（食品科学专业论文）红色红曲菌mrr基因的克隆与功能初步研究.pdf

红色红曲菌，l 基凶的克降与功能分析 摘要 红曲菌( m o n a s c u ss p p ) 是用来发酵生产红曲的微生物，它能够产生红曲色素、 m o n a c o l i nk 、丫一氨基丁酸( 丫一a m i n ob u t y r i ca c i d ，g a b a ) 、麦角固醇等生理活性物质， 具有较高的商业价值。目前，国内外关于红曲菌的研究主要集中在菌种分类、选育， 发酵条件研究，桔霉素检测等方面，关于其分子生物学的研究刚刚起步，其功能基 因研究主要集中于色素、桔霉素和m o n a c o l i nk 代谢调控途径等方面。 双组分系统是细菌、植物与真菌中均存在的一种信号传导途径，其包含组氨酸 蛋白激酶与应答调节蛋白两个组分。研究表明，双组分系统在丝状真菌中与氧化应 激应答、渗透压应答及孢子形成有关。目前为止，在红曲菌中关于双组分系统的研 究尚未见报道。 本实验室前期采用根癌农杆菌介导的转化方法建立了包含1 0 0 0 0 多株t - d n a 突 变子的红色红曲菌泓r u b e r ) m 7 转化库。本实验从转化库中选出8 株t - d n a 插入 突变子，并对其菌落形态和显微形态进行了观察。在此基础上，采用t a i l p c r 分 离得到4 株突变子的t - d n a 侧翼序列，并利用s o n p c r 对其中1 株突变子d n a 序列进行了延伸，总共获得5 个基因，发现其中一个基因m r r 的编码蛋白与曲霉属 ( a s p e r g i l l u ss p p ) 压力应答调节蛋白高度同源，利用基因敲除的方法对其功能进行了 初步研究，主要研究内容如下： 1 红色红曲菌突变子t - d n a 侧翼序列的克隆 通过对1 4 3 株t - d n a 插入突变子与出发菌株m 7 菌落形态进行比较，筛选得 到8 株菌落形态发生变化的突变子并对其显微形态进行了观察。采用t a i l p c r 法 对上述8 株突变子t - d n a 插入位点的侧翼序列进行了扩增，得到了3 1 9 2 8 、3 4 4 0 襻、 2 3 4 1 8 、3 7 2 5 “4 株突变子t - d n a 插入位点侧翼序列。其中，突变子31 9 2 4 扩增序列 7 2 6 b p ，与构巢曲霉( a s p e r g i l l u sn i d u l a n s ) 压力应答调节蛋白编码基因重叠1 0 1 b p 。利 用s o n p c r 对此序列进行延伸后获得全长为1 3 6 4 9 b p 的d n a 序列。此序列共包含 5 个基因，其编码氨基酸序列分别与曲霉属c 0 9 6 、n i l 3 蛋白、b o l a 蛋白、a h p c t s a 家族蛋白及压力应答调节蛋白的同源性达到8 0 以上。 2 历基因敲除 压力应答调节蛋白编码基因全长2 3 5 6 b p ，包含6 个外显子，5 个内含子，预测 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 蛋白含6 3 4 个氨基酸，具有一个保守的接受结构域和一个d n a 结合区，这两者是 应答调节蛋白的基本原件。推测该基因可能是红色红曲菌双组分系统中应答调节蛋 白编码基因，将其命名为m r r ( m o n a s c u sr u b e rr e s p o n s er e g u l a t o r ) 。构建脚 基因敲除 载体p c m r r ，并利用农杆菌介导转化的方法成功获得3 株聊突变子。 3m 功能初步研究 对a m r r 突变子的性状进行了初步的研究，发现聊玎基因的缺失使得红曲菌的生 长速度加快，有性发育滞后。m r r 基因的缺失对于红曲菌耐渗特性影响不显著，但其 缺失使得红曲菌对外界氧化压力的敏感性增大，a m r r 突变子h 2 0 2 最大耐受浓度低于 0 3 m m o l l ，而m 一7 的最大耐受浓度高于0 7 5 m m o l l ，推 测m r r 基因与红色红曲菌氧 化应激信号传导和有性繁殖相关。 关键词：红曲菌；t a i l p c r , s o n p c r ；m r r 基因；基因敲除 a b s t r a c t 如刀傩c z 岱s p p ，u s e d f o rr e dr i c ef e r m e n t a t i o n ，i s ak i n do ff u n g iw i t hh i g h c o m i l l e r c i a lv a l u e sd u et oi t sp r o d u c t i o no fm a n y k i n d so fp h y s i o l o g i c a la c n v es u b s t a n c e s ， s u c ha u sm o n a s c u sp i g m e n t ，m o n a c o l i nk ，7 - a m i n o b u t y r i c a c i da n de r g o s t e r 0 1 a tp r e s e n t ， t l l e i n v e s t i g a t i o na b o u tm o n a s c u ss p p w a s f o c u s e do ni t sc l a s s i f i c a t i o n ，b r e e d l n g ， f e m e n 协n o nc o n d i t i o i l sa n dc i t r i n i nd e t e c t i o n , b u tt h es t u d y o nm o l e c u l a rb l o l o g yo f m o 聆伽伽s p p i sa tt h eb e g i n n i n gs t a g e t h ei n v e s t i g a t i o no ff u n c t i o n a l g e n e sa b o u t m o ，2 傩c 淞s p p w a sf o c u s e do n t h eg e n e sr e l a t e dt ot h em e t a b o l i cr e g u l a t i o no ip i 肿e n t ， c i t r i n i na n dm o n a c o l i n sk n l e 撕oc o m p o n e n ts y s t e mw h i c he x i s t si nb a c t e r i a , p l a n t sa n df u n g io o m p h s e s t w o p r o 妇c o m p o n e n t s ，ah i s t i d i n ep r o t e i nk i n a s ea n dar e s p o n s er e g u l a t o rp r o t e l n s 伽y s h o w e dn l a tt h er o l e so ft h et w oc o m p o n e n ts y s t e mw e r ei n v o n e dm o x i d a t l v es t r e s s r e s p o n s e o s m o t i cr e s p o n s ea n ds p o r ef o r m a t i o ni n f i l a m e n t o u sf u n g i u n t l ln o w ，t n e r e w a sn 0f e p o na b o u tt h eg e n e si n v o l v e si nt h et w oc o m p o n e n ts y s t e mm m o 刀船c 淞s p p t h et - d n ai n s e r t e dt r a n s f o r m a n tl i b r a r yo fm o n a s c u sr u b e rm - 7c o n t a i n i n gm o r e t l l a i l10 0 0 0t r a n s f o m a l l t sw a sc o n s t r u c t e di np r e l i m i n a r ys t u d i e s o fo u rl a b o r a t o r y i nt h i s 咖“8t - d n ai n s e r t e dm u t a n sw e r es e l e c t e d ，a n dt h ec o l o n ym o r p h o l o g i e s ，删c 加s c o p l c m o r p h o l o g i e sw e r eo b s e r v e d a f t e rt h a t ，t h et - d n a f l a n k i n gs e q u e n c e so ff o u r 删s w e r ei s o l a t e db yt 舭l p c r , a n do n eo ft h ef o u ri s o l a t e ds e q u e n c e w a se x t e n d e db y s o n p c r 5g e n e sw e r ec l o n e da n dt h ec o d i n gp r o t e i no fm r r ，o n eo f t h ef w e ，h a st n g b h o m o l o g yt 0t h er e s p o n s er e g u l a t o rp r o t e i no fa s p e r g i l l u ss l a p f i n a l l y , t h e f u n c n o no f m r rw a sa n a l y z e db yg e n ek n o c k - o u t t h em a i n r e s e a r c hc o n t e n t sa l ea sf 0 1 1 0 w s ： 1i s o l a t i o no ft h et h et - d n af l a n k i n gs e q u e n c e s o fm o n a s c u sr u b e rm u t a l l t a c c o r d i n gt 0t h ec o m p a r i s o nb e t w e e n 14 3t - d n ai n s e r t e dm u t a n sa n dm - 7 ，8 删1 t a n t sw 讹d i f f e r e n tc o l o n y m o r p h o l o g i e s w e r es e l e c t e d t h e删c r o s c o p l c m o r p h o l o g i e sw e r eo b s e r v e d ，a n dt h e d n as e q u e n c e sf l a n k e dt - d n ab o r d e r o f8 m u t a n t sw e r e 锄p l i f i e db yt a i l p c r a n dt h et - d n af l a n k e ds e q u e n c e so f3 4 4 0 ”，2 3 4 1 ” a n d3 7 2 5 # w e r es u c c e s s f u l l yi s o l a t e d 7 2 6 b pi s o l a t e df r o m3 1 9 2 ”h a s a1 0 1 b p 代g l o no f o v e r l a pw 池a s p e r g i l l u sn i d u l a n ss t r e s sr e s p o n s er e g u l a t o r as e q u e n c e w l t l ll e n g t t lo t 13 6 4 9 b pw a sc l o n e db ye x t e n d i n gt h e f l a n k e ds e q u e n c e so ft h e7 2 6 b pr e g i o nb y s o n p c r , a n di nt h es e q u e n c e ，5g e n e sw e r ef o u n dt oh a v em o r et h a n8 0 h o m o l o g y 、析t l lc 0 9 6 。n i l 3 ，b o l a ，a h p c t s af a m i l ya n dr e s p o n s er e g u l a t o rp r o t e i n ，r e s p e c t i v e l y i i i 7 2g e n ek n o c k o u to fm r r 华中农业大学2 0 0 9 届硕上学位论文 t h em r r ( m o n a s c u sr u b e rr e s p o n s er e g u l a t o r ) e n c o d i n gt h er e s p o n s e r e g u l a t o r p r o t e i nc o n t a i n s2 3 5 6 b pw i t h6e x o n sa n d5i n t r o n s a n dt h ed e d u e da m i n oa c i d ss e q u e n c e o f ，行玎c o n t a i n e d6 3 4a m i n oa c i d s 晰t l lar e c e i v e rd o m a i na n dad n ab i n d i n gd o m a i n w h i c hb o t hw e r et h eb a s i cc o m p o n e n t so fr e s p o n s er e g u l a t o rp r o t e i no ft h et w o c o m p o n e n ts y s t e m t oa n a l y z et h ef u n t i o no f ，纷i nm o n a s c u ss p p t h eg e n ek n o c k o u t v e c t o rp c m r rw a sc o n s t r u c t e da n dt r a n s f o r m a t e di n t om o n a s c u sr u b e rm 一7b yt h e m e t h o do f a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sm e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n f i n a l l y 3 ，竹玎m u t a n t s w a so b t a i n e d 3p r i m a r i l ys t u d yo nt h ef u n c t i o no fm r r t h ec h a r a c t e r so fa m r rm u t a n tw e r es t u d i e da n dt h er e s u l t ss h o wt h a tt h eg r o w i n g r a t eo fa m r rm u t a n tw a sf a s tt h a nm - 7 ，w h i l et h es e x u a ld e v e l o p m e n to fa m r rm u t a n t w a ss l o w e r m r rw a sn o ti n v o l v e di no s m o s t r e s sr e s i s t a n c eb u tw a sr e q u i r e df o rh 2 0 2 r e s i s t a n c e ，t h em a x i m u mt o l e r a t e dc o n c e n t r a t i o no f x ，咒m u t a n tw a sl e s st h a n 0 3 m m o l l ，w h i l et h em - 7i sh i g h e rt h eo 7 5 m m o l l ，m 玎w a sp r e s u m e dt ob er e l a t e dt o o x i d a t i v es t r e s ss i g n a lt r a n s d u c t i o na n ds e x u a lr e p r o d u c t i o no f m o n a s c u s s p p k e yw o r d s ：m o n a s c u sr u b e r ；t a i l p c r ；s o n - p c r ；坍；g e n ek n o c k o u t i v 红色红曲菌m 基冈的克隆与功能分析 缩略语表 v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否如需保密，解密时间年 月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地：h - 夕_ t - ，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 鼢物帆坤年6 月g 日 i 学位论文使用授权书 糊黼始嬲摊名：钐地 签名日期硼年厶g 名签名魄呻6 月器日 注：请将本表真接装订在学位论文的扉页和目录之间 红色红曲菌朋基冈的克隆与功能分析 第一章文献综述弟一早义陬琢尬 1 红曲菌的分子生物学研究 红曲菌( m o n a s c u ss p p ) 是用来发酵生产红曲的微生物，其发酵产物红曲在我国古 代被广泛用于酿酒，酿醋，食品着色和防腐等诸多领域( 张徐兰等，2 0 0 6 ) 。随着对 红曲菌研究的逐步深入，发现红眭菌除了能够产生大量的红曲色素之外，还能产生 m o n a c o l i nk 、丫一氨基丁酸0 一a m i n ob u t y r i ca c i d ，g a b a ) 、麦角固醇等一系列的生理 活性物质，具有较高的商业价值，但是，红曲菌产桔霉素的问题在一定程度上限制 了其应用( 杨涛等，2 0 0 5 ) 。 目前，国内外关于红曲菌的研究主要集中在菌种分类( 邢旺兴等，2 0 0 4 ) 与选育( 孙 嘉龙等，2 0 0 7 ) ，发酵条件研究( 汪志君等，2 0 0 7 ) ，桔霉素检测( 柴秋儿等，2 0 0 8 ) 等 方面，关于其分子生物学的研究才刚刚起步，在红曲菌分类、d n a 文库构建、遗传 转化体系的建立，m o n a c o l i nk 和桔霉素代谢调控途径相关基因的研究等方面取得了 一定的进展( 黄欣等，2 0 0 9 ；蒋丽娟等，2 0 0 9 ；李燕萍等，2 0 0 8 ；c h e ne ta l ，2 0 0 8 ) 。 1 1d n a 分子标记方法在红曲菌分类中应用 红曲菌的命名在分类上尚有不完备之处，至今为止国际上尚没有一个统一的标 准，近年来，d n a 分子标记技术以其快速、准确、灵敏的优点逐渐成为微生物分类 鉴定的重要手段之一。 p a r k 等( 2 0 0 3 ) 根据红曲菌r r n a 上l s u ( 1 a r g es u b u n i t ) 基因的d 1 d 2 区序列同源性 对6 5 个红曲菌的菌株进行了分类，结果将这6 5 个菌株分为5 类( c u l s t e r ) 。p a r k 等( 2 0 0 4 ) 通过扩增红曲菌的i t s ( i m e m a lt r a n s c r i b e ds p a c e r ) 及部分d m b u l i n 基因序列对红曲菌 属1 7 个a t c c 参考菌株的亲缘关系进行了分析，结果表明mr u b e r 和mp i l o s u s 属于同 一个种。丁红梅等( 2 0 0 7 ) 禾1 j 用随机引物对1 0 株红曲菌进行r a p d ( r a n d o ma m p l i f i e d p o l y m o r p h i cd n a ) 分析，结果显示1 0 株红曲菌的同一性高达7 3 3 2 ，说明其遗传背 景有很大的相似性，且r a p d 的结果与菌株间的形态差异相关；丁红梅等( 2 0 0 8 ) 通过r a p d 分析从红曲菌株f 中获得一条特异片段，并将该特异r a p d 标记转化为稳 定的s c a r ( s e q u e n c ec h a r a c t e r i s e da m p l i f i e dr e g i o n ) 标记作为f 菌株的特异d n a 指纹， 可在l d 内对f 菌株作出准确鉴定。许璐( 2 0 0 7 ) 乖u 用i g s ( i n t e r g e n i cs p a c e r ) 、i s s r ( i n t e r 华中农业大学2 0 0 9 届硕上学位论文 s i m p l es e q u e n c er e p e a t ) 、s r a p ( s e q u e n c er e l a t e da m p l i f i e dp o l y m o r p h i s m ) 三种方法对6 7 株红曲菌进行分类。其研究表明，i g s 片段具有很好的多态性，对不同菌株的区分度 较高，可用作种内不同菌株的鉴别；i s s r 扩增获得的多态性条带对不同种间的区分 度最高，比较适于红曲菌的种间鉴别；s r a p 扩增得到的条带最丰富，但亲缘关系较 近的菌种不易区分，比较适于红曲菌种群的分析。 d n a 分子标记技术正越来越多地应用于红曲菌的分类与鉴定中，但目前还没有 一种分子标记技术能单独胜任对红曲菌的鉴定，在红曲菌的分类研究中，尤其是在 鉴定一个新种的时候，需要应用多种方法进行综合分析。 1 2 红曲菌基因文库的构建 为了分离和获得生物体特定的基因片段，对生物体基因的结构、功能、表达及 其调控进行研究，最常用的方法便是建立基因文库。在红曲菌分子生物学背景不明 确的前提下，基因组文库的构建为获得红曲菌基因提供了方便的渠道。 赖卫华等( 2 0 0 3 ) 应用s s h 技术( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ) ，构建红曲菌 产桔霉素和不产桔霉素差异表达的c d n a 消减文库，并在此基础上，构建了另一个与 红曲菌产桔霉素相关的c d n a 消减文库( 赖卫华等，2 0 0 5 ) 。熊勇华等( 2 0 0 4 ) 研究探讨 了红曲菌s a g e ( s e r i a la n a l y s i so fg e n ee x p r e s s i o n ) 文库构建过程中总r n a 提取、 m r n a 分离纯化、c d n a 合成以及双标签( d i t a g s ) 的制备方法，并通过p c r 条件的优化 获得双标签p c r 的最佳模板稀释浓度及扩增循环，为建立完整的s a g e 文库奠定理论 基础。李燕萍等( 2 0 0 8 ) 构建了红曲菌的基因组f o s m i d 文库，库容量为3 x 1 0 4 ，平均插 入片段长度为3 6 6 k b ，为克隆聚酮化合物基因簇或其他重要基因及其功能的研究奠 定了基础。 1 3 红曲菌遗传转化方法 近年来，许多遗传转化方法被应用于丝状真菌的研究中，并且有些方法已经在 红曲菌的转化中得到了成功应用。 国外在2 0 0 3 年对红曲菌遗传转化体系的报道较多，所用方法分别有电转化法 ( l a k r o de ta l ，2 0 0 3 ；k i me ta l ，2 0 0 3 ) ，原生质体转化和根癌农杆菌介导转化法 ( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sm e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n ，a t a m ) ( c a m p o ye ta l ，2 0 0 3 ) 等。 在国内，周礼红等( 2 0 0 6 ) 考察和比较了基于原生质体的传统转化和电击转化、基于 萌发孢子的电击转化以及r e m i ( r e s t r i c t i o ne n z y m e m e d i m e di n t e g r a t i o n ) 4 种不同的 2 红色红曲菌m r r 基冈的克隆与功能分析 红曲菌转化方法，发现r e m i 技术更适合于红曲菌的转化。邵彦春等( 2 0 0 6 ) 建立了 根癌农杆菌介导的红曲菌高效转化体系，并构建了以红色红曲菌( m r u b e r ) m 一7 为出 发菌株的t - d n a 插入转化库。李燕萍等( 2 0 0 7 ) 优化了橙色红曲菌( m a u r a n t m c u s ) a s 3 4 3 8 4 原生质体制备及再生条件，最终原生质体数可达8 1 07 + m l ， 再生率达到1 8 ，并建立了p e g 8 0 0 0 介导的原生质体转化方法。c h e n 等( 2 0 0 8 ) 利用 金精三羧酸( a u r i n t r i c a r b o x y l i ca c i d ，a t a ) 处理原生质体，结果表明此种方法能够提 高红曲菌遗传转化效率。 1 4 红曲菌功能基因的研究 红曲菌分子生物学研究起步较晚，其功能基因的研究尚处于起步阶段，相关报 道不多，而且主要集中在色素、桔霉素和m o n a c o l i nk 代谢调控途径相关基因的研 究上。 1 4 1 色素和桔霉素相关基因的研究 红0 i i 色素是红曲菌生长过程中产生的次生代谢产物，是一种优质的天然色素， 具有极高的商业价值，同时在红曲菌代谢产物中也存在一种真菌毒素桔霉素。 桔霉素具有肾毒性，不仅可以致畸，导致肿瘤，还可以诱发突变( 赖卫华和许杨， 2 0 0 2 ) 。红曲色素和桔霉素的生物合成开始于同一起点，红曲色素的生物合成是由1 个乙酰辅酶a 和3 个丙二酰辅酶a 在聚酮体合成酶( p o l y k e t i d es y n t h a s e ，p k s ) 作用 下生成四酮化合物，再在1 个丙二酰辅酶a 的参与下生成五酮化合物，进而合成六 酮化合物，产生红曲色素。而桔霉素的合成从四酮化合物起与色素合成分开( h a j j a j ， 1 9 9 9 ) 。红曲菌中桔霉素和色素的合成在起始阶段共用一个p k s 基因，通常情况下， 产色素量高的菌种产生桔霉素的量也较多。 s h i m i z u 等( 2 0 0 5 ) 针对真菌的p k s 保守序列设计简并引物，对彪p u r p u r e u s 进行 扩增，进而获得p k s 基因的全长序列，发现其缺失突变株不产桔霉素，回复突变后 可恢复产桔霉素的能力，由此推测肱p u r p u r e u s 中p k s c t 基因编码的p k s 与桔霉素 的生物合成有关。周礼红( 2 0 0 6 ) 分离、克隆了红色红曲菌p k s c t l 和# s e t 2 基因， 确证p k s c t l 是红曲菌桔霉素合成途径中一个关键聚酮体合成酶的编码基因。s h i m i z u 等( 2 0 0 7 ) 在p k s c t 基因上游克隆得到新的基因c t n a ，发现其为桔霉素生物合成途径 中主要的激活因子。南昌大学对橙色红曲菌( 肱a u r a n t m c u s ) a s 3 4 3 8 4 桔霉素合成途 径相关的基因进行了研究，魏康霞( 2 0 0 7 ) 克隆得到3 条p k s 基因，其中m a p k s l 为 华中农业人学2 0 0 9 届硕：f ：学位论文 非还原性i i i 型p k s 基因，其编码的蛋白可能参与桔霉素的合成，m a p k s 3 和m a p k s l 0 为还原性p k s 基因，其翻译蛋白与负责合成t - 毒素和洛伐他汀的聚酮合酶具有同源 性；付桂明( 2 0 0 7 ) 分析了1 4 株产桔霉素菌株中桔霉素合成基因p k s c t 基因的保守性， 发现p k s c t 基因具有高度的保守性，并构建了橙色红曲菌p k s c t 基因敲除载体，获 得p k s c t 基因缺失菌株p h d s 2 6 ，其桔霉素生成量比出发菌株降低了9 7 2 ，红色 色素和黄色色素的色价分别提高了4 9 4 和2 8 8 ；阮琼芳( 2 0 0 7 ) 对橙色红曲茵a c s 基因和g m c 基因进行了敲除，结果表明，a c s 参与桔霉素和红曲色素代谢过程中 聚酮链骨架和十酰辅酶a 的合成，g m c 参与桔霉素和红曲色素的p k s 后修饰过程。 c h e n 等( 2 0 0 8 ) 研究发现p k s c t ，c t n a ，d 椰基因在1 8 种红曲菌中的分布不同，p k s c t 基因在mp u r p u r e u s ，彪k a o l i a n g 和ms a n g u i n e u s 中高度保守，s o u t h e r n 分析表明 p k s c t ，c t n a 和d 椰在mp i l o s u s ，肱t u b e r ，肱b a r k e r i ，m f l o r i d a n u s ，ml u n i s p o r a s 和mp a l l e n s 中不存在或与其它种存在显著的不同。 1 4 2m o n a c o l i nk 相关基因的研究 m o n a c o l i nk 是红曲菌的次生代谢产物，属洛伐他汀( 1 0 v a s t a t i n ) 类物质，对羟甲 戊二酰辅酶a ( h m g c o a ) 还原酶( h m g r ) 具有强大的竞争性抑制作用，能有效地、 特异性地抑制胆固醇的合成( e n d o ，1 9 7 9 ) 。s u t h e r l a n d 等( 2 0 0 1 ) 阐述了洛伐他汀的生 物合成途径：乙酸和丙二酸经缩合、还原、脱水形成二酮( d i k e t i d e ) q b 间体，这一过 程由酮基还原酶( k r ) 、烯醇还原酶( e r ) 或甲基转移酶( m e t ) 催化，并重复此过程形成 己酮体( h e x a k e t i d e ) ，接下来经酶促d i e l s a l d e r 反应产生双环萘烷( d e c a l i n ) 骨架，这 一双环加成物延伸成九酮体( n o n a k e t i d e ) ，后经一系列反应可生成m o n a c o l i n k 。 高蓝( 2 0 0 6 ) 用以土曲霉( a s p e r g i l l u st e r r e u s ) 洛伐他汀合成酶基因为基础设计的引 物对红曲菌基因组进行p c r 扩增，结果在红曲菌基因组中相当于土曲霉洛伐他汀合 成酶基因的l n k s 区域扩增得至u 7 4 5 b p 的核酸片段，其序列与土曲霉合成酶的这一区 域序列相同，推测土曲霉和红曲菌洛伐他汀合成酶基因存在同源区域。周礼红( 2 0 0 6 ) 克隆了红色红曲菌的r o o k l 基因，初步推定其为红曲菌九酮体合成酶编码基因。c h e n 等( 2 0 0 8 ) 研究了mp i l o s u sb c r c 3 8 0 7 2 ，推测其洛伐他汀合成酶基因簇包括m k a m k 等9 个基因，与土曲霉洛伐他汀生物合成基因簇具有5 4 的相似性，其中m k , 4 编码p k s 蛋白，m 胜基因正调节m o n a c o l i nk 生物合成基因和m o n a c o l i nk 的产量。黄欣等( 2 0 0 9 ) 从红曲菌c i c c 5 0 3 1 中克隆得到聊胜，基因，长1 4 6 4 b p ，编码4 5 5 个氨基酸，与土曲霉o r e 编码蛋白同源性很高，是洛伐他汀生物合成酶调控基因。 4 红色红曲菌所”基因的克隆与功能分析 除此之外，在红曲菌其他功能基因的研究方面也取得了些进展。如z h a n g 和 m i y a k e ( 2 0 0 7 ) 从肱p i l o s u s 中克隆得到了浅蓝菌素抗性基因m p m a t ，编码5 5 9 个氨基 酸，包含1 1 个跨膜区域，研究其功能为向外转运浅蓝菌素及增加mp i l o s u s 对浅蓝 菌素的莸茬：尽管红曲菌功能基因的研究在近年来取得了一定的成果，但是其深度 和广度有限，还有大量值得研究的空间。 2t a i l p c r 与so n p c r 研究一个基因的结构、功能及其表达产物的特性，完整的基因信息是必需的， 特别是在获得一段已知序列后，对其侧翼序列进行扩增进而拿到全长基因的方法显 得尤为重要。大量用于侧翼序列扩增的p c r 方法被建立，包括s e f a p c r ( s e l f - f o r m e d a d a p t o rp c r ) ( w a n ge ta l ，2 0 0 7 ) 、d w - a c p - p c r ( d n aw a l k i n g - a n n e a l i n gc o n t r o lp r i m e r p c r ) ( h w a n ge ta l ，2 0 0 3 ) 、t 接头p c r ( t - l i n k e r - s p e c i f i cl i g a t i o np c r ) ( y a n e ta l ，2 0 0 3 ) 、 锅饼p c r ( p a n h a n d l ep c r ，p - p c r ) ( j o n e s ，1 9 9 5 ) 、载体介导的p c r ( v e c t o r e t t ep c r ) ( a r n o l da n dh o d g s o n ，1 9 9 1 ) 、捕捉p c r ( c a p t u r ep c r ) ( l a g e r s t r o m e ta l ，19 9 1 ) 、连接 介导p c r ( 1 i g a t i o nm e d i a t e dp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，l m p c r ) ( p f e i f e re ta l ，19 8 9 ) 、 锚定p c r ( a n c h o r e dp c r ) ( l o he ta l ，1 9 8 9 ) 和反晦j p c r ( i n v e r s ep c r ，w c r ) ( o c h m a ne t a l ，1 9 8 8 ) 等。上述方法各有其优缺点，而1 9 9 5 年由l i u 和w h i t t i e r 提出的热不对称交 错p c r ( t h e r m a la s y m m e t r i ci n t e r l a c e dp c r ，t a i l p c r ) ，只需通过琼脂糖凝胶电泳即 可证明产物的特异性，给侧翼序列的扩增带来了极大的方便。 2 1t a i l p c r t a i l p c r 是随机引物p c r 的一种，是由l i u 和w h i t t i e r ( 1 9 9 5 ) 第一次提出的，这 种方法利用3 个嵌套的s p 引物( s p e c i a lp r i m e r ) 和1 个较短的a d 引物( a r b i t r a r y d e g e n e r a t ep r i m e r ) 弓l 发p c r 扩增。该方法的理论基础是：根据已知序列设计的s p 三2 1 物 具有一个较高t m 值，而与未知序列结合的a d 引物具有一个较低的t m 值，二者之间 差值1 0 1 5 ，利用几组热不对称交错p c r ，通过控制退火温度来调节s p 引物和a d 引物与模板的复性，使得特异性p c r 产物得到有效扩增。 这种p c r 反应一般有3 种产物生成：由s p 引物和a d 引物共同延伸产生的i 型产 物，由s p ；3 物单独延伸产生的型产物和由a d 引物延伸产生的i i i 型产物。t a i l p c r 用特殊的热循环程序使p c r 反应有利于i 型产物的扩增，而抑带l j i i i 型非特异性产物的 扩增。这种策略的关键是通过控带u p c r 循环中的退火温度决定在p c r 反应中何种引 华中农业人学2 0 0 9 届硕：j ：学位论文 物能够起作用，从而控制不同类型产物的生成。 t a i l p c r 的关键是选择合适的s p 引物和a d 引物，一套合适的引物可以使反 应表现出很高的特异性。t a i l p c r 自1 9 5 5 年创立至今，研究者在应用的同时对其 进行了许多的改良。t e r a u c h i 和k a h l ( 2 0 0 0 ) 在进行t a i l p c r 的时候，用1 0 b p 的r a p d 引物代替a d 引物，同时设计了5 个嵌套的s p 引物，其中3 个用于第3 轮反应，提 高了t a i l p c r 的扩增效率。应革等( 2 0 0 2 ) 在第3 轮反应中采用t a i l 循环代替普通 p c r 循环，不但可以有效地抑制非特异性产物的扩增，相对增加特异性产物的丰度， 且其采用3 种不同的t a q 酶与a d 引物组合，大大增加了可选性与成功性。l i u 和 c h e n ( 2 0 0 7 ) 又对t a i l - p c r 进行了改良，提出高效t a i l - p c r ( h i g h e f f i c i e n c yt h e r m a l a s y m m e t r i ci n t e r l a c e dp c r ) ，其在反应中使用特殊设计的3 3 3 4 b p a d 引物，同时优化 了相应的循环条件，并将之运用于转基因大米t - d n a 侧翼序列的扩增，扩增效率高 于9 0 ，且大部分序列长度在1 - 3 k b 之间。陈军营等( 2 0 0 8 ) 在已有t a i l p c r 程序的 基础上，省去了1 0 次较低特异性循环，延长变性时间，取得了较好的扩增效果。 2 2s o n p c r 单核苷酸套式p c r ( s i n g l eo l i g o n u c l e o t i d en e s t e dp c r ，s o n p c r ) 是较新的一种侧 翼序列扩增技术，是a n t a l 等( 2 0 0 4 ) 对t a i l p c r 进行改良后提出的。其通过根据已知 序列设计的嵌套式单向s p 引物，对未知侧翼序列进行扩增，扩增程序为：变性后进 行少量的高退火温度循环，这时s p 引物进行单引物循环，获得包含靶序列的单链 d n a ；然后进行一个超低退火温度循环，在此过程中s p 引物发生错配，在引物下游 未知序列上产生反向的结合位点，经过延伸后单链变成两端含有s p 引物结合位点的 双链；最后又进行多个高退火温度循环，富集双链d n a ，达到扩增侧翼序列的目的。 通过2 3 条嵌套引物，经过2 3 轮p c r ，可以提高目的产物的丰度，降低非特异产物的 产量。 邓洪渊等( 2 0 0 6 ) 对其进行了改进，在第二轮反应中先以外侧巢式引物配对5 端选 择性扩增，然后再加入第一轮引物特异结合单链3 端引发指数扩增，使特异性和扩 增效率都得到很大提高，产物长度也得到最大保证。另外，增加第一轮反应的循环 数将体系中的引物残留降到最低以及将产物稀释倍数进行适当调整，都有助于减少 第一轮引物引发两端扩增的可能性。 t a i l - p c r 与s o n p c r 都不需要在p c r 前进行任何d n a 操作，对模板的量要 求不高，用时短，成本低廉；但t a i l p c r 对引物和模板的纯度要求高( 彭玮欣等， 红色红曲菌小幕因的克隆与功能分析 2 0 0 1 ) 。t a i l p c r 已被应用于哺乳动物，拟南芥，小麦，水稻及克隆载体上d n a 序列的分离( 罗丽娟和施季森，2 0 0 3 ) ，并在医学上得到了广泛的应用( 苗灵凤等， 2 0 0 7 ) 。而s o n p c r 目前为止只在部分真菌( a n t a l ，2 0 0 4 ) 和植物( 肖燕等，2 0 0 8 ) 中得 到应用，具有广阔的应用前景。 3 基因敲除技术在丝状真菌中的应用 丝状真菌是真菌中一个很大类群，在工业、农业、医药及基础生物学研究中具 有重要作用，多年来一直被广泛地研究。目前，包括构巢曲霉( a s p e r g i l l u sn i d u l a n s ) 、 粗糙脉孢霉( n e u r o s p o r ac r a s s a ) 、烟曲霉( a s p e r g i l l u s f u m i g a t u s ) 、稻瘟菌( m a g n a p o r t h e g r i s e a )