（食品科学专业论文）功能性食品添加剂——谷胱甘肽分离纯化工艺的研究.pdf

摘要 摘要 谷胱甘肽( g s h ) 是一种生物活性三肽。g s h 在生物体内具有多种重要的生理功能， 在临床医药、食品工业、体育运动及有关生物研究领域都有着广泛的用途。 本文对产朊假丝酵母( c 口n 疥出甜，玎西聊掰d ? 一) g s h 积累株酵母细胞中g s h 的提 取分离和纯化进行了研究。研究的主要内容如下： 研究确定了实际体系中影响谷胱甘肽稳定性的主要因素是p h 值和温度：p h 值为 l 2 谷胱甘肽较稳定；谷胱甘肽在常温下保藏两天相对较稳定，在2 0 m i n 内1 0 0 下提 取液g s h 时，其损失率较小。因此，在对g s h 进行分离纯化过程中应尽量避免较高p h 和高温。 研究了应用超滤技术去除富含谷胱甘肽的产朊假丝酵母提取液中的蛋白质的最佳 工艺操作参数；同时为提高谷胱甘肽回收率，比较了间歇稀释过滤( d d ) 和连续稀释 ( c d ) 过滤两种稀释方法的优缺点，最终确定采用间歇稀释过滤和超滤相结合的方法 分离纯化谷胱甘肽。另外，实验还确定了超滤膜最佳的清洗方法： 本实验研究了超滤技术对谷胱甘肽在阳离子交换树脂( o o l 7 ) 上的交换行为的影 响。同时对影响固定床离子交换吸附的条件的研究，确定了最佳上柱和洗脱的工艺参数， 最终的g s h 回收率达到8 0 2 ，蛋白质去除率6 0 ，g s h 浓缩倍数达2 5 倍( 高峰时 达到8 3 倍) ，纯化倍数为3 9 倍，获得了良好的分离效果。 在上述研究的基础上，通过改进提取工艺，对谷胱甘肽的工业化生产路线进行了简 化，使得富含g s h 的产朊假丝酵母经提取、离交、浓缩和干燥简单四步主要单元操作， 得到含量为11 3 谷胱甘肽复合产品。 关键词：谷胱甘肽，分离，纯化，食品添加剂 江南大学硕= l 学位论文 a b s t r a c t g s h ( t h er e d u c e df o r n lo fg l u t a t h i o n e ) i so n eo ft h em 巧o rn o n p m t e i nt h j o lc o m p o u n d s g s hi sw i d e l yd i s t r i b u t e di nn a t u r ea n dp l a y sm a n yi n l p o n a n tp h y s i 0 1 0 9 i c a lr o l e si nl i v i n g c e l l s s i n c eg s h i s 、i d e l yu s e di 1 1m a l l yf i e l d s ，f p c l i n i c a lm e d i c i n e ，f o o di n d u s t r y ，a t h i e t i c s p o r t sa i l db i 0 1 0 9 i c a lr e s e a r c h ，t h ed e m a i l do fg s h h a sb e e ne x p a n d i n g i nt 1 1 i sp 印e r ，t h e s e p a r a t i o na n dp u r i n c a t i o np r o c e s so f9 1 u t a t l l i o n e 行o m ( k 玎优d h “f f 凰w s h0 2 一0 8w e r e i n v e s t i g a t e di nd e t a i l t h em a i nr e s u l t sw e r ed e s c r i b e da sf o l l o w s ： i tw a sf o u n d 廿l a tt h es t a b i l i t yo fg s hw a sd e t e h n i n e db yp ha 1 1 dt e m p e r a t u r ei nt h e e x 妇c t i n gs o l u t i o n i i la d d i t i o n ，ah i 曲g s hs t a b i 】i t y w a so b s e r v e dw h e np hv a l u ea tt h e r a n g eo f1 t o2a 1 1 da tr o o m t e m p e r a t u r ef o rt 、v od a y s f u n h e m o r e ，o i l l yal m l eo fg s h w a s d e g r a d e dw h e ng s he x t r a c tw a st r e a t e db y1 0 0 f o r2 0m i n u t e s t h o s er e s u l t si n d i c t e dt 1 1 a t ， a no p t i m i z a t i o np ha n dt e m p e r a t i l r ei sr e q u i r e df o rg s h s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n a n 叩t i l l l a lo p e m t i o np a r 锄e t e r sf o r r e m o v i n gp r o t e i n 舶m 胛讲砌“棚sw s h 0 2 0 8 e x a c t i o nb vu l t f a f i l t r a i o nw e r ed e t e n n i n e d a tt 1 1 es 锄et i n l e i no r d e rt of u n l l e ri n c r e a s et h e r e c o v e r ym t eo fg s h ，t h ea d v a l l t a g e sa 1 1 dd i s a d v a m a g e so fd o 丌1 1 a 1 1 c yd i l u t i o n ( d d ) a n d c o n t i 肌o u sd i i u t i o n ( c d ) w e r ec o m p a r e d b a s eo nt h o s er e s u l t s ，a 1 1i n t e g r a t e dp m c e s s i n go f d da 1 1 du 1 仃a f i l 仃a i o nw a sd e t e n n i n e da 1 1 da st h em o s te c t i v em e t h o dt os e p a m t ea i l dp u r i 母 f u r t h e m o r e ，t 1 1 ec l e a n i n gp m c e s so fu l 仃a f i l t m t i o nm e m b 砌ew a sa l s od e t e h n i n e di nn l i s p a p e l 1 1 1 ea 船c t so fu l t r a f i l t r a i o no nt h ee x c h a n g ea c t i o no fg s ho nc a t i o ne x c h a n g er e s i n ( 0 01 7 ) w e r es t i l d i e d t h eo p t i m a lp a r 锄e t e r so fa d s o r p t i o na n de l u t i o n 、v e r ed e t e m l i n e dt h m u g h m es t u d yo fc o n d i t i o n sa f f b c t i n gi o ne x c h a n g i n ga n da d s o r p t i o no ff i x e db e d t 1 1 er e s u l t sw a s f e u o w ：t h er e c o v e r yr a t eo fg s h8 0 2 ，t h er e m o v a lr a t eo fp r o t e i n6 0 ，t h ec o n c e n t r a t i o n r a t i oo f g s h 2 5 ：l ( a tm o s t8 3 ：1 ) ，t h ep u r i f i c a t i o nr a t e3 9 w i t ht h o s eo p t i m a lc o n d i t i o n s ，a 1 1 e 珩c i e n tg s h s e p a r a t i o nw a s a c l l i e v e d b a s e do nt h o s er e s u l t s ，a ni n d u s 埘a l i z e dp r o c e s sf o rg s he x t r a c t i o nh 愠sd e v e l o p e d a e n d p r o d u c tw h i c hc o n t a i nl1 3 g s hw a so b t a i n e d ，a r e r ( d 池“r 玎括w s h0 2 一0 8w a s t r e a t e db ye x t r a c t e d ，i o ne x c h a n g e d ，c o n c e n t r a t e da n dd r i e d 1 ( e y w o i 。d ：g 1 u t a t h i o n e ，s e p a r a t i o n ，p u r i n c a t i o n ，f u n c t i o n a lf o o da d d i t i v e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：查越日期：必彩，年月肛日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阗，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：盥导师签名：乙落 日期：年g 月忙日 第一章绪论 1 1 谷胱甘肽的性质和分布 第一章绪论 谷胱甘肽，即y l 谷氨酰- l 一半胱氨酰甘氨酸( y l g l u t 锄y i l c y s t e 血y 1 9 1 y c h e ， g l u f a “o n e ，缩写g s h ) ，是由l 一谷氨酸、l 半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的一种同 时具有y 谷氨酰基和巯基的生物活性三肽化合物。早在18 8 8 年，法国科学家d er e v p a h l a d e 就在面包酵母的乙醇萃取物中首先发现了谷胱甘肽，将其命名为p l l i l o “o n ； 1 9 2 1 年，英国生物化学家h o p k i n s 从酵母抽提物中分离得到了谷胱甘肽并正式命名为 g l u t a t h i o n e ；作为生物体内的非蛋白巯基化合物，谷胱甘肽主要有还原型( g s h ) 和氧 化型( g s s g ) 两种形态，在机体中大量存在并起主要作用的是还原型谷胱甘肽。酵母 细胞中氧化型和还原型谷胱甘肽之间的相互转化过程见图1 1 【2 ，3 1 。 ，k p r d d i c d t s 图1 1 酵母细胞中谷胱甘肽的形态转化过程 c e h u t 8 r e n e 氇， g s h 是细胞中最丰富的小分子硫醇类化合物，其结构特点是分子中含有一个特殊的 y 肽键：由l 一谷氨酸y c o o h 与l 半胱氨酸的吐n h 2 缩合成的肽键，它不同于蛋白质分 子中的普通肽键【4 j o g s h 的分子量为3 0 7 3 3 ，熔点1 8 9 1 9 3 ( 分解) ，等电点为5 9 3 1 5 ， ，比旋光度为 q 】d ”= 1 9 。( c = 4 6 5g l 1 ，h 2 0 ) ，晶体呈无色透明细长柱状。它易溶于 水、稀醇、液氨和n ，n 二甲基甲酰胺，但微溶于醇、醚和丙酮等有机溶剂。g s h 固体 较为稳定，但其水溶液在空气中极易被氧化成g s s g 。g s s g 是由两分子g s h 经氧化脱 氢而形成的以二硫键连接的二聚体，一般以水合物的形式存在，其熔点为1 7 8 1 8 2 ， 比旋光度为【a d 2 0 = 1 0 8 。( c = 2 og l ，h 2 0 ) ，分子量为6 1 2 6 3 ，是一种溶于水的白色晶 体【5 】。g s s g 可以由谷胱甘肽还原酶还原成g s h ，这个酶是黄素蛋白，它能利用n a d p h 作为电子供体。正常情况下大多数生物细胞中g s h 与g s s g 的比例约为l o o ：1 【6 】。g s h 在水溶液中的构象存在分子内氢键，而g s s g 无此现象发生【7 】。其g s h 和g s s g 的化 学结构见图1 2 和图1 3 。 江南大学硕士学位论文 l i ：l i ： m 2 1 i 佣2 “弋r f r 叫也q 0 0 “ c 0 c h ：e h 2： ：h 一g g 图1 3 g s s g 的化学结构 谷胱甘肽在自然界中广泛分布于动物、植物和微生物细胞内，其中以酵母、小麦胚 芽以及人和动物肝脏、肾、红细胞和眼睛晶状体中含量较为丰富，许多植物如蔬菜、豆 类、谷物、薯类、菇类等也含有一定量的g s h 【8 1 。动物细胞中的g s h 主要起着巯基缓 冲剂的作用，人体血液中g s h 的正常浓度为3 7 1m g l ，肝脏、肾脏是g s h 主要的合 成、代谢和排泄器官【9 】。另外，g s h 还可以在红细胞中合成且都以还原形态存在1 ”。 1 2 谷胱甘肽的功能及应用前景 谷胱甘肽在生物体内有着多种重要的生理功能，特别是对于维持生物体内适宜的氧 化还原环境起着至关重要的作用【6 “j 。自从g s h 被发现以来，它不仅作为试剂广泛用于 生物化学、医学、生物学和化学的研究测定中，而且已成为一种重要的生化药物。越来 越多的临床实验结果表明，g s h 可以迅速增强机体的免疫力，人体内g s h 增加后对消 化系统、呼吸系统和新陈代谢等都有很大帮助。加拿大麦基尔大学教授古特曼博士这样 预测：“g s h 很快就会像胆固醇一样深入民心，成为人们衡量健康的指标之一”( 华佗网) 。 除此之外，g s h 还有改善性功能和消除疲劳的作用，近年来还发现g s h 具有抑制 艾滋病病毒的功效【l ”。同时，g s h 还被用于与其它物质组合构成治疗或保健药物，如 以高剂量与治疗肿瘤的药物配合使用，可以防止这些药物对肝脏和肾脏的毒性；与维生 素g 起服用，可防止空气污染和紫外照射诱发肿瘤等。随着人们对g s h 研究的不 断深入，g s h 在医药及临床领域内还会有更多的用途。 谷胱甘肽具有独特的生理功能，被称为长寿因子和抗衰老因子。日本等发达国家在 2 0 世纪五十年代就开始将g s h 作为生物活性添加剂并积极开发应用在保健食品的生产 中【l5 1 ，而我国对g s h 的研究起步较晚，在食品方面的应用还处于起始阶段。谷胱甘肽 作为生物添加剂积极的将谷胱甘肽应用于食品的加工的各个领域：a 谷胱甘肽加入面制 咿ioio j 田 一 一 u u 第一章绪论 品中起还原作用，强化氨基酸；b 谷胱甘肽加入酸奶和婴儿食品中，起相当于维生素c 的作用，稳定食品中的营养成分；c 谷胱甘肽在鱼糕中可以抑制核酸的降解，强化风味 的作用；d 在水果罐头中谷胱甘肽可以防止褐变的发生；e 对肉制品等也有强化风味 的作用。g s h 在食品加工业中的用途见非常广泛。作为一种抗氧化剂，g s h 具有昂贵 的市场价格，目前还没有能在食品加工领域中得到广泛应用。但是，由于g s h 在强化 食品风味的同时对人体有保健作用，它的应用前景显然要优于其它类型的防腐剂或抗氧 化剂1 1 6 】。因此，在价格下降的前提下，采用g s h 作为食品抗氧化剂是食品加工业的发 展趋势之一。 根据国外情报机构预测，g s h 作为一种多功能的生物活性添加剂在食品加工业中的 应用将会愈来愈广，g s h 的需求量正日益增大。随着g s h 的生理生化功能和性质被不 断研究发现，人们对其在医药工业、食品工业、体育运动领域及有关生物研究领域上的 兴趣将日益增长，对其需求量也将不断增加。很显然，g s h 有一个极其巨大的市场。 1 3 国内外纯化谷胱甘肽方法的研究动态 基于谷胱甘肽在医疗食品等方面的价值，自h 撕n g t o na i l dm e a d 【1 7 】首先化学合成得 到g s h 以来，国外学者围绕g s h 的生产开展了大量的研究，概括来说，目前g s h 的生产 方法主要有溶剂萃取法、化学合成法、酶转化法和发酵法。目前，研究者们通过工艺条 件优化及其菌种选育等多种方法使得发酵法生产谷胱甘肽的方法不断地得到改进，己成 为目前国内外生产谷胱甘肽最普遍的方法。但要获得纯度很高的g s h ，选择良好的纯化 方法极其重要，目前分离提纯谷胱甘肽的方法，见诸文献报道的主要有：铜盐法、离子 交换、亲和层析、双水相分离等。 铜盐法是重金属沉淀法的一种，主要是利用g s h 与金属氧化物c u 2 0 反应，生成可分 离的沉淀物g s c u ，再通过还原剂h 2 s 进行还原，成为g s h 。它是一种比较传统法，有一 定实用价值，目前仍然被一些g s h 生产工艺所应用，但需要大量的h 2 s ，污染较大，工 艺复杂。亲和层析法是利用巯基化合物有着很强的与汞化学亲和的作用，将有机汞的化 学亲和树脂，用于吸附抽提液中的g s h ，盐酸溶液进行洗脱，得到提纯的g s h 。但由于 这种方法可能存在汞的泄露，而且含汞树脂对酸碱比较敏感，稳定性也比较差，所以在 工业上，特别是在食品工业上该法的应用受到很大限制。双水相萃取可应用于蛋白质和 肽的选择性分离，但目标蛋白或肽与成相聚合物实现高效分离是影响其大规模工业应用 的主要问题。 虽然利用以上三种方法来生产g s h 在实验室均具有可行性，但是它们在工业化过 程中却还存在着许多问题，有些甚至无法实现工业化。目前，国际上日本等国家已经采 用离子交换树脂进行了一些研究，并取得了很好的效果，而国内关于离子交换树脂分离 谷胱甘肽的研究已经逐步展开，但是不够深入，故一直未能实现工业化。尽管如此，该 方法经济效益较高，可望完全代替铜盐法，依然是生化工程以及食品领域的一个研究热 江南大学硕士学位论文 点。 1 3 1 离子交换法纯化谷胱甘肽 离子交换吸附是生化分离的一个重要手段。由于氨基酸和多肽类物质为具有弱碱性 和弱酸性官能团的两性化合物，因此采用阴阳离子交换树脂吸附、解吸的方法来使得氨 基酸和肽类化合物和其他物质快速有效的分离。尤其近年来我国离子交换树脂工业发展 顺速，离子交换树脂的价格相对于进口树脂价格大大降低，使得离子交换在生化物质的 分离方面的研究不断广泛。该方法能够将带电情况不同的物质进行分离，广泛应用于天 然活性成分的研究中。 对于离子交换法，国际上日本等国家研究的较多，并取得了很好的效果，申请并公 布了一系列相关专利【1 8 _ 2 “。其中主要使用阳离子交换树脂【8 之2 1 ，也有一些研究者使用阴 离子交换树脂【2 3 1 。国内关于离子交换树脂分离谷胱甘肽的研究还不成熟，其中模拟移动 床分离1 8 埘】和大孔型及其交联度较小的树脂分离的效果比较好【2 5 ，2 6 1 。 1 。3 2 离子交换法纯化谷胱甘肽过程中仍存在的问题 g s h 作为一种重要的药物，在i 临床上的用途极广，g s h 的抗氧化性能又使得它在 食品加工业中倍受青睐。自1 9 2 1 年h o p k i n s 首先发现g s h 以来，科学家们一直研究它 在各种生物体内的生理作用，许多内容至今仍然是研究的热点【2 7 】。日本的k y o w a 和 蹦i n o m o t o 等公司早在二十世纪8 0 年代就完成了g s h 的工业化生产，现己成为g s h 的 主要生产和供应商【2 8 】，由于产量有限加之g s h 的应用范围及用量越来越大，g s h 的市 场价格一直居高不下( 作为原料药的价格约为4 5 0 美元，k 2 ) ，这给g s h 的广泛应用带来 了许多困难。因此，加大研制开发的力度并投入生产已经势在必行。 有关g s h 的研究报道非常多，但绝大部分涉及的都是g s h 在生物体内生理功能的 体现及其在疾病治疗过程中的应用等当前研究的热点内容。对于各种g s h 的生产方法 的研究也有一些，但是关于分离纯化g s h 的相关文献资料则寥寥无几，而这些研究成 果正是保证g s h 工业化生产持续、稳定、高效运行的理论依据和技术支持。日本在这 方面处于比较领先的地位，除了实现了酵母发酵法生产g s h 的产业化外，还有很多研 究结果以专利的形式公布于众。我国国内总体来说对于用离子交换树脂分离谷胱甘肽的 研究比较少，而且研究还不深入，只是处在探索阶段，不能指导工业化的生产。本实验 室已经对用阳离子交换树脂分离纯化谷胱甘肽的方法进行了研究，但仍存在许多问题尚 待解决。总体来说，对整个用离子交换树脂分离纯化g s h 过程的把握和分析还相对肤 浅，对g s h 稳定性、离子存在状态、交换容量和纯化倍数等主要技术指标的影响因素 的探讨还不够透彻，至少有以下几个方面的问题值得我们去进行更为深入的研究。 1 ) 保证g s h 在实际体系中的稳定性是实现工业化生产的前提。 在整个生产过程中，应保证g s h 的稳定性。选择的操作条件应使得g s h 具有极高的 稳定性，温度、p h 值等对g s h 稳定性有较大的影响。 2 ) 增大离子交换树脂对g s h 的交换容量是提高分离效率的前提条件。 第一章绪论 富含g s h 的发酵液中含有较多的氨基酸，肽类和蛋白质等杂质，因此如果直接进 行离子交换，必定会影响g s h 对树脂的吸附能力，所以应当选择适当的方法除去部分 杂质来提高离子交换树脂对g s h 的交换容量。 3 ) 建立适合工业化生产的工艺路线 在保证g s h 稳定性、一定的回收率和分离纯化程度的条件下，尽量减少工艺流程， 减少操作费用，节省时间和试剂，建立简单稳定适合我国国情的生产工艺，如采用国产 的离子交换树脂可以大大减少费用，从而降低生产成本，降低g s h 价格，推动g s h 的 广泛应用。 1 4 本论文研究的主要内容 作为江苏省高校高新技术产业发展项目“微生物发酵法生产谷胱甘肽”( 编号： j h 0 2 1 0 1 ) 的子课题，本论文在实验室规模上以一株能在胞内高积累g s h 的产朊假丝 酵母( c 口n 西幽“f 船f f 跗d 2 一嬲) 为生产菌株，以g s h 的高回收率，高纯度和低价格 为目标，对制备功能性食品添加剂谷胱甘肽的下游技术路线进行了较为详细的研 究，以寻求适合工业化生产的工艺和条件。具体研究内容主要分为以下几个部分： 1 ) 研究了实际体系中谷胱甘肽的稳定性；并且探索了应用超滤技术去除富含谷胱 甘肽的酵母提取液中的蛋白质的工艺操作； 2 1 研究了经过超滤后的谷胱甘肽提取液进行离子交换的过程，并详细研究了吸附 和洗脱的离子交换工艺条件； 3 ) 为了简化谷胱甘肽的工业化生产过程，对含有细胞碎片的谷胱甘肽酵母提取液 直接带菌上柱，并对其离子交换过程进行了研究，该工艺路线可以大大减少谷 胱甘肽的损失，降低成本。 江南大学硕士学位论文 第二章应用超滤法去除谷胱甘肽提取液中蛋白质的研究 2 1 引言 由于g s h 稳定性不好，容易氧化，寻找合适的操作条件来减少分离纯化过程中g s h 的损失，对g s h 工业生产及其重要。本实验室前人已经对g s h 纯品的稳定性进行了初 步的研究【2 9 】，但是当g s h 在实际体系时，它的稳定性可能会发生变化，所以有必要对 提取液中g s h 的稳定性进行深入的研究。另外，本实验室已经研究了将破壁离心后的 谷胱甘肽提取液直接与离子交换树脂进行吸附，结果发现流出曲线出现一个g s h 顶出 峰，经分析可能是溶液中存在交换能力比g s h 强的物质( 大分子蛋白质) 的缘故。随 着不断的加样，强吸附物质的量不断增加。将吸附较弱的g s h 替换下来，使得g s h 对 离子交换树脂的交换容量大大下降，因此离子交换的工作效率较低f 2 9 1 。 超滤技术是以压差为推动力的液相膜分离过程之一，其分离性能介于微滤和纳滤之 间，膜孔径为l l o o m ，截留分子量从几千到几百万之间。超滤的典型应用是从液相 体系中分离生物大分子、胶体分散液以及乳液。使用适当孔径的超滤膜，可以实现含有 各种小分子量纯化可溶性溶质和高分子物质( 蛋白质，酶等) 溶液的浓缩、分离和纯化。 它主要具有以下的优点：较稳定的高渗透通量：p h 和温度使用范围宽；操作简便、能 耗低；操作成本低，废液排放量少：设备体积小，便于设备生产能力的扩大。超滤技术 在工业大规模应用的历史不长，但由于其独特的优点，使它成为膜分离技术中一种重要 的单元操作，目前广泛应用于电子、饮料、食品、化工、医疗和水处理等领域。 在超滤过程中，大分子被膜截留，小分子和溶剂( 水) 则透过膜。使大分子溶质被 膜截留的主要原因为：被吸附在超滤膜的表面和孔中( 基本吸附) ；被保留在孔内( 堵 塞) ；机械地被截留在超滤膜的表面上( 筛分) ，这样就可以有效的截留大分子。 基于以上的考虑，本章主要研究的内容为： 1 ) 研究提取液中谷胱甘肽在不同p h 值和温度条件下的稳定性； 2 ) 研究了使用截留分子量为5 0 0 0 的p e s 超滤膜对富含谷胱甘肽的产朊假丝酵母提 取液进行超滤的情况，同时分析了膜压差p 、温度t 、p h 值、料液浓度等因素对超滤 的影响，以期达到较好的分离效果： 3 ) 为提高g s h 回收率，采用间歇和连续两种方式进行稀释过滤，并对它们进行优 化，从中选出最佳的稀释方式； 4 ) 选择适当的超滤膜清洗方法。 2 2 实验材科与设备 2 2 1 实验材料 产朊假丝酵母( n 硪出“r f ，j 妇雕日d 2 一) g s h 积累株：江南大学生物工程学院 第二章谷胱甘肽稳定性及超滤法去除提取液中蛋白质的研究 环境生物技术研究室提供；g s h ：生化试剂，上海伯奥生物科技有限公司；d t n b ：生 化试剂，s i g m a 华美生物工程公司分装：t r i s ：生化试剂，中国医药( 集团) 上海化学 试剂公司。 2 2 2 实验设备 f i l t e c h u f l 0 1 型超滤装置：上海弗立特实业有限公司：膜材料：聚醚砜p e s ( 截 留分子量为5 0 0 0 膜) ，上海弗立特实业有限公司；阿贝折光仪w z s i8 6 0 4 2 7 ：上海分 析仪器厂；u n i c 0 2 0 0 0 可见分光光度计：尤尼柯( 上海) 仪器有限公司：7 5 2 紫外光 栅分光光度计：上海第三分析仪器厂；m e t t l e 卜t 0 l e d oi n s t l ( 上海) l t d ： 漩涡混合器： x w 8 0 a 上海沪西分析仪器厂：移液器：g i l s o ne p p e n d o r f 。 2 3 实验方法 2 3 1g s h 的测定方法 优化的e l l m a n s 测定法【3 0 】，在试管中顺序加入0 2m l 2i 姗o l l 1d n m ，0 4m ll m o l lt r i s h c l 缓冲溶液和3 4 m l 适当浓度样品，5 m i n 后测定4 1 2 1 1 1 1 1 处的o d 值，根 据标准曲线( 图2 1 ) 计算出样品中浓度。 1 2 o 9 o 6 0 3 0 0o 2o 40 6o 81 1 2 g s h ( g l ) 图2 1g s h 测定标准曲线 2 3 2 蛋白质的测定方法 蛋白质测定方法采用紫外分光光度法( 2 8 0m ) 测定，用牛血清白蛋白作为标准蛋 白【3 i 】，建立标准曲线如图2 2 。 江南大学硕士学位论文 o0 2 o 40 60 8l1 2 蛋白质( g 几) 图2 2 蛋白质测定标准曲线 2 3 3 提取液中谷胱甘肽稳定性的研究方法 用富含g s h 的产朊假丝酵母提取液在不同p h 值和温度条件下进行稳定性研究，测 定终值并对比计算其损失。 2 3 4 超滤参数的确定 在小型超滤设备中装入膜面积为0 1m 2 的p e s 超滤膜，在不超过o 2 5m p a 的压力 下，超滤谷胱甘肽酵母提取液为除去其中的蛋白质。分别考察各操作参数对超滤的影响， 每组考察一个参数，固定其它条件，进行超滤，记录其通量。在研究料液浓度对超滤的 影响时，将原料液分别稀释1 倍和2 倍，同时测定三个料液浓度的可溶性固形物含量。 2 3 5 计算方法 2 3 5 1 谷胱甘肽回收率和蛋白质去除率 分离效果常用截留量表示，例如蛋白质的脱除率定义为： 蛋白质脱除率= c ，一翟箬蔫蚤器，- o o c z 一， 而g s h 回收率为： g s h 回收率= 厦篙誉i 丢器，o o c z z ， 2 3 5 2 溶液通量 关于通量和过程参数以及料液的物性参数之间的关系，目前还没有一个令人满意的 模型进行描述，主要原因是对发生在膜表面的浓差极化和膜污染不能进行准确的描述。 在较低的操作压差、低固形物含量以及较高的循环流速等条件【3 2 】，作如下假设： 膜表面孔均匀分布：忽略膜污染；忽略浓差极化现象等等，可以从h a g e n p o i s e u i l l e 方程出发推导得到描述超滤通量的模型： 3 5 2 5 l 5 o 2 1 0 0 0 0 o 0 0 gonoo 第二章谷胱甘肽稳定性及超滤法去除提取液中蛋白质的研究 溶液通量：，v ( u m 2 h ) 护鋈器糕 2 3 5 3 膜污染率 膜污染率：f r = 挲1 0 0 j 0 其中：j o 一膜使用前纯水滤出速率： j w 一膜使用后纯水滤出速率。 ( 2 3 ) ( 2 - 4 ) 2 4 实验结果与讨论 2 4 1 谷胱甘肽在实际体系中稳定性的研究 在溶液状态下，两分子还原型谷胱甘肽( g s h ) 的活泼巯基容易氧化缩合为二硫键， 得到氧化型谷胱甘肽( g s s g ) 。此外，g s h 在一些条件下也常常不稳定而发生分解， 对g s h 的提取过程中g s h 有可能由于其不稳定而有所损失。因此，本文研究了酵母提 取液中g s h 在不同的p h 、温度条件下的稳定性，为g s h 的分离纯化研究提供依据。 2 4 1 1p h 值对谷胱甘肽稳定性的影响 前人的研究表明【2 9 】g s h 酸性条件下比碱性条件下稳定，所以本论文只是研究了在 常温( 2 4 ) 下，g s h 在p h 值为1 6 条件下不同时间的损失率。如图2 3 所示： l o o 一8 0 琶 斟6 0 水 皤4 0 z o 2 0 o o2 0 4 0 6 08 0l o o 1 2 01 4 0 时间( h ) + p h = l + p h = 2 士p h = 3 + p h = 4 + p h = 5 + p h = 6 图2 - 3p h 值对提取液中g s h 稳定性的影响 从图中可以很明显看到p h 值对g s h 稳定性有很大影响，尤其是当p h 3 时，g s h 在1 2 h 内不同程度的损失3 0 7 0 ，而当p h 为1 2 时，g s h 损失率不大，尤其是在 常温下存放6 天后，p h = l 的提取液中g s h 损失 5 ，p h = 2 中g s h 的损失率也不超 过2 0 。由此可见，复杂体系中的g s h 的损失率是随着提取液p h 值的增加而增加的。 综上所述，在对g s h 进行分离纯化过程中应尽量避免在较高p h 范围内，应尽量将g s h 提取液调至p h = 1 2 ，此时g s h 比较稳定。 9 江南大学硕士学位论文 2 4 1 2 温度对谷胱甘肽稳定性的影响 本实验研究了9 5 1 0 0 下提取液中g s h 的稳定性，如图2 4 ；同时还考察了提取 液中g s h 在室温( 2 5 ) 和冷藏( 4 ) 时的稳定性，如图2 5 。 o 1 0 2 03 04 05 0 6 0 时间( m i n ) 图2 49 5 1 0 0 时提取液中g s h 的稳定性 从图2 4 中可以看出，在9 5 1 0 0 下提取液中g s h 是不稳定的，它随着煮沸时间 的延长不断的损失。在3 0 m i n 内几乎损失了2 ，在1 h 内已经损失了近6 。可见工业 生产中应该尽量避免高温下g s h 的长时间处理。 未 卜 哇k 皤 工 昌 ulz34bb， 时间( d ) + 2 5 + 4 图2 5 温度对提取液中g s h 稳定性的影响 从上面的图可以很明显的看出提取液中的谷胱甘肽在低温冷藏时相对稳定，六天损 失不到3 5 。但是在室温下，六天损失达到8 6 。所以，为了避免损失，生产中应尽 量低温，并缩短生产时间，高温工艺后，要设有冷却措施。 2 4 2 应用超滤技术去除富含谷胱甘肽提取液中蛋白质的研究 通量是超滤一个十分重要的过程指标，直接反映了分离设备的处理能力。超滤过程 中，被截留的溶质在膜表面处积累，其浓度会逐渐升高，形成浓差极化层。它导致溶质 向原料液主体的反向扩散，经过一段时间后会达到稳态，溶质以对流扩散向膜表面的通 o 7 6 5 4 3 2 1 o 拿一褂水鞲 0 第二章谷胱甘肽稳定性及超滤法去除提取液中蛋白质的研究 量等于溶质通过膜的通量加上从膜表面扩散回主体的通量。比较简单而且被广泛应用的 描述此区域内超滤的模型是： ，：旦l n 坐= 鱼：k l n q 二望f 2 - 5 、 6 c b l pl b c p 其中d 为扩散系数：6 为边界层厚度；k 为传质系数：c 。为凝胶层浓度；c b 为原料 液主体浓度。 影响传质系数的主要因素是原料流速、溶质扩散系数、粘度、密度以及设备的几何 尺寸。在这些参数中，流速和扩散系数是最重要的【3 3 】。( 2 5 ) 式可以较好地描述传质控制 下的超滤过程。 2 4 2 1 压力对超滤的影响 超滤是在压力差为推动力的作用下进行的液相分离过程，因超滤的推动力是压差， 故通量和推动力直接相关。将操作压力增大，可以增大膜的通透量，加快超滤速度；但 是，操作压力过大，又会加速了某些组分在膜孔中的沉积，容易造成膜孔减小甚至堵塞， 减小了膜的实际有效面积。因此，选择合适的压差对超滤过程至关重要。图2 6 为p e s 超滤膜通量与压差之间的关系： 2 o 一 向 蚓 疑 媲 8 0 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 o 00 0 50 10 1 50 20 2 50 3 压差( m p a ) 图2 6 压差对溶液通量的影响 从图2 6 看出，当压差升高，通量现时升高，过程处于压差控制区；然后，通量的 增加趋缓：最后，通量不随压差而改变，过程处于传质控制区。在压差较小时( 图中是 在0 1 5m p a 以下) ，膜通量随p 的增加几乎呈直线上升，因为这时膜面上尚未形成浓 差极化层，j v 与p 成正比。p 超过0 1 5m p a 时，溶液通量j v 的增加趋于平缓，这 是因为随压差的增大，膜被压密，浓差极化逐渐严重，使有效的传质推动力下降，因此， j v 的增长速率减慢。 2 4 2 2 温度对超滤的影响 温度升高时，由于降低了原料液的粘度，所以通量一般会上升，但是有可能降低某 些物质的溶解度。当循环流速增大的时候，膜面上的浓度边界层即浓差极化层厚度下降， 通量会上升。在p = o 1 5m p a 的条件下，于6 、2 4 下用p e s 超滤膜超滤富含谷胱甘 江南火学颂士学位论文 肤的产朊假丝酵母提取液，得到的溶液通量j v 随温度变化的趋势如图2 7 。 03691 2 时间t ( m i n ) + 2 4 - - 6 图2 7 温度对溶液通量的影响 如图2 7 所示，温度越高，溶液通量j v 越大。这主要是因为料液的粘度随温度的升 高而下降，溶质在溶液中的扩散系数增大，由膜边界向料液主体的反向扩散通量增大， 有利于减轻浓差极化的影响。 2 4 2 3 料液浓度对超滤的影响 进料浓度对溶液通量j v 有一定的影响。将原料液浓度分别稀释1 倍、2 倍，并分别 测定其可溶性固形物含量分别为2 3 、1 2 、o 5 ，以溶液通量j v 对时间作图，得到 图2 - 8 。 01234 时间( m i n ) 一23 - 一1 2 r o 5 图2 - 8 物料浓度对溶液通量的影响 图2 8 显示，在相同的操作条件下，可溶性固形物含量越低，溶液通量j v 越大。这 是因为浓度越高，料液的粘度越大，溶质问的相互作用也越大，使溶质的反向扩散加强， 因此传质阻力增加，溶液通量下降。 肋舳如如0 一f。1)r嘲固燃缝 蚰加蚰o f。1)r唰图疑缝 第二章谷胱甘肽稳定性及超滤法去除提取液中蛋白质的研究 co 5 c0 2 5 c 物料浓度( c 表示原液) g s h 回收率口p r o 去除率口膜污染率 图2 9 料液浓度对g s h 回收率、蛋白质脱除率和膜污染率的影响 图2 9 表明，料液浓度增加，g s h 回收率、和蛋白质去除率均有所不同程度的增大。 同时，膜污染也越来越严重。这可能是由于浓度的增大引起浓差极化现象增强，膜表面 的浓度明显增大，但对g s h 这样的小分子阻力并不强，反而蛋白质大分子通过膜的阻 力却增强，因而被截留的蛋白质增多，提高了截留率，同时对g s h 回收率影响并不大。 但是，膜污染却随着料液中可溶性固形物含量的增加，污染率却明显增加。但是考虑到， 超滤后此膜很容易清洗，很容易就可以恢复到原始通量。因此，从提高g s h 回收率和 蛋白质脱除率考虑，宜采用可溶性固形物含量2 3 的原谷胱甘肽提取液直接进行超滤。 2 4 2 4p h 值对超滤的影响 改变原料液的p h ，会造成一些两性物质的沉淀或溶解，对通量也会有一定的影响。 在p = o 1 5m p a 、2 2 下，研究截留分子量为5 0 0 0 的p e s 超滤膜在不同p h 下超滤情况。 由于前人的研究已经表明g s h 在酸性条件下稳定【2 9 1 ，故在研究p h 对超滤的影响时只 考虑p h 在l 5 的范围，结果如下： 0 12345 时间( m i n ) 一p h = 5 - 一p h = 3 r p h = l 图2 - 1 0p h 对溶液通量的影响 粥 僦 猕 傩 印 如 帅 如 o f。山1)r删暇警缝 江南大学硕士学位论文 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 扪扪扪 图2 - 1 1 口h 对g s h 回收率、蛋白质脱除率及膜污染率的影响 图2 - 1 0 显示，在p h = l 、3 时，溶液通量j v 较低；在p h = 5 时，溶液通量j v 较高。 图2 1 1 表明，随着p h 的降低，g s h 回收率变化不明显，但是蛋白质的脱除率逐渐增加， 同时膜的污染程度越来越严重。原因可能是等电点在1 3 附近时，谷胱甘肽酵母发酵 液中蛋白质比较集中。处于等电点的蛋白质分子间的静电斥力最小，容易沉积在膜面【3 ”， 使传质阻力增大，溶液通量下降。另外，部分在其等电点沉淀的蛋白质堵塞了膜孔，使 得膜的孔隙率降低，同时考虑到谷胱甘肽在低p h 下较稳定，因此，综合考虑超滤过程 中控制p h 为1 3 比较好。 2 4 2 5 超滤的分离效果 对于富含谷胱甘肽的产朊假丝酵母原提取液，使用截留分子量为5 0 0 0 的p e s 膜， 我们确定了适宜的操作条件为p = o 1 5m p a 、t = 2 4 、p h = 1 3 。为了更直观的反映 超滤效果，我们将超滤前的原液和超滤后的滤液分别作h p l c 相对分子质量分布图，如 图2 1 2 、2 1 3 所示： 图2 - 1 2 超滤前g s h 提取液相对分子质量分布图2 - 1 3 超滤后g s h 提取液相对分子质量分布 第二章谷胱甘肽稳定性及超滤法去除提取液中蛋白质的研究 从上面两个图可以很明显的看到，超滤前和超滤后滤液中的大分子蛋白质确实有了 很明显的减少，蛋白质去除率可以达到3 8 。这表明超滤技术的应用确实对富含g s h 的产朊假丝酵母提取液起到了很好的浓缩作用。 表2 】原发酵液和透过液比较 表2 1 总结了超滤的分离效果。从表中可以看出，超滤后发酵液的品质得到很大改 观：固形物含量有所降低，这主要是由于膜截留了大分子物质所致。但是g s h 的回收率 只有7 0 左右，说明还有一部分的g s h 被截留，因此为了提高g s h 的回收率，要采用稀 释过滤。 2 4 2 6 稀释过滤在提高g s h 回收率过程中的应用 稀释过滤( d i a f i i t r a t i o n ，又译为重过滤、渗滤、透滤等) 即是在膜分离过程中向料 液