（食品科学专业论文）电融合法构建海藻糖高产菌株的研究.pdf

吉林农业大学硕士学位论文电融合法构建海藻糖高产菌株的研究 摘要 本实验运用原生质体电融合技术，将高产海藻糖的菌株酿酒酵母a s 2 1 4 1 6 与具有 s t a 基因能水解淀粉的糖化酵母a s 1 8 8 7 进行融合，目的在于构建出既能利用淀粉又能 高产海藻糖的菌株。并对影响原生质体形成率、再生率的各种因素以及影响电融合的各 项参数进行了深入的探讨。以期能够找出这些因素的作用规律和最佳的作用参数，进而 阐明融合的机理为利用原生质体融合技术进行微生物育种工作提供科学依据。研宄结果 如下： 1 、原生质体形成率和再生率的影响因素 经过大量的对比实验确定： 1 ) 最佳的酶浓度为0 3 ；适宜的酶解时间为2 0 m i n ；最适酶促反应的温度为3 0 3 7 o c ；最适酶促反应的p h 值为6 7 。 2 ) 对比了b 一巯基乙醇不同用法影响原生质体形成率及再生率的关系，确定蜗牛 酶及b 一巯基乙醇混合液对茵体酶解的方法为最后方案。 3 ) 不经同步培养的茵体酶解后原生质体的数量要比经同步培养的低，不利于融合 的进行。因此，本实验采用将活化2 4 小时的茵液放入冰箱中4 保温2 小时的同步培 养方法。 4 ) 对比了甘露醇( 0 8 m o l l ) 、山梨醇( i m o l l ) 和蔗糖( 0 6 m o l l ) 作为渗透 压稳定剂的效果。结果表明，用甘露醇和蔗糖作渗透压稳定剂时原生质体形成率较高； 用甘露醇和山梨醇作渗透压稳定剂时再生率较高。本实验确定以甘露醇作为渗透压稳定 剂。 5 ) 确定了碘乙酸用量o 6 ，处理3 2 分钟；热灭活的参数，6 0 9 ( 3 ，4 5 分钟。 2 、融合参数的选择 1 ) 实验结果表明两种茵具有不同的成串特性，a s ：1 4 1 6 理想细胞成串峰值出现在 2 0 0 v c m 左右，a s l 8 8 7 的出现在2 5 0 v c m 左右。因此本实验采用交变电场强度为2 5 8 v c m 。 2 ) 原生质体在电场中有不同的移动速度，需要调整原生质体的密度，使其在相同 交变电场强度下有最高的理想成串率。本实验确定的最适密度1 0 5 。 3 ) 确定了原生质体在交变电场中的静止时间，在6 0 s 时原生质体能够形成高的理 想细胞成串率。 吉林农业大学硕士学位论文电融合法构建海藻耱高产菌株的研究 4 ) 通过电场强度的调整，理想细胞成串率分剐由4 5 提高到5 5 ，5 0 提高到5 9 。 得到的结论是电场强度的调整对提高理想细胞成串率有明显效果。 5 ) 确定脉冲场强为5 5 k v l c m ，在此脉冲场强下，a s ：1 4 1 6 和a s 1 8 8 7 的原生质体 存活率分别为7 1 、6 6 。 6 ) 确定脉冲时间常数为3 0 s ，在此脉冲时间常数下，a s 。1 4 1 6 和a s 1 8 8 7 的原 生质体存活率分别为7 7 、7 0 。 7 ) 确定脉冲个数为5 个，在此脉冲个数下，a s ：1 4 1 6 和a s 1 8 8 7 的原生质体存活 率分别为7 2 、6 9 。 从所获得的融合子中，筛选出一株既能利用淀粉又能生产海藻糖的菌株。 关键词：酿酒酵母；糖化酵母；原生质体；电融合 i i 吉林农业大学硕士学位论文 电融合法构建海藻糖高产菌株的研究 a b s t r a c t a s 2 1 4 1 6p r o d u c et r e h a l o s eh i g h l y a s 1 8 8 7w i t hs t a g e n ec o u l dd e g r a d es t a r c h h i o r d e rt oc o n s t r u c tt h e h i g h l yp r o d u c i n g t r e h a l o s es l t a i nw h i c hh a st h e a b i l i t y o f s a e c h a r i f i c i t i o n ，t h er e s e a r c hi n t r o d u c es t ag e n ei n t oa s 2 1 4 1 6b ym e a n so fp r o t o p l a s t e l e c t r o f u s i o n t e c h n i q u e f a c t o r s o f p r o t o p l a s tf o r m a t i o n ，r e g e n e r a t i o n a n d p a r a m e t e r s o f d e t r o f u s i o nw e r e s t u d y i nt h er e s e a r c h l o o k i n gf o r w a r dt o f i n d i n g t h er e g u l a t i o na n d o p t i m u mp a r a m e t e r s ，t h er e s e a r c hw i l lo f f e rs o m ed a t af o rm i c r o o r g a n i s mb r e e d i n gb yu s i n g p r o t o p l a s te l e c t r o f u s i oa n dc o n t r i b u t et oc l a r i f yt h em e c h a n i s mo ff u s i o n t h er e s u l to ft h e r e s e a r c ha sf o l o w s ： 1 i n f l u e n c i n g f a c t o r so ff o r m a t i o na n d r e g e n e r a t i o no fp r o t o p l a s t 1 )f r o mp l e n t yo ft r i a l s ，t h ec o n f o r m a t i o ni s ：t h eo p t i m u mc o n c e n t r a t i o no fs n a i l a s e 0 3 ；t h et i m eo fs n a i l a s et r e a t m e n t2 0 m i n ；t h et e m p e r a t u r eo fs n a i l a s et r e a t m e n t3 0 - 3 7 ；t h e p h o fs n a i l a s et r e a t m e n t6 - 7 2 ) c o n t r a s tt h ec o n n e c t i o no fd i f f e r e n t u s a g e s o fb - - m e r c a p t o e t h a n o lt ot h e f o r m a t i o na n dr e g e n e r a t i o no fp r o t o p l a s t t h ef i n a ls c h e m ei st h eb l e n dd i s s o l u t i o nl i q u i do f s n a i l a s ea n d b - 1 n e r c a p t o e t h a n 0 1 3 ) t h ea m o u n to fp r o t o p l a s t i sf e w e rt h a ns y n c h r o n i z a t i o nc u l t u r e s ，w h i c h g o a g a i n s t t h ef u s i o n s ot h es y n c h r o n i z a t i o nc u l t u r ei s n e c e s s a r y t h ee x p e r i m e n ta d o p tt h e m e t h o dt h a tt h ef u n g u sa c t i v a t e d2 4 hi sp u ti n t ot h er e f r i g e r a t o r y4 。c2 h 4 )c o n t r a s tt h ee f f e c to ft h ed i f f e r e n to s m o t i cs t a b i l i z e ro f 5 1c o n f l r mt h ep a r a m e t e ro fo 6 3 2 r a i na n d6 0 4 5 r a i n 2t h ec h o i c eo ff u s i o np a r a m e t e r 1 ) t h e r e s u l t so ft h ee x p e r i m e n ts h o wt h et w of u n g u sh a v ed i f f e r e n tc h a r a c t e r i s t i c o fs t r i n g t h e p e a kv a l u eo f i d e a lc e l ls t r i n g o f a s 2 1 4 1 6 i so n t h e 2 0 0 v c m ，t h e a s 1 8 8 7 i so n i l l 吉林农业大学硕士学位论文 电融台法构建海藻糖高产菌株的研究 t h e2 5 0 v c m s ot h ee l e c t r i cf i e l di n t e n s i t yi s2 5 0 v c mi nt h e e x p e r i m e n t 2 ) t h ep r o t o p l a s th a sd i f f e r e n tv e l o c i t yi nt h ee l e c t r i cf i e l d ，t h e a d j u s t m e n to f p r o t o p l a s td e n s i t y i sn e c e s s a r yt oh a v et h em a x i m a lr a t i oo fi d e a l s t r i n g t h ed e n s i t yi s1 0 5 3 ) t h e s t i l l n e s st i m eo f p r o t o p l a s ti sc o n f i r m e d t h eh i g hr a t i oo fi d e a ls t r i n gi so n 6 0 s e c o n d 4 ) a f t e rt h ea d j u s t m e n to fe l e c t r i cd e n s i t y , t h er a t i oo fi d e a ls t r i n gi m p r o v ef r o m 4 5 t o5 5 ，5 0 t o5 9 s e p a r a t l y t h ec o n c l u s i o ni st h a tt h ea d j u s t m e n th a se v i d e n te f f e c t o nt h er a t i oo fi d e a ls t r i n g 5 ) t h ei m p u l s ei n t e n s i t yi s5 5 v c m ，t h el i v a b i l i t yo f p r o t o p l a s ti s7 1 、6 1 6 ) t h e i m p u l s e t i m ei s3 0 s e c o n d ，t h e l i v a b i l i t yo fp r o t o p l a s ti s7 7 、7 0 7 ) t h e i m p u l s e n u m b e ri s5 ，t h el i v a b i l i t yo f p m t o p l a s t i s7 2 、6 9 f r o mt h ef u s a n t s ，as t r a i nc o u l d p r o d u c e st r e h a l o s ea n dd e g r a d e ss t a r c h k e y w o r d s ：s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ；s a c c h a r o m y c e sd i a s t a t i c u s ；p r o t o p l a s t ；e l e c t r o f u s i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，【| ：王不包含为获得吉林农业大学或其他教育机 构的学位证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：彭炒产 签字日期： 一p j 年月z z 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解吉林联_ p 大学有关保留、使用学位论文的规定， l | 吉林农业大学有权保甜并：龟国家：蓑部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。本人授权吉秫衣、世大学可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可咀采翊影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。( 保密的学位论文在解暂后适用本授权书) 学位论文作者签名 鹋融 签字日期：2 即i 二_ 莎j ? o ， 签宁日期： 加绎月二日 学位论文作者毕业后去陶： 一位：芗仫履蟛恕缁诡电话 通讯地址：邮编 吉林农业大学硕士学位论文电融合法构建海藻糖高产菌株的研究 1前言 利用物理的、化学的诱变剂单独或复合处理微生物是选育高产变种行之有效的经典 方法。它在培育多种抗生素、氨基酸、核苷酸及酶( 包括蛋白酶、淀粉酶) 的高产变种 方面曾经起过极为重要的作用，至今仍然是有效的方法之一。但这个方法也有以下几方 面的不足之处：如工作量大，盲目性大在连续多次处理达到饱和之后就不易进一步提高 对某一些菌住的作用不明显等 1 。因此，在遗传研究的基础上，寻找能定向获得优良 遗传性状、效果好、效率高的新技术，是微生物遗传育种工作者的共同愿望。遗传重组 虽然是大家追求的目标之一，期望通过z d - 亲株的基因重组来获得新的优良性状，或者 籍基因重组改变遗传背景以提高一般诱变剂的敏感性。问题在于要实现基因重组并不容 易，存在很多困难。而原生质体融合技术，对实现重组育种提供了很大的方便。 原生质体融合起源于20 世纪60 年代。1 9 6 0 年法国的b a r s k i 研究小组在两种不 同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象口4 1 01 9 6 2 年日本的o k a d a 发现并证 明了灭活的仙台病毒可诱发体内艾氏腹水癌细胞彼此融合，从而开始了细胞融合的探索 1 5 “。早期的研究中，只是将其作为一种生化的、遗传的研究工具，应用于基因重组转 移。原生质体融合技术具有许多常规杂交方法所无法比拟的独到之处，生物学研究手段 的不断创新使原生质体融合技术正在逐步完善。近几年来，在原生质体融合的基础研究 及应用研究中，都有相当大得进展。真菌原生质体融合的第一篇报道，是以白地霉 ( g e o t r i c h u mc a n d i d u ml i n k ) 营养缺陷型突变株为材料，采用离心方法进行原生质体融 合 _ ”。随后，人们又利用一些化学式剂如c a ( n 0 3 ) 2 、k c l 、n a c l 等作为融合诱导剂，促 进原生质体融合，但融合率都没超过1 0 3 水平。自从发现p e g 的助融合性以来，原生 质体融合技术便跃入了新阶段，从而使融合率提高1 0 0 0 倍以上丌】。因原生质体融合技 术的突出特点作为细胞工程的重要组成部分、高频重组的有效方法和遗传学研究的重要 工具，近年来日益受到国内外生物学工作者的重视，使这项技术不断丰富和发展。从技 术本身方面，已形成了原生质体融合、原生质体诱变和原生质体转化等一系列技术体系。 融合方面，除了化学方法外，1 9 8 0 年，z i m m e r m a r m 等人报道了电场诱导细胞融合的新 技术哺1 2 。以后的几年里人们把这项新的融合手段从动物、植物扩展到微生物的原生质 体融合中 9 ”。导致了原生质体融合技术的新突破。1 9 8 8 年张闻迪等又报道了激光诱 导动物细胞融合“。 吉林农业大学硕士学位论文电融台法构建海藻糖高产菌株的研究 1 1 原生质体融合 原生质体融合就是把二个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使在高渗环境 中释放出只有原生质体膜包被着的球状原生质体，然后将二个亲株的原生质体在高渗条 件下混合，在一定条件下，使它们相互凝集，通过细胞质融合，接着发生二套基因组之 间的接触、交换，从而发生基因组的遗传重组，就可以在再生细胞中获得重组子”。 1 1 1 化学融台 1 化学因子诱导的原生质体融合，最成功并且至今为人们所经常使用的是以聚乙 二醇( p e g ) 作为融合剂。对于所有种类的真菌而言，p e g 诱导的融合条件基本一致： p e g 分子量为4 0 ( o ) 0 6 0 0 0 ，浓度2 5 4 0 ，p h 7 9 ，g a 2 + 存在的情况下( 1 0 - - l o o m m 0 1 ) 融合率可以进一步提高5 1 。 1 1 2 电融合 电融合技术是1 9 8 0 年由z i m m e r m a n n 等提出的一项有效促成原生质体融合的新手 段 1 ”。并对几十种植物、微生物原生质体，动物细胞和脂质体广泛的进行电场诱导融合 实验，为电融合技术的发展和对机理的认识奠定了基础。近年来，这种物理融合技术迅 速崛起，显示出强大的生命力。概括地说，融合过程首先是原生质体在电场中极化成偶 极子并沿电力线排列成串，然后在短时间强电场( 高压脉冲电场，场强为k v c m 量级， 脉冲宽度为斗s 量级) 的作用下。原生质体膜发生可逆性电击穿，瞬时地失去其高电阻 和低通透特性，然后在数分钟内恢复原状。当可逆电击穿发生在两个相邻细胞的接触区 时即可诱导它们的膜相互融合，从而导致融合的发生。此法直观、定向、高效。主要用 于替代难以进行化学物质诱导融合的情况中【5 j 。 电融合为一个空间定向、时间同步的可控过程；它不会象化学诱导剂那样产生任何 毒害细胞的作用。 1 1 3 原生质体细胞融合特点1 4 】 1 杂交频度高细胞壁是微生物细胞之间进行遗传物质交换的主要障碍之一，由 于原生质体是将细胞壁脱去的类似球形的活体，在原生质体细胞融合时，又加入了融合 促进剂，因此，细胞融合的频度明显地高于有性杂交。 2 受结合型或致育性的限制少将原生质体细胞进行融合，与细胞表面的结构无 2 吉林农业大学硕士学位论文 电融合法构建海藻糖高产菌株的研究 关，二亲株中任何一株都可能起受体菌或供体菌的作用，这就有利于不同种、属间微生 物的杂交。 3 遗传物质的传递更为完善原生质体细胞融合是二亲株的细胞质和细胞核合而 为一的过程。因此，遗传物质的交换较完整。原核生物有可能可以将二个或更多个完整 的基因组携带到一起的机会。 4 存在着二株以上亲株同时参与融合，形成融合子的可能性这是由于细胞融合 前，加入融合促进剂p e g ，使众多的原生质体细胞聚集成簇，大大的增加了多个原生 质体细胞参与融合的可能性。 1 1 4 原生质体融合的几个步骤 1 1 4 1 去除细胞壁、制备原生质体 根据各种微生物细胞壁的不同结构和组成，可以用不同的方法来脱壁，但从现有的 文献报导来看多数是用酶法，如溶菌酶、纤维素酶等，再结合一些其它的措施以提高酶 对细胞壁作用的敏感性1 61 7 1 。 1 1 。4 2 生质体再生成细胞 对原生质体融合育种来讲，重要的一个环节是必须使原生质体再生成细胞，这才可 以对它的子代进行遗传鉴别。再生是一个十分关键的问题，因为不同微生物的原生质体 所要求的最适条件不同，即使一些非常近似的种，最适的再生条件也往往在再生培养基 营养成分及其它条件如温度等方面有所差别口5 】。 1 1 4 3 融合 融合就是把二亲株原生质体混合在一起，用p e g 助融或电融合仪融合，然后将融 合液涂布在再生平板上，保温后检出重组予。 1 1 5 融合子的选择方法 真菌原生质体融合的第一步是细胞壁或细胞质融合形成异核体体，然后核融合形成 杂合二倍体。然而，真正稳定的杂合二倍体是极少数的大多数异核体会产生亲型的分离 子。因而，原生质体融合发生后，关键的问题是如何选出具有新的优良性状的融合子一 吉林农业大学硕士学位论文电融合法构建海藻糖高产菌株的研究 稳定的重组体。 1 利用营养缺陷型作为遗传标记物进行融合子的选择。它的理论依据是将亲本菌株 诱变处理后产生对某些营养物质合成途径受阻的突变型。这种营养缺陷型在基本培养基 上不能生长，只有营养缺陷型得到互补后才可恢复正常生长【3 “。 应用原生质体技术改良一些具有重要商品性状的真菌菌种，利用营养缺陷型标记往 往会造成一些优良性状，和所需代谢物产量的丢失，诱变处理也会造成一些有害突变的 出现。从方法本身讲，营养缺陷型的获得繁琐费时，而且营养缺陷型突变体的产生随时 间的延长而下降“。 2 利用抗药性进行融合子的选择微生物的抗药性是其种的特性，是由于遗传物质决 定的。不同的微生物对某一种药物的抗性存在差异，利用这种差异或与菌种其他特性结 合起来，即可对融合子进行选择【l ”。但利用抗药性标记的方法选择有两个问题：药物 的浓度浓度过高会使融合频率降低，浓度过低则会使亲株生长，影响融合子的检出。 带有某种抗性标记的基因必须为“显性”或“半显性”，以免抗性得不到表达。 3 利用灭活的原生质体( 致死供体) 进行融合子的选择这种方法与上述方法不同， 利用灭活原生质体不需要经过营养缺陷型人工标记”。尽管这种技术目前在真菌原生质 体融合中应用较少，但已广泛为人们所重视。 灭活有多种途径，常用的有热灭活，大剂量紫外线灭活抑制剂灭活等。灭活原生质 体的机理认为是：紫外线使菌株的d n a 发生突变，热的作用可使细胞内有功能蛋白、酶 蛋白变性失活，化学药剂的作用是不可逆的抑制细胞代谢过程的关键酶并使之失活。 4 以荧光染色法选择融合子近几年，又一项非人工标记原生质体融合子选择法一 一荧光染色选择已经出现“。这种方法首先在双亲原生质体制备过程中，向酶解液中 加入荧光色素，使其形成带有荧光色素的原生质体。离心清洗掉多余的染料，然后进行 融合处理，融合的原生质体悬浮液置于带有显微操作器和落射荧光装置的立体型显微镜 下，直接挑选出带有两种荧光染料的原生质体( 已融合的原生质体) 。 1 1 6其它方法 除以上几种方法外，实践中还有一些辅助性方法用于融合子的检测。虽然依靠它们 单独定论是否为融合子正据不够充分但它们各自都从不同侧面反映了融合的发生，因而 常被用作非人工标记鉴别融合子的辅助性方法。包括：对昆虫的毒力测定、利用形态差 异法( 青霉) 、利用一些生化指标( d n a 含量、氨基酸含量、酸性磷酸酶、同工酶、电 泳及酶的活性测定等) 、电镜观察检测原生质体融合等等”。 4 吉林农业大学硕士学位论文电融合法构建海藻糖高产菌株的研究 原生质体融合技术在实际应用中，其关键环节是准确地选出真正的融合子，而这个 选择往往是上述某些方法结合使用。如将营养缺陷型与抗药性，抗药性与灭活等相结合。 1 2 原生质体融合的应用 1 2 1 改良菌种 通过原生质体融合技术使两个菌株的遗传物质得到重组，从而获得兼具两个亲本优 良性状的新菌株。酿酒酵母应用于啤酒酿造。在发酵后期，那些能凝集并形成絮状的酵 母称凝集性酵母而那些沉淀不好的酵母称为粉状酵母。具有良好凝集性的酵母，可使啤 酒发酵液澄清速度加快，降低酵母分离时的能量消耗，并且还可防止酵母在发酵液中长 时间悬浮导致细胞自溶而影响啤酒的风味。酿酒酵母的凝集特性由其本身遗传特性决 定。一般凝集性较好的酿酒酵母往往发酵度偏低。陈海昌等应用原生质体融合技术选育 出的融合子f p - 9 ，即具有较高的发酵度，又具有较强的凝集性【2 13 7 1 0 1 2 2 抗生素研究 利用原生质体融合技术不但可用于提高抗生素的产量，同时还可用于融合子产生新 的抗生素的研究贺敏霞等通过诺卡氏菌原生质体融合重组研究，发现有四株融合子产生 亲本没有的甾体转化中间体，三株融合子产生亲本没有的抗生物质，还得到甾体转化活 力明显高于亲本的融合子”。林荣团等的工作更容易说明这个问题。他们以天然无抗 菌活性的变青链霉菌( s t r e p t o m y c e sl i v i d a n s ) 1 3 2 6 与链霉菌1 2 5 4 营养缺陷型突变株进 行种问原生质体融合】。从7 5 5 株融合体中筛选到5 株抗菌活性较稳定的菌株。对于这 种新产物合成的机理，h o p w o o d 解释为：在链霉菌可能存在着大量的、没有表现遗传 功能的沉没基因( s i l e n tg e n e ) ，若能使这些基因得到表达，这些微生物就有可能合成更 多的次级代谢产物“”。近年来的研究表明：突变、外源d n a 片段的插入以及种内或种 间的杂交，都可能使某些链霉菌产生原来没有的新物质“剐 1 2 3酶的研究 应用原生质体融合技术对酶的研究是相当广泛的。研究最多的是淀粉酶、蛋白酶和 纤维素酶，主要用于提高菌种的产酶力活力，改变菌种分泌的种类或使产酶菌种获得新 的优量性状等。日本w a s e d a 大学应用此技术以柠檬酸生产菌株黑曲霉和纤维素酶产生 菌绿色木霉( t r i c h o d e r m av i r i d e ) 为亲本，融合后筛选到一类融合子，能在甘蔗渣固体 吉林农业大学硕士学位论文电融合法构建海藻糖高产菌株的研究 培养基上生长，并产生柠檬酸。融合子( 异核体) 兼具了绿色木霉产纤维素酶的能力和 黑曲霉产柠檬酸的能力。古屋武和牛岛重臣应用原生质体融合技术得到了生长素度快， 蛋白酶活性高的新菌种阱2 5 1 os u s h i j i m a 进行了米曲霉( a 一淀粉酶产生菌) 和酱油曲 霉( a s p e r g i l l u s s o j a e ，蛋白酶高产菌株) 种间融合育种研究。 1 2 4 病毒传递 在真菌中，有的种感染病毒，有的种不感染病毒。以常规技术从可亲和菌丝联合传递 病毒成功的例子表明，病毒在菌株问传递是胞质遗传现象。既通过细胞质的交换传递病 毒。梁平彦等通过曲霉属种间原生质体融合后病毒传递及遗传重组的研究，对这一问题 作了极为重要的修正和补充【2 ”。即：仅仅胞质交换不能满足病毒在新寄主中复制所需的 条件，核的融合方能使病毒恢复正常。因为核因子( 遗传物质) 控制着病毒生存和复制。 若融合子得到了核因子，后代病毒能存在并能增殖。若无核融合，只有胞质融合，核因 子未得到交换，病毒不能存在和复制。说明原生质体融合技术，确能使双亲遗传物质得 到交换与重组。 1 2 5 核的转移 f e r e n c y 基于原生质体融合技术建立了一种核与原生质体融合方法，实现了核的转 移。他们首先酶解获得酿酒酵母稳定营养缺陷型菌株的原生质体，使其在低渗溶液中破 裂，将细胞核释放出来。通过蔗糖密度梯度离心收集细胞核。然后将核与营养缺陷互补 的受体菌原生质体混合，在p e g 和c a 2 + 存在下进行核融合处理。随后在基本培养基上 选择融合子，从而实现了核的转移，频率为1 0 _ 8 。l f f 9 2 9 1 。 1 2 6 质粒转移 微生物可通过转化、转导、接合和转染等多种方式传递遗传信息。但有些微生物不 具备这些条件。因而对这些微生物来讲，其遗传物质的传递研究和育种工作皆受到一定 的限制。由于原生质体融合可在种内、种间甚至属间进行，因而通过原生质体融合有可 能够将质粒转移到非感受态菌株间为基因转移和育种提供了新的途径。b i b b 等于1 9 7 8 年报道了质粒d n a 在链霉菌属间的高频转移【蚓。国内江行娟等对枯草杆菌( b a c i l l u s s u b t i l i s ) 通过细胞原生质体融合的质粒转移进行了研究【3 ”。 6 吉林农业大学硕士学位论文电融合法构建海藻糖高产菌株的研究 1 2 7 耐热性研究及菌种筛选 很多微生物能在4 5 6 5 生存。有的菌种甚至可在9 8 。c 温泉中生长繁殖。虽然目前 关于微生物耐热性的机理研究还不是很清楚，但其耐热性却有很重要的应用价值 3 9 。在 酒精酿造中，酿酒酵母于4 0 时产酒明显下降。为此必须消耗大量能源降低发酵液的 温度。方霭祺【3 习等报道了以酿酒酵母3 9 6 ( 能利用甘蔗糖蜜生产酒精) 和假丝酵母缠( 4 5 生长良好) 为亲本，通过原生质体融合技术，得到了一株在4 0 培养条件下原料利 用率为9 4 3 ，乙醇产量为5 9 7 9 l 的属问融合株。 原生质体融合技术由于不受亲缘关系的影响，遗传信息传递量大，不需了解双亲详 细的遗传背景等优点，因而便于操作。这一技术为遗传操纵、分子生物学和基础理论研 究提供了一种重要工具，也为遗传育种提供了一种有效手段。 目前，细胞内含有海藻糖的菌株较多，但产量高的却很少。酿酒酵母a s 2 1 4 1 6 海藻 糖含量就很高，但没有分泌糖化酶( 胞外葡萄苷淀粉酶) 的能力，因此不能利用淀粉。 糖化酵母是糖化酶基因的重要来源，它所分泌的糖化酶可以从淀粉糊精的非还原性末端 顺序水解葡萄糖单位，理论上可将直链淀粉全部水解为葡萄糖。糖化酵母与酿酒酵母亲 缘相近，易于s t a 基因( 糖化酶基因) 的转移和表达，避免了属间排斥现象 4 0 4 ”。 本试验采用原生质体电融合技术，将海藻糖含量较高的酿酒酵母a s 2 1 4 1 6 与能利用 淀粉的糖化酵母a s l 8 8 7 进行了融合，拟构建能利用淀粉生产海藻糖的高产菌株，并进 一步对酶的浓度、酶的作用时间、酶的作用温度、作用p h 、高渗溶剂及预处理条件等 对原生质体的形成率、再生率的影响进行了探讨，力求确定出蜗牛酶对a s 2 1 4 1 6 及 a s l 8 8 7 最佳的作用条件；而且对电融合的参数：高压交变场强、成串电流、融合电压 等进行了优化组合研究，以期达到较高的融合频率，为利用电融合技术进行微生物育种 及理论研究创造技术条件。并探讨不可逆生化抑制剂碘乙酸抑制某一亲株细胞酶活性和 热灭活原生质体作为原生质体融合的选择性标记的可行性，以期为进行酵母融合提供一 种操作简单、有效方法。 2 材料与方法 2 1 实验材料 菌株酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ，a s 2 1 4 1 6 ) 购自中科院微生物所 糖化酵母( s a c c h a r o m y c e sd i a s t a t i c u s ，a s 1 8 8 7 ) 购自中国食品发酵工业研究所 吉林农业大学硕士学位论文电融合法构建海藻糖高产茵株的研究 微生物菌种保藏中心 培养基 液体完全培养基1 2 0 1 ( c m 液体) ：蛋白胨2 ，葡萄糖2 ，酵母膏1 ，蒸馏水1 0 0 0 ， p h 7 2 。 固体完全培养基( c m 固体) ：液体完全培养基加2 琼脂。 再生完全培养基：固体完全培养基中加入o 8 m o l l 甘露醇。 再生完全培养基软琼脂 ：液体完全培养基中加入0 7 5 琼脂。 以上培养基0 1 m p a ，1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 含淀粉完全培养基( y e p s ) 嘲：蛋白胨2 ，酵母膏2 ，可溶性淀粉1 ，蒸馏 水1 0 0 0 。 高淀粉含量完全培养基( y e p s 3 ) 3 3 】：蛋白胨2 ，酵母膏2 ，可溶性淀粉3 ， 蒸馏水1 0 0 0 。 0 0 6 m p a ，1 1 3o c 灭菌3 0 m i n 。 溶液 磷酸缓冲液( s t ) m 】：o 1 m o l l p h 6 0 磷酸缓冲液。 高渗缓冲液：磷酸缓冲液加入0 8 m o l l 甘露醇。 原生质体稳定液( s m m ) ：o 8 m o l l 甘露醇，2 0 m m o l l m g c l 2 ，o 0 2 m o l l 顺丁烯二 酸，p h 6 5 。 溶酶液：磷酸缓冲液加入o i e d t a 和0 3 b 巯基乙醇。 碘乙酸溶液：磷酸缓冲液加入0 6 碘乙酸。 缓冲液加电脉冲液：o 8 m o l l 甘露醇，1 0 。4 m o l l c a c l 2 ，用导电率小于1 0 5 ，欧姆? 米 的去离子水配制，调至p h 6 0 。 以上溶液0 1 m p a ，1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 碘液：碘( 1 2 ) 4 0 m g ，碘化钾( ) 6 0 m g ，加9 5 乙醇1 0 0 m l 。 蜗牛酶：北京鼎国 仪器设备 超净工作台：s w c j f 国产 离心机：l g l 6 w 北京医疗器械厂 离心机：r n 一1 8 m 上海离心机厂 水浴锅：国产 热鼓风干燥箱：1 0 1 a 一2 型上海实验仪器厂 恒温培养箱：d p h - - 1 2 0 上海实验仪器厂 吉林农业大学硕士学位论文 电融台法构建海藻糖高产菌株曲研完 水浴摇床：d s h z - - 3 0 0 江苏太仓 移液器：国产 倒置显微镜：n i k o n 日本 显微镜：o l y m p u s 日本 菌种保藏冰箱：s j m s u n 冷藏冰箱：h a i e r 国产 7 2 1 分光光度计：国产 电融合仪：c r y 一3 型宁波新芝科器厂 电子天平：a l c 一1 l o 4 北京赛多利斯天平有限公司 精密酸度计：p h s 3 c 型上海雷磁仪器厂 2 2 实验方法( 以下均为无菌操作) 2 2 1 菌体前处理 2 2 1 1 a s 1 8 8 7 菌种的活化与保存 ( 1 ) 从a s 1 8 8 7 菌种斜面挑取一环菌种接种于装有2 0 m l 完全培养基的1 0 0 m l 三角 瓶中，3 0 震荡培养2 4 小时。 ( 2 ) 取出i m l 菌液，用无菌水离心洗涤一次，用装有9 m l 无菌水的试管稀释至i 0 。 ( 3 ) 取i 0 。菌液0 i m l ，于高淀粉含量培养基平板上，用玻璃刮棒进行涂布，于 3 0 。c 培养4 6 天。”。 ( 4 ) 取出平板，挑取生长的菌落接种于高淀粉含量培养基斜面上进行保存。 2 2 1 2 菌种活化 分别从斜面取一环菌种接种于装有5 0 m l 完全培养基的2 5 0 m i 三角瓶中，3 0 0 c 振荡 培养2 4 小时”“。 2 2 1 3 生长曲线的测定 按5 的接种量接入完全培养基，3 0 。c 培养，用7 2 1 分光光度计( 6 7 0 n m ) ，每隔2 小时测一次。测定时的菌体用无菌水离心洗涤一次，洗去其他杂质，用无菌水溶为原菌 液浓度，以无菌水为空白，进行吸光度的测定1 。生长曲线见图1 。 吉林农业大学硕士学位论文 电融合法构建海藻糖高产菌株的研究 2 2 1 4 菌体前培养 分别取1 5 m l 活化的培养物接种于装有3 0 m l 液体完全培养基的5 0 m l 三角瓶中，3 0 振荡培养，培养至对数生长期。 2 2 1 5 总菌数测定 ( 1 ) 取菌液用无菌离心管离心洗涤一次，将菌体悬浮于无菌水中，振荡均匀，取 0 5 m l ，用无菌水稀释至1 0 。 ( 2 ) 取i 0 一、i 0 一、i 0 。7 稀释度菌液各0 i m l ，于相应编号的完全培养基平板上( 每 个稀释度做三个平板) ，用玻璃刮棒进行涂布，进行总菌数测定。 2 2 2 原生质体制备 2 2 2 1酶解 ( 1 ) 分别取菌体离心( 4 0 0 0 转分i 0 分钟) 收集菌体，用无菌水离心( 4 0 0 0 转 分，1 0 m i n ) 洗涤菌体二次，尽可能除去杂质。 ( 2 ) 将菌体分别悬浮于蜗牛酶液中，在一定的温度下反应，随时用显微镜观察细 胞形成原生质体情况。 2 2 2 2原生质体形成率和再生率测定 ( 1 ) 分别吸取0 5 m l 菌液f 经酶处理) 放入4 5 m l 高渗缓冲液中。 ( 2 ) 经高渗缓冲液稀释至i 0 ；取1 0 、1 0 一、1 0 。稀释度菌液各0 i m l ，于相应编 号的再生完全培养基平板上，迅速倒入冷却至3 0 4 0 q c 的再生完全培养基软琼脂，进 行再生培养基上的总菌数测定。 ( 3 ) 分别取0 5 m l 菌液( 经酶处理) 至无菌水试管中，稀释至1 0 。 ( 4 ) 取1 0 、1 0 一、1 0 。5 稀释度菌液各0 1 m l ，于相应编号的完全培养基平板上，进 行经酶处理未脱壁菌数测定。 ( 5 ) 根据未经酶处理总菌数、再生培养基平板上总菌数和经酶处理后完全培养基 上剩余菌数计算原生质体形成率及再生率”。 原生质体形成率( ) = a b a 1 0 0 a ：细胞总数； 1 0 吉林农业太学硕士学位论文 电融合法构建海藻糖高产菌株的研究 b ：经酶及低渗处理后剩余菌数。 原生质体再生率( ) = a b c 1 0 0 = a b i d e 1 0 0 a ：再生培养基平板上总菌数； b ：经酶及低渗处理后剩余菌数； c ：原生质体数； d ：未经酶处理细胞总数； e ：经酶及低渗处理后剩余菌数。 2 2 2 3原生质体灭活处理 ( 1 ) 取经酶处理过的菌液，用高渗缓冲液离心洗涤一次。 ( 2 ) 将离心后的a s 2 1 4 1 6 悬浮于2 m l 高渗缓冲液中，放入干燥箱中，进行热灭活。 于不同时间取出菌液，用高渗缓冲离心洗涤一次，用0 i m l 高渗缓冲液溶开，将菌液铺 于完全培养基平板上，迅速倒人冷却至3 0 4 0 的再生完全培养基软琼脂，测定热灭 活曲线。见图2 ( 3 ) 将离心后的a s 1 8 8 7 加入2 m l 碘乙酸溶液，3 0 保温。进行碘乙酸灭活实验。 曲线的制作同上。见图3 2 2 3电场诱导原生质体融合 2 2 3 1除酶 ( 1 ) 取两亲本原生质体各2 m l ，混合于灭菌小试管中。 ( 2 ) 离心弃上清夜，用电脉冲缓冲液离心洗涤一次。 2 。2 3 2融合 ( 1 ) 取灭活后的两亲本原生质体各2 m l ，按1 ：1 的比例混合。将一部分灭活后的 原生质体倒平板，观察灭活是否完全。 ( 2 ) 用无菌移液器将原生质体混合液注如入电容合小池，将小池至于倒置显微镜的 载物台上，接通成串高频电场及高频电流，持续几分钟，经电解质电泳使原生质体形成 稳定的串珠状。 ( 3 ) 接通直流融合电流，输入单个脉冲，作可逆电击穿，触发原生质体融合。将融 吉林农业大学硕士学位论文电融合法构建海藻糖高产菌株的研究 合小池取下，放人无菌操作台内，静止1 5 m i n ，将原生质体融合液洗下，倾人再生完全 培养基，倒人3 0 4 0 软琼脂，3 0 。c 培养4 6 天。 2 2 4 融合子检出 ( 1 ) 挑取平板上生长的菌落，分别接种于高淀粉含量完全培养基平板上，3 0 培养 4 6 天。 ( 2 ) 计算融合率” 融合率( ) = a b x l 0 0 a ：融合子数； b ：完全培养基平板上再生原生质体数。 2 2 4 i d n a 含量测定 待测菌株接种于完全培养基，振荡培养4 8 小时，离心收集菌体，并计菌体总数。 然后，将菌体至于6 0 干燥至恒重，按0 9 u r “”等的方法提取d n a ，用二苯胺显色“， 分光光度法测定d n a 的单位细胞含量。 2 2 4 2 淀粉水解圈直观比较 按l a l u c e 等人“”的方法加以改进。将所有待比较的菌株分别接种于完全培养基， 振荡培养2 4 小时，培养液经适当稀释后涂布完全培养基平板，培养至形成单菌落，无 菌牙签挑取，点种于高淀粉含量平板，3 0 培养7 2 小时，取出后用碘液浸没，静止放 置1 0 小时以上，倒去碘液，直观比较淀粉水解圈与菌落的大小比例。 2 3 结果与分析 2 3 1 对数生长期的确定 细胞的生理状态是决定原生质体形成率的主要因素，尤其是茵龄，明显影响溶壁酶 类渗入细胞壁及溶壁效果。一般认为对数期酵母细胞的细胞壁中，物质代谢较为活跃， 对酶的敏感性提高，溶壁酶类较易渗入其中，与专一性底物作用进而瓦解细胞壁。文献中 提到，在同样条件下脱壁处理时，处于对数生长早期的细胞较易形成原生质体，而处于 对数生长后期的细胞，原生质体的形成率则较低。 从图1 可以看出a s 2 1 4 1 6 从6 小时开始进入对数生长期，a s 1 8 8 7 从1 2 小时开始 1 2 吉林农业大学硕士学位论文电融合法构建海藻糖高产菌株的研究 进入对数生长期。 预试验的结果可知，在酶的浓度，酶解时间，酶解温度等其他条件相同的情况下， 处于对数生长早期的细胞对酶更加敏感，原生质体形成率和再生率均较高。与文献中所 提到的基本一致。 2 3 2 原生质体制备条件的研究 制备原生质体，必须有效地去除细胞壁。采用机械法破壁及一些非酶法破壁所得到 的原生质体活性低，而酶法破壁的作用条件温和，所制备的原生质体能够保持菌体的生 理状态，因此实际工作中，绝大多数采用酶法破壁。一些文献中提到，用蜗牛酶和纤维 素酶( 从绿色木霉