（食品科学专业论文）橙汁与柑橘园中脂环酸芽孢杆菌的分离鉴定与检测研究.pdf

摘要 橙汁与柑橘园中脂环酸芽孢杆菌的分离、鉴 定与检测 食品科学专业硕士研究生王梅 指导老师焦必宁研究员 摘要 脂环酸芽孢杆菌可造成巴氏灭菌的果汁腐败，影响果汁的品质，引起国际的关注，已成 为果汁国际贸易技术壁垒的新内容。国际贸易中严格要求每1 0m l 浓缩果汁中脂环酸算芽孢 杆菌的含量小于1 个。而我国在脂环酸芽孢杆菌分离、检测方法等方面的研究较少，且仅侧 重于苹果汁中脂环酸芽孢杆菌的研究，对橙汁中脂环酸芽孢杆菌研究较少。因此，对橙汁与 柑橘园中脂环酸芽孢杆菌的分离、鉴定与检测技术这对我国橙汁生产和贸易都具有十分重要 的意义。 本文以柑橘园及不同橙汁中分离得到的1 3 株具有耐酸耐热性的菌株为研究材料，首先对 其进行了菌落形态、培养基气味、耐酸性、耐热性、革兰氏染色等常规检测；随后对分离菌 株进行了1 6 sr d n a 序列聚类分析；研究了分离菌株的1 6 sr d n ap c r r f l p 限制性酶切特征 图谱，并进行了聚类分析；此外，还根据脂环酸芽孢杆菌的1 6 sr d n a 设计了一对特异性强， 灵敏度高的引物。具体研究结果如下： ( 1 ) 选用b a t 培养基在4 5 2 5d 的培养条件，从橙汁及柑橘园中分别分离得到8 株 和2 株脂环酸芽孢杆菌。因此，b a t 培养基在4 5 2 5d 的培养条件，可作为橙汁中脂环酸 芽孢杆菌的选择性培养基。 ( 2 ) 本研究以分离菌株n f c 1 为研究材料，对其生长曲线进行了研究，结果表明该菌经 过1 8h 培养后进入对数生长期，在2 5h 菌体浓度能达到最高，随后进入稳定生长期。从而确 定该菌的基因组d n a 提取条件为：2 2 5r m i n4 5 气浴摇床培养2 5h 。 ( 3 ) 对1 3 株分离菌与3 种脂环酸芽孢杆菌标准菌的1 6 sr d n a 序列对比，并进行系统发 育分析。结果表明，橙汁中8 株具有耐酸耐热性的菌株均为脂环酸芽孢杆菌属，其中1 株 a l i c y c l o b a c i l l u sa c i d i p h i l u sd s m l 4 5 5 8 ，3 株a l i c y c l o b a c i l l u sa c i d o t e r e s s t r i sd s m 3 9 2 2 ，4 株 a a c i d o c a l d c u l a r ；柑橘园中有2 株耐酸耐热菌为a l i c y c l o b a c i l l u sa c i d i p h i l u sd s m l 4 5 5 8 。 ( 4 ) 采用1 6 sr d n ap c r r f l p 法对分离得到的1 3 株耐酸耐热性菌株与3 种脂环酸芽孢 杆菌的标准菌进行聚类分析。结果表明，在8 7 的相似水平上，所有菌株分为5 个种群和1 0 个分支，其中p 1 、p 5 、k 1 与标准菌a a c i d i p h i l u sd s m l 4 5 5 8 相似水平较高，可视为同一个 种，即嗜热脂环酸芽孢杆菌；h - 1 、z h 1 、z h 2 与a a c i d o t e r r e s t r i u sd s m 3 9 2 2 相似水平较高， 可视为同一个种，即酸土脂环酸芽孢杆菌；n f c 1 、n f c 2 、n f c 4 、n f c 1 0 另分一支，n f c - 4 号菌经克隆测序及序列比对，结果与嗜酸耐热菌中的a a c i d o c a l d a r u s 序列同源性高达9 9 以 上，说明这4 株菌均是酸热脂环酸芽孢杆菌。此外，1 6 sr d n ap c r - r f l p 聚类与1 6 sr d n a 序列分析聚类结果较为一致，由此说明本研究结果是可靠的。 i i i 两南大学硕十学位论文 ( 5 ) 根据1 6 sr d n a 属间的高变区，种间的保守区，设计出一对针对脂环酸芽孢杆菌的特异 性强、灵敏度高的引物。通过优化试验，得到最佳扩增条件为：2 5 皿扩增体系中，d d h 2 01 7 7 5 皿，1 0 x b u f f e r2 5 止，2 5m mm 9 2 + 1 5 此，1 0m m d n t p1 5g l ，3 5 l0 3 此，3 5 r0 3 此，5 u u lt a q 酶0 1 3 此，d n a 模板1 皿。扩增条件为：9 4 5m i r a9 4 4 0s ，5 9 8 4 0s ，7 2 4 0s ，3 5 个循环；7 2 8m i n 。在最佳的扩增程序下，p c r 扩增脂环酸芽孢杆菌的基因组 d n a 最低量为1 0 4p g ，扩增脂环酸芽孢杆菌的最低菌液浓度为3 o x1 0 3c f u l t l l 。 ( 6 ) 成功建立了脂环酸芽孢杆菌的p c r 快速检测方法。该方法的整体体系为：2 0m l 橙汁 _ 8 0 1 3m i n _ 1 0m l 接种于b a t 培养液_ 2 2 5r m i n 4 5 的条件下气浴振荡培养2 5h _ 采用c t a b 法提取d n a _ 进行p c r 扩增一琼脂糖电泳检测扩增产物_ 结果判断。整个检 测过程约需要2 5d ，而传统常规检测过程约需要7 1 4 d 。 关键词：脂环酸芽孢杆菌；常规检测；生长曲线；系统发育；聚类分析；快速检测 i v a b s t r a c t flj 1 。mj llj - i s o l a t i o n ，l c l e n t i t i c a t i o na n dd e t e c t i o n a l i c y c l o b a c i l l u ss p pf r o mo r a n g ej u i c ea n d c i t r usg r o v e s c a n d i d a t e ：w 办gm e i a d v i s o r ：p r o f b i n i n gj i a o a b s t r a c t a l i c y c l o b a c i l l u ss p pc a nc a u s et h ep a s t e u r i z e df r u i tj u i c et ob ec o r r u p t ，a f f e c tt h eq u a l i t yo f f r u i tj u i c e s ，a r o u s e s et h ei n t e r n a t i o n a lc o n c e r n ，h a sb e c o m en e wc o n t e n to ft e c h n i c a lb a r r i e r st o i n t e r n a t i o n a lt r a d ei nf r u i tj u i c e i nt h ei n t e r n a t i o n a lt r a d e ，s t r i c t l yr e q u i r et h ec o n t e n to f a l i c y c l o b a c u ss p pi ss m a l l e rt h a n1p e r10m lc o n c e n t r a t ef r u i tj u i c e b u ti no u rc o u n t r y , t h e r e s e a r c ho ni s o l a t i o na n dd e t e c t i o nf o ra i c y c o b a c i l l u ss p pa r ef e w ：a n do n l yf o c u so nt h ea p p l e j u i c e ，r e s e a r c ho nt h eo r a n g ej u i c eo fa i i c y c i o b a c u ss p pl e s s t h e r e f o r e ，i t sn e c e s s a r yt o r e s e a r c ht h ei s o l a t i o n ，a n di d e n t i f i c a t i o no fa i i c y c i o b a c i i u si no r a n g ej u i c ea n dc i t r u sg r o v e s ，i t s a l s og r e a ts i g n i f i c a n c et oo r a n g ej u i c ep r o d u c t i o no fo u rc o u n t r ya n dt h ei m p o r t - e x p o r tt r a d e i nt h i sp a p er ，c h o s e13a c i d - h e a t - r e s i s t a n ts t r a i n sa st h es t u d ym a t e r i a l w h i c hi s o l a t e df r o m d i f f e r e n to r a n g ej u i c ea n dc i t r u sg r o v e s ，f i r s t ，c a r r i e do u tt h e c o n v e n t i o n a ld e t e c t i o n ，i n c l u d e d c o l o n ym o r p h o l o g y , m e d i u mo d o r , a c i dr e s i s t a n c e ，h e a tr e s i s t a n c e ，g r a ms t a i n ；s u b s e q u e n t ，1 6 s r d n as e q u e n c ea n dc l u s t e ra n a l y s i sf o ri s o l a t e s ；s t u d i e di s o l a t e so f16 sr d n ap c i o r f l p c h a r a c t e r i s t i c sa n dc a r d e do u tc l u s t e ra n a l y s i s ；i na d d i t i o n ，a c c o r d i n gt o1 6 sr d n ad e s i g n e dap a i r o fs p e c i f i ca n ds e n s i t i v ep r i m e r sf o ra l i c y c l o b a c i l l u ss p p r e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) s e l e c tb a tm e d i u ma t4 5 2 5do fc u l t u r ec o n d i t i o n s ，i s o l a t e d8s t r a i n sa n d2s t a i n s a l i c y c l o b a c i l l u ss p p 们mo r a n g ej u i c e ，a n do r a n g eg r o v e s ，r e s p e c t i v e l y , t h e r e f o r e ，b a t m e d i u ma t4 5 2 5do fc u l t u r ec o n d i t i o n s c a nb e u s e da ss e l e c t i v em e d i u mt oi s o l a t e a l i c y c l o b a c i l l u ss p pi no r a n g ej u i c e ( 2 ) i s o l a t e sn f c 一1a ss t u d ym a t e r i a l ，s t u d i e di t sg r o w t hc u r v e 。r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e b a c t e r i ae n t e r e dt h el o g a r i t h m i cg r o w t hp h a s ea f t e r18h ，c e l lc o n c e n t r a t i o nt oa c h i e v et h e h i g h e s ta t2 5h ，a n dt h e ne n t e r e ds t a b l ep h a s e t od e t e r m i n et h eg e n o m eo fb a c t e r i ad n a e x t r a c t i o nc o n d i t i o n s ：2 2 5r ，m i n4 5 a i rb a t hs h a k e rc u l t u r e2 5h ( 3 ) c o m p a r es e q u e n c ea n da n a l y z ep h y l o g e n e t i c16 sr d n ao f13i s o l a t e sa n d3s t a n d a r d a l i c y c l o b a c n u ss p p t h er e s u l t ss h o w e dt h a t8a c i d - h e a t - r e s i s t a n ts t a i n sw h i c hi s o l a t ef r o m o r a n g ej u i c ea l lw e r ea l i c y c l o b a c i l l u ss p p ，i n c l u d i n g1a i c y c o b a c n u sa c i d i p h f l u sd s m l 4 5 5 8 ，3 a i c y c o b a c i u sa c m o t e r e s s t n sd s m 3 9 2 2 4a a c i d o c a l d c u l a r ；c i t r u sg r o v e sh a v e2 a c i d - h e a t - r e s i s t a n ts t r a i n sa r ea i i c y c i o b a c i i i u sa c i d i p h i l u sd s m14 5 5 8 ( 4 ) c l u s t e ra n a l y s i s13s t r a i n sj s o l a t e d 们ma c i d h e a t - r e s i s t a n ts t r a i n sa n d3s t r a i n so f a i i c y c i o b a c u ss p ps t a n d a r ds t r a i n sb y16 sr d n ap c r - r f l p t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta t8 7 v 两南大学硕十学佗论文 s i m i l a r i t yl e v e l ，a l ls t r a i n sw e r ed i v i d e di n t of i v es p i e c eg r o u pa n d10b r a n c h e s ，i n c l u d i n gp - 1 ，p - 5 ， k - 1a r es i m i l a rw i t hs t a n d a r ds t r a i na a c i d i p h i l u sd s m l 4 5 5 8i nh i g hl e v e l s c a nb er e g a r d e da s t h es a m es p e c i e s ，t h e r m o p h i l i ca i i c y c l o b a c 川u ss p p ；h - 1 ，z h - 1 ，z h - 2a n da a c i d o t e r r e s t r i u s d s m 3 9 2 2s i m i l a rt ot h eh i g h e rl e v e l ，c a nb er e g a r d e da st h es a m es p e c i e s ，t h a ti s a l i c y c l o b a c i l l u sa c i ds o i lb a c t e r i a ；n f c - 1 ，n f c 2 。n f c - 4 ，n f c 一10i no t h e rb r a n c h e s b yc l o n i n g a n ds e q u e n c i n ga n ds e q u e n c ea l i g n m e n to fn f c - 4 ，r e s u l t ss h o wt h a tt h es e q u e n c eh o m o l o g yo f n f c , - 4a n da a c i d o c a l d a r u sm o r et h a n9 9 i n d i c a t i n gt h a tf o u rs t r a i n sw e r ea a c i d o c a l d a r u s i n a d d i t i o n 16 sr d n a p c r - r f l pa n d16 sr d n as e q u e n c ea n a l y s i sc l u s t e r i n gc l u s t e r i n gr e s u l t s a r em o r ec o n s i s t e n t ，t h i ss h o w st h er e s u l t so ft h i ss t u d yi sr e l i a b l e ( 5 ) a c c o r d i n gt ot h e16 sr d n a a t eh i g h l yv a r i a b l eb e t w e e na r e a s ，i n t e r - s p e c i e sc o n s e r v e d r e g i o n st od e s i g nap a i ro fs p e c i f i ca n ds e n s i t i v ep r i m e r sf o ra i i c y c i o b a c j i i u ss p p b yo p t i m i z i n g t h et e s t ，t h eo p t i m a la m p l i f i c a t i o nc o n d i t i o n s ：2 5u la m p l i f i c a t i o ns y s t e m ，d d h z o17 7 5 l ，10x b u f f e r2 5p l ，2 5m mm 9 2 + 1 5u l ，1 0m md n t p1 5p l ，3 5 l0 3p l ，3 5 r0 3p l ，5u ，u lt a q e n z y m e0 13p l ，d n at e m p l a t e1p l a m p l i f i c a t i o nc o n d i t i o n s ：9 4 5m i n ；9 4 4 0s 5 9 8 4 0s ，7 2 4 0s ，3 5c y c l e s ；7 2 8m i n u n d e rt h eb e s to ft h ea m p l i f i c a t i o np r o c e s s ，p c r a m p l i f i c a t i o no fa l i c y c i o b a c 川u ss p pm i n i m u ma m o u n to fg e n o m i cd n a w a s1 旷p g ，a m p l i f i c a t i o n 0 fa c y c i o b a c j i i u ss p pm i n i m u mb a c t e r i ac o n c e n t r a t i o no f3 0x10 。c f u ，ml ( 6 ) s u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e dp c rr a p i dd e t e c ta l i c y c l o b a c i l l u ss p p t h eo v e r a l ls y s t e m ：2 0 m lo r a n g ej u i c e - + 8 0 1 3r a i n _ 1 0m lw a si n o c u l a t e di nb a tm e d i u m _ 2 2 5r ，m i n4 5 b a t hu n d e rt h ec o n d i t i o n so fg a sb ys h a k i n gc u l t u r ef o r2 5h _ c t a bm e t h o df o re x t r a c t e dd n a - - , p c ra m p l i f i c a t i o n - , a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i sd e t e c ta m p l i f i e dp r o d u c t s - , j u d g et h er e s u l t s t h ew h o l ep r o c e s st a k e sa b o u t2 5d ，b u tt r a d i t i o n a lt e s t i n gt a k e sa b o u t7 1 4d k e yw o r d s ：a l i c y c l o b a c i l l u ss p p ；c o n v e n t i o n a ld e t e c t i o n ；g r o w t hc u r v e ；p h y l o g e n e t i cd e g e n e r a t i o n ； c l u s t e ra n a l y s i s ；r a p i dd e t e c t i o n v l 缩略词表 缩略词表 简写编号 b l a s t b p k b d n t p l b p c r e b t m s d s k f l l 谭l p r a p d 英文全称 中译 b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht o o l 碱基相似性比对搜索工具 b a s ep a i r 碱基对 妇i o b 弱ep 甜r 千碱基对 b e 。x y m 。n u c l e 。s i d et r i p h 。5 p h 咖 脱氧核糖核苷三磷酸 l u r i a b e n a n im e d i a p 。l y t n e r a s ec h a i n 聆a c t i 。n l 嘶a - b e n a i l i 培养基 e t h i d 啪b r o m i d e 聚合酶链式反应 b a c t e r i aa c i d 溴化乙锭 d o d e c y ls u l f a t e 。s o d i u ms a l tk r u e g e rf o o d 十二烷基磺酸钠 l a b o r a t o r i e s 美国库克食品实验室 r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m 限制性片断长度多态性 r a n d 鲫锄p l i f i e dp o j y m o r p h i c 随机扩增多态性 独创性声明 学位论文题目：堡进盏鳖叠鱼虫篷至夔差垄堑莹墅金塞鳖塞兰鳖型受至 本人提交自每学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了 特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁 在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者：2 - 绍签字日期：枷p 年s 月砌日 学位论文版权使用授权书 小拳位沦义作杆完个j 7 解f jl i i 钉人学仃火保留、使川。誓位论义的规 定，自杖仪留j i ：向幽家仃火部f j 或机构送交论文的复印件和磁7 ：，允 诌：论义破奔蒯和俳测。小人授十义i 向人0 老研究个l 筑( 嚣) n j 以将位 论文的个部或部分内容编入仃火数据阼进行柃索，几j 以乐川影印、缩 印或于l 捕等复制下段俅仃、 l ：编学位沦丈。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：啊保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：王襁 导师签名： 签字日期：矽扣年f 月冲日 签字日期： 第一章文献综述 第一章文献综述 橙汁中不仅富含糖、有机酸、v c 等营养成分，还含有类黄酮、类胡萝卜素及类柠檬苦素 等功能成分，可以预防关节炎、降血压、能够提高人体对药物的吸收水平，从而提高药效、 喝含维生素c 的橙汁有助于血管扩张，增强人体免疫力【l l 。但由于原料、技术、管理等方面的 原因，致使橙汁常遇到诸如褐变【2 3 1 、后浑浊、农药残留1 4 】、脂环酸芽孢杆菌超标等问题，影响 橙汁的品质和功能。橙汁生产中，对褐变、农药残留已研究的比较透彻，并且都有相应切实 可行的工艺控制措施，而对脂环酸芽孢杆菌的控制，目前仍物可靠的方法，脂环酸芽孢杆菌 成了各果汁生产厂家最棘手的问题，对脂环酸芽孢杆菌的检测与控制也是各橙汁生产厂家最 迫切任这些问题若得不到及时的解决，将会影响我国橙汁工业的持续健康发展。 脂环酸芽孢杆菌，俗称“耐热菌”，是脂环酸芽孢属，革兰氏阳性芽孢杆菌。主要分布 在高酸的热环境、土壤及水果加工中，如苹果、柑橘、芒果掣5 , 6 , 7 , 8 l 。脂环酸芽孢杆菌最初来 源可能是原料在收获时被土壤污染，而加工前又未充洗所致，果汁生产中比较棘手的常见污 染菌。最初认为，巴氏灭菌足以杀灭p h 值小于4 的果汁中的致病菌和产芽孢的细菌，但c e m y 等 ( 1 9 8 2 ) 首次从腐败变质的浓缩苹果汁中分离出一株含脂环酸的芽孢杆菌，并证明该菌是 造成巴氏灭菌果汁( p h2 5 5 5 ) 腐败的主要原因之一1 9 】。此后，在美国、澳大利亚、日本相 继发生了数起大规模的由脂环酸芽孢杆菌引起的果汁腐败案例，由此该菌备受人们关注。最 初将其归类为芽孢杆菌属，但根据g + c 含量、耐酸与耐热性、1 6 sr d n a 序列差异以及细胞膜 特有的环状脂肪酸，最后将其重归类茭j a l i c y l o b a c i l l u sg e n 挖d 1 ，属于肋c 硼册c p 【2 | 。在已确定的 1 6 种脂环酸芽孢杆菌中，a a c i d i p h i l u s ，a a c i d o c a l d a r i u s 、a a c i d o t e r r e s t r i s 、a p o m o r u m 四种菌 与果汁的腐败有关 1 0 , 1 1 , 1 2 j ，在极地的浓度下，遇到适宜的条件，也可在果汁中迅速生长繁殖， 并产生具有臭袜子味的气体物质，这种腐败在初期不易被发现，产品并不出现明显的涨包或 酸败，但其代谢产物在万分之一浓度就会使果汁口感乏味变差，产生浊度升高甚至在包装物 底部形成白色沉淀等质量问趔】。 目前，国际贸易中要求每1 0m l 浓缩汁中脂环酸芽孢杆菌的数量不超过1 个，而我国部 分浓缩果汁中脂环酸芽孢杆菌的严重超标导致其合格率较低【1 3 l 。如何确保果汁的质鼍安全， 将是我国果汁拓展国内外市场的重要前提与保障。目前，国内尚未就果汁中脂环酸芽孢杆菌 污染制定相应的限量值，但脂环酸芽孢杆菌正在成为果汁国际贸易技术壁垒的新内容。而我 国检测方法、毒理学研究及限量标准等内容的缺失，有可能造成我国果汁进出口贸易风险。 1 1 脂环酸芽孢杆菌的生理生化特性 脂环酸芽孢杆菌细胞呈杆状，长2 4 8g m ，宽0 6 0 9g r n ，其末端或次末端可产芽孢( 长 3 5 岬、宽o 7 1 岬) ；在生长初期细胞为g + ，菌落呈圆型，平滑透明，颜色从白色到米黄色， 生长后期细胞为g + 或g 。，颜色略有变黑；脂环酸芽孢杆菌为严格好氧菌，其生长温度较广， 能在2 0 7 0 c 、p h2 5 - 6 0 的条件下生长，但最适生长环境为4 2 6 0 c 、p h3 5 4 5 1 0 , 1 4 , 1 5 , , 1 6 , 1 7 , 1 8 , 】 ( 表1 1 ) 。 该菌糖代谢能力强，且产酸不产气；氧浓度低于0 1 及水分活度低于0 8 f 4 等条件均可抑 制脂环酸芽孢杆菌营养细胞的生长，但不会影响芽孢的存活1 1 9 】。脂环酸芽孢杆菌具有较强耐 l 两南大学硕十学位论文 热性。这主要是由于其细胞膜含有环状脂肪酸( a p o m o r u m 除外) ，而环状脂肪酸与脂环 酸芽孢杆菌可在高温低p h 的条件下生长有关。k a n n e n b e r g 等研究发现，紧密包裹的环状脂 肪酸为脂环酸芽孢杆菌的细胞膜形成一个保护层，降低了细胞在高温条件下的扩散率，从而 使其可在高温和低p h 的条件下存活【2 0 1 。所以巴氏灭菌不但不能将脂环酸芽孢杆菌杀死，反而 促进其芽孢的形成和生长。在浓缩果汁中脂环酸芽孢杆菌虽不能繁殖，但经稀释后，可在室 温下代谢产生烟熏味的愈创木酚和具有臭味的2 ，6 二溴苯酚和2 ，6 二氯苯酚，其在果汁中的 味觉阈值较低，分别为2 0 2 3 2p p b 、0 5p p t 和3 0p p t 【2 l 2 2 1 ，因此果汁很可能在外观无明显变化、 且在保质期内就已被脂环酸芽孢杆菌污染，使果汁产生浑浊沉淀、口感变差、最终导致腐败。 众多研究表明，造成果汁腐败的一些细菌具有毒性，但w a l l 等将脂环酸芽孢杆菌直接注 射到老鼠体内或接种于果汁喂养后老鼠，结果发现老鼠均未生病或死亡，同样在饮用由脂环 酸芽孢杆菌腐败果汁的消费者中也未发现患病者。但由于该菌在常温下产生不良风味物质给 果汁业带来了巨大的经济损失，所以，该菌是果汁生产厂家比较棘手的常见污染菌【2 3 1 。 表1 1 脂环酸芽孢杆菌的种类及特征 t a b l e1 - 1t y p ea n dc h a r a c t e r i s t i c so f a l i c y c l o b a c i u u ss p p 生长温最适温生长最适 来源频率 细胞膜特有脂肪 g + c 参考 菌种 度度p hp h酸 m 0 1 文献 a a c i d i p h i l u s 2 0 - 5 54 0 5 03 0 - 6 03 5 - 4 0 十壤、水果少心环己烷脂肪酸 5 4 1 f 1 1 】 a a c i d o c a l d a r i u s3 5 7 05 5 - 6 0 2 5 - 6 04 5 5 0 土壤、水果多心环己烷脂肪酸 5 6 3 【1o 】 a a c i d o t e r r e s t r i s2 0 - 5 54 0 5 03 0 - 6 03 5 - 4 0土壤、水果 多 心环己烷脂肪酸5 2 2 【1 0 a c o n t a m i n a n s3 5 - 6 05 0 5 53 0 - 6 04 0 - 4 5 土壤少静环己烷脂肪酸 6 0 1 6 0 6 【1 4 1 a c y c l o h e p t a n i c u s 4 0 5 35 0 3 0 - 6 0 4 0土壤少睁环庚烷脂肪酸5 5 6 【1 0 1 a d i s u l f i d o o x y d a n s 3 0 - 4 03 53 5 - 6 03 5 - 4 5土壤 少咖环已烷脂肪酸 5 3 【1 5 】 a f a s t i d i o s u s2 0 5 54 0 - 4 52 0 5 54 0 - 4 5 土壤少伽环己烷脂肪酸 5 3 9 1 1 4 a h e r b a r i u s3 5 - 6 55 5 - 6 03 5 - 6 04 5 - 5 0土壤少 咖环庚烷脂肪酸 5 6 2 【1 6 a h e s p e r i d u m 3 5 - 6 5 5 0 - 5 3 2 5 - 5 53 5 - 4 0 土壤少睁环己烷脂肪酸 5 4 0 【1 7 】 a k a k e g a w e n s i s 4 0 - 6 05 0 5 53 0 - 6 54 0 - 4 5土壤少咖环己烷脂肪酸6 2 3 - 6 1 7 【1 4 】 a m a c r o s p o r a n g i i d u s 3 5 - 6 05 0 5 53 0 - 6 54 0 - 4 5 土壤、水果少咖环己烷脂肪酸 6 2 5 【1 4 】 a p o m o m m 3 0 - 6 05 0 - 5 32 5 5 53 5 - 4 0软饮料少无 5 3 1 1 2 1 a s a e c h a r i3 0 5 54 5 5 02 0 - 6 04 0 - 4 5 土壤少心环己烷脂肪酸 5 6 6 【1 4 1 a s e n d a i e n s i s 4 0 - 6 55 5 2 5 - 6 05 5 土壤少伽环己烷脂肪酸 6 2 3 1 0 1 a s h i z u o k e n s i s3 5 - 6 04 5 5 03 0 - 6 54 0 - 4 5土壤少兮环己烷脂肪酸6 0 5 【1 4 1 a t o l e r a n s2 0 5 53 8 - 4 21 5 5 02 0 - 2 7 土壤少心环己烷脂肪酸4 8 5 1 18 】 1 2 脂环酸芽孢杆菌的分离与检测 1 2 1 分离 已有很多方法用于脂环酸芽孢杆菌的分离和检测，研究表明，培养基种类的选择对脂环 酸芽孢杆菌的分离至关重要。最初，脂环酸芽孢杆菌是通过基础培养基( p h2 - 5 ) ，4 5 6 0 c 富 集培养，然后将富集培养液直接涂平板于固体培养基( p h3 0 3 5 ) 上培养。已证实脂环酸芽 孢杆菌不能在营养琼脂培养基、l b 培养基中生长，最常见的用于分离该菌的培养基有 2 第一章文献综述 y e a s t - s t a r c h g l u c o s e 掣( y s ga g a r ) 、b a t 、b a c i l l u sa c i d o c a l d a r i u sm e d i u m ( b a m ) 、o r a n g es e r u m a g a r ( o s a ) 、p o t a t od e x t r o s ea g a r ( p d a ) 、k - a g a r 、s k a g a r1 2 4 乃1 ( 表2 ) 。但对脂环酸芽孢杆菌 检测培养基的选择上，研究者众口不一。w a l l s 和g h u g a t e 将k 培养基与o s a 、p d a 比较， 发现在所有的检测温度中，脂环酸芽孢杆菌在k 培养基的生长菌落数最多、生长情况最好【1 9 1 。 g o t o 等研究比较了脂环酸芽孢杆菌在y s g 、b a t 、o s a 三种培养基上的生长情况，结果发现 脂环酸芽孢杆菌的营养细胞在以上三种培养基中生长情况无明显差别，但其芽孢在y s g 培养 基中生长的菌落数明显高于其他两种培养基【l6 1 。近来，c h a n g 等研究比较了s k 、o s a 、p d a 、 k 培养基，结果表明脂环酸芽孢杆菌在s k 上的菌落数最多，菌落形态最明显【2 扪。 由于原果汁中该菌含量甚少，s p l i t t s o e s s e r 等通过孔径为0 4 5i n n 的微滤膜成功从1 0 0 2 5 0 m l 体积的果汁中富集脂环酸芽孢杆菌1 2 4 】。此外，p e t t i p h e r 等采用涂平板和膜过滤的方法，在 果汁中分离得到脂环酸芽孢杆菌的数量分别为5c f u m l l 和1 1 0 0c f u m l ，再次证实了膜过 滤的高灵敏度1 2 引。由于直接涂平板的取样量少，无法完全分离出所有脂环酸芽孢杆菌，而膜 过滤取样量大，并且截留富集果汁中的脂环酸芽孢杆菌，所以该技术被广泛应用于脂环酸芽 孢杆菌的分离，也可用于果汁生产中脂环酸芽孢杆菌的去除。 y s g 具检测时间短的优点使其在日本与巴西被广泛用于脂环酸芽孢杆菌的检测，而在欧 洲、美国和澳大利等国家和地区使用的却是b a t 、o s a 、p d a 和k 培养基。因此，今后需 要研发一种用于快速分离脂环酸芽孢杆菌的标准培养基，提高检测灵敏度，减少假阴性。 表1 - 2 培养基成分及用途0 2 s 2 7 1 t a b l e l - 2c o m p o s i t i o na n du s eo fc u l t u r em e d i u m 3 两南大学硕十学位论文 1 2 2 检测方法 1 2 2 1 常规分离与初步鉴定 目前脂环酸芽孢杆菌属的检测主要是采用常规的检测方法，各果汁厂对脂环酸芽孢杆菌 检测多引用b e r r 法( 澳大利亚b e r r i 公司推荐方法) 或k f l 法( k r u e g e rf o o dl a b o r a t o r i e s ， 美国库克食品实验室) 。b e r r 法是将一定量的待检测果汁用无菌水稀释至约原汁浓度( 清汁 不必稀释) ，8 0 水浴1 0m i n ，室温水冷却至5 0 左右后将所处理的果汁置于温箱增值培养 2d ，然后再将培养果汁用接种环勾一环在k 培养基平板上划线，4 5 培养2 - 4d ，观察有无菌 落产生。k f l 法，热处理同前法，0 4 5 岬无菌滤膜真空抽滤果汁，滤膜正面朝上置于k 培养 基上，4 5 左右培养4d ，记录菌落数。两种方法在检测灵敏度上基本一致，但各有优缺点， k f l 方法结果可以量化，但无法对不可过滤的果汁进行检测，且由于使用滤膜，费用较高。 而b e n 可适用于各种果汁的检测，且费用省，但其结果只能表示为某体积果汁脂环酸芽孢杆 菌的有无，结果无法量化【2 8 】。 并非所有在上述k 培养基中生长的菌落均为脂环酸芽孢杆菌，但该菌具有如下特征，白 色或略带黄色的菌落、有臭袜子气味、有芽孢、不能在l b 培养基上生长，符合以上条件的菌 落可初步认为是脂环酸芽孢杆菌，否则，就予以排除1 引。 传统检测法检测指标多、程序复杂、耗时等缺点致使检测结果的滞后性无法及时指导生 产并向生产线反馈信息以采取相应的防范和控制措施。m i c k e y 等通过脂环酸芽孢杆菌的形态 特征( g + 、产芽孢、白色、圆形菌落) 、生长温度范围等生理生化指标，对1 5 7 5 个柑橘进行 脂环酸芽孢杆菌检测，结果在5 9 1 个柑橘中检测出该创2 9 l 。此外，目前各机构所推荐的方法 不尽相同，结果也存在一定差异。因此，急需快速、特异性的检测方法为果汁生产商提供一 种从原料到产品全程跟踪，以及时指导生产。 1 2 2 2 数值分类技术鉴定 数值分类技术基本原理是指通过数学的编码技术将细菌的生化反应模式转换成数学模 式，给每种细菌的反应模式赋予一组数码，建立数据库或编成检索本。通过对未知菌进行有 关生化试验并将生化反应结果转换成数字( 编码) ，查阅检索本或数据库，得到细菌名称。其 基本原理是计算并比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和。随着 电脑技术的进步，这一过程已变得非常容易。法国生物梅里挨( b i o m e r i e u x ) 公司生产的 a p i5 0c h i 是根据微生物对4 9 种碳源( 糖、醇) 利用情况进行测定的一种快速检测培养基，以 数学符号( + 、) 表示待测微生物对4 9 种碳源( 糖、醇) 利用情况和指示剂的颜色变化，并通 过绘制菌种的生化图谱来对待测微生物进行鉴定或分类1 3 0 1 。脂环酸芽孢杆菌的多数菌种可根 据各种糖醇利用情况就可以直接鉴定出种，由于部分菌株之间糖醇利用情况的并不显著，往 往还需要进一步的鉴定。目前已有多篇报道将a p i5 0c h 鉴定试剂条与分子生物学相结合，应 用于脂环酸芽孢杆菌的检测，取得了一致性的检测结果i l 6 。 1 2 2 3 傅立叶红外光谱鉴定 傅立叶红外光谱检测( f o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r o s c o p yf t - i r ) 可根据细菌细胞生化 构造的细微差异，对每种微生物建立一个特有的“指纹图谱”，以实现对果汁中脂环酸芽孢杆菌 4 第一章文献综述 进行快速检测。自1 9 9 1 年，n a u m a n n 等首次报道了f t - i r 可用于鉴定微生物以来，由于