（食品科学专业论文）郫县豆瓣中黄曲霉毒素B1在线监测技术研究.pdf

西华大学学位论文独创性声明 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究 工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外， 本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请 学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献 均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文作者签名：药匿幻 指导教师签名： 日期： 九ff 6 f 日期： 西华大学学位论文版权使用授权书 似 如i 。乙。1 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，在校 攻读学位期间论文工作的知识产权属于西华大学，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，西 华大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复印手段保存和汇编本学位论文。( 保密的论文在解 密后遵守此规定) 学位论文作者签名：勤厦砧 指导教师签名： 日期： 如l i 易f 日期： 西华大学硕士学位论文 摘要 郫县豆瓣是川菜中重要的调味品之_ ，是人们每餐必食的佐料，也是我市传统农产 品加工的支柱性产业。现有的国家标准已经规定了某些产品的黄曲霉毒素检测方法，但 是在黄曲霉毒素检测中，样品前处理非常重要，所以成品的检测方法还不能直接应用于 原材料和半成品豆瓣。 本文首先分析比较了薄层层析法、酶联免疫吸附法和高效液相色谱法三种方法检测 黄曲霉毒素b l 的操作可靠性、检测时间、检测成本等，酶联免疫吸附法从方法的可操作 性、经济成本及企业适用性等各方面优于薄层层析法和高效液相色谱法。最终确定采用 酶联免疫吸附法研究郭县豆瓣生产过程中各阶段产品黄曲霉毒素b 1 的在线检测技术。 采用酶联免疫吸附法研究从原材料到生产过程中各个环节的半成品豆瓣直至终产 品中黄曲霉毒素b l 的最佳检测条件。首先确定酶联免疫试剂盒检测黄曲霉毒素b l 的可 靠性，结果显示：该酶联免疫试剂盒分析方法的线性范围为o 1 广一8 0 n g m l ，检测灵敏度 达到o 1 n g m l ，批内和批间的变异系数均小于5 ，o 1 8 0 n g m l 线性范围内的平均加 标回收率为9 7 8 8 。从结果可以得，该酶联免疫试剂盒在黄曲霉毒素b l 含量检测方面 灵敏度高，可操作性强。 然后建立了不同样品材料的前处理方法，分析不同原材料采用酶联免疫法检测黄曲 霉毒素b 。的条件。文中主要考查了提取液种类和用量、提取方法和时间等因素，通过 响应面设计软件获得黄曲霉毒素b 1 的最佳提取条件。 实验表明，郫县豆瓣原材料蚕豆中黄曲霉毒素b l 的最佳提取条件：甲醇浓度 4 3 4 1 ，料液比l ：5 3 5 ，超声波提取时间3 9 8 9 r a i n ，黄曲霉毒素b i 值达到最大，为 1 5 0 1 x g k g ；成曲蚕豆瓣子中黄曲霉毒素b l 的最佳提取条件：甲醇浓度3 9 6 6 ，超声波 提取时间2 7 7 0 m i n ，超声波提取功率8 8 9 7 w ，黄曲霉毒素b 1 值达到最大，为1 4 7 9 9 k g ； 辣椒醅中黄曲霉毒素b l 的最佳提取条件：甲醇浓度4 3 0 1 ，料液比l ：6 3 4 ，超声 波提取时间4 0 9 9 m i n ，黄曲霉毒素b l 值达到最大，为1 3 2 i t g k g ；成品豆瓣中黄曲霉毒 素b l 的最佳提取条件：甲醇浓度6 0 8 0 ，料液比1 ：6 2 4 ，超声波提取时间2 0 7 0 r a i n ， 黄曲霉毒素b l 值达到最大，为3 2 2 t g k g 。 所研究的样品中黄曲霉毒素b l 的含量均在l 3 5 9 9 k g ，都达到了最佳提取效率； 实验所选模型均显著，决定系数均大于0 9 4 ，说明结果能很好地预测其响应值，变异系 数均低于5 ，说明实验精确度高、可靠性强；得出的检测方法安全适用，检测效率高。 关键词：郫县豆瓣；黄曲霉毒素b l ；酶联免疫吸附法 郫县豆瓣中黄曲霉毒素b l 在线监测技术研究 a b s t r a c t p i x i a nb e a np a s t ei so n eo fi m p o r t a n tc o n d i m e n t si ns i c h u a nd i s h e s a n di sa ni n t e g r a n t s e a s o n i n gm a t t e rf o rp e o p l e se v e r ym e a l ，a n di sa l s ot h ec o m e r s t o n ei n d u s t r yo ft r a d i t i o n a l a g r i c u l t u r a lp r o d u c tp r o c e s s i n gi no u rc i t y e x i s t i n gn a t i o n a ls t a n d a r d sh a v ep r o v i d e da f l a t o x i n t e s t i n gm e t h o d sf o rs o m ep r o d u c t , a tt h es a m et i m e ，s a m p l e p r e t r e a t m e n ti sv e r yi m p o r t a n ti nt h e p r o c e s so f a f l a t o x i nt e s t i n g ，s ot h a tt e s t i n gm e t h o d sf o rf i n i s h e dp r o d u c t c a n tb ed i r e c t l yu s e di n r a wm a t e r i a la n ds e m i - m a n u f a c t u r e db e a np a s t e f i r s t l y , w ea n a l y s e da n dc o m p a r e dt h eo p e r a t i o n a ls a f e t y 、t e s t i n gt i m ea n dc o s te t cf o r a f l a t o x i nb lt e s t i n gb y 弛l a y e rc h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) 、e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y ( e l i s a ) a n dh i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) ，e l i s ai ss u p e r i o rt o t l ca n dh p l ci no p e r a t i o n a ls a f e t y 、e c o n o m i cc o s ta n da p p l i c a b i l i t yf o re n t e r p r i s e i nt h e e n d ，w eu s ee l i s a t or e s e a r c ht h ea f l a t o x i nb to n - l i n et e s t i n gt e c h n o l o g yi nt h es t a g e so f p i x i a n b e a np a s t ep r o d u c i n g w eu s et h ee l i s at or e s e a r c ht h eb e s tt e s t i n gc o n d i t i o n so fa f l a t o x i nb io n - l i n et e s t i n g t e c h n o l o g yi n t h es t a g e so f p i x i a nb e a np a s t ep r o d u c i n g f i r s t , w eh a v et od e f i n et h er e l i a b i l i t yo f t h ed e t e c t i o no fe l i s ak i t , t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h el i n e a rr a n g eo fa n a l y t i c a lm e t h o do ft h i s e l i s ak i ti s 0 1 8 o n g m l ，a n dt h ed e t e c t i o ns e n s i t y v i t y i s 0 1 n g m l ，i n t r a - a s s a ya n d i n t e r - a s s a yc o e f f i c i e n to fv a r i a b i l i t y ( c a r ea l ll e s s t h a n5 ，t h ea v e r a g er e c o v e r yr a t ei s 9 7 8 8 i nl i n e a rr a n g e a c c o r d i n gt ot h er e s u l t s ，t h i se l i s ak i ti sr e a l l yf e a t u r e db yr e l i a b l e ， l l i 曲s e n s i b i l i t yf o ra f l a t o x i nb ld e t e c t i o n a n dt h e n ，w ei n s t i t u t e dp r e t r e a t m e n tm e t h o d so fd i f f e r e n ts a m p l e s ，a n da n a l y s e dt h e c o n d i t i o n sf o ra f l a t o x i nb ld e t e c t i o nb ye l i s a i nt h i sp a p e r , w em a i n l ym a d ea no n t h e - s p o t i n v e s t i g a t i o nf r o mk i n da n dd o s a g e o fe x t r a c t 、e x t r a c t i n gt i m ea n dm e t h o d ，f i n a l l yw eg o tt h e b e s te x t r a c t i n gc o n d i t i o nf o ra f l a t o x i nb tb yr e s p o n s es u r f a c ed e s i g n ( b o x - b e h n k e nd e s i g n ) e x p e r i m e n tr e s u l t ss h o wt h a tt h eb e s te x p e r i m e n tc o n d i t i o n so fa f l a t o x i nb le x t r a c t i n g f r o mr a wm a t e r i a lb r o a db e a n sw e r ea sf o l l o w s ：m e t h a n o lc o n c e n t r a t i o ni s4 3 41 ，r a t i oo f s a m p l et os o l u t i o ni s1 ：5 3 5 ，u l t r a s o n i ce x t r a c t i o nt i m ei s3 9 8 9 m i n ，d e t e c t i n go f r a wm a t e r i a l b r o a db e a n sc a na c h i e v ei t sm a x i m u mv a l u ef o r1 5 0 1 a g k gb yt h i so p t i m i z e dc o n d i t i o n ；t h eb e s t e x p e r i m e n tc o n d i t i o n so fa f l a t o x i nb le x t r a c t i n gf r o mk o j ib e a nw e r ea sf o l l o w s ：m e t h a n o l c o n c e n t r a t i o ni s3 9 6 6 ，u l t r a s o n i ce x t r a c t i o nt i m ei s2 7 7 0 r a i n ，u l t r a s o n i ce x t r a c t i o np o w e ri s 8 8 9 7 ，d e t e c t i n go f k o j ib e a nc a l la c h i e v ei t sm a x i m u mv a l u ef o r1 4 7 - t g k gb yt h i so p t i m i z e d e o n d i t i o n 西华大学硕士学位论文 t h eb e s te x p e r i m e n tc o n d i t i o n so f a f l a t o x i nb 1e x t r a c t i n gf r o mc h i l l is o ys a u c em a s hw e r e a sf o l l o w s ：m e t h a n o lc o n c e n t r a t i o ni s4 3 0 1 r a t i oo f s a m p l et os o l u t i o ni sl ：6 3 4 ，u l t r a s o n i c e x t r a c t i o nt i m ei s4 0 9 9 r a i n ，d e t e c t i n go fc h i l l is o ys a u c ec a r la c h i e v ei t sm a x i m u mv a l u ef o r 1 3 2 i _ t g k gb yt h i so p t i m i z e dc o n d i t i o n ；t h eb e s te x p e r i m e n t c o n d i t i o n so fa f l a t o x i nbie x t r a c t i n g f r o mp i x i a ns o y b e a np a s t ew e r ea sf o l l o w s ：m e t h a n o lc o n c e n t r a t i o ni s6 0 8 0 r a t i oo fs a m p l e t os o l u t i o ni sl ：6 2 4 ，u l t r a s o n i ce x t r a c t i o nt i m ei s2 0 7 0 m i n ，d e t e c t i n go fp i x i a ns o 曲e a n p a s t ec a na c h i e v ei t sm a x i m u mv a l u ef o r3 2 2 i _ t g k gb y t h i so p t i m i z e dc o n d i t i o n c o n t e n to fa f l a t o x i nb li ns a m p l e sf o ra l lr e s e a r c hi nr a n g eo f1 3 5 i - t g k g , a n da c h i e v e d t h eb e s te 施c i e n c yo fe x t r a c t i o n ；e x p e r i m e n t a lm o d e l sa r ea l ln o t a b l e t h et o e 街c i e n to f d e t e r m i n a t i o na n dt h er s di s0 9 4a n d5 r e s p e c t i v e l y , i ti sf o u n dt h a tt h ee x p e r i m e n t a ld a t a a g r e ew e l lw i t ht h er e s p o n s ev a l u e ，t h i sm e t h o di sr e a l l yf e a t u r e db yr e l i a b l e ，h i 曲s e n s i b i l i t y a n de 街c i e n c yf o ra f l a t o x i nb id e t e c t i o n k e yw o r d s ：p i x i a ns o y b e a np a s t e ；a f l a t o x i nbl ；e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y ( e l i s a ) i 摘 a b 引 l 1 1 3 样品的提取1 6 1 2 结果与分析16 1 2 1 e l i s a 线性范围的考察。1 6 1 2 2 精密度实验17 1 2 3回收率实验。18 1 3 小结1 9 2 郫县豆瓣中黄曲霉毒素b l 在线检测方法的研究一2 0 2 1 材料与方法2 0 2 1 1 材料与仪器一2 0 2 1 2 在线检测方法的建立一2 0 2 2 结果与讨论2 7 2 2 1 e l i s a 法检测原料蚕豆中黄曲霉毒素b l 方法的实验结果与分析2 7 2 2 2 e l i s a 法检测成曲蚕豆瓣子中黄曲霉毒素b l 方法的实验结果与分 析3 7 2 2 3 e l i s a 法检测辣椒醅中黄曲霉毒素b l 方法的实验结果与分析4 7 2 2 4 e l i s a 法检测成品豆瓣中黄曲霉毒素b l 方法的实验结果与分析5 7 结 论一6 8 参考文献7 1 攻读硕士学位期间发表的论文及科研成果7 4 致 射7 5 西华大学硕士学位论文 引言 郫县豆瓣产自于四川省成都市郫县的郫筒、犀浦等十九个乡镇，已经有3 0 0 余年的 历史，作为四川省地方名产而饮誉海内外。郫县豆瓣以鲜红辣椒、蚕豆为主要原料，食 用盐、小麦粉等为辅料，按照传统工艺酿制而成的，具有色泽红褐、油润、酱酯香、瓣 粒香脆、味道鲜辣等特点。它的生产自有其独特之处，生产过程中自然而成的微生物区 系也较为独特，这种多菌种的微生物区系的小生态是经过了较长时间才形成的，独特的 微生物群的共同作用对于“郫县豆瓣 的生产起着至关重要的作用，由此形成了“郫县 豆瓣”独特的外观品质和内在的风味。郫县豆瓣是川菜的必备调料，被誉为“川菜之 魂”，同时它还具有一定的生理保健功效，可延缓动脉硬化、降低胆固醇、增进食欲等。 “郫县豆瓣 于2 0 0 0 年4 月获得由国家工商总局商标局批准的“郫县豆瓣 地理 标志证明商标，其产地区域仅限于国家质量监督检验检疫总局批准的四川省成都市郫县 现辖行政区域的范围。通过国家原产地保护和审查，受到了国家严格的原产地标准的规 范和管理，郫县豆瓣作为地理标志保护产品，不仅有识别产品来源的功能，更是一种质 量标志【1 1 。 郫县豆瓣的生产不仅带动了郫县酿造业的发展，而且还成为郫县食品工业的支柱产 业之一。随着科学技术发展和食品工业生产产业化的不断深入，郫县豆瓣的经济效益和 社会效益已被认可，逐步跨越地域，走向世判2 1 。随着川菜在中国乃至世界的推广和普 及，1 9 9 9 年，郫县豆瓣及其系列产品总量为5 万吨，销售收入总额达2 5 亿元，利税总 额3 0 0 0 万元，截至2 0 1 0 年底，郫县豆瓣及系列产品总产量已达4 5 万吨，销售收入总 额达到1 8 亿元，利税总额1 8 亿元。同时郫县豆瓣产业还带动了食品包装、运输和竹编 产业等相关产业的快速发展，吸纳和接收了大量农村剩余劳动力，有力地促进了农民就 地就业增收及区域经济发展。 郫县豆瓣目前仍采用传统的生产工艺，其加工过程大致为：蚕豆经脱壳、浸泡、接 种、制曲、撒盐水等工序后，加入辣椒再入池发酵近1 年；然后经过消毒，与各种辅料 按比例进行配制，就为成品豆瓣酱。豆瓣制曲主要是通过米曲霉在原材料上生长繁殖， 其分泌的蛋白酶和淀粉酶是郫县豆瓣发酵过程的主要物质，在发酵过程中，从空气中落 入的酵母和细菌也同时进行繁殖并分泌多种促进发酵的酶类物质，与蛋白酶和淀粉酶共 同作用，形成了郫县豆瓣独特的风味和色泽【3 】。根据研究，郫县豆瓣独特的香气中主要 成分为酯类，其次是醇类，然后是醛酮类等，其中含量较大成分有3 甲基丁醇、糠醇、 芳樟醇、3 一甲基丁醉醛、乙酸乙酯等，对郫县豆瓣酱香气有较大贡献的还有低级的脂肪 酸酯类成分【4 j 。 ( 1 ) 郫县豆瓣安全性分析 豆瓣酱的主要原料是大豆和辣椒，原材料受黄曲霉污染而产生黄曲霉毒素是成品豆 瓣产生食品安全问题的主要原因之一，据联合国粮农组织估计，全世界谷物供应2 5 受 真菌毒素污染而不能食用【9 1 ，其中对谷物污染最严重是黄曲霉毒素【l0 1 。农作物在贮藏期 间受环境影响其品质会产生一系列变化，农作物的理想贮存条件是将其贮存于干燥低温 的状态，能有效地控制霉菌的生长。由于我国不少地区气候湿热，粮食及加工产品易于 发霉，导致产品品质劣变。而存在于豆瓣原料( 蚕豆瓣子，小麦，辣椒等) 中的真菌毒 素主要是黄曲霉毒素、镰刀菌毒素，其次是杂色曲霉毒素和棕曲霉毒素a l 】。黄曲霉毒 西华大学硕士学位论文 素和镰刀菌毒素可使人体免疫功能受抑制，对人还有致癌作用，所以在原材料选购时， 应昼剔除表面受损的。原料的安全性直接影响到成品豆瓣的品质，如能在原材料选购上 进行严格的挑选，把住原料安全关，是保证郫县豆瓣质量的第一步。 黄曲霉可以在大豆、辣椒收获前、收获后、储藏、运输期间和加工过程中产生，粮 食作物在收获后应该迅速降低其水分含量。如果大豆、辣椒等主要原料由于环境条件不 能及时干燥和储藏期间的水分控制不合理就有利于霉菌的生长，同时也会在收获后被黄 曲霉毒素污染【5 j 。黄曲霉菌适宜的生长温度为1 2 - - 4 2 ，在2 4 - 3 0 时生长最快，产毒 量最剐1 2 】。研究发现，水分活度也是影响黄曲霉菌生长的重要因素，水分活度低于0 9 0 ， 温度低于1 5 时不利于黄曲霉菌的生长【l3 1 ，一般谷物水分在1 4 以上最适合黄曲霉菌的 繁殖与生长【l 钔。同时虫害、鼠类啃咬和物理性破碎加大了原材料受霉菌污染的机会，因 为受损原材料的破损处暴露于空气中，极易被霉菌污染并产毒，所以在原料的选择上， 应该选择无破损、无霉变的。 传统大豆发酵制品的生产仍处于比较粗放的境况，主要发酵过程采用传统自然发 酵，在制曲、发酵过程中起主要作用的是曲霉菌，其次是细菌和酵母菌，制曲时杂菌数 量多，包括黄曲霉毒素污染。在发酵过程中被黄曲霉毒素污染是真菌、寄主和环境相互 作用的结果，这些因子的结合决定了真菌的侵染和繁殖，以及黄曲霉毒素产生的类型和 数量。 工业化生产用于发酵豆制品生产的主要微生物种类很多，主要是细菌、霉菌2 个大 类，如枯草芽孢杆菌属，霉菌属有毛霉、根霉、曲霉等，从食品安全与人类健康方面考 虑，大豆发酵制品生产所用微生物必须具有不产生真菌毒素的特点。而且由于诸多因素， 传统酿造工艺中的微生物间共生的主要原理和性质长期被忽略，致使郫县豆瓣的加工工 艺一直处于传统阶段，产品质量无明显提高。已有许多学者对大豆发酵过程中的许多微 生物进行了分离纯化，并且得到了像m h c 1 、沪酿3 0 4 2 米曲霉等活力强、适应能力强， 安全无毒的菌株。还有学者研究了针对郫县豆瓣发酵过程中菌种的共培养技术，结果表 明，采用共培技术，显著提高了郫县豆瓣中主要的呈香呈色物质比例，大大缩短了发酵 周则15 1 。 ( 2 ) 黄曲霉毒素概述 黄曲霉毒素的分子结构及理化性质 黄曲霉毒素( a f l a t o x i n s ) ，是黄曲霉( a s p e r g i l l u sf l a v u s ) 、寄生曲霉( a p a r a s i t i c u s ) 在生长过程中产生并分泌的次级代谢产物，它是一类毒性极强的物质1 1 6 】。黄曲霉毒素的 存在可以在食物链中进行传递，从田间、收获、储存直至做为食品加工原料被使用【1 7 】。 研究表明黄曲霉毒素的细胞毒素可干扰信息r n a 和d n a 的合成，进而干扰细胞蛋白质 郫县豆瓣中黄曲霉毒素b l 在线监测技术研究 的正常合成，导致动物全身器质性损害。目前已分离鉴定出的黄曲霉毒素达2 0 多种， 其中主要是黄血霉毒素b l 、b 2 、g l 和g 2 以及由b l 和b 2 在体内经过羟化作用而衍生成 的代谢产物m l 、m 2 掣18 1 。黄曲霉毒素已被世界卫生组织列为已知最强致癌化学物质之 一，其中黄曲霉毒素b l 是毒性最强的，也是被研究最多的【19 1 。黄曲霉毒素b l 、b 2 、g 1 、 g 2 的结构如图i 所示。 a f l a t o x i nb 1 a f l a t o x i nm 1 a f l a t o x l nb 2 oo a f l a t o x i nm 2 oo a f l a t o x i n 0 ， a f l a t o x i ng 2 图i 黄曲霉毒素结构图 f i g 1 c o m t m c t i o n a d e t a i lo fa f l a t o x i m 在紫外线照射下产生蓝紫色荧光的为b 类黄曲霉毒素( a f t b ) ，产生黄绿色荧光的 为g 类黄曲霉毒素( a f t g ) 。黄曲霉毒素溶解于多种有机溶剂中，易溶于甲醇、乙醇、 三氯甲烷、乙腈和二甲基酰胺等有机溶剂，不溶于正己烷、石油醚和乙醚中，微溶于水。 一般在中性溶液中较稳定，在强酸性溶液中稍有分解，在p h9 1 0 的碱性溶液中分解 迅速，同时易被强氧化剂分解。人及动物摄入黄曲霉毒素b l 和b 2 后，在乳汁和尿中均 可检出其代谢产物黄曲霉毒素m 。和m 2 【2 0 1 。黄曲霉毒索性质非常稳定，2 6 8 2 6 9 。0 时 才发生裂解，毒性才能被破坏【1 8 1 。 黄曲霉毒素的主要危害 4 西华大学硕士学位论文 黄曲霉毒素b l 的( a f b l ) 半数致死量为o 3 6m g k g 体重，属特剧毒的毒物范围( 动 物半数致死量l o m g k g ) ，它的毒性比氰化钾大1 0 倍，比砒霜大6 8 倍。黄曲霉毒素引 起人的中毒主要是损害肝脏，发生肝炎、肝硬化、肝坏死等症状，长期摄入黄曲霉毒素 会诱发肝癌。它诱发肝癌的能力是二甲基亚硝胺的7 5 倍，是目前公认的致癌性最强的 物质之一。另据世界卫生组织报导，黄曲霉毒素含量在3 0 - - 5 0 1 t g k g 时为低毒，5 0 - 1 0 0 j _ t g k g 时为中毒，1 0 0 l 0 0 0 i l g l ( g 时为高毒，1 0 0 0 i - t g k g 以上为极毒。鉴于黄曲霉毒 素对人类的巨大危害性，我国对其在食品中的含量作了严格规定，其中，乳制品中黄曲 霉毒素最高允许量为5 1 x g k g ( 即5 p p b ) 2 1 j 。 黄曲霉毒素b l 对蛋白质合成的抑制会引发血清蛋白浓度的变化，从而导致基体非 特异性体液物质的抑制。亚急性剂量的黄曲霉毒素b l 会使豚鼠补体缺乏，火鸡体内的 干扰素产生延迟，淋巴因子激活延迟等。更高剂量的黄曲霉毒素b 1 会同时降低小鸡体 内免疫球蛋白g 和免疫球蛋白a 的水平，同时它能够在动植物细胞中引起染色体失常 ( f 染色体断裂，染色单体桥接和破损) 和d n a 的破损。黄曲霉毒素b l 还有致畸作用， 它能有效抑制蛋白质的正常合成，能够影响原始细胞的发育和胎儿的分化。黄曲霉毒素 b l 与d n a 的共价结合可能会抑制d n a 的甲基化反应，从而改变基因表达和细胞分化， 促使哺乳动物细胞内致癌基因的形成和转化【2 2 1 。1 9 8 8 年国际肿瘤研究机构 ( i n t e m a t i o n a la g e n c yf o rr e s e a r c ho nc a n c e r ，i a r c ) 将黄曲霉毒素b l 列为人类致癌物。 除此以外，黄曲霉毒素与其他致病因素( 如肝炎病毒) 对人类疾病的诱发具有相互叠加效 应【1 8 】。 黄曲霉毒素除具有巨毒性外，还会降低食品的营养价值。各种霉菌利用粮食中营养 物进行生长繁殖并产生黄曲霉毒素，在霉菌所含各种酶的作用下，食品组分发生分解、 变质，从而降低了粮食使用价值。此外，食品霉变还可以导致食品变色、变味、结块， 使食品的营养价值有所降低。真菌或真菌毒素的存在，不仅严重影响农作物产量，而且 严重降低了农产品、饲料以及畜产品的品质，造成每年数百亿美元的经济损失【2 3 】。 食品中黄曲霉毒素污染状况 黄曲霉毒素对粮食食品的污染非常广泛，主要受污染的食品有：粮油食品、动物食 品等，如花生、玉米、大米、小麦、豆类、坚果类、肉类、乳与乳制品【2 4 1 、水产品等容 易被黄曲霉毒素污染，其中以花生和玉米受污染最严重。1 9 6 0 年英国发生了“火鸡x 病，【2 5 1 ，造成1 0 万余只火鸡死亡，经研究是由于火鸡所吃的饲料原料花生饼被黄曲霉毒 素所污染，黄曲霉毒素主要由某些黄曲霉菌株和寄生曲霉菌株产生，其他菌株如 a n o m i u s 和黑曲霉a n i g e r 也可产生黄曲霉毒素【2 6 】。 郫县豆瓣中黄曲霉毒素b l 在线监测技术研究 y o u s i fm a i d r i s 等【2 7 j 利用高效液相检测方法分析了黄曲霉毒素b l 、b 2 、g l 和g 2 对食品的污染，样品采集于几个不同的州，样品种类为花生油、芝麻油和棉籽油，总共 分析了5 6 个样本。结果表明黄曲霉毒素b l 在8 个样品中检出，占总样品数的1 4 3 ， 其中芝麻油中的黄曲霉毒素含量最高，检出率达4 3 7 5 ，花生油中黄曲霉毒素检出率 相对较低，为3 7 5 ，棉籽油中未检出。黄曲霉毒素b 1 在芝麻油中的含量在0 2 - 0 8 a g k g 范围内，在花生油中的平均含量为0 6 9 9 k g 。m a n s o o r e hm a z a h e r i t 2 8 】对伊朗的进口大米进 行了黄曲霉毒素分析，采用免疫亲和柱净化高效液相分析方法进行检测，结果表明在 所检测的7 1 个样本中，5 9 个样本检出了黄曲霉毒素，检出率高达8 3 ，黄曲霉毒素b l 的平均含量达到2 0 9 n g g ，其中有两个样本的黄曲霉毒素b l 含量超出了规定的最高限值 ( 5 n g g ) 。 发酵食品是以粮食为原料，在贮存、制曲、发酵、产品后熟等过程中也会产生黄曲 霉毒素，尤其是高温、高湿地区的粮油及制品中的检出率更耐2 9 1 。在我国，长江沿岸以 及长江以南高温高湿地区黄曲霉毒素污染严重，北方地区污染较轻，黄曲霉毒素污染已 成为重大食品安全隐患【3 们。近几年来，我国出口欧盟的花生有几十批次出现了黄曲霉毒 素超标的问题，有的批次黄曲霉毒素的含量超过欧盟限量值数十倍，占出口欧盟问题产 品总数的2 3 5 。这些黄曲霉毒素超过限量的花生，要么被退货，要么被拒入境，有的 甚至被销毁，造成了巨大的浪费和经济损失【3 1 】。 黄曲霉毒素限量标准： 由于黄曲霉毒素污染越来越普遍，对人类生存构成的威胁也日益严重，迫使得人们 十分重视其对人类的各种潜在威胁性。截止2 0 0 3 年，世界上已有7 6 个国家制定了食品 中黄曲霉毒素的限量标准【3 2 1 ，不同国家对粮食中黄曲霉毒素含量并没有一致的规定，很 多国家依据不同物品制定了各自的限量或推荐限量【3 3 】( 见表i ) ，从0 5 0 n g g 不等【3 4 】。 尽管食品中真菌毒素的污染不能完全避免，但是，将真菌毒素的限量规定在可能达到的 最低水平是非常必要的。 自2 0 0 3 年8 月1 日起，凡在我国境内从事米、面、油、酱油、醋生产加工的企业， 其产品必须经检验合格后才可上市。国家质检总局发布的关于印发小麦粉等5 类食品 生产许可证实施细则的通知中明确规定，黄曲霉毒素b l 必须检测。在第八期中华 人民共和国国家质量监督检验检疫总局公报中发布关于黄曲霉毒素检测方法的最新国 标，其内容主要包括：g b t 1 8 9 7 9 2 0 0 3 食品中黄曲霉毒素的测定免疫亲和层净化高效 液相色谱法和荧光光度法【3 5 】；g b t 1 8 9 8 0 2 0 0 3 乳和乳粉中黄曲霉毒素m 1 的测定免 疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法【3 6 1 。 西华大学硕士学位论文 2 0 0 2 年2 月4 日欧盟决议对从中国进口或委托从中国进口的花生和花生制品实施黄 曲霉毒素强制性检测。国际卫生组织( w h o ) 世界粮农组织所属的食品法典委员会( c a c ) 推荐食品、饲料中黄曲霉毒素最大允许量标准为总量( b l + b 2 + g l + g e ) d x 于1 5 “g k g ；牛奶 中m l 的最大允许量为0 5 9 9 k g ；南非1 9 9 0 颁布了黄曲霉毒素的最大允许标准：食品中黄 曲霉毒素总量( b l + b 2 + g l + g 2 ) d x 于1 0 9 9 k g ，其中黄曲霉毒素b 1 小于5 9 9 k g ；印度标准 是花生中黄曲霉毒素b l 小于3 0 9 9 k g ；越南和阿根廷的标准为黄曲霉毒素b 1 小于 2 0 p g k g t 3 7 1 。 表i 部分国家食品和饲料中黄曲霉毒素的限量标准 t a b it h el i m i ts t a n d a r do f a f l a t o x mi i lf o o da n df e e di 1 1s e l e c t e dc o u n t r i e s ( 3 ) 黄曲霉毒素的预防及解毒 黄曲霉毒素属于剧毒类物质，对人类及其他生物表现出很强的毒性，同时具有明显 的致癌性，其中以黄曲霉毒素b l 最为突出。对于黄曲霉毒素b 。的预防、去除及解毒显 法、免疫化学分析方法掣4 2 1 。 薄层层析法 薄层层析( t l c ) 是在黄曲霉毒素研究方面应用最广的分离技术，自1 9 9 0 年，它被 列为a o a c ( a s s o c i a t i o no f o f f i c i ma g r i c u l t u r a lc h e m i s t s ) 标准方法，该方法同时具有定 性和定量分析黄曲霉毒素的功能。薄层层析法的原理是将样品经有机溶剂提取、净化、 浓缩后进行薄层分离，在3 6 5 n m 紫外灯下，黄曲霉毒素b l 、b 2 、g l 和g 2 分别会显紫色、 蓝紫色、绿色和绿色荧光。薄层层析法对实验室仪器设备要求低，一般的实验室即可实 施，成本低，无需价格昂贵的仪器。但其步骤较繁琐，耗时，只能半定量检测，主观影 响较大，灵敏度不高，不适合大量样品检测。而且在检测过程中检测人员与黄曲霉毒素 标准品接触机率高，对检测人员的身体健康易造成威胁。 8 西华大学硕士学位论文 高效液相色谱法 高效液相色谱【4 3 】与薄层层析在许多方面具有相似性，二者互相补充。通常用薄层层 析法进行前期的条件设定，选择适宜的分离条件后，再用高效液相色谱进行黄曲霉毒素 的定量测定。高效液相色谱法由于其具有荧光检测器，所以在对黄曲霉毒素的检测中更 准确，而且这种方法已广泛该用于不同样品中黄曲霉毒素的检测中】。 王君等在食品中黄曲霉毒素b l 、b 2 、g l 、g 2 的高效液相色谱测定方法中研究 了大米、玉米、花生中黄曲霉毒素的高效液相色谱法，方法的回收率和精密度均比较好， 简化了试样前处理过程，减少了试剂的使用量，研究结果显示，花生的污染情况仅次于 玉米，大米的污染情况较轻，应该重点加强玉米和花生中黄曲霉毒素的监测的控制一引。 姜兆兴等建立了用三氯甲烷提取、硅胶小柱净化、三氟乙酸衍生，再以荧光检测器来测 定粮谷中黄曲霉毒素b 1 的高效液相色谱法，通过试验得出，该方法的最低检出限可达 o 4 l x g k g ，线性范围为2 - 5 0 1 a g k g ，平均回收率较好。通过反复测试后，所得出的方法应 用于各种粮谷中黄曲霉毒素b 1 的检测中，具有操作简单，净化效果好，分辨率高，干 扰少等特点，满足了日常对黄曲霉毒素b l 的检测要求【4 引。 一 鲍蕾等研究了人参和生姜中的黄曲霉毒素和棕曲霉毒素a 的检测，其中对3 0 个待 测样品进行了测定，采用了免疫亲和柱( a f l a o c h r a t e s tc o l u m n ) 净化、电化学在线衍生、 高效液相色谱荧光检测器检测人参和生姜中黄曲霉毒素b 1 、b 2 、g l 和g 2 和棕曲霉毒素 a ，其中对黄曲霉毒素检测的回收率为8 0 - 9 0 ，准确度高，重现性好，此方法能够 满足对人参和生姜中黄曲霉毒素的检测【4 。 褚庆华等根据美国v i c a m 生物科技有限公司对谷物中真菌毒素采用免疫亲和柱层 析净化技术进行检测的基础上，将此方法推广到油料( 大豆，油菜籽等) 和食用植物油， 建立了黄曲霉毒素b 1 、b 2 、g l 、g 2 及其总量、赭曲霉毒素a 和玉米赤霉烯酮的快速测 定方法，首先采用免疫亲和柱层析净化荧光光度法进行快速筛选，然后用高效液相色谱 法进行快速确证。结果表明：免疫亲和柱层析净化荧光光度法和高效液相色谱法测定大 豆、油菜籽和食用植物油中的黄曲霉毒素、赫曲霉毒素a 和玉米赤霉烯酮的回收率均在 6 0 1 2 0 ，相对标准偏差( r s d ) 在3 5 以下，符合生物毒素检测方法制订时对回收 率和相对标准偏差的要求。此方法可以满足检验检疫机构，质量监督机构等对油籽和食 用油进行实时监控j 。 高效液相色谱法检测黄曲霉毒素，多采用荧光检测器进行检测，对于检测的参数设 置大致相同，但在不同样品的前处理及流动相的选择上却差别较大。高效液相色谱法具 有特异性强、灵敏度高、重现性好及分析定量准确等特点，但其检测过程所需的仪器价 格十分昂贵，样品前处理要求高， 9 性好，平均回收率为9 1 4 - - 9 3 5 ，相对标准偏差( r s d ) 小于5 ，此方法适宜普遍 推广【5 1 1 。( ( e l i s a 检测食品中黄曲霉毒素b l 的方法学研究及应用中针对五类食品中 黄曲霉毒素b l 的提取方法做了研究与评价，结果表明所建立的检测方法灵敏度达到 o 1 , g k g ，重现性好，变异系数小于7 ，并且应用所建立的方法对五类食品进行抽样检 测，样品合格率达到9 9 【5 2 1 。辣椒调味品中黄曲霉毒素b l 检测及应用中建立了e l i s a 1 0 西华大学硕士学位论文 方法检测辣椒调味品中黄曲霉毒素b l 含量评价指标，验证了e l i s a 法用于辣椒调味品 中黄曲霉毒素b 1 分析的可行性，证实了样品溶液中盐、油脂等因素对e l i s a 法检测结 果的影响【5 3 1 。 一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法瞰】原理：利用单克隆抗体而设计的固相免疫分析 法。由此产生的一步式黄曲霉毒素快速检测试纸可在5 1 0 分钟完成对样品中黄曲霉毒 素的定性测定借助黄曲霉毒素标准样品，这种方法能估算黄曲霉毒素的含量，非常适用 于现场测试和进行大量样品的初选。 微柱筛选法 原理：样品提取液中的黄曲霉毒素被微柱管风硅镁型吸附层吸附后，在波长3 6 5 n m 紫外光灯下显示蓝紫色荧光环，其荧光强度与黄曲霉毒素在一定的光密度范围内成正比 例关系。若硅镁型吸附剂层未出现蓝紫色荧光，则样品为阴性( 方法灵敏度为5 1 0 9 9 k g ) 。由于在微柱上不能分离黄曲霉毒素b 1 、b 2 、g l 和g 2 所以测得结果为总的黄 曲霉毒素含量，可以用来半定量测定各种食品中黄曲霉毒素b l 、b 2 、g l 和g 2 的总量。 ( 5 ) 检测方法的确定 根据现有的黄曲霉毒素检测方法，采用试验性方法，首先对薄层层析法、高效液相 色谱法和酶联免疫吸附法进行对比性操作，分别从操作性、实用性、经济性等进行