3m l0 1 乙酸中和至p h = 6 7 ( 可适当调整氢氧化钠和乙酸的体积比，使总体积为1m l 即可) ； 第十一步：过o 2 2i l m 有机相滤膜； 第十二步：h p l c 检测。 3 3 4 标样的前处理 第一步：2m la as t1 0p g m l + 8m l 水+ 0 6m l1 0 ( 功h 2 s 0 4 ，棕 色容量瓶，在4 c 预冷1 5m i n ； 第二步：标样的衍生与上述样品的衍生相同，处理方法与检测参考3 3 3 第六 步一第十二步即可。 3 3 5 定量定性方法 3 3 5 1 定性方法 将丙烯酰胺标准工作液( 浓度不限) ，依照3 3 4 的方法衍生处理后，按色谱条 件进行测定，记录其保留时间，作为定性依据。每日进样5 针，记录其保留时间，并计 算保留时间的平均值和日内相对标准偏差；连续检测5 d ，取每日保留时间的平均值， 计算保留时间的日间相对标准偏差。 3 3 5 2 定量方法 将丙烯酰胺标准工作溶液依次从低浓度到高浓度0 0 5 、o 1 、0 2 5 、o 5 、1 0g g m l ， 依照3 3 4 的方法衍生处理后，按色谱条件进行测定。每一浓度进3 针，按其所得峰面 积平均值与对应的标准溶液浓度作标准曲线图，并计算回归方程和相关系数。样品测 定时，以样品的峰面积对应标准曲线上相应的浓度计算样品中丙烯酰胺含量。计算公 式见：式( 3 1 ) 四川农业大学硕士学位论文 x ：i o 0 0 v c ( 3 1 ) 形 式中：x 一样品中丙烯酰胺的含量( “眺g ) c 一标准曲线上对应的丙烯酰胺的浓度( p , g m l ) 矿一溶解样品的溶液体积( m l ) 形一