（食品科学专业论文）酶解大豆分离蛋白及酶解液的美拉德反应合成酱香物质的研究.pdf

沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 本文以大豆分离蛋白为原料分别用经过选择的中性蛋白酶、木瓜蛋白 酶、a l c a l a s e 蛋白酶、碱性蛋白酶进行酶解，探索最佳酶解条件。分别从酶 底物不同比、温度、p h 值、大豆分离蛋白浓度、水解时间等因素进行大量实 验，最终得到最佳酶解大豆分离蛋白条件为： ( 1 ) 中性蛋白酶蛋白液浓度8 ，温度4 04 c ，p h 值8 0 ，酶与底物比为 8 0 0 0 u g ，时间6 小时： ( 2 ) 木瓜蛋白酶蛋白液浓度4 ，温度5 0 。c ，p h 值7 0 ，酶与底物比为 8 0 0 0 u g ，时间6 小时： ( 3 ) a l c a l a s e 蛋白酶蛋白液浓度8 ，温度6 0 。c ，p h 值8 0 ，酶与底物比为 7 5 0 u g ，时间6 小时： ( 4 ) 碱性蛋白酶蛋白液浓度1 6 ，温度4 5 * ( 2 ，p h 值1 0 ，酶与底物比为 8 0 0 0 u g ，时间6 小时。 酶解后蛋白多肽液水解度不高而且苦味很大，所以用f l a v o u r z y m e 酶进一 步深层水解。课题先用四种酶( 按相同酶活力) 分别水解大豆蛋白后，其水 解液再用f 酶继续深层水解，对双步水解程度进行比较，最终选用价格较低 水解效果较好的中性蛋白酶对大豆蛋白水解，再用f 酶分步水解，此种方法 不仅降低苦味效果较好，而且可得到水解度4 6 的水解液，便于大豆蛋白肽 进一步深加工。 ( 大量资料表明，明胶水解液、植物蛋白水解液和糖通过控制条件可产 酱香味物质。同时经大量实验证明，明胶水解液制得的物质刺激味较大，所 以只选用自制大豆蛋白酶解液) 。美拉德反应广泛用于香精香味料的制备， 尤其是各种鸡味、肉味物质的制备。本实验探索用自制水解植物蛋白( h v p ) 、 和糖及其它物质控制反应条件制备酱香物质。控制条件包括p h 值、反应时 间、反应温度、还原糖种类，还原糖浓度等。分别测定氨基酸损失率，褐变 2 摘要 程度并进行香味评分，最终得出： ( i ) 产酱香味物质所用材料为酶解液( 氨基酸含量3 9 6 6 9 ) 、木糖( 2 ) 、 盐( g ) 、维它命c ( g ) ； ( 2 ) 产酱香味最佳时条件为：反应时间1 0 0 m i n ，反应温度1 1 5 。c ，糖蛋自 液为0 5 ：1 。 本课题探索用自制酶解液加入糖及其它物质，制备酱香物质，为酶解液 的进一步应用提供一新途径，为酱香物质合成提供一新思路。 关键词：大豆分离蛋白；酶解；双步水解；美拉德反应：褐变程度；酱 香物质 沈阳农业人学硕士学位论文 前言 大豆是一类在世界范围内广泛种植的作物。大豆中蛋白质和油的质量分 数分别为3 5 一4 0 和1 8 2 0 ( 丁纯孝，1 9 8 5 ) ，它是重要的油料资源，更 是重要的植物蛋白资源。大豆蛋白是一种优质植物蛋白其中8 种人体必需 氨基酸的含量与人体需要相比较仅蛋氨酸稍嫌不足，与肉、鱼、蛋、奶相近 似，属全价蛋白，且没有动物性蛋白的副作用。 然而大豆蛋白分子结构复杂，分子量大，从而使得大豆蛋白的消化率和 生物效价还不如牛奶、蛋类等动物性蛋白。大豆蛋白溶解度低，无法作为功 能性成分在乳品、饮料、糖果等食品体系中加以利用。大豆蛋白水解后的产 物一大豆多肽，不仅克服了大豆在营养学上的弱点，具有抗氧化、抗衰老、 降血压、减肥等多种生理功能( 邓勇，1 9 9 4 ) ，还具有比大豆蛋白更优质的 加工功能特性。 大豆蛋白水解液应用十分广泛。例如大豆蛋白肽饮料、各种调味剂、增 味剂、各种肉味香精等等的原料( 陈大淦等， 1 9 8 8 ) 。但这些物质的制备大部 分都离不开复杂化学反应一美拉德反应( m a i l l a r d ) 。美拉德反应按其本质 而言是氨基羰基间的加缩反应，它可以在醛、酮、还原糖及脂肪氧化生成的 羰基化合物与胺、氨基酸、肽、蛋白质甚至氨之间发生反应，其化学过程十 分复杂( 冯大炎，1 9 9 3 ) 。经大量资料查阅，蛋白水解液与糖及其它物质在某 条件下，能产生酱香味，但具体很少有研究。因此本课题旨在用大豆蛋白液 探索不同条件下制备酱香物质的最佳途径。 1 1 大豆蛋白肽研究及其意义 1 1 1 大豆分离蛋白的选择 植物蛋白质占世界蛋白供应总量7 0 以上，其营养价值与动物蛋白质接 近，且胆固醇含量低，含有大量人体必需氨基酸，是人类食用蛋白质的重要 来源( 陈大淦等，1 9 8 8 ) 。其中大豆蛋白的氨基酸含量如表1 。植物蛋白资源 堑童 扩大应用的出路在于利用生物方法或酸碱化学方法对植物蛋白进行加工处 理，使其分子量降低，同时去除抗营养因子及毒素，改善营养价值与功能特 性提高溶解性能，使其生物效价接近动物蛋白质，代替部分动物蛋白质， 达到充分利用植物蛋白资源的目的。 表l 大豆蛋白质必需氨基酸组成表( ) t a b l e1c o m p o n e n to f t h es o y b e a np r o t e i nn e e da m i n oa c i d 大豆多肽是以大豆蛋白为原料经水解而成的低分子肽( 3 - 6 个氨基酸组 成) 的混合物，其氨基酸组成几乎与大豆蛋白一样，必需氨基酸的平衡良好， 含量也丰富。 一般来说，制备大豆多肽的原料分为三种：是大豆，二是大豆分离蛋 白，三是豆粕粉。以大豆为原料制备大豆多肽，需经过清洗、破碎、精磨、 匀浆、稀释、酶解或酸解等一系列步骤，过程复杂且难以控制。大豆分离蛋 白是以低温豆片为原料，通过浸出，分离酸沉 水洗- 老化斗中和 喷雾干燥等生产工艺精加工而成的产品。豆粕粉是大豆 用浸提法或预压浸提法榨油后的副产物，豆粕残油少，易于保存。 国产大豆、大豆分离蛋白、及豆粕粉的各种成分含量如表2 。由表中数 据可以得知，与大豆相比，豆粕粉中除脂肪含量大大减少外，其它养分并无 实质差异，三者中，大豆分离蛋白的蛋白质含量最高( 李里特，2 0 0 3 ) 。蛋白 含量可达9 0 。 沈阳农业大学硕士学位论文 表2 国产二级大豆、大豆分离蛋白、豆粕粉的养分含量( ，的 t a b l e 2n u t r i e n tc o n t e n to f s o y b e a np r o t e i n 大豆、大豆分离蛋白、及豆粕粉在市场上价格相差很大。大豆分离蛋 白的价格是豆粕粉的9 倍，如果以大豆、豆粕粉为原料，则由于成分复杂， 蛋白含量相对较小，水解效果不好：而如果用大豆分离蛋白作为制各大豆多 肽的原料，极为不经济，其成本很高。由于本课题工作量较大，所以对于蛋 白的前处理暂不考虑，但如果能对豆粕探索出一种较好的前处理方法，此课 题将最终得到一投资小收益大的结果。本课题经各方面考虑，选择蛋白含量 高、成分稳定的大豆蛋白作为制高水解度蛋白液的原料。 1 1 2 大豆多肽的生产制备方法 大豆蛋白水解研究起始于上世纪6 0 年代，当时采用酸、碱化学试剂在一 定温度下促使蛋白质分子的肽链断裂形成小分子物质，即多肽。从现有的植 物蛋白加工方法来看( 郭勇等， 2 0 0 0 ) ，传统发酵加工方法存在许多不足之 处，如水解无特异性，水解产物感官性能差等，存在生产工序繁多，生产时 间长，劳动强度大，生产质量与卫生条件不易控制等问题；酸碱化学加工方 法因副反应多，营养成分损失大，产品质量不佳，可能产生三氯丙醇等有毒 成分而在食品实际使用中受到一定限制；因此这方面的研究进展缓慢。 8 0 年代酶化学迅猛发展，美国、日本对于大豆蛋白的酶解工艺和酶解过 程的研究取得了较大的进展。蛋白酶水解因其反应温和、对氨基酸破坏性小 等优势，成为当前最主要的多肽制备方法( 刘玉田等，2 0 0 2 ) 。生物酶工程 加工方法在温和反应条件下，水解生成多肽及氨基酸等物质，具有很高营养 价值与功能特性，易于人体吸收与消化，反应可控、副反应少，产品质量好 和不破坏氨基酸等特点，生物酶法将是植物蛋白资源开发利用最有效、最有 前途的加工方法。我们在深入研究传统发酵工艺与现代生物酶水解机理基础 上，结合大豆蛋白质结构特点，对大豆蛋白水解复合酶进行了研究。 1 1 3 大豆多肽的应用 水解植物蛋1 1 1 ( h y d r o l y z e dv e g e t a b l e p r o t e i n ，h v p ) ，即植物蛋白水解产 物，是由植物蛋白经酶、酸或碱水解后得到的产物。水解植物蛋白( h v p ) 的原科来源为各种蛋白含量高的植物。最常见的蛋白质来源有大豆蛋白， 玉米蛋白，小麦蛋白，菜籽蛋白，花生蛋白等。不同的原料水解后将产生不 同的增进风味的物质。许多种植物蛋白的水解物可被用于加工各种各样的产 品以增加产品风味和作为调味料的基础。一般来说，作为蛋白来源的原料的 脂肪含量越低越好。因此许多工厂采用榨取油脂后的副产物例如豆粕，菜籽 饼，花生饼等为原料。其中大豆蛋白的p h 值约为中性，小麦蛋白、玉米蛋 白为弱酸性。而且小麦蛋白的谷氨酸含量较高( 一般在3 0 以上) ，这样就导 致水解产物中含有较高的游离谷氨酸，具有非常强烈的增强风味的作用( 郭 勇等，2 0 0 0 ) 。但是，大豆蛋白通常被认为是生产标准等级的i - w p 的原料， 并且随水解过程中不同的反应阶段将产生风味由弱到强，颜色由浅到深，甚 至烤肉风味的一系列风味物质。由此可见，不同来源的蛋白质组成将是产生 各具特色的风味物质的原因。 蛋白水解物可作为一种天然风味料，又可作为一种天然氨基酸调味剂。 可用于：方便面汤和酱包的增鲜增香；膨化食品和饼干的调味；提高糖果、 饮料的蛋白质氨基酸含量；提高牛肉、鸡肉、猪肉香料的香气丰度；提高鱼、 肉制品香、鲜度；还可用于调味品如海鲜酱油、辣汁、醋等的调香增香( 宋 鲨堕堡些查兰竺兰= 堂壁笙苎 焕禄，2 0 0 2 ) 。大豆蛋白质经水解后，主要产物是各种氨基酸和多肽，能被 人体快速和多途径地吸收，而且具有解毒、降血压等特殊生理功能，是功能 食品研究领域中最引入注目的物质之( 刘钟栋，1 9 9 3 ) 。同时，水解蛋白 也广泛应用于调味品、方便面、膨化食品、酱菜等食品中。制备植物水解蛋 白时，应选择来源广泛、价格便宜的原料。因此较常用的是脱脂大豆。 1 1 4 大豆多肽的脱苦 蛋白质水解时都会产生苦味，如何降低蛋白质水解物的苦味，是水解工 艺优化的重要因素。植物蛋白水解过程中，一般都能产生苦味的物质，包 括少量的游离氨基酸及其衍生物，其中主要是相对分子质量为5 0 0 2 0 0 0 左右 的小分子肽物质，从而h v p 产品带有不同程度的苦味，直接影响了相关食 品的风味，也给人们的食用带来一些麻烦，其在食品工业中的推广应用也就 受到了一定的限制。 为了有效地去除植物蛋白质水解物的苦味，人们曾先后就苦味物质的化 学组成与特性、产生原因及其去除方法进行了较系统地研究，并取得了一些 进展，从而为植物蛋白质资源的深入开发利用起到了积极的推动作用。 对水解过程苦味产生机理的系统研究表明，植物蛋白质水解物苦味的产 生原因有( 郭勇，2 0 0 2 ) ：在蛋白质水解过程中，常生成一定量的游离氨 基酸，而其中一些氨基酸在水溶液中本身就呈现不同程度的苦涩味，从而使 水解产物的苦味各不相同：有些氨基酸本身原来并不具有苦味，但在水解 反应过程中，它们当中有些可自身转化成呈苦味的衍生物，如酪氨酸在衍变 生成龙胆酸化合物后，其苦味十分强烈；而有些氨基酸与其他成分结合后， 也可生成有苦味的结合产物，如精氨酸、赖氨酸等与盐酸反应生成的盐类产 物，都有一定的苦味；由于植物蛋白质水解不够完全，所生成的一些具有 苦昧的含疏水氨基酸的小分子肽类，也是导致蛋白质水解物苦味的主要原 因。 人们在研究植物蛋白质水解物苦味产生的原因、化学组成及其特性的基 础上，也相继建立了一些去除苦味的方法：活性炭或者树脂吸附处理法 酸处理法水与有机溶剂混合体系萃取法控制蛋白质的水解度酶解 处理法。 近年来，随着量子化学和酶化学的飞速发展，为蛋白质水解物苦昧物质 分子结构的分析测定与改造以及苦味成分的去除，开辟了新的途径。已经有 报道利用特殊蛋白酶进行生物酶解处理来去除蛋白质水解物的苦味。用特殊 酶解处理去除苦味时，可以与正常蛋白质的酶解同时进行，也可分两步进行， 即先将蛋白质水解之后，再加入特殊酶将苦味物质除去。 1 2 美拉德反应制酱香昧物质的研究及其意义 美拉德反应( m a i l l a r dr e a c t i o n ) 是食品中的氨基化合物( 胺、氨基酸、肽和 蛋白质) 和碳基化合物( 糖类) 在食品加工和储藏过程中自然发生的反应，由法 国著名科学家l c m a i l l a r d 于1 9 1 2 年发现。从营养学角度考虑，由于反应使 食品中的有效成分如氨基酸类和糖类有所损失以及引起食品的褐变等，使食 品的营养价值部分降低。但是，美拉德反应是加工食品色泽( 如焙烤类食品的 色泽) 和风味的主要来源，这在食品生产上具有特殊的意义( 蔡妙颜等，2 0 0 3 ) 。 美拉德增香调味料的合成与应用是当今世界食品及烟草工业的热门研究课 题之一，目前人们己研制出了各种模拟食品香味科及烟用香味料，其它领域 有待于进一步开发。 1 2 1 美拉德反应与酱香物质合成 用各种蛋白水解液作为原料进行美拉德反应在各种肉制品香精的制备 方面有较多应用，但在生成酱香味物质方面应用十分少。用各种氨基酸与糖 可简单模拟美拉德反应，不同的氨基酸生成香味不同。见表3 ( 曹雁平，2 0 0 2 ) 。 鲨里查些查兰里主兰垡堡苎 表3 各种氨基酸和葡萄糖在醇水溶液中1 2 0 。c 两小时加热反应及产生香气情况 t a b l e 3f l a v o u ro f a l lk i n g so f a m i n oa c i dr e a c tt og l u c o s ei ne t h a n o l w a t e rf o r2 h 经大量资料表明，蛋白水解液与葡萄糖进行美拉德反应，可生成酱味( 冯 大炎，1 9 9 3 ) ，还有资料显示美拉德反应与糖种类也有关系。反应顺序为木 糖) 阿拉伯糖 葡萄糖) 乳糖、麦芽糖) 果糖，葡萄糖的反应活性是果糖的 l o 倍( 陈华，1 9 9 8 ) 。 l 2 2 美拉德反应机理 在对m a i l l a r d 反应机理研究方面：美拉德反应是法国著名化学家 m a i l l a r d ，在1 9 1 2 年发现的，他首先对葡萄糖和甘氨酸混合液加热后产生 的褐色色素和类黑精作了详细描述，在以后的5 年中他对该反应进行了深入 的研究。美拉德反应按其本质而言是氨羰间的加缩反应，它可以在醛、酮、 还原糖及脂肪氧化生成的羰基化合物与胺、氨基酸、肽、蛋白质甚至氨之间 发生反应，其化学过程十分复杂美拉德反应主要以下列三个阶段进行( 丁耐 克编著，1 9 9 6 ) ： ( 1 ) 起始阶段：醛糖与氨基化合物进行缩合反应形成希夫硷f s h i f f b a s e ) ， 9 前言 再经环化形成相应的n 一取代醛糖基胺，经重排形成a m a d o r i 化合物( 1 一氨基 一1 脱氧一2 一酮糖) 。 ( 2 ) 中间阶段：a m a d o r i 化合物进行的反应主要有三条路线：一是在酸性 条件下进行l ，2 烯醇化反应生成羟甲基呋喃醛或呋喃醛；二是碱性条件下进 行的2 ，3 一烯醇化反应，产生还原酮类及脱氢还原酮类；三是继续进行s t r e c k e r 分解反应产生s t r e c k e r 醛类。 ( 3 ) 最终阶段：此阶段反应相当复杂其反应机理尚不清楚，中间阶段产物 与氨基化合物进行醛基一氨基反应最终生成类黑精。类黑精是引起食品色泽 非酶褐变的主要物质，在产生类黑精的同时，有一系列的美拉德反应的中间 体一还原酮类物质及杂环类化合物生成，这类物质除能提供给食品特殊的气 味外，还具有抗氧化，抗诱交等特性( 胡见曙，1 9 8 7 ) 。 1 2 3 影响美拉德反应的因素 由于美拉德反应的研究包括了醛、酮、还原糖与胺类、氨基酸、肽和 蛋白质之间的反应，而且目前只是对该反应产生低级和中级分子的反应机理 比较清楚，对产生高分子集合物仍不能得到满意的解释。影响食品中美拉德 反应的因素主要包括氨基酸种类、糖种类、水分、p h 值、加工温度、加工 时间以及添加剂的使用等因素。 ( 1 ) 氨基酸种类 由于各种食品中所含的氨基团的种类差异很大，而氨基酸种类不同，就 会导致不同食品发生美拉德反应后所产生的风味也不同。如表l ，又如：g 1 v 、 a l a 、t y r 、a s p 等氨基酸于1 8 0 。c 和葡萄糖反应可产生焦糖香气；而v a l 能产 生巧克力香气；h i s 、l y s 、p r o 可产生烤面包香味，p h e 则能产生一种特殊的 紫罗兰香气e 为此，在加工过程中，人们通常利用氨基酸的这种性质，将其 和葡萄糖直接加入食品，以提高和改善食品的风味。 ( 2 ) 糖种类 因为糖是美拉德反应必不可少的一类物质，因此，糖的种类、含量的高 0 鎏塑查些查兰婴主兰竺笙苎 低也会影响美拉德反应。有资料表明：单糖和a r p ( a d n a d o r i 重排产物) 的呋 喃或吡喃糖环更能直接脱水。这是因为a r p 椅式吡哺果糖环是以半缩醛羟 基和c 一3 h 的反式消去方式进行直接脱水，这是由于有1 8 0 的扭转角加之半 缩醛羟基的不稳定性部使直接脱水更易进行。这说明糖与氨基化合物能发生 美拉德反应，而且环状a r p 间接脱水后随着温度的升高形成共轭产物，这 些共轭产物还可进行区域专一的再环化，形成5 、6 、7 环杂环化合物，而美 拉德反应的这些杂环化合物有许多则是重要的风味物质。所以，我们在加工 食品时通常添加糖进行加工，以利改善和增强食品的风味，而不同糖类和氨 基酸产生的香味都不相同，关于什么糖影响美拉德反应，大量资料显示，随 着环状结构的增大，美拉德反应相应要慢很多，即5 环较6 环快，6 环较7 环快。 ( 3 ) 水分 水分在食品中充当介质的作用。通常我们用水分活度来表示食品中水分 含量的高低，因为食品中的水分与食品的风味密切相关，而且美拉德反应的 进行也必须在食品中的水分 1 0 才行，通常为1 5 以上。一般地讲，在一 定范围内( 1 0 一2 5 ) ，随着水分含量的增加，美拉德反应加快。 ( 4 ) p h 值 美拉德反应一般随着p h 值的升高而加剧，对大多数美拉德反应来说， 仅【辊于p h3 - 1 0 。而p h 值偏酸性时则会抑制美拉德反应的发生，偏碱性时会 加速美拉德反应。这是因为：一是氨基酸是两性分子，它在碱性介质中呈阴 离子，此时，氨基反应性较强，易发生褐变反应；二是在酸性条件下，a r p 的间接脱水后生成的4 - 羟吡喃可进行芳化形成阳离子，从而在毗喃糖直接脱 水形成2 ，3 - 二氢- 3 ，5 - 二羟基6 一甲基4 h 一吡喃4 酮，使食品具有特殊的香 味，在碱性条件下，这种香味会更浓。 ( 5 ) 加工温度和时间的影响 总体来说，温度升高会使美拉德反应加快，但是，过高的温度不仅使 前言 食品中的营养物质氨基酸和糖类的营养价值下降，而且还有可能形成一些崤 毒物质，比如，花生焦化，油脂的焦化等都有致癌酌可能。凼此，利用拉 德反应制取香味料时，就需控制好温度，通常为 1 8 0 。c ，时问 4 h ，p h m ， 含水量为1 5 一2 5 。 1 2 4 美拉德反应的应用 美拉德反应在近几十年来一直是食品化学、食品工艺学、营养学、香抖 化学等领域的研究热点。因为美拉德反应是加工食品色泽和浓郁芳香的各种 风味的主要来源，特别是对于一些传统食品的加工工艺过程如咖啡、可可豆 的焙炒，饼干、面包的烘烤以及肉类食品的蒸煮等等( 蔡妙颜等，2 0 0 3 ) 另外，美拉德反应对食品的营养价值也有重要的影响，既可能由于消耗了食 品中的营养成分或降低了食品的可消化性而降低食品的营养价值，也可能在 加工过程中生成抗氧化物质而增加其营养价值( 朱国斌等，1 9 9 6 ) 。对美拉 德反应的机理进行深入的研究，有利于在食品贮藏与加工的过程中，控伟i 食 品的色泽、香味的变化或使其反应向着有利于色泽、香味生成的方向进彳亍 减少营养价值的损失，增加有益产物的积累，从而提高食品的品质。 m a i l l a x d 反应广泛应用于食品工业中，对食品色泽、风味影响很大，在 各种肉味、面包、饮料、酱油等香精中均有应用。在其反应制得的香精香瓣 中，以其风味天然、自然逼真、安全可靠、低脂低热的特点深受商家和消费 者的喜欢。 1 3 国内外现状分析： 1 3 1 大豆多肽( s o y b e a n p e p t i d e ) 世界上一些发达国家正积极致力于开发大豆利用新途径的研究，美国和自 本均已有了多肽类食品的问世；目前，国内也开始了大豆多肽应用的研充 国内有数所高校进行了大豆多肽的研究，已在蛋白酶的选择，酶解工乏 参数等方面取得了一定的进展。但是，采用酶解与脱苦一步法来生产风味良 好的大豆多肽在国内相关报道鞍少见。 垄塑查些查兰婴主兰垡堡苎 目前，水解大豆蛋白常用的方法有酸法、碱法和酶法，其中酸法和碱法 研究较多，酶法水解的研究较少。而实际上，与酸法和碱法相比较，酶法水 解具有反应条件温和、副反应少、不破坏氨基酸、水解程度容易控制等特点， 特别是在营养成分的保留上，具有不可比拟的优点。同时，随着酶工业的发 展，蛋白酶生产成本的不断降低和酶应用技术研究的不断深入，酶解方法将 成为替代酶法和碱法水解植物蛋白最有效的方法之一。本课题的目的，是在 前人研究的基础上，对酶法水解植物蛋白生成高水解度蛋白肽的条件进行研 究。 水解植物蛋白( h v p ) 中高水解度蛋白肽作为一种高级调味品，是近年来 蓬勃发展起来的新型调味品，它集色、香、味、营养成份等于一体，投放市 场以来即为广大消费者认可。由于其氨基酸含量较高，逐渐成为取代味精的 新一代调味品( 郭勇等，2 0 0 0 ) 。况且h v p 的制造原料植物蛋白质来 源丰富，经水解、脱色、中和、除臭、除杂、调味、杀菌、喷雾干燥等工艺 制造而成，可机械化、大规模、自动化生产，因此，水解植物蛋白( h v p ) 作 为调味品，前景非常广阔。 1 3 2 美拉德反应的发展现状 目前对于美拉德反应的研究主要有以下几个方面：美拉德反应过程中新 的特征中间体及终产物的分离与鉴定，进步揭示美拉德反应的机理；在反 应香味料的生产中如何控制反应条件使反应中生成更多的特征香昧成分及 反应香味料稳定性的影响因素；研究美拉德反应中褐色色素、致癌杂环含氮 化合物的形成的动力学过程，为食品加工处理提供有效的控制点；美拉德反 应产物对慢性糖尿病、心血管疾病以及癌症等的病理学研究以及其对食品安 全性的影响( s a r am a r t i n s ，2 0 0 1 ) ：美拉德反应在食品调味中的实际应用， 在控制好反应条件下制成营养浓缩的调味料，将会带来十分可观经济利益， 也是将来发展的重要方向。 近三十年来，一些微量和超微量分析技术应用于食品化学领域的研究之 ，。ji!j!i：，。一 中，如气相色谱、高压液相色谱、核磁共振谱、质谱以及气相色谱一质谱联 用、气相色谱一红外光谱联用等，使美拉德反应的研究得到了极大发展。另 外，食品化学家近年来将动力学模型引入对美拉德反应的研究中。运用这种 方法的优点在于不需要考虑美拉德反应复杂的反应过程，而只需要研究反应 物、产物的质量平衡以及特征中间体的生成与损失来建立动力学模型，从面 预测反应的速率控制点n ( 蔡妙颜，2 0 0 2 ) 。美拉德反应在香精生产中的应用 国外研究较多，国内研究较少，该技术在肉类香精及烟草香精中有非常好的 应用，所形成的香精具有天然香精的逼真效果，具有调配技术无法比拟的作 用( 刘梅森和何唯平，2 0 0 4 ) 。美拉德反应技术在香精领域中的应用打破了 传统的香精调配和生产工艺的范畴，是一全新的香精香料生产应用技术，值 得大力研究和推广。 沈阳农业人学硕士学位论文 第二章大豆蛋白酶解工艺的研究 2 1 材料与方法 2 1 1 实验材料 大豆分离蛋白：黑龙江黎明大豆分离蛋白厂：经微量凯氏定氮法测定， 蛋白质含量为8 7 9 5 ，水分含量经测定为5 9 8 ， 木瓜蛋白酶：广西南宁市庞博生物工程有限公司； a s 1 3 9 8 中性蛋白酶：广西南宁市庞博生物工程有限公司； a l c a l a s e 碱性内切蛋白酶：丹麦n o v o 公司： 碱性蛋白酶：广西南宁市庞博生物工程有限公司； f l a v o u r z y m e 复合风味蛋白酶：丹麦n o v o 公司。 2 1 2 实验仪器 7 2 0 0 型分光光度汁：尤尼柯( 上海) 仪器有限公司； u v 1 2 0 0 2 型紫外分光光度计； 电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司； h h - 6 数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司： 1 0 1 一l a 型电热鼓风于燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司； p h s 一3 c 型精密p h 计：上海雷磁仪器厂 2 1 3 实验方法 2 1 3 1 大豆蛋白质含量测定：微量凯氏定氮法 2 1 3 - 2 酶活测定采用紫外分光光度法q b l 8 0 5 3 9 3 蛋白酶在一定条件下，水解酪蛋白，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并 使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用分光光度法测定。 2 ，1 3 3 大豆蛋白溶液配制及预处理条件的确定 精称0 4 克大豆分离蛋白用相应p h 值缓冲液配成4 ( w v ) 的蛋白液。 分别在8 0 c 、8 54 c 、9 0 4 c 、9 5 。c 、1 0 0 。c 下处理1 0 分钟，迅速冷却，加一定 查里里皂墼壁三苎箜竺塞 量酶在最适条件下水解l 小时，加入三氯乙酸终止反应，测定水解度。确定 水解度最高的温度9 5 c 。再分别在9 5 。c 下处理1 0 分钟，2 0 分钟，3 0 分钟， 酶解，测水解度，最终确定预处理为9 5 。c 下处理2 0 分钟。 2 1 3 4 大豆蛋白质的水解 将经过预处理的大豆蛋白溶液加入相应量蛋白酶，调节各种条件至最适 条件下水解，水解6 小时后在沸水浴中灭酶活2 0 分钟，待测。 2 1 35 酶解蛋白质水解度的测定茚三铜比色法 采用校正后的茚三铜比色法即利用水解原料的完全水解液作为标准，使 结果更接近真实值。 2 1 3 5 1 完全水解蛋白液的制备 取大豆蛋白2 5 m g ，放入反应瓶加入2 5 m l 的6 m o l l 盐酸，拧紧瓶盖， 1 3 0 水解2 4 h ，冷却，过滤，滤液真空浓缩o 5 m l 左右，加蒸馏水，用1 m n a o h 中和至中性( p h 6 ) ，定溶至2 5 m l 。 2 1 3 5 2 工作曲线的绘制 取完全水解液o 1 0 8 m l 于2 5 m l 比色管中，蒸馏水稀释至2 m l ，加p h 8 缓冲溶液0 5 m l ，茚三铜o 5 m l ，沸水浴加热1 6 m i n ，冷却，蒸馏水稀释至2 5 m l 。 5 7 0 n m 测光密度，以蒸馏水为参比。另取2 5 m g 蛋白，加水2 5 m l ，振荡均匀后 过滤，取相应体积的滤液，按上述方法测光密度值。相同体积样品的光密度之 差与蛋白质量做工作曲线。 2 1 1 3 5 ，3 水解度测定 取水解后灭酶的水解液l m l ，稀释至1 0 0 m l ，过滤，取滤液2 m l ，加p h 8 的缓冲溶液0 5 m l ，茚三铜溶液o 5 m l ，沸水浴加热1 6 m i n ，冷却，蒸馏水稀 释至2 5 m l ，5 7 0 n m 测光密度( 蒸馏水做参比) 。另取相同浓度未水解蛋白溶 液2 m l ，按上述方法测光密度，以二者光密度之差从工作曲线上查蛋白质含 量，按下式计算水解度： 沈阳农业大学硕士学位论文 a1 0 0 d h ( ) = x v l 1 0 0 1 0 0 0 w v 2 a ：查表得蛋白质的毫克数； w - 称样重( g ) ； v ：水解液的总体积( m 1 ) ； v 2 ：显色时所用稀释液的体积( m 1 ) 。 2 1 3 6 氨基酸的测定双指示剂甲醛滴定法 2 1 3 7 苦味测定感官评价法 将蛋白水解液调p h 6 5 ，并加热至6 0 。c 以2 0 名品尝者( 男女各1 0 x ，均为不 吸烟者) 按照下面评分基准进行评分，最后得出的平均值表示苦味程度。0 完全 无苦昧：1 非常轻微苦味：2 轻微苦味；3 中等苦味；4 强苦味：5 非常强苦味。 2 1 4 主要试剂的配制 2 1 4 11 0 0 g m l 的l 一酪氨酸标准溶液 精确称取l 酪氨酸( 预先在1 0 5 烘箱内干燥至恒重) ，用0 2 nh c i 溶解后，定容至l o o m l ，再用水稀释5 倍，得到2 0 0 9 m l 的酪氨酸溶液。 2 1 4 21 0 9 l 酪氨酸溶液 称取酪氨酸1 0 0 0 9 ，精确至0 0 0 1 9 ，用少量0 5 m o l l 氢氧化钠溶液湿润 后，加入适量的各种适宜p h 值的缓冲溶液8 0 m l ，在沸水浴中边加热边搅拌， 直至完全溶解，冷却后，转入1 0 0 m l 容量瓶中，用适宜的p h 值缓冲溶液稀释 至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为3 天。 2 1 4 3 磷酸盐缓冲溶液 黜l j ( p h 6 8 、 n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 取7 1 6 4 9 用一升容量瓶定容， n a h 2 p 0 4 2 h 2 0 取3 1 2 1 9 用一升容量瓶定容 具体配置如表2 1 大豆蛋白酶解工艺的研究 表2 1 磷酸盐缓冲溶液配制 t a b l e 2 1c o n s t i t u t o ro f p h o s p h a t ec u s h i o nl i q u o rs o l u t i o n 2 1 4 。4 2 茚三酮溶液：称取l g 茚三酮于盛有3 5 m l 热水的烧杯中使其溶 解，加入4 0 m g 氯化亚锡，搅拌过滤。滤液置冷暗处过夜，加水至5 0 m l ，摇 匀备用 2 1 5 酶解工艺 大豆分离蛋白预浸热处理- - 冷却卜调整p h 值 加酶保温水解斗取出放入沸水中灭酶卜测定水解度 2 2 结果与讨论 2 2 1 酶活力测定结果 2 211l 一酪氨酸标准曲线 用1 0 0 9 m l 的酪氨酸溶液，配制不同浓度的溶液，并测其吸光度，制成的 标准曲线如图2 1 0 5 o 4 0 3 0 2 0 1 o o i o 2 0 3 04 05 0 浓岛( g m 1 ) 图2 - 1l 一酪氮酸标准曲线 f i g 2 1l - t y r o s i n es t a n d e r dc h i v e 鲨堕查些查堂婴主兰垡堕苎 根据回归方程，可计算出当吸光度为1 时的酪氨酸的量( ug ) ，即为吸光 常数k 值。根据以下公式可计算出酶活力。公式为： x = a x k x 4 1 0 n x ：样品的酶活力( u g 或u m 1 ) a ：样品平行试验的平均吸光度 k ：吸光常数 4 ：反应试剂的总体积 1 0 ：反应时间l o m i n 1 2 ：稀释倍数 2 2 1 2 蛋白酶活力测定结果 表2 - 2 蛋白酶活力 t a b l e2 - 2 v i g e ro f e n z y m e 2 2 2 预处理对大豆分离蛋白酶解的影响 天然大豆蛋白分子具有紧密的立体结构，内部结构复杂，多肽链紧密折 叠在一起。由于其酶切位点包藏于蛋白质分子内部，丽很难被蛋白酶水解 必须对其进行预处理，使蛋白变性。以利于蛋白酶的结合。蛋白变性方法有 很多，其中热处理由于具有经济、设备投资少、经热变性的蛋白质不易回复 等特点而倍受青睐。但必须采取适当的热变性方式，若加热过度，不但不能 促进反而还会阻碍酶对大豆蛋白的水解作用。所以本研究从热处理温度、热 处理时间方面探讨了对大豆蛋白酶解的影响 2 2 2 1 热处理温度对大豆蛋白水解的影响 配制4 ( w v ) 大豆蛋白溶液五份分别在8 0 ，8 5 ，9 0 ，9 5 ，1 0 0 。c 水浴加热 1 0 m i n ，用木瓜蛋白酶进行水解，水解条件为：温度为5 0 ，酶加量8 0 0 0 u 惶，p h 1 9 大豆蛋白酶解工艺的研究 值为7 5 ，水解时间6 0 m i n 。水解后迅速冷却，灭酶1 5 m i n ，测水解度( d h ) 如图2 2 ，图2 3 1 一 舌。 图2 2 热处理温度对大豆蛋白水解的影响 图2 3 热处理时间对大豆蛋白水解的影响 f i g 2 2e f f e c lo f t e m p e r a t u r eo ns o y b e a nf i g 2 - 3e f f e c to f t i m eo i ls o y b e a np r o t e i n p r o t e i nh y d m l y t i cd e g r e eh y d r o l y t i cd e g r e e 2 2 2 2 预处理加热时间对水解度的影响 配箨j r j 4 ( w v ) 大豆蛋白溶液五份，分别在9 5 水浴加热1 0 ，2 0 ，3 0 m i n 后 用本瓜蛋白酶进行水解，水解条件为：温度为5 0 。c ，酶加量8 0 0 0 u g ，p h 值为 7 5 ，水解6 0 r a i n ，水解后迅速冷却，灭酶1 5 m i n ，测水解度( d h ) 。 从图2 2 ，2 - 3 大豆蛋白的最佳热处理温度是9 54 c ，在此温度保温2 0 m i n 后再进行酶解，大豆蛋白的水解度最高。 2 2 3 蛋白酶最佳水解条件确定 2 2 3 。1 中性蛋白酶水解工艺条件确定 称取几份o 4 9 大豆分离蛋白，分别加入p h 8 0 磷酸盐酸溶液l0 m l ，在 9 5 下处理2 0 m i n ，( 以下的酶水解都在相应的温度下预处理之后再加酶) 。 然后在某因素控制不同水平，其它因素条件按：底物酶为8 0 0 0 u g ，p h 为 8 0 ，温度为4 0 * ( 2 ，酶解时间6 h ，之后沸水浴中灭酶活2 0 m i n ，取l m l 按水 解度的测定方法测水解度。 ( 1 ) 酶，底物对水解度的影响 从图2 - 4 可以看出，经过多次加酶量尝试，加入8 0 0 0 u g 时水解度增加 倍数较大，接近加酶量是其两倍时水解度，出于经济考虑加酶8 0 0 0 u g 较合 2 0 l 拶 一 i卸-l阳 f1l | ( 誉_ ) z o l温鼢lj 豁l 鲨堕堡些查兰堡主兰堡堡苎 适。 ( 2 ) 大豆分离蛋白浓度对水解度的影响控制条件p h 8 。0 ，温度4 04 c ，酶 底物为8 0 0 0 u g 。从图2 - 5 可直接看出浓度8 时水解度较大。随着浓度增大， 水解效果变差，呵能与酶与底物混合不均减少了作用面积的原因。 图2 - 4 酶与底物比对水解度的影响图2 - 5 浓度对水解度的影响 f i g 2 - 4e f f e c t o f t h er a t eo f t h ee n z y m e t os u b s t r a t ef i g 2 5 e f f e c to fc o n c e n t r a t i o no n o i ls o y b e a np r o t e i nh y d r o l y t i cd e g r e e h y d r o l y t i cd e g r e e ( 3 ) p h 值对水解度的影响p h 值为7 5 时水解度最大。这是由于酶作 为一种特殊的蛋白质分子，其酶催化反应的能力与环境p h 密切相关，环境 p h 会影响酶分子的构象和酶分子及底物分子的解离状态，从而影响酶的活 性和酶促反应速度，p h 过高、过低均对酶促反应不利。结果见图2 - 6 。 1 4 1 2 一1 0 邑8 舌6 4 2 o o24 6时间(h)02 46时间( h ) 图2 - 6o h 对水解度的影响 图2 7 温度对水解度的影响 f i g 2 6e f f e c to f p hv a l u e0 1 1s o y b e a n f i g 2 7e f f e c to f t e m p e r a t u r eo i ls o y b e a n p r o t e i nh y d r o l y t i cd e g r e e p r o t e i nh y d r o l y t i cd e g r e e ( 4 ) 温度对水解度的影响由图2 - 7 可看出，在4 0 。c 下水解液的氨基氮 含量最高，故中性蛋自酶水解最适温度为4 04 c 。温度对酶促反应的影响有两 一i e 叩_ o 查星墨皇壁竺三苎竺竺茎 个方面，一方面温度提高可使反应速度加快，另一方面随着温度的提高，酶 失活速度也开始加快。本实验使用h h 6 数显恒温水浴锅温度恒定效果不好， 造成数据差距较小。 2 - 2 3 2a c a l a s e 酶水解大豆蛋白最佳条件确定 称取几份0 4 9 大豆分离蛋白，分别加入p h 8 0 磷酸盐缓冲溶液1 0 m | ， 在9 5 下预处理2 0 r a i n 。然后在某因素控制不同水平，其它因素条件按：底 物酶为8 0 9 m l ，p h = 8 0 ，温度= 6 0 ，酶解时间6 h 。之后沸水浴中灭酶活 2 0 r a i n ，取l m l 按水解度的测定方法测水解度。 图2 - 8 底物与酶比对水解度的影响图2 - 9 浓度对水解度的影响 f i g 2 8e f f e c to f t h er a t eo f t h es u b s t r a t et oe n z y m e f i g 2 9e f f e c to f c o n c e n t r a t i o no n o l ls o y b e a np r o t e i nh y d r o l y t i cd e g r e e h y d r o l y t i cd e g r e e ( 1 ) 从图2 8 可以看出，随着酶水解时间延长和加酶量的增加，大豆蛋白 水解度变化的总趋势是逐渐增加，在水解初期，水解度上升很快，4 h 后上升 速度逐渐放缓，至5 h 以后基本保持稳定：底物与酶比从8 0 9 m l 至1 6 0 m l 酶浓 度增加一倍，水解度仅增大1 ，因此考虑到成本因素，加酶量以8 0 m l 为宜 ( 2 ) 从图2 9 可以看出，随着大豆蛋白浓度的增大，酶水解效率增加很快， 但到浓度增加到9 后水解率逐渐下降。 沈阳农业大学硕士学位论文 图2 1 0d h 对水解度的影响图2 - 1 1 温度对水解度的影响 f i g2 - l oe f f e c to f p hv a l u eo i ls o y b e a nf i g 2 1le f f e c to f t e m p e r a t u r eo i ls o y b e a n p r o t e i nh y d r o l y t i cd e g r e ep r o t e i nh y d r o l y t i cd e g r e e ( 3 ) 从图2 1 0 可以看出，a i c a l a s e 蛋白酶是一种碱性蛋白酶，在p h 值65 9 范围内对大豆蛋白均有较好的水解效果。但在p h 为8 5 条件下水解大豆蛋白 的效果更好一些。 ( 4 ) 从图2 i l 可以看出，温度对a l c a l a s e 蛋白酶水解大豆蛋白的影响比较 显著，6 5 条件下由于a l c a l a s e 蛋白酶失活，导致酶解反应逐渐出现停滞现 象，水解度不再增加。5 5 、6 0 。c 条件下大豆蛋白水解度比较接近，因最终 还是6 0 。c 水解度较高，所以本实验a l c a l a s e 蛋白酶水解大豆蛋白的温度选择 6 0 。 2 2 3 r 3 木瓜蛋白酶水解大豆蛋白最佳条件确定： 称取几份o 4 9 大豆分离蛋白，分别加入p h 8 0 磷酸盐缓冲溶液1 0 m l ， 在9 5 。c 下预处理2 0 r a i n 。然后在某因素控制不同水平，其它因素条件按：底 物酶为3 9 0 0 0 u g ，p h 为8 0 ，温度为4 0 。c ，酶解时间6 h 。之后沸水浴中灭 酶活2 0 r a i n ，取l m l 按水解度的测定方法测水解度。 一：lh凸 重 8 6 4 2 o 嚣一 口 大豆蛋白酶解工艺的研究 3 萝2 三 凸】 0 0246 时间( h o 图2 - 1 2 酶与底物比对水解度的影响图2 ，1 3 浓度对水解度的影响 f i g 2 1 2e f f e c to f t h er a t eo f t h ee n z y m et os u b s t r a t ef i g 2 - 1 3e f f e c to f c o n c e n t r a t i o no n o ns o y b e a np r o t e i nh y d r o l y t i cd e g r e e h y d r o l y t i ed e g r e e ( 1 ) 从图2 1 2 可以看出，木瓜蛋白酶对大豆蛋白水解率较差，在经过 大量实验后加酶到3 5 7 5 0 u