（食品科学专业论文）大豆疏水分离蛋白的结构表征及新型胶粘剂的研究.pdf

大豆疏水分离蛋白的结构及新型胶粘剂的研究 摘要 我国大豆蛋白资源丰富，价格便宜。作为一种可再生资源，通过适当改性可 以作为无毒无污染的化工原料，减少不可再生资源的消耗和环境的污染。大豆分 离蛋白的疏水性主要应用在化工及材料工业，但是由于大豆分离蛋白的抗水性较 差而难以投入生产。有关提高大豆分离蛋白疏水性和大豆分离蛋白疏水性与结构 关系的研究鲜有报道，关于大豆分离蛋白作为胶粘剂的研究也未见详细报道。本 文在以a n s ( 8 一苯胺基- 1 - 萘磺酸) 荧光探针法测定大豆分离蛋白疏水性的基础 上，研究了理化因子对大豆分离蛋白疏水性的影响、疏水性与结构之间的关系以 及大豆分离蛋白作为胶粘剂的应用。主要研究结果如下： 1 理化因子对大豆分离蛋白表面疏水性的影响 在以a n s 荧光探针法测定大豆分离蛋白表面疏水性的基础上，研究了理化 因子对大豆分离蛋白表面疏水性的影响。在没有其他因素干扰的情况下，p h 值 和温度对s o 均有极显著的影响；在一定的p h 和温度范围内，温度和p h 对s o 的影响有协同效应；温度过高时使蛋白发生凝聚而使表面疏水性降低；在p h 7 6 ， 7 0 时有相对最大s o 值；一定程度的交联反应有利于s p i 的疏水性提高，但交 联剂浓度过高反而不利于提高蛋白质的疏水性。乙酸酐和戊二醛浓度对s p i 表面 疏水性的影响并不显著；随着脲和s d s 浓度的增大，s p i 变性程度加大，浓度过 高时由于变性程度过大使疏水性降低；脲浓度对s o 的改变有一定程度的影响， 但不显著：s d s 浓度对s o 的改变有极显著性影响；在p h 值8 0 、温度6 0 。c 、s d s 浓度2 5 9 l 时有最大s o 值。 2 大豆疏水分离蛋白的结构表征 通过傅立叶红外光谱( f t - m ) ，扫描电镜( s e m ) ，激光拉曼光谱对改性前 后大豆分离蛋白的结构进行了初步表征。通过红外光谱可以推断改性前后的s p i 均以0 【螺旋结构为主，与拉曼光谱所得结论相符。采用扫描电镜观察发现在同一 放大倍数下，改性前后s p l 分子表面呈现不同性状。改性前的s p i 表面比较平整 光滑，有少许片状结构，而改性后的s p i 表面出现坑洼，十分不平整。 3 大豆疏水分离蛋白作为胶粘剂的应用 研究了s d s 浓度、s p i 浓度和搅拌时间三个因素对改性后的s p i 用做胶粘剂 的性能的影响。实验结果显示当s d s 浓度为3 ，s p i 浓度为1 0 ，搅拌时间为 华中农业大学2 0 0 9 届硕十学位论文 3 5 h 时胶粘剂可达到最大的干态切变强度。采用线性综合分析法对正交试验中的 九个样品和市售白乳胶的质量进行综合评分，结果显示s d s 浓度4 ，s p i 浓度 1 5 ，搅拌时间3 5 h 条件下制得的胶粘剂质量最好。 关键词：大豆分离蛋白；表面疏水性；改性；结构表征；胶粘剂 i l 大豆疏水分离蛋白的结构及新型胶粘剂的研究 a b s t r a c t s o y b e a np r o t e i n sa r er i c h i nn a t u r a lr e s o u r c e sa n dh a v eal o wp r i c ei no u r c o u n t r y a so n eo ft h er e n e w a b l er e s o u r c e ，a f t e rp r o p e r l ym o d i f i e d ，i tc a nb eu s e da l s n o n t o x i ca n dn o n - p o l l u t ei n d u s t r i a lc h e m i c a l st or e d u c et h e c o n s u m p t i o no f u n r e n e w a b l er e s o u r c e sa n de n v i r o n m e n tp o l l u t i o n t h eh y d r o p h o b i c i t yo fs o y b c a n p r o t e i ni s o l a t ei sm a i n l yu s e di nc h e m i c a la n dm a t e r i a li n d u s t r y , b u ti ti sd i f f i c u l tt ob e p u t t e di n t op r o d u c t i o nb e c a u s eo fi t sw e a kh y d r o p h o b i c i t y t h el i t e r a t u r ea b o u th o w t o e n h a n c et h eh y d r o p h o b i c i t yo fs o y b e a np r o t e i ni s o l a t ea n dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e n t h eh y d r o p h o b i c i t yo fs o y b c a np r o t e i ni s o l a t ea n di t ss t r u c t u r ei ss c a n t y i nt h i sp a p e r , t h ee f f e c t so fp h y s i c a l c h e m i c a lf a c t o r so nt h es u r f a c eh y d r o p h o b i c i t yo fs o y b e a n p r o t i e ni s o l a t e ，t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h eh y d r o p h o b i c i t yo fs o y b c a np r o t e i ni s o l a t e a n di t ss t r u c t u r ea n dt h ea p p l i c a t o no fs o y b e a n p r o t e i ni s o l a t et ob eo n eo fa d h e s i v e a r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t sa r ea st h ef o l l o w i n g ： 1 e f f e c to fp h y s i c a l - c h e m i c a lf a c t o r so nt h es u r f a c eh y d r o p h o b i c i t yo fs p i t h ee f f e c t so fp h y s i c a l - c h e m i c a lf a c t o r so nt h es u r f a c eh y d r o p h o b i c i t yo f s o y b e a np r o t i e ni s o l a t ew e r es t u d i e db a s e do nt h ea n s f l u o r e s c e n tp r o b em e t h o d p h a n dt e m p e r a t u r eh a v ear e m a r k a b l ee f f e c to ns ow i t h o u ti n t e r f e r e n c eo fo t h e rf a c t o r s ； p ha n dt e m p e r a t u r eh a v eac o o r d i n a t e de f f e c to ns oi nf i x e dr a n g e ；h i g ht e m p e r a t u r e r e s u l t si nc o a c e r v a t i o no fp r o t e i nw h i c hr e d u c et h es o ；t h es p iu n d e rt h ec o n d i t i o no f p h 8 0 、7 0 ch a st h er e l a t i v eb i g g e s ti n d e xo fs u r f a c eh y d r o p h o b i c i t y ；w i t ht h e i n c r e a s eo fc o n c e n t r a t i o no fc r o s s l i n k i n ga g e n t ，s oi m p r o v e sf i r s tt h e nd e c l i n e s t h e e f f e c to fc o n c e n t r a t i o no fa c e t i ca n h y d r i d ea n d9 1 u t a r a l d e h y d eo ns oi sn o t r e m a r k a b l e ；w i t ht h ei n c r e a s eo fc o n c e n t r a t i o no fu r e aa n ds d s ，s oi m p r o v e sf i r s t t h e nd e c l i n e s t h ee f f e c to fc o n c e n t r a t i o no fu r e ao ns oi sn o tr e m a r k a b l e ，t h e c o n c e n t r a t i o no fs d sh a sar e m a r k a b l ee f f e c to ns o ；t h em o d i f i e ds o y b c a np r o t e i n i s o l a t eh a st h eb i g g e s ti n d e xo f s u r f a c eh y d r o p h o b i c i t yu n d e rt h ec o n d i t i o no f p h 8 0 、 6 0 c 、2 5g ls d sc o n c e n t r a t i o n i i i 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 2 t h ec o n f o r m a t i o no fh y d r o p h o b i cs o y b e a np r o t e i ni s o l a t e a st h er e s u l t so fr o m a ns p e c t r u ma n df t - i rs p e c t r u ms h o w n ，t h es e c o n d a r y s t r u c t u r eo fa n - m o d i f i e da n dm o d i f i e ds p ia r em a i n l ya - h e l i x a n dw i t he q u a l a m p l i f i c a t i o no fs e m ，d i f f e r e n c e si na p p e a r a n c ec a nb eo b s e r v e d ：t h eu n - m o d i f i e d s p ih a ss m o o t hs u r f a c ea n dt h em o d i f i e ds p ih a sh o l e s 3 t h ea p p l i c a t i o no fm o d i f i e ds p it ob eo n eo fa d h e s i v e t h ee f f e c t so fs d sc o n c e n t r a t i o n ，s p ic o n c e n t r a t i o na n dm i x i n gt i m eo n p e r f o r m a n c eo ft h es d s m o d i f i e ds p ia d h e s i v ew e r es t u d i e d ，a st h er e s u l t ss h o w n ， s p ia d h e s i v eh a sam a xs h e a rs t r e n g t hw h e ns d sc o n c e n t r a t i o ni s3 s p i c o n c e n t r a t i o ni s10 ，m i x i n gt i m ei s3 5 h t h es a m p l e sa n dt h ew h i t el a t e xa r eg r a d e d t h r o u g ht h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n ta n dl i n e a ra n a l y s i s t h er e s u l t ss h o wt h a tw h e n s d sc o n c e n t r a t i o ni s 4 ，s p ic o n c e n t r a t i o ni s 15 ，m i x i n gt i m ei s 3 5 h ，s p i a d h e s i v eh a st h em o s th i g hq u a l i t y k e yw o r d s ：s p i ；s u r f a c eh y d r o p h o b i cp r o p e r t y ；m o d i f i c a t i o n ；c o n f o r m a t i o n ； a d h e s i v e i v 大豆疏水分离蛋白的结构及新型胶粘剂的研究 s p i s o f t - i r s e m a n s s d s 缩略表 s o y b e a np r o t e i ni s o l a t e i n d e xo fs u r f a c eh y d r o p h o b i c i t y t o u r i e rt r a n s f o r m a l ：i o ni n f r a e d s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y 8 - a n i l i n o 一1 - n a p h t h a l e n e s u l f o n a t e d o d e c y ls u l f o n i ca c i ds o d i u ms a l t v 大豆分离蛋白 表面疏水性指数 傅立叶红外光谱 扫描电镜 8 苯胺基1 萘磺酸 十二烷基磺酸钠 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同7 - _ 作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：致菘 彳 时间： 川年月日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版 和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保 密的论文) 在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名：嗽拍导师鼢 话是软 签名日期：歹p 7 年厂月p 日 签名日期：年月 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 大豆疏水分离蛋白的结构及新型胶粘剂的研究 第一章文献综述 大豆蛋白的分类与结构特性 1 1 大豆蛋白的主要组分 大豆是当今世界上最重要的作物之一。大豆起源于中国，已有5 0 0 0 多年的 栽培历史，十八世纪先后传入欧美等国，遍及全球，现已有5 0 多个国家种植。 大豆是最好的非动物性高蛋白食品原料，具有丰富的营养成分，大约含有4 0 的蛋白质、1 8 的脂肪和2 5 的碳水化合物( 石彦国，1 9 9 6 ) ，此外，还含有大 量人体必需的不饱和脂肪酸、膳食纤维、异黄酮等。大豆蛋白主要是球蛋白，按 照蛋白质在超速离心机中的沉降速度来分，可将其分为4 个组分，即2 s 、7 s 、 1 1 s 和1 5 s ( s 是蛋白质超速离心机组份分离时的单位，1 s = i i o b s ) 4 个主要组 分( p e n g ，1 9 8 4 ) ，其组成如表1 1 所示。 表1 - 1 大豆蛋白的组成 t a b l e1 - 1c o m p o s i t i o no fs o y b e a np r o t e i n 1 2 大豆蛋白的空间结构 蛋白质的二级结构就是蛋白质分子中多肽链主链骨架的空间构象( w o l f , 1 9 7 0 ) 。从表1 1 可以看出7 s 和1 1 s 球蛋白是大豆蛋白的主要组分。7 s 球蛋白 包含理化性质各异的三种主要组分：p 一伴大豆球蛋白，丫伴大豆球蛋白和碱性7 s 球蛋白( r a j r ne ta 1 ，2 0 0 3 ) ，其中p 伴大豆球蛋白约占大豆7 s 球蛋白的5 0 以上。 华中农业大学2 0 0 9 届硕上学位论文 b 伴大豆球蛋白是由：0 【，a 和p 亚基组成的分子量为1 5 0k d a 的三聚体化合物 ( c o a t e se ta 1 ，1 9 8 5 ) 该三聚体的亚基组成呈现丰富的多态性，并且所有的亚 基都是包含氨基葡糖和甘露糖残基的糖基化蛋白，可低温溶解( 刘珊珊等，2 0 0 7 ) 。 大豆1 1 s 球蛋白是由酸性多肽( 分子量3 5 0 0 0 3 7 0 0 0 ) 矛d 碱性多肽( 分子量2 0 0 0 0 ) 构成的、分子量为3 0 0 0 0 0 3 8 0 0 0 0 的疏水性六聚体。亚基之间以及相同亚基之间 通过二硫键结合。这两种蛋白质分子在水溶液中是紧密折叠的，这种结构除氢键 外还被疏水键所稳定。在蛋白质中有秩序的结构是很少的，而大量的则是无规则 卷曲结构( 周兵和周瑞宝，1 9 9 8 ；h u u ，1 9 7 0 ) 。f u k u s h i m a 等利用旋光色散、紫 外差光谱等研究方法发现了7 s 和l l s 球蛋白分子的主要内部结构不是a 螺旋结 构，而是反平行p 折叠和无规则卷曲结构；7 s 和1 1 s 分子结构紧密，形成水分 子无法渗透的疏水中心。7 s 和1 1 s 分子的这种疏水作用保持了7 s 和1 1 s 球蛋白 分子的天然构象的稳定性( f u k u s h i m a ，1 9 6 8 ) 。在蛋白质凝聚过程中，通过改变 介质的p h 值、离子强度使包裹在球蛋白分子内部的非极性氨基酸残基暴露在分 子表面，各个疏水基团间相互吸引，进而形成凝胶。因此疏水作用对蛋白质凝胶 的形成有十分重要的作用( 陶慰孙，1 9 9 5 a ；c a t s i m p o o l a se ta 1 ，1 9 9 5 ) 。在1 1 s 球蛋白中，可以离子化的基团约1 4 ，主要是包埋在蛋白分子内部的酪氨酸残基。 多肽链在二级结构的基础上进一步折叠和卷曲，形成了近似于球形紧密结 构，即大豆蛋白的三级结构( s c h u l z ea n ds c h i r m e r ，1 9 7 9 ) 。多肽链的侧链即氨 基酸残基相互作用所形成的弱键是稳定蛋白质三级结构的主要因素。根据侧链基 团的性质可将氨基酸分为两类( p e t r u c c e l l ia n d a n 6 n ，1 9 9 5 ) ：极性氨基酸( 丝氨 酸、苏氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、羟脯氨酸) 和非 极性氨基酸( 甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、 色氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨酸) 大豆7 s 和1 1 s 球蛋白的氨基酸分析见表 1 2 ( 王翔，1 9 8 7 ) 。在大豆蛋白质的三级结构中，非极性基团转向分子内部，极 性基团或者转向分子内部或者转向分子表面。球蛋白三级结构中，除氢键外还有 盐键、二硫键以及具有疏水作用的次级键( 疏水键) 维持其空间结构。大豆蛋白 是由多种l 型氨基酸组成的大分子，沿着蛋白质大分子主链，分布着n h 3 、一c o o 一、一c o n h 一等亲水基团，这些亲水基团与水分子有极强的亲和力，能借助氢键 将水分子拉住，把极性的水分子吸附到蛋白质分子周围。与蛋白质亲水基团结合 2 大豆疏水分离蛋白的结构及新型胶粘剂的研究 的水分子，本身也有未共用的电子对，能与更多的水分子结合。另外蛋白质分子 表1 2 大豆蛋白7 s 、l l s 组分的氨基酸分析 t a b l e1 - 2a m i n oa c i da n a l y z eo f7 s 、l l si ns o y b e a np r o t e i n 木每1 0 0 9 蛋白质干基中氨基酸的含量( g ) 本身含氧含氮基团所具有的未共用的电子对，具有吸引水分子中氧原子的能力， 所以溶液中的蛋白质表面被一层厚的水化膜所包围( k i n s e l l a ，1 9 7 9 ；b i g e l o w ， 1 9 6 7 ) 。在氨基酸侧链残基中，亮氨酸、异亮氨酸等疏水性残基，通过疏水键相 互结合于蛋白质分子中心，形成疏水性区域；另一方面，谷氨酸、天门冬氨酸、 精氨酸、赖氨酸等亲水性残基，配列于能够与水分子接触的蛋白质分子外侧，形 成亲水性区域( s h u r y o ，1 9 8 3 ) 。非极性基团转向分子内部，形成疏水键；极性 基团转向分子内部的，相互作用形成氢键和盐键，转向分子表面的，可与水分子 相互作用。蛋白质的非极性疏水基团常趋向于分子结构域的内部，形成一个疏水 核，这种聚集是由于水对非极性基团的排斥造成的，疏水侧链基团从水介质转到 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 蛋白质内部的疏水环境是受熵增的驱动自发进行的( p e t m c c e l l ia n d a n 6 n ，1 9 9 4 ) 。 蛋白质结构复杂、种类繁多，并非上述一种结构模式，疏水核如果不在核心而暴 露在分子表面，则表现为一定的疏水性，而亲水溶解性降低，由于疏水、亲水程 度不同，造成蛋白质不同的溶解分散性( j o h na n dc h e r r y ，1 9 8 0 ) 。 1 3 大豆蛋白的疏水性研究 维持蛋白质的三级结构的最重要的作用力就是疏水相互作用( h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n ) ( 沈同和王镜岩，1 9 9 1 ) 。疏水相互作用对于蛋白质的稳定性、构象 和蛋白质功能具有重要意义。疏水相互作用是一种配位体间非共价键相互作用， 它在生物体内的许多精细化学和物理特性以及对其反应性的研究方面的知识迄 今仍很不完全( 陈耀峰等，1 9 9 5 ) 。在天然蛋白质中，疏水键是疏水侧链为了避 开水相而群集在一起的一种相互作用。使蛋白质稳定的疏水键可以由于溶剂极性 的减小而削弱。为了比较在有机溶剂和水中的蛋白质构象，往往通过p h 值、离 子强度和介电常数，来最大限度的减少静电斥力的影响。在这种环境里，由非极 性溶剂所诱导的蛋白质构象的崩溃，很可能是由于他们对疏水键的破坏。这一切 需要更多的理论和实验知识，才能对溶于有机溶剂或混合有机溶剂中的蛋白质和 多聚氨基酸所产生的非共价相互作用做出充分的描述和定量的估计( b l a n s h a r d ， 1 9 7 1 ) 。由于蛋白质的大分子结构，表面疏水性( s u r f a c eh y d r o p h o b i c i t y ) 比整 体的疏水性对蛋白质的功能具有更大的影响( c a r o l y ne ta 1 ，1 9 9 8 ) 。至今仍没 有一个标准测定方法来定量测定蛋白质的表面疏水性( n o o s h i ne ta 1 ，2 0 0 0 ) ， 通常采用几种经验测定方法。但由于这些经验方法的建立都没有考虑到蛋白质结 构的复杂性及蛋白质与其他物质之间的相互作用，所以测定的疏水系数与蛋白质 的乳化能力间的相关性尚存在争议。主要有荧光探针法、十二烷基磺酸钠法、甘 油三酯法、碳氢化合物法、疏水色谱法、疏水分级法等。现将其简单介绍如下。 1 3 1 荧光探针法 该方法目前应用的最为广泛，它可以评估蛋白质的功能并且用量很少。 h a y a k a w a 和n a k a i 将蛋白质疏水性分为两种类型，芳香型和脂肪型。该方法测 量的是蛋白质分子中芳香族氨基酸残基的作用，因此不能直接反映整个蛋白质体 系的疏水性，它所测定的是蛋白质的表面疏水性。探针的荧光量子产率与最大发 4 大豆疏水分离蛋白的结构及新型胶粘剂的研究 射波波长取决于环境的极性。水溶液中的荧光量子产率很低，而当它们结合到蛋 白质或膜上时，荧光量子产率大为提高，这样可以用来指示探针在蛋白质和膜上 的结合的极性。加入过量的疏水探针，所测得的荧光强度与蛋白质浓度的比值作 图得到该曲线的最初斜率s o 它同用疏水分级法测得有效疏水性一样与蛋白质的 表观作用如表面张力、乳化性能等具有很好的相关性( p e n z e r ，1 9 7 2 ) 。因此， s o 的值即可认为是蛋白质表面疏水性指数。荧光探针法测定蛋白质表面疏水性可 以反映出溶液中这些疏水区域的三维结构，另一个优点在于它可用于测定由几种 不同分子作用类型组成的复合体系的疏水性，所得是混合蛋白质的平均表面疏水 性。 疏水探针主要有8 苯胺基1 一萘磺酸( a n s ) 、顺十八碳四烯酸( c p a ) 、 d i p h e n y lh e x a t l l e n e ( d p h ) 、2 - p t o l u i d i n y l n a p h t h a l e n e - 6 一s u l f o n a t e ( t n s ) 、双8 - 苯胺基 1 萘磺酸( 简称b i s a n s ) ，在蛋白质研究中使用历史较长，其中最常用的是 a n s ，因为它的荧光性最好。 a n s 溶液在紫外光照射下会发生绿色荧光，但荧光强度不大，激发峰在 3 7 0 3 8 0 n m ，荧光峰在5 1 0 n m ，当它与组蛋白反应后，荧光强度大为加强，激发 峰在3 7 5 n m ，荧光峰在5 0 0 n m ，如将它的浓度保持在2 5 0 肛r d m l ，在组蛋白的浓 度为1 - 3 0 0 , e d r r l l 的范围内，荧光强度与组蛋白的浓度呈线性关系( t e r a d ae ta 1 ， 1 9 8 5 ) 。使用该方法时，a n s 及其类似物所发的荧光受外界环境的影响。在非极 性溶剂中，荧光的量子产率可超过0 0 7 ，在水中，产率在0 0 0 3 2 一0 0 1 1 范围 内时发射光可以淬火。同时最大发射光发生红移现象，波长可移l o o n m 左右。 s k l a r 等人提出使用c p a 作为疏水探针。由于十八碳四烯酸同分异构体的结构类 似于天然的脂肪酸结构，那么该分子对于生物膜的干扰作用最小。t e c o m a 等人 已经验证了这一推断。他们认为，十八碳四烯酸能够直接结合到大肠杆菌( e c o l i ) 的脂肪酸营养缺陷体的细胞磷脂层中。固相分离检测大肠杆菌细菌膜中所含的十 八碳基磷酸酯探针，发现它与自由脂肪酸探针的功能是相同的。因此，c p a 可 以作为膜流动性探针使用。另外，食品蛋白质疏水性测定中c p a 比较合适，因 为其结构类似天然脂肪酸而且在食品体系中也与蛋白质一脂肪酸和蛋白质一类 脂作用相当( f r a l e ye ta 1 ，1 9 7 8 ) 。 但是，对于某些蛋白质用a n s 法所测疏水值与用c p a 法所测的疏水值经常 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 不一样的现象尚未有合理的解释。这一矛盾可能与a n s 某些至今仍不清楚的作 用机制有关，d a m o d a r a n 注意到，虽然变性牛血清蛋白( b s a ) 比天然b s a 的表面 疏水基团多得多，但用荧光法测定的表面疏水性却较低。他认为a n s 疏水性虽 然与蛋白质的功能性质有较好的相关性，但它并不能代表蛋白质表面疏水性，而 是蛋白质的非极性空穴( n o n p o l o rc a v i t i e s ) 所表现的疏水性，这些空穴可容许 a n s 分子进入，但水分子不能进入( d a m o d a r a n ，1 9 9 0 ) 。 最近，加拿大学者h a s k a r d 和l i - c h a n 采用了p r o d a n ( 即6 一p m p i o n y l - 2 ( n ， n d i m e t h y l a m i n o ) a n i l i n o n a p h t h a l e n e 8 s u l f o n i c a c i d ) 探针来测定蛋白质表面疏水 性。p r o d a n 是一种不带电荷的溶剂敏感性探针，这就减少了蛋白质疏水性测量 中可能存在的静电作用的干扰。p r o d a n 作为荧光探针的优点在于它可以用于测 定p h 值范围广泛的蛋白质表面疏水性( n o o s h i ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 1 3 2 十二烷基磺酸钠( s d s ) 法 a k i ok a t o ，t o m o h i k o 等认为在较低的s d s 浓度下，蛋白质结合s d s 的能 力与用荧光方法测定的表面疏水性呈正比。4 2 种天然和变性的蛋白质的s d s 结 合能力与表面疏水性呈良好的相关性。s d s 是一种剧烈的蛋白质变性剂，然而在 一定浓度的s d s 溶液中，许多酶仍具有活性。s d s 能使蛋白质的氢键、疏水键 打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质一s d s 复合物。i m o t o 等人曾经报道说， s d s 可以与溶菌酶形成一种特殊的复合结构而不会导致分子构象的改变，但是产 生这种作用需要疏水基团和溶菌酶所带正电荷共同参与。用s d s 结合法测定的 疏水性与用c p a 荧光探针法测得的蛋白质表面硫水性具有良好的相关性。蛋白 质对s d s 结合量随蛋白质表面疏水性的提高而增加。s d s 结合法的优点在于它 可以用于测定不溶性蛋白质的疏水性，但这毕竟是另一种经验方法，在解释所得 结果时同样有困难( k a t oe ta 1 ，1 9 8 4 ) 。 1 3 3 甘油三酯法 s m i t h 等人利用甘油三酯与蛋白质的结合能力来测定蛋白质的疏水性。该方 法涉及甘油三酯悬浊液与蛋白质溶剂超声微乳化作用平衡。用多碳膜过滤器过滤 后，滤液中的甘油三酯与蛋白质形成的稳定体系可以用气液色谱( g l c ) 或放射 技术分析。分析结果显示，采用蛋白质晶体作为蛋白质结合作用的研究对象，饱 6 大豆疏水分离蛋白的结构及新型胶粘剂的研究 和甘油三酯分子量增加或者不饱和甘油三酯双键的增加均能导致疏水结合力下 降。从实用角度来讲，由于食品品质中脂肪与蛋白质的作用具有重要性，甘油三 酯在食品中广泛使用，因此利用甘油三酯作荧光探针还是比较可靠的。 但是，s m i t h 等人提出用g l c 或放射技术分析测定甘油三酯的结合量十分 复杂，仪器价格昂贵而且对技术要求较高。t s u t s u i 等人提出的用荧光探针法来 测定甘油三酯结合量相对来说简单多了。相比之下，荧光分光光度计价格较低， 仪器操作也简单。将甘油三酯溶于玉米油中，用非极性不溶性荧光探针d p h 作 为定量剂来测定蛋白质与玉米油的结合能力。采用这种方法测得的蛋白质疏水性 与a n s 法测定结果有很好的相关性( t s u t s u ie ta 1 ，1 9 8 6 ) 。 1 3 4 碳水化合物法 芳香族化合物可以与食品成分相结合，特别是能与大分子组分相结合。蛋白 质分子与乙醇、丙醇、己烷以及乙酸根离子的吸附作用取决于蛋白质的疏水性。 b i g e l o w ，m o h a m m a d z a d e hk 等人将多种脂肪族和芳香族碳氢化合物分别与牛血 清白蛋白( b a s ) 及b 乳球蛋白结合并加以比较，以其中n 庚烷含量作为蛋白质结 合能力的计量标准来测定蛋白质的疏水性。实验结果表明，蛋白质的结构对碳氢 化合物的结合能力有显著的影响。然而，就像研究食品风味一样，食品大分子吸 附了芳香物质，碳氢化合物结合法的结合能力很难估测，因此该方法在食品研究 中并不具有重要性( m o h a m m a d a z a d e he ta 1 ，1 9 6 9 ) 。 1 3 5 疏水色谱法 色谱分离方法灵活、分析高效、分离物质广泛是目前分辨率最高的化学分离 方法之一。色谱分析的原理是基于待测物质在互不相溶的两相：流动相和固定相 之间的分配系数不同而达到分离的效果。含待测物质的混合物溶解的流动相中， 当流动相通过固定相时，混合物各组分与固定相不同的亲和力使它们具有不同的 流速，使得它们在流动相中分离出来。早在七、八十年代，国外有人用此方法测 定蛋白质的疏水性，发现使用反相固相色谱洗脱蛋白质的结果与氨基酸残基组成 部分的疏水性估算值基本一致。但是，学术领域对蛋白质疏水性的色谱分析法的 利弊一直是颇有争议的，因为在色谱分析过程中有可能导致蛋白质分子变性。尽 管与反相固相色谱( r p c ) 相比之下，疏水色谱( h i c ) 的作用要缓和得多，但是仍没 7 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 有确凿的证据说明可以用h i c 方法来测定天然蛋白质的疏水性。况且，色谱法 需要特定的分析仪器，时耗大，还有一定的技术要求。因此，色谱法很难用于常 规的定性测定( w i l s o nc ta 1 ，1 9 8 1 ；i m o t oa n do k a z a k i ，1 9 7 9 ) 。 1 3 6 疏水分级法 该方法不仅操作十分麻烦而且由于一些蛋白质在非极性相中不溶解，它们可 以游离于分级两相的中间相内，从而导致了两相间的不平衡。这限制了该方法在 食品研究中的使用( z a s l a v s k ye ta 1 ，1 9 7 9 ) 。 综上所述，无论目前还是将来，在一段时间内，疏水荧光探针法将仍为最常 用的方法。特别是用于定性测定，该方法分析过程简单，一般在十分钟内即可完 成。同时，由于疏水探针法在食品化学中沿袭采用己久，国外许多食品科研机构 曾从事过该方向的研究并颇有成效；他们公布了一些经验性数据可供参考，这使 荧光探针法应用简单并且有据可依。我国学者也采用过a n s 法研究改性大豆蛋 白，结果发现a n s 探针法测得的疏水性指数s o 与乳化能力的对应关系并不是非常 吻合。疏水性测定方法的研究虽然取得了很大的进展，但各种经验方法均有利弊， 作用机制仍有某些不清楚的地方。所以说，为适应全球食品工业的发展，从理论 上继续探讨是有必要也是具有重大意义的。 1 4 大豆蛋白的改性研究 大豆蛋白的改性就是基于结构决定功能这一原理，利用化学因素( 如化学试 剂) 或物理因素( 如热、高频电场、微波、超声波等) 或生物因素( 如酶制剂，微生 物等) 使其氨基酸残基和多肽链发生某种变化，引起蛋白质大分子空间结构和理 化性质发生改变，在不影响其营养价值的基础上改善其加工功能特性。目前，根 据作用原理的不同，常用于食品蛋白质的改性方法有物理改性法、化学改性法、 酶改性法和生物工程改性法( 李阳阳，2 0 0 3 ) 。由于本文主要研究化学改性，现 将化学改性简单介绍如下。 大豆分离蛋白的化学改性对其功能性有较大的影响，改性处理能使天然s p i 结构不稳定。从而促使分子伸展开，增强了s p i 溶液中蛋白质分子间的相互作用， 从而引起分子间或分子内s h s s 的氧化反应( t h o r n t o n ，1 9 8 1 ) 。加热、变性剂 处理( 脲、s d s ) 等均能引起s p i 的二硫键发生聚合反应( w a g n e re ta 1 ，1 9 9 2 ) 。 大豆疏水分离蛋白的结构及新型胶粘剂的研究 在高p h 值下二硫键相互作用明显，另外在低p h 值下s h 与s s 相互转换( n i r e t a 1 ，1 9 9 4 ) 。美国、日本等发达国家早已用化学改性的方法生产出各种功能特性 的大豆分离蛋白。近年来我国在化学改性方面取得突飞猛进的发展，可根据新开 发的工程化食品的各种模式设计的需要，通过化学手段把各种功能基团引入大豆 蛋白中从而开发生产出具有多种特殊功能的大豆蛋白品种。表1 3 列举了经过化 学改性后的大豆蛋白的应用效用。 大豆分离蛋白的化学改性的一个途径是通过引入带负电荷的基团来改变蛋 表1 3 大豆蛋白的化学改性与功能效果 t a b l e1 - 3c h e m i c a lm o d i f i c a t i o na n df u n c t i o n a le f f e c t so fs o y b e a np r o t e i n 白质的等电点，增强改性后蛋白质的抗凝聚力，使蛋白质在食品加工过程中适用 性提高，在中性或微酸性介质中仍具有良好的溶解性，充分发挥其功能特性。大 豆分离蛋白的化学改性的另一个途径是通过引入一些含硫醇基或二硫键的基团， 提高大豆分离蛋白的强韧性、粘弹性和组织感。比如小麦面筋蛋白和动物肌肉蛋 白所具有的良好的强韧性和组织感，就是由于半胱氨酸中的硫醇基的作用所致。 大豆蛋白的工业利用增大了大豆的利用价值( h e t t i a r a c h c h y e ta 1 ，1 9 9 5 a ) ，而大 豆蛋白的工业利用取决于它的功能特性。关于大豆蛋白改性以提高其对木材粘合 性能鲜有报道。h e t t i a r a c h c h y 等人用n a o h 和胰蛋白酶改性方法制备大豆蛋白胶。 他们发现，与未改性大豆蛋白相比，改性大豆蛋白的粘接强度和抗水性均有提高 ( h e t t i a r a c h c h ye ta 1 ，1 9 9 5 b ) 。美国k a n s a s 州立大学科研人员研究比较过脲改 性与碱和热改性大豆蛋白胶的粘接性能，用脲改性的大豆蛋白胶有更强的剪切力 和抗水性( h u a n ga n ds u n ，2 0 0 0 a ；s u ne ta 1 ，1 9 9 9 a ) ，但对疏水性测定结果却 9 华中农业人学2 0 0 9 届硕士学位论文 未见有过报道。有研究发现脲改性比碱改性蛋白有更强的抗水性。部分地打开蛋 白质分子一定数量的二级结构，对蛋白胶的粘合性能有利( s u n a n d b i a n ，1 9 9 9 b ) 。 国内外学者对大豆蛋白质的水溶性也做了大量的研究，并采用多种手段提高大豆 蛋白的水溶性；对蛋白质疏水性也有不同程度的研究，但是关于如何提高大豆蛋 白疏水性以及疏水性与结构之间关系却鲜有报道。本研究的目的就是研究如何提 高大豆蛋白的疏水性及其结构表征，以及大豆蛋白作为木材胶粘剂的应用。 1 5 大豆蛋白在工业上的应用 我国对大豆的种植和利用历史悠久，据文献资料记载，大豆蛋白在胶合板和 镶木工业上的应用很重要( 薛培元，1 9 5 2 ) 。北京农业大学薛培源试验利用豆粕 作原料，制成蛋白胶作为粘合剂。建国初期，森林工业生产部门采用国内较多的 黄豆榨油后，用豆饼中的蛋白来制胶，也用部分动物血( 猪血) 来做胶粘剂，用 以制造胶合板，但所制胶合板的质量不高。1 9 5 2 年，以豆粉提纯，制豆酪素胶 粘剂，提高了胶粘剂的等级。但是由于成本较高且抗水性差，生产的产品质量不 高( 汪锡安和胡宁先，1 9 8 3 ) 。大豆蛋白胶对于很多木材的粘合如杉、松、柏等 松柏类木材、落叶类如桦木等箱板和类似木材非常适宜。美国曾在5 0 6 0 年代以 大豆蛋白作为原料生产豆胶来作为木材用粘合剂。其特点是价格便宜，原料来源 比较丰富，加工制造使用等方面都比较简便。但是其粘结强度低，耐热性和耐腐 蚀性差，特别是耐水性差更限制了它的应用( l a m b u t h ，1 9 9 4 ) 。国内也曾用豆科 植物种子内所含蛋白质与氢氧化钙和氢氧化钠作用生产大豆蛋白粘合剂。其特点 是原料丰富，价格便宜，热压冷压均可，特别是没有臭味，适合制造食品用的包 装材料。缺点是耐水性差，而且加入的碱量过多会使大豆蛋白变色，从而影响了 产品的质量( j o h n s o ne ta 1 ，1 9 8 4 ) 。自第二次世界大战以后，合成石油化学产 品问世以来，由于石油产品的品质、性能、成本均优越于大豆蛋白产品，大豆蛋 白在工业上的应用大为减少了。然而随着社会的不断发展，两个原因又使大豆蛋 白获得了新的机会( b r i e na n do l o f s s o n ，1 9 8 0 ) ，在木材工业上重新具备了竞争 力：一是成本问题，二是环境问题。市场对苯酚的日益需求促使苯酚甲醛树脂 的价格日益上涨，森林资源又不能满足建筑材料的需求。于是便出现了合成板材 的新产品，这些合成木材需要大量的粘结剂。制造商便要寻求一种价格优廉又能 1 0 大豆疏水分离蛋白的结构及新型胶粘剂的研究 保证粘结剂产品质量的原料代替。由于甲醛能从层压木板中不断挥发出