（食品科学专业论文）谷氨酰胺合成酶产酶菌株的筛选.pdf

， 摘要 l u lilll l l ll 11 1 1 1 1 11 1l 、t17 3 5 0 3 7 谷氨酰胺合成酶( g s ，g l u t a m i n es y n t h e t a s ee c 6 3 1 2 ) 是生物体内广泛存在 的酶，它参与许多生物体的氮和碳代谢。而氮代谢是生物体维持生命所必需的，因此， 它是生物体内最为关键的酶类之一。谷氨酰胺合成酶在生物体内的分布及生理功能的 研究也很透彻。此外，它也是体外微生物酶促转化合成茶氨酸的重要酶类之一，更是 谷氨酰胺工业化生产中极其重要的催化剂，是非常有价值的物质，故对其需求量也日 益增多。利用微生物发酵生产谷氨酰胺合成酶是条经济而又高效的途径。目前谷氨酰 胺合成酶的产酶菌株主要是节杆菌属的一些细菌。而利用霉菌发酵生产谷氨酰胺合成 酶的研究却很少，米曲霉更是没被研究过。本实验首先从实验室保藏的菌株中筛选出 具有较高产酶能力的米曲霉，并对其进行紫外诱变、优化发酵条件和酶学性质的研究。 实验中首先从实验室保藏的菌株中筛选出具有较高产谷氨酰胺合成酶能力的米 曲霉。进而对米曲霉进行紫外诱变，诱变条件为：紫外灯1 5 w ，照射距离2 0 c m ，照射 时间1 2 0 s 。最后，经过、复筛和遗传稳定性实验，选育出的诱变菌株产谷氨酰胺合 成酶的能力比出发菌株提高了1 5 6 。 其次，对选育出的米曲霉进行发酵条件的优化，先进行单因子实验，筛选出米曲 霉液态发酵产谷氨酰胺合成酶的最适碳源、氮源、起始p h 、装液量、发酵温度、摇 床转速和诱导因子。结果表明最适碳源为蔗糖，最适氮源为蛋白胨，最适起始p h 为 6 ，最适装液量为6 0 m l ，最适发酵培养温度为2 8 ，最适摇床转速为1 6 0 r m i n ，最 适诱导因子为谷氨酸钠。再通过正交实验确定四种显著影响因子的添加量，优化培养 基的成分和液体发酵条件，使选育出的米曲霉产谷氨酰胺合成酶的能力进一步提高。 再次，对超声波破碎器破碎米曲霉细胞壁的条件进行研究，分别设定不同的工作 时间和间隔时间，再对总时间进行优化，结果表明在超声波破碎器功率为4 0 0 w 的条 件下，工作1 s ，间隔3 s ，2 0 m i n ，是破碎米曲霉细胞壁的最适破碎条件。 最后，对提取的谷氨酰胺合成酶的粗酶液进一步的纯化，通过实验对米曲霉谷氨 酰胺合成酶的酶学性质进行初步的研究。结果表明最适酶促反应时间为：3 0 m i n ，最 适p h 为为6 5 ，最适温度为6 0 c ，并且得出m 9 2 + 、m n 2 + 对维持酶活至关重要。 关键词：谷氨酰胺合成酶米曲霉紫外诱变发酵条件酶学性质 i - 一 - 一 a bs t r a c t g l u t a m i n es y n t h e t a s e ( g s ，g l u t a m i n es y n t h e t a s e ；e c 6 3 1 2 ) i sa ne n z y m e w i d e s p r e a di nv i v o ，i ti si n v o l v e di nm a n yo r g a n i s m s ，n i t r o g e na n dc a r b o nm e t a b o l i s m a n d n i t r o g e nm e t a b o l i s mi sn e c e s s a r yf o ro r g a n i s m st om a i n t a i nl i f e ，t h e r e f o r e ，i ti so n eo f t h em o s tc r i t i c a l e n z y m e si n v i v o i ti sa l s ov e r yt h o r o u g hi nv i v od i s t r i b u t i o na n d p h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s i na d d i t i o n ，i ti sa ni m p o r t a n te n z y m e st h a tc a l lc a t a l y z et h e s y n t h e s i so ft h e a n i n ei nv i t r o g l u t a m i n ei se x t r e m e l yi m p o r t a n ti ni n d u s t r i a lp r o d u c t i o no f c a t a l y s t s ，i sv e r yv a l u a b l em a t e r i a l ，s oi ti sa l s oi n c r e a s i n gf o rd e m a n d i n g m i c r o b i a l f e r m e n t a t i o ni se c o n o m i ca n de f f i c i e n tw a yt op r o d u c eg l u t a m i n es y n t h e t a s e c u r r e n t l y g l u t a m i n es y n t h e t a s ep r o d u c i n g - s t r a i n m a i n l yb e l o n g t os o m eo ft h eb a c t e r i a a r t h r o b a c t e r t h eu s eo fm o l df e r m e n t a t i o no fg l u t a m i n es y n t h e t a s er a r e l y , a s p e r g i l l u si s n o tb e i n gs t u d i e d i nt h i ss t u d y , f i r s ts c r e e n i n gah i g hg l u t a m i n es y n t h e t a s e - p r o d u c i n g s t r a i n ，f r o ms t r a i n sp r e s e r v e di nl a b o r a t o r y a n dr e s e a r c h i n gu vm u t a g e n e s i s ，o p t i m i z e d f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa n dt h ee n z y m a t i cp r o p e r t i e s f i r s to fa l l ，s c r e e n i n gah i g hg l u t a m i n es y n t h e t a s e - p r o d u c i n gs t r a i n a s p e r g i l l u sf r o m s t r a i n sp r e s e r v e di nl a b o r a t o r y t h e n ，a s p e r g i l l u so r y z a ew a sc h o s e nf o ru v m u t a g e n e s i s t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o ru vm u t a g e n e s i so fa s p e r g i l l u so r y z a ew e r ed e t e r m i n e da s f o l l o w s ：u vl a m p15 w ：i r r a d i a t i o nd i s t a n c e2 0 c m ，i r r a d i a t i o nt i m e12 0 s f i n a l l y , a f t e r r e s c r e e n i n g ，a n dg e n e t i cs t a b i l i t yt e s t i n g ，t h ee n z y m ep r o d u c t i o nc a p a c i t yi n c r e a s e du pt o 1 5 6 。 s e c o n d l y , o u to ft h eb r e e d i n g c o n d i t i o n so f a s p e r g i l l u so r y z a ef e r m e n t a t i o n o p t i m i z a t i o n ，f i r s tt h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t s ，i n c l u d i n g ：o p t i m a lc a r b o na n dn i t r o g e n s o u r c e s ，i n i t i a lp h ，m e d i u mv o l u m e ，f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e ，r o t a t i o ns p e e da n dt h e i n d u c i n gf a c t o r t h er e s u l t ss h o wt h a tt h eo p t i m u mc a r b o ns o u r c ew a ss u c r o s e ，t h e o p t i m u mn i t r o g e ns o u r c ew a sp e p t o n e ，a n dt h eo p t i m u mi n i t i a lp h6 ，t h eo p t i m u ml i q u i d v o l u m eo f6 0 m l ，o p t i m u mt e m p e r a t u r ei s2 8 ，t h eo p t i m u mr o t a t i o ns p e e d16 0 r m i nt h e o p t i m u mi n d u c e df a c t o rw a ss o d i u mg l u t a m a t e d e t e r m i n e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n to f f o u rf a c t o r sa d ds i g n i f i c a n t l ya f f e c tt h ea m o u n to fo p t i m i z a t i o no fm e d i u mc o m p o n e n t sa n d l i q u i df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rt h eb r e e d i n go u to fg l u t a m i n es y n t h e t a s ei na s p e r g i l l u s o r y z a ee n h a n c et h ea b i l i t y a g a i n ，o nt h eu l t r a s o n i cb r e a k e rb r o k e nt h ec o n d i t i o n so ft h ec e l lw a l lo fa s p e r g i l l u s s t u d y , s e t t i n gd i f f e r e n tw o r k i n gt i m ea n di n t e r m i t t e n tt i m e ，a n dt h e no p t i m i z et h et o t a l t i m e ，t h er e s u l t ss h o wt h a tt h eu l t r a s o n i cp o w e r4 0 0 wb r e a k e rc o n d i t i o n sa sf o l l o w s ： w o r k i n gt i m e1s ，i n t e r m i t t e n tt i m e3 s ，u l t r a s o n i ct i m e2 0 m i n ，w a st h eo p t i m u mc o n d i t i o n f i n a l l y , t h ee x t r a c t e dg l u t a m i n es y n t h e t a s ei nc r u d ee x t r a c tf o rf u r t h e rp u r i f i c a t i o n , a s p e r g i l l u s0 1 3 z a eb ye x p e r i m e n t so ne n z y m a t i cp r o p e r t i e so fg l u t a m i n es y n t h e t a s ei na p r e l i m i n a r ys t u d y t h er e s u l t ss h o wt h a tt h eo p t i m a le n z y m a t i cp r o p e r t i e sa sf o l l o w s ： 。 r e a c t i o nt i m ew a s3 0 m i n ，t h eo p t i m u mp hw a s6 5 ，t h eo p t i m u m t e m p e r a t u r ei s6 0 ，t h e r e s u l t sa l s os h o w nt h a tb o t hm 9 2 + a n dm n 2 + w e r ee s s e n t i a lt om a i n t a i ng s a c t i v i t y k e yw o r d s ：g l u t a m i n es y n t h e t a s ea s p e r g i l l u so r y z a eu vm u t a g e n e s i sf e r m e n t a t i o n e n z y m a t i cp r o p e r t i e s i i i 目录 1 文献综述1 1 1 谷氨酰胺合成酶的简述1 1 1 1 谷氨酰胺合成酶的结构1 1 1 2 谷氨酰胺合成酶的分布2 1 1 3 谷氨酰胺合成酶的生理功能2 1 1 4 谷氨酰胺合成酶的研究进展3 1 1 5 酶法合成茶氨酸4 1 1 6 谷氨酰胺合成酶催化合成酸5 1 2 菌株简述6 1 2 1 枯草杆菌6 1 2 2 大肠杆菌6 1 2 3 米曲霉6 1 3 米曲霉紫外诱变7 2 引言1 0 2 1 课题的立题背景及意义1 0 2 2 本论文的主要研究内容1 1 3 材料与方法1 2 3 1 材料1 2 3 1 1 菌株1 2 3 1 2 培养基1 2 3 1 2 1 真菌培养基1 2 3 1 2 2 细菌培养基1 2 3 2 主要试剂1 2 3 3 主要仪器1 3 3 4 酶活力测定1 3 3 4 1 酶活力定义1 3 3 4 2 酶活力的测定方法1 4 3 4 3 蛋白质的测定1 4 3 5 菌株的发酵培养条件1 5 3 6 菌株的收集1 5 3 7 菌株的超声波破碎1 5 3 8 粗酶液的制备1 5 3 9 菌株的筛选1 6 3 1 0 菌体生长曲线的测定1 6 3 1 1 菌体的紫外诱变1 6 3 1 1 1 孢子悬浮液的制备1 6 3 “2 诱变时间的测定1 6 3 1 1 3 初筛1 7 3 1 1 4 复筛1 7 3 1 1 5 遗传稳定性的测定1 7 3 1 2 突变高产谷氨酰胺合成酶菌株发酵条件的优化1 7 3 1 2 1 碳源优化筛选1 7 3 。1 2 2 氮源优化筛选1 7 3 1 2 3 起始p h 优化筛选1 7 3 1 2 4 发酵温度优化筛选1 8 3 1 2 5 摇床转速优化筛选1 8 3 1 2 6 装液量优化筛选1 8 3 1 2 7 诱导因子优化筛选1 8 3 1 2 8 正交实验1 8 3 1 3 超声波破碎条件的优化1 9 3 1 4 谷氨酰胺合成酶的初步纯化1 9 3 1 4 1 粗酶液的制各1 9 3 1 4 2 硫酸铵分级沉淀1 9 3 1 4 3 透析除盐2 0 3 1 5 谷氨酰胺合成酶的酶学性质2 0 3 1 5 1 谷氨酰胺合成酶酶促反应最适作用时间2 0 3 1 5 2 谷氨酰胺合成酶酶促反应最适p h 2 0 3 1 5 3 谷氨酰胺合成酶酶促反应最适温度2 0 3 1 5 4 金属离子对谷氨酰胺合成酶酶促反应的影响2 0 4 结果与分析2 1 4 1 蛋白质标准曲线的绘制2 l 4 2 菌株筛选的结果2 1 4 3 米曲霉生长曲线2 2 4 4 米曲霉紫外诱变2 2 4 4 1 诱变时间测定的结果2 2 4 4 2 初筛的结果2 3 4 4 3 复筛的结果2 3 4 4 4 遗传稳定性实验2 3 4 5 发酵条件优化的结果2 4 4 5 1 碳源优化的结果2 4 4 5 2 氮源优化的结果2 5 4 5 3 起始p h 优化的结果2 5 4 5 4 发酵温度优化的结果2 6 4 5 5 摇床转速优化的结果2 7 4 5 6 装液量优化的结果2 7 4 5 7 诱导因子优化的结果2 8 4 5 8 正交实验的结果2 9 4 6 超声波破碎条件优化的结果3 0 4 7 谷氨酰胺合成酶初步纯化的结果3 4 4 8 谷氨酰胺合成酶酶学性质3 4 4 8 1 谷氨酰胺合成酶酶促反应最适作用时间优化的结果3 4 4 8 2 谷氨酰胺合成酶酶促反应最适p h 优化的结果3 5 4 8 3 谷氨酰胺合成酶酶促反应最适温度优化的结果3 6 4 8 4 金属离子对谷氨酰胺合成酶酶促反应影响的结果3 6 5 主要结论3 8 参考文献3 9 致谢4 3 作者简介4 4 攻读硕士学位期间发表的论文4 4 i i i 1 文献综述 1 1 谷氨酰胺合成酶的简述 谷氨酰胺合成酶( g s ，g l u t a m i n es y n t h e t a s e ；e c 6 3 1 2 ) 是生物体中最古老也 是最广泛存在的酶【1 1 ，它参与许多生物体中的氮和碳代谢。且是生物体氮代谢的关键酶 之一，而生物体维持生命必须要有氮代谢作用，因此该酶对生物体是至关重要的。它 及基因在细菌、真菌、植物体中也均被广泛研究【2 一钉。在生物体中它可催化下式的反 应：l 谷氨酸+ 氨+ a t p = l 谷氨酰胺+ a d p + 无机磷酸。如图1 1 所示： 叶绿体 囵菡太下岁虻酸 魁 匙一 光吁呱 天冬醯 藏尿素 陌司 i 一 谷羹醒寻芰舍残酶 卜圆 圆 回 谷氮酸合成酶循环 图l 1 谷氨酸合成酶循环中谷氮酰胺和谷氨酸的机制 f i g l - 1 s y n t h e s i z i n gm e c h a n i s mo f g l u t a m i n ea n dg l u t a m i ca c i di nt h ec i r c l eo f g l u t a m i n es y n t h e t a s e 它也是体外微生物发酵法合成茶氨酸的重要酶类之一【5 】，更是谷氨酰胺工业化生 产中极其重要的催化剂，是非常有价值的物质，故对其需求量也日益增多。 1 1 1 谷氨酰胺合成酶的结构 目前根据g s 氨基酸序列的同源性可将其分为三大类，最i g s i ，g si i 和g s i i g s i 主要存在于原核生物中，g si i 则主要分布于真核生物和少量细菌中，g s i i i 与前两类 差异较大，仅存在于蓝细菌和一些厌氧微生物中。而有些细菌含有g si 和g si i 两种 谷氨酰胺合成耐6 。7 1 。根据一些调节特性和氨基酸序列的相似度，又可将g s i 进步划分 为g s i a 和g s i b ( 受磷酸腺苷酰化共价修饰) 两大亚型【8 1 。g si 由1 2 个亚基构成，每个亚 基的分子量大约是5 5 k d ，空间三维结构是双层平行的六边形，并且每个亚基上都具 有5 个关键的位点，它们分别与谷氨酸、铵离子、a t p 和2 个二价金属阳离子结合p j 。 g si i 由8 个亚基组成，每个亚基的分子量也只有4 0 k d ，整体的分子量也是比较小的。 并且g si 和g si i 两种谷氨酰胺合成酶具有较高的氨基酸同源性【6 j 。g s i i i 由1 6 个亚基 组成，且每个亚基的分子量都大于8 0 k d 7 1 ，是三种类型中分子量最大的。在高等植物 中，天然的g s 全酶均为八聚体，分子量为3 3 0 3 8 0 k d 左右，由8 个亚基组成，每个亚基 分子量为3 8k d 一4 5k d 左右【l o 】。由于g s 均由八个亚基组成，亚基又有不同的种类和组 成形式，更山于这些亚基具有不同的基因编码，在不同的组织中有不同的表达水平， 因而存在多种g s 同工酶，呈现不同性质。 1 1 2 谷氨酰胺合成酶的分布 在微生物中，谷氨酰胺合成酶是革兰氏阴性微生物中氮同化过程中的关键酶之 一。分布在菌体的细胞内，对它最初的研究是通过肠道细菌进行的，随着研究的深入 在其它菌种上也有报道，如：节杆菌嘲、粪产碱菌【1 1 1 、林肯链霉菌【嘲、耐热嗜酸古细 菌 1 3 】、头状轮生链霉菌【1 4 】。此外，为了提高g s 的活力，黄星【1 5 1 等进行了重组大肠杆 菌的研究，刘顺谊和殷志敏【l6 j 研究了重组枯草芽孢杆菌的表达条件。 在植物体中，谷氨酰胺合成酶首先将无机氮转变成谷氨酸或植物体内其他的含氮 化合物，完成植物组织对氮素吸收利用的第一步。因此在高等植物的种子、叶、根、 根瘤和果实等器官中就分布着多种g s 的同工酶【1 1 1 。在植物叶片中，存在两种g s 同工 酶，一种定位于细胞质部分，称为胞液( 胞质) 型g s ( g s i ) ；另一种定位于叶绿体部分， 称叶绿体型g s ( g si i ) 。在大多数植物叶片中存在上述两种g s 同工酶：但也有少数植 物叶片中只存在其中的一种g s 同工酶【1 8 】。如烟草、西红柿、菠菜等的绿叶中仅存在 一种g s 同工酶i l 引。在植物的根中也存在两种类型的g s 同工酶即存在于胞液中的胞液 型g s ( g s i ) 和存在于质体中的质体型g s ( g si i ) 。z h a n g 2 0 l 等在水稻根部检测到两种g s 同工酶。在豆科植物的根瘤中亦存在胞液型g s i 和质体型g si i 。c u l l i m o r e t 2 1 - 2 2 等则从 菜豆根瘤中分离到两种g s ( g s n l 和g s n 2 ) 。不仅在绿叶类植物中g s 广泛存在，在黄 化植物中也含有。尤其在黄化叶中，g s i 主要具有主要活性，或者只有g s i 活性【2 3 】。 在动物体内，谷氨酰胺合成酶广泛存在于中枢神经系统内，尤其在神经胶质细胞 内富含谷氨酰胺合成酶，也被看做是神经胶质的一种特异标记物。随着研究的深入， 在周围神经节内卫星细胞、视网膜和少突神经胶质细胞内都发现g s 的存在【2 4 】。 1 - 1 3 谷氨酰胺合成酶的生理功能 g s 是生物体中氮代谢的关键酶之一，也是参与氨的同化和谷氨酰胺形成的主要 酶。在微生物体内，它参与细菌和真核生物体内碳和氮的代谢。是合成多种氨基酸的 氮源供体，具有依赖a t p 催化谷氨酸和铵盐合成谷氨酰胺的功能。在固氮类细菌中g s 则首先同化固氮产物氨，然后通过谷氨酸合成酶的途径形成谷氨酸，再合成蛋白质， 核酸等生物大分子，维系固氮菌的生长及活性【1 1 】。在肠道的一些细菌中，例如大肠杆 菌，g s 活性可以自行调节以适应外界氨的变化【2 5 l 。如果细胞内的氮素很充足，g s 水 平就会很低，相反当细胞内的氮素很缺乏，g s 水平会迅速升高。 2 在植物体中，在其组织的生长和发育的过程中，氮素的代谢是一个十分重要的生 理过程。因为，无机氮必须同化为有机氮才能为植物体所吸收和利用，谷氨酰胺和谷 氨酸就是同化后有机氮的形式1 2 6 1 。谷氨酰胺合成酶( g s ) 是参与这一氨同化过程的关键 酶【”l 。并且分布在不同器官的特异性决定了它们具有不同的生理功能【2 8 1 ，胞质型g s 且0 g s l 的主要功能是产生谷氨酰胺以完成细胞之间氮的运输，此夕b g s l 在种子萌发时 实现储存氮源的转运，而在叶片衰老时，首先是参加氮源的转移，进而是再利用；绿 体型g s 臣p g s 2 的主要功能是同化叶绿体中由硝酸盐还原所释放的氨，或者再同化光呼 吸释放的氨【2 9 1 。此外参与光呼吸氨、还原氨( 初级氮) 、循环氨的再同化【3 0 】。而植物根 部的g s 及其同工酶的生理作用还未被研究清楚。随着生物技术的广泛研究与应用， 谷氨酰胺合成酶与植物多种抗逆性结合产生的抗非生物胁迫的多功能作用正日趋明 显。主要包括抗土壤氮素的贫瘠和盐渍化、抗除草剂草胺麟、抗强光照和提高植物生 物量。 在动物体内，g s 主要在神经胶质细胞胞体内表达，是g l u 和g i n 在神经元与星形 胶质细胞之间的循环流动过程即g l 咖l n 循环的关键代谢酶【3 1 。3 3 1 。是大脑中星形胶质 细胞的标志酶 3 4 1 ，在机体中谷氨酰胺合成酶能够能有效地将过度释放的谷氨酸转化为 谷氨酰胺，维护g l u g 1 n 循环的动态平衡，进而保护机体神经系统的相应功能。 此外，谷氨酰胺是人体内重要的氨基酸之一，存储在人体的脑、骨骼和血液中。 对维护机体功能至关重要。它是人体内氨基酸转化的枢纽，还是细胞内氮的清除剂和 生物合成许多重要物质如核酸、核苷酸、氨基糖和蛋白质的重要前体【3 5 - 3 6 1 。在工业上 是一种重要的生化试剂，在医学等领域更是一种极具潜力的药剂和食品添加剂。而谷 氨酰胺合成酶则是酶法合成谷氨酰胺首要酶，荷兰l e i d e n 大学的科研者提出了在谷氨 酰胺合成酶催化作用下合成谷氨酰胺的工艺路线，可实现谷氨酰胺产率的大幅度提 高。反应式为： 谷氨酰胺合成酶 l g l u + a t p + n h 3 l - g l n + a d p + p i 陈群英口刀等进利用基因工程酶法结合酵母使l 一谷氨酰胺的生产成本大为降低。通过基 因工程方法扩增出谷氨酰胺合成酶基因，克隆至表达载体大肠杆菌，由于表达水平提 高很多，并且反应中采用的粗酶结合新鲜酿酒酵母发酵产生的a t p 再生体系，从而使 酶法合成l 一谷氨酰胺中的a t p 价格昂贵和副产物抑制谷氨酰胺生成的问题得到很好解 决，并且整个反应的成本很低，因此为酶法合成l 一谷氨酰胺的工业化打下了良好的基 础。 1 1 4 谷氨酰胺合成酶的研究进展 谷氨酰胺合成酶最初的研究是通过肠道细菌进行的，其中大肠杆菌被研究的最 早，其谷氨酰胺合成酶的一些性质也被研究的最为透彻。大肠杆菌谷氨酰胺合成酶由 1 2 个相同的亚基对称排列成两个六面体环棱柱状结构。每个亚基的相对分子质量为 5 1 6 0 0 。此后对其研究范围进一步扩大，发现了多种细菌都具有产谷氨酰胺合成酶的 能力。这些细菌主要以革兰氏阴性菌为主，如：枯草杆菌、粪产碱菌、耐热嗜酸古细 菌、农杆菌、棒杆菌等。其中日本的一些科研者对谷氨酰胺合成酶和产酶菌株研究最 为深入，技术也很成熟。在二十世纪九十年代中期，日本野田产业科学研究所在进行 节杆菌属微生物培养时，发现培养物中产有大量g s 。使之以后对谷氨酰胺合成酶产 酶菌株的选择和使用上局限于节杆菌属上。近年来，科研者主要以基因工程菌的构建 为主，刘顺谊等【1 6 】枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶克隆至大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 菌株，诱 导产生大量的重组谷氨酰胺合成酶。工程菌的发酵条件也在不断的摸索改进中。在植 物中，先是研究其为促进植物氮素的吸收利用所起的作用。进而细化出谷氨酰胺合成 酶的三种不同类型，并且分布在植物体的不同器官组织中，所起的作用也各不相同。 还有个别组织如种子、根、根瘤中同时存在几种g s 的同工酶。近年来，随着环境的 恶化和生物技术的发展，植物中谷氨酰胺合成酶的研究主要以转基因植物所产生的多 功能效应上，培育出抗较恶劣土壤和光照条件的具有抗病和高生物产量的品种。 1 1 5 酶法合成茶氨酸 茶氨酸学名为n 一乙基一y l 一谷氨酞胺( n - e t h y l y l - g l u t a m i n e ) 又名y 一谷氨 酰基乙酰胺。是一种非蛋白氨基酸，是茶叶特有的一种氨基酸，更是绿茶中有效的呈 昧物质。茶氨酸的含量茶叶品质决定性因素之一。在茶叶，茶氨酸都占茶叶游离氨基 酸的5 0 以上，干茶叶中茶氨酸的含量大约为1 2 【3 8 】。早在1 9 5 0 年日本学者酒 户弥二郎首先从茶叶中提取、精制并确定了它的化学结构【3 9 1 。由于没有在茶科植物以 外的高等植物中发现茶氨酸，它也被看做是茶树中的特征氨基酸。此后，科研学者们 对茶氨酸进行了系统的研究，发现茶氨酸在体内被小肠吸收，之后酶促水解为谷氨酸 和乙胺，其代谢部位是在肾脏。其生理活性和药理作用渐渐成为研究的热点。现已发 现茶氨酸具有降血压f 4 0 】、抗疲劳、抗肿瘤【4 2 1 、减肥和保护脑神经细胞的作用m 】。 此外，茶氨酸在食品领域的应用也在进一步的扩大，首先是做为茶饮料的品质改良剂， 日本麒麟公司新开发“生茶”饮料就添加有茶氨酸，并一举在日本饮料市场上大获成 功【4 2 1 。做为食品风味的改良剂，茶氨酸的添加可以有效的抑制食品中的苦昧和辣味， 大大改善食品的口感【4 引。而做为功能性食品添加剂，则可以起到使人产生轻松感和提 高记忆力的作用 4 6 1 。 生产合成茶氨酸的方法主要有：从茶树组织中提取或组织培养生产、化学合成、 发酵法和酶法合成。而酶法合成茶氨酸所使用的主要酶有：茶氨酸合成酶、谷氨酰胺 合成酶、y 一谷氨酰基转肽酶和y 一谷氨基甲酰胺合成酶。酶法合成的优点是酶与底物 4 的接触很充分，进而缩短转化周期，提高转化效率。王那等【4 7 】将枯草杆菌的y 一谷氨 酰基转肽酶基因克隆到大肠杆菌中，构建了表达重组y 一谷氨酰基转肽酶的工程菌， 有效的提高了酶活力，也提高了茶氨酸的产率。贾晓鹤等【4 8 】构建了重组菌使y 一谷氨 酰基转肽酶高效表达，还发现粗酶液就具有较好的催化l 一谷氨酰胺和乙胺合成l 一茶氨 酸的能力。直接用粗酶液催化合成l 一茶氨酸，这样简化了步骤，降低了成本，具有很 好的工业化生产的发展前景。此外，钱绍松等【4 9 j 则利用米曲霉产生的氨基酰化酶合成 了茶氨酸，只是氨基酰化酶的活力不高。但是可以避免化学合成法带来的消旋的缺陷， 并为茶氨酸的酶法合成提供新的酶。 1 1 6 谷氨酰胺合成酶催化合成茶氨酸 谷氨酰胺合成酶催化合成茶氨酸主要是利用谷氨酰胺合成酶( g s ) 的y 一谷氨酰基 转移活性，能够催化谷氨酰胺和乙胺发生转谷氨酰基反应，从而得到茶氨耐4 8 1 。谷氨 酰胺合成酶( g s ) 合成茶氨酸时需依赖a t p 及m n 2 + 2 戈m 9 2 + 存在，才能催化底物发生反 应。因为此反应需要a t p 水解成a d p 后提供能量才能进行，而葡萄糖的降解可以满足 a t p 的获得与再生，因此催化合成茶氨酸的反应必须与葡萄糖的降解反应相偶联才行 5 0 1 。s a s a o k a 等【5 卜5 2 】研究了从高等植物豌豆种子和动物鸽子的肝脏中提取谷氨酰胺合 成酶的酶液来催化合成茶氨酸，结果表明，这些酶只有在高浓度乙胺和特定p h 值的 条件下才能进行，并将其归类于催化生成茶氨酸的g s 的非特异性反应。学者还发现 m i c r o c o c c u sg l u t a o i c u s 中的g s 对乙胺也具有反应活性，在特定p i l l 0 并有a t p 释放能量 和m n 2 + 存在时才可以催化合成茶氨酸5 3 。李健等例在进行牛肝菌液态发酵合成茶氨 酸的研究中发现，谷氨酰胺合成酶催化反应体系中检测到了茶氨酸的生成，推断出牛 肝菌体内合成茶氨酸的关键酶为谷氨酰胺合成酶。近年来，t a c h i k i 研究组集中研究了 酵母和具有产谷氨酰胺合成酶能力菌株的结合，实现供能反应的偶联，在以面包酵母 为供能体系结合菌株所产的g s 催化谷氨酸和乙胺合成茶氨酸 5 5 - 5 7 】。但是在反应的过 程中，p h 的有效控制则比较困难，首先两个反应所需要的p h 范围就有差异。g s 催化 反应的特定p h 为1 0 ，而酵母发酵的p h 则为中性范围，在反应中随着茶氨酸的不断合 成，反应混合物中的p h 快速降低，低p h 又抑制了糖发酵反应，因此p h 不能有效控制 是导致茶氨酸催化合成效率低的主要原因【5 5 】。最近，t a c h i k i 等【5 6 】从一株假单胞杆菌 ( p s e u d o m o n a st a e t r o l e n s y - 3 0 ) q b 分离出了谷氨酰胺合成酶，由于g s 在中性p h 条件下和 乙胺就有很高的反应活性，和酵母发酵所需的p h 范围相同，因此它可来耦合面包酵 母供能系统合成茶氨酸。紧接着，他们对假单胞杆菌的谷氨酰胺合成酶催化合成茶氨 酸的反应特性和条件进行研究和改进【5 7 】，改进后反应混合物的组成为：2 0 0 m m o l 谷氨 酸钠、1 2 0 0 m m o l 乙胺、3 0 0 m m o l 葡萄糖、5 0 m m o l 磷酸钾缓冲液( p h 7 o ) 、5 m m o l m n c l 2 、 5 m m o l a m p 、1 0 0 u m lg s 和6 0 m g m l 酵母细胞，在3 0 条件下反应4 8 h ，可生成 1 7 0 m m o l 的茶氨酸，产率达到2 8 ( 以葡萄糖消耗量计) 。 随着生物技术的快速发展，越来越多的科研学者构建工程菌，实现茶氨酸产率的 提高。主要是将具有产谷氨酰胺合成酶能力菌株的g s 基因克隆到大肠杆菌和枯草杆 菌中，构建具有较高合成茶氨酸能力的基因工程菌。朱文娴等【5 8 】构建了含细菌g s 基因 的大肠杆菌工程菌，研究了诱导条件，得出异丙基硫代- b - d - 半乳糖苷是最佳诱导剂， 它能够使工程菌表达出较高活性的谷氨酰胺合成酶活力。此外他们还优化了培养和反 应体系条件，得到最佳培养温度为3 0 ，最佳诱导温度为2 8 。茶氨酸合成的最适p h 值为9 5 ，最适缓冲液为1 0 0m m o l l 咪唑；并且咪唑缓冲液优于磷酸钾缓冲液；低浓 度l 一谷氨酸钠、高浓度盐酸乙胺和高浓度a t p 对茶氨酸的合成均有促进作用，有利于 茶氨酸生成量的提高。2 0 0 6 年，t a c h i k i 研究组【5 9 1 也构建了基因工程菌，将假单胞杆 菌中的g s 克隆到大肠杆菌( e c o l ia d 4 9 4 ) q b 并超量表达出来，获得的g s 酶量是原菌株 中的3 0 倍以上，进而实现了茶氨酸的酶法催促反应的大量合成。 1 2 菌株简述 1 2 1 枯草杆菌 枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属中的一种，自身长芽孢，有利于菌株的长期保存。也 是食品领域中的安全使用菌种，和酵母菌、乳酸菌一起做为饲料添加剂中的三种微生 物；由于其极高的安全性，已被做为活菌剂用于人类的医疗保健【6 0 1 。枯草芽孢杆菌做 为工业生产菌已有很长的历史，主要是因为其能够自动地向胞外分泌大量的蛋白质， 并且产物的分离纯化操作过程简单易行，产率高，因此是工业发酵生产淀粉酶、蛋白 酶等的重要菌株。尤其生产a 一淀粉酶的菌株选育和发酵条件都研究的很深入【6 1 1 。所 产的蛋白酶主要是碱性蛋白酶和中性蛋白酶。此外，枯草杆菌所产的酶类还有：糖化 酶、植酸酶、溶纤酶等。 1 2 2 大肠杆菌 大肠细菌( e c o l i ) 为埃希氏菌属代表菌。一般多不致病，为人和动物肠道 中的常居菌，但是在一定条件下可引起肠道外感染。尤其某些血清型菌株的致 病性很强，能够引起腹泻，统称致病性大肠杆菌。属于革兰氏阴性短杆菌，大 小o 5x1 - 3 微米。周身堕眭，能运动，无莹塑。大肠杆菌由于遗传背景清楚， 目标基因表达水平高，现在多被用来做为重组工程菌的载体。然而大肠杆菌自身细胞 中就存在多种蛋白酶【6 2 1 。尤其谷氨酰胺合成酶最早就是在大肠杆菌中发现的，并且其 菌体中谷氨酰胺合成酶的分子结构都已被研究出来。 1 - 2 3 米曲霉 6 米曲霉在分类学上属于半知菌亚门、曲霉属、黄曲霉群，是丝状真菌中的一类。 且是一种典型的好气性真菌。菌丝体一般里黄绿色，后变为黄褐色。米曲霉产分生饱 子，分生抱子头呈放射形，直径大小为1 5 0 3 0 0 p r o ，分生抱子幼时呈梨形或椭圆形， 老后大多变为球形或近似球形，一般4 5 - 7 p r o ，粗糙或近于光滑。分生抱子梗长度一 般为2 p m 左右，大多数的为单层。顶囊则近似球形，壁较薄，粗糙。如图1 - 2 所示： 分生孢子梗段炮子头 7 竹 分垒斑子 图2 米曲霉孢子形态 f i g l - 2s p o r em o r p h o l o g yo f a s p e r g i i l u so r y z a e 在自然界中，米曲霉主要存在于粮食、腐败有机物、土壤等处，在工业发酵食品中也 广为存在。米曲霉是美国食品与药物管理局和