（食品科学专业论文）草莓乙烯受体Etr1基因克隆及其植物表达载体的构建.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑韭盔些叁堂或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：汪丽 签字日期： d 1 1 年石月乡日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑皇垦盔些盘鲎有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑兰堡壅些盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：；王码 签字日期：卅l1 年6 月；日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 新躲豸侈涉 签字日期：11 年6 月弓日 电话： 邮编： 摘要 草莓是一种经济价值很高的果品，但果实采后极易软化腐烂，不耐贮运，造成很 大的经济损失。乙烯受体e t r l 基因在草莓果实成熟阶段表达较多，可能与果实的成 熟密切相关。深入研究e t r l 基因功能将有助于揭示乙烯受体与非跃变型果实成熟的 关系，从而为采用生物技术手段提高草莓果实的贮运性能奠定基础。为此，本研究以 全明星草莓基因组d n a 为模板，p c r 扩增到了草莓乙烯受体e t r l 基因片段，构建了 该基因的反义和r n a 干扰植物表达载体。主要结果如下： ( 1 ) 根据已发表的c h a n d l a r 草莓乙烯受体e t r l 的保守氨基酸序列，设计了一对 特异性引物，p c r 扩增得到一个长6 1 7 b y 的基因片段，序列分析表明该片段与 g e n b a n k 中c h a n d l a r 草莓e t r l 基因核苷酸序列及所编码的氨基酸序列同源性高达 9 8 ，无内含子序列。说明克隆到的片段是全明星草莓e t r l 基因片段。 ( 2 ) 将克隆到的全明星草莓e t r l 核苷酸序列反向克隆到了p b l 2 2 1 质粒的 x b ai - b a m hi 酶切位点之间，构建成中间表达载体p b l 2 2 1 a n t i - e t r l 。用s m ai 和 h i n d l i i 酶切构建好的中间载体p b l 2 2 1 a n t i - e t r l 和p b l l 2 1 质粒，切下中间载体质粒 上的c a m v3 5 s 启动子和e t r l 的反义序列，将其定向插入到切除c a m v3 5 s 启动子 的p b l l 2 1 质粒中，构建成反义表达载体p b i l 2 1 a n t i e t r l 。 ( 3 ) 将e t r l 的序列正向插入到中间载体p b l 2 2 1 质粒的b a m hi 和s m ai 酶切位 点之间，构建成中间表达载体p b l 2 2 1 s e n s e - e t r l 。用e c o ri 和b a m hi 酶切构建好 的反义表达载体p b l l 2 1 a n t i e t r l 和中间载体p b l 2 2 1 s e n s e - e t r l 。切下中间载体质粒 上的g u s a 、n o s 终止子和正义序列，将其插入到切除了g u s a 和n o s 终止予的 p b i l 2 1 a n t i - e t r l 质粒中，构建成r n a i 植物表达载体p b i l 2 1 胁j r n a i 。 ( 4 ) 利用冻融法将p b l l 2 1 a n t i - e t r l 、p b l l 2 1 出，j r n a i 两个植物表达载体转化 到农杆菌l b a 4 4 0 4 中，经特异性引物对转化菌液的p c r 扩增，证实表达载体已转入 农杆菌。 关键词：草莓；乙烯受体；e t r l 基因；植物表达载体；r n a 干扰 s t r a w b e r r y ( f r a g a r i aa n a n a s s ad u c h ) e t r lg e n ea n di t sp l a n te x p r e s s i o nv e c t o r c o n s t r u c t i o n a u t h o r ：w a n gl i m a j o r ：f o o ds c i e n c e s u p e r v i s o r ：p r o f m aj u n l i a n p m z h a n gz i d e a b s t r a c t c u l t i v a t e ds t r a w b e r r y ( f r a g a r i ax a n a n a s s ad u e h ) i saf r u i tc r o ps p e c i e sw i t hh i 曲 v a l u e s ，b u ti t sf l e s h yf r u i t s ，w h i c ha r eg e t t i n gl e s sf i n nd u r i n gp r o g r e s s i v er i p e n i n g , a r e l i a b l et oap o s t - h a r v e s td e t e r i o r a t i o nt h a ti m p a i r st h e i rp r e s e r v a t i o na n dc a u s e sg r e a t e c o n o m i cl o s s e s f u r t h e rr e s e a r c ho ng e n ef u n c t i o no fe t r lm a yd e m o n s t r a t ear e l a t i o n b e t w e e ne t h y l e n ea n dt h er i p e n i n go fn o n c l i m a c t e r i cf r u i t sa n dp a yt h ew a yf o ri m p r o v i n g s t o r a g ep e r f o r m a n c eo fs t r a w b e r r yf r u i tt h r o u g hb i o l o g i c a lt e c h n i q u e s u s i n gg e n o m i c d n aa st e m p l a t e , ae t rl g e n ef r a g m e n tw a sa m p l i f i e db yp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) f a e t r l g e n ea n t i s e n s ea n dr n a ie x p r e s s i o nv e c t o r sw e r ec o n s t r u c t e d u s i n g a l l - s t a r nv t r o p l a n t l e tl e a f 弱e x p l a n t s ，t h ee f f e c t so fb a s i cm e d i u m ，h o r m o n e s ， p h y s i o l o g i c a ls t a t eo ft h ee x p l a n t s ，s e e d l i n ga g e sa n dd a r k c u l t u r et i m eo ns t r a w b e r r yl e a f r e g e n e r a t i o nw e r es t u d i e dt oo p t i m i z et h er e g e n e r a t i o nc o n d i t i o n s e f f i c i e n tr e g e n e r a t i o n s y s t e mo fa l l s t a rs t r a w b e r r yw a so b t a i n e d u s i n ga l l s t a rs t r a w b e r r yl e a fd i s c s 弱 e x p l a n t s ，g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e mm e d i a t e db ya g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e nw a s e s t a b l i s h e d k a n a m y c i nr e s i s t a n tp l a n t l e t sw e r eo b t a i n e d g u sc h e m i c a ls t a i n i n ga n dp c r d e t e c t i o ns h o w e dt h a te t r l - r n a lg e n ew a st r a n s f o r m e di n t oa l l s t a rs t r a w b e r r yp l a n t l e t s t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 ap a i ro fs p e c i f i cp r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h ep u b l i s h e dc h a n d l a r s t r a w b e r r ye t h y l e n er e c e p t o r se t r lg e n ec o n s e r v a t i v ea m i n oa c i ds e q u e n c e a 6 17b p f r a g m e n tw a sa m p l i f i e d s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h en u c l e o t i d es e q u e n c eo ft h e c l o n e df r a g m e n tw a s9 8 i d e n t i t yw i t hc h a n d l e r - e t r li ng e n b a n k ，a n dn oi n t r o ns e q u e n c e ， w h i c hd e m o n s t r a t e dt h a tt h ef r a g m e n tw a sa l l s t a rs t r a w b e r r ye t r lf r a g m e n t 2 d o u b l ed i g e s t e db yx b aia n db a m hi a 1 1 s t a rs t r a w b e r r y 上| r j n u c l e o t i d e s e q u e n c ew a ss u b c l o n e di n t ox b ai b a m his i t eo fp b l 2 2 1v e c t o ri nr e v e r s eo r i e n t a t i o n w h i c hr e s u l t e di np l a s m i dp b l 2 2 1 - a n t i - e t r l af r a g m e n ti n c l u d i n gc a l 订v3 5 sp r o m o t e r a n de l r la n t i s e n s es e q u e n c ew a sc u tf r o mp b l 2 21 a n t i e l r lv e c t o rb ys m ala n dh i n 蕊 t h ef r a g m e n tw a sd i r e c t i o n a l l yi n s e r t e di n t ot h es a m er e s t r i c t i o ne n z y m e sd i g e s t e dp b il21 p l a s m i d ，w h i c hr e s u l t e di np b l l 2 1 - a n t i - e t r l 3 d o u b l ed i g e s t e db yb a m hia n ds m ai 朋1 s t a rs t r a w b e r r y 上l i ，j n u c l e o t i d e s e q u e n c ew a ss u b c l o n e di n t ob a m hi - s m ais i t eo fp b l 2 21 i ns e n s eo r i e n t a t i o n , w h i c h r e s u l t e di n p l a s m i dp b l 2 21 s e n s e - e t r l t h e p l a s m i dp b i121 a n t i - e t r l a n d p b l 2 21 一s e n s e - e t r l w e r ed o u b l ed i g e s t e db yb a m hia n de c o ri ，r e s p e c t i v e l y 1 1 1 e s e q u e n c ew i t he t r l s e n s ef r a g m e n tw a si n s e r t e di n t ot h ed o u b l ed i g e s t e dp b l l 2 1 a n t i - e t r l v e c t o r , w h i c hr e s u l ti np b i l21 - e t r l r n a ip l a s m i d 4 t h ev e c t o ro fp b l l 2 l - a n t i - e t r la n dp b l l 2 l - e t r l r n a iw a st r a n s f e r r e di n t oa f u m e f e c i e n ss t r u ml b a 4 4 0 4b yt h ef r e e z i n g - t h a wm e t h o d t h et r a n s f o r m a t i o nw a s c o n f i r m e db yp c ra m p l i f i c a t i o nw i t hs p e 虻 i f i cp r i m e r s k e yw o r d s ：s t r a w b e r r y ；e t h y l e n er e c e p t o r ；e t r lg e n e ；r n ai n t e r f e r e n c e ( r n 础) 目录 第一章引言。1 1 草莓果实贮藏保鲜技术的研究进展。 2 乙烯与果实的成熟衰老2 3 乙烯的生物合成。2 4 乙烯信号转导研究进展3 5 与草莓成熟有关的基因研究进展 6 调控果实成熟的基因工程研究5 6 1 反义r n a 技术5 6 2r n a 干扰技术6 7 本研究的目的意义8 第二章草莓乙烯受体e r r ! 基因克隆9 l 材料与试剂9 1 1 植物材料9 1 2 菌株和载体9 1 3 试剂及试剂盒9 1 4 主要仪器9 1 5 主要试剂溶液的配制1o 2 试验方法10 2 1 草莓基因组d n a 的提取1 0 2 2p c r 扩增ll 2 3 目的扩增片段的回收1 2 2 4 目的片段与t 载体连接。1 2 2 5 连接产物的转化l3 2 6 阳性克隆的鉴定1 3 2 7 阳性克隆的序列测定及其同源性分析1 4 3 结果与分析一1 4 3 1 电泳检测p c r 产物1 4 3 2 阳性克隆的菌液p c r 鉴定1 5 3 3 阳性克隆的酶切鉴定。1 5 3 4 阳性克隆的序列测定及同源性分析1 6 第三章草莓乙烯受体e t r ! 基因植物表达载体的构建及农杆菌的转化1 9 l 材料与试剂1 9 2 方法l9 2 1e r r ! 基因反义植物表达载体的构建。1 9 2 2e r r ! 基因r n a 干扰表达载体的构建2 3 2 - 3 构建好的植物表达载体向农杆菌中转化2 7 3 结果与分析2 8 3 1 正义片段与反义片段的p c r 扩增2 8 3 2 反义植物表达载体的构建及检测2 9 3 3r n a i 植物表达载体的构建及检测3 3 3 4 农杆菌中表达载体的遗传稳定性3 8 第四章讨论3 9 l 关于草莓乙烯受体的研究3 9 2 关于草莓e r r ! 基因的克隆。3 9 2 1 引物设计3 9 2 2 温度设置3 9 3 载体构建4 0 3 1 载体的选择4 0 3 2 限制性内切酶的使用4 0 3 3 连接片段的浓度比4 0 3 4r n a i 植物表达载体的构建。4 1 第五章结论4 2 参考文献4 3 在读期间发表的论文5 0 作者简历5 l j 麦谢5 2 缩略词 cd _ n a e d t a e b a m p s p 尉f p t g x - g a l p c r k m b 嘣s r n 加 b p g u s o d p v p - 4 0 缩略词表 英文全称 c o m p l e m e n t a r yd n a e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d e t l l i d i u l l lb r o m i d e a m p i e i l l i n s p c c f i n o m y c i n r i f a m p i c i n i s o p r o p h y t h i o 1 3 d - g l u c u r o n i d a s e 5 - b r o m o l - c h l o r o - 3 - i n d o l y l - d g a l a c t o s i d e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n k a n a m y e i n b e e f - y e a s te x t r a c tm e d i u m t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e r n ai n t e r f e r e n c e b a s cp a i r b - g l u c u r o n i d a s e o p t i c a ld e n s i t y p o l y v i n y lp y r r o l i d o n e - 4 0 中文全称 互补d n a 乙二胺四乙酸 溴化乙锭 氨苄青霉素 壮观霉素 利福平 异丙基硫代1 3 - d 半乳糖苷 5 溴1 氯3 吲哚d 半乳糖苷 聚合酶链式反应 卡那霉素 y e b 培养基 十二烷基硫酸钠 i 心l a 干扰 碱基对 1 3 葡萄糖苷酶 光密度 聚乙烯吡咯烷酮4 0 草莓乙烯受体e t r l 基因克隆及其植物表达载体的构建 第一章引言 草莓( f r a g a r i a 口m 肋豁口d u c h ) 属蔷薇科( r o s a c e a e ) 草莓属( f r a g a r i a ) 多年生草本植物。果实 色泽鲜艳、风味独特，草莓不仅含糖、酸和蛋白质还含有丰富的营养元素，其钙、磷、铁含量也 比较丰富，素有“水果皇后”的美誉。草莓还有消暑解热的功效，并在抗菌、抗肿瘤、抗病毒等 方面也具有一定的效果，深受人们的喜爱。 草莓属世界性水果，其产量在世界小浆果中居首位。我国是世界草莓生产大国，栽培面积、 年总产量均居世界前列。但草莓收获时间集中，采后寿命很短，在常温下仅可保存1 - 2 d ，在收获 和运输过程中极易受损伤和遭受微生物侵染，导致腐烂而失去商品价值，这些严重制约了草莓经 济效益的提高，传统的贮藏保鲜方法很难从根本上解决这一问题。草莓保鲜是生产实践中一个亟 需解决的难题。 乙烯是控制果实成熟的激素，在果实成熟衰老中起重要的作用【。对乙烯生物合成及其信号 传导途径的研究，一直是果实采后生理研究的热点。乙烯受体是乙烯感知和信号转导的初始成分， 也是乙烯生物合成和信号转导途径中的关键因子，决定植物对乙烯的敏感性，控制植物衰老的进 程及对环境刺激的应答1 2 】。草莓乙烯受体目前研究很少，t r a i n n o t t i 等【3 1 从c h a n d l e r 草莓中克隆出 3 个乙烯受体基因，f a e t r l 、f a e t r 2 和f a e r s l 。其中属于类型i 的f a e t r l 基因在果实成熟阶段 大量表达。c a n c e l 和i a r s e n d 认为类型i 受体有一个组氨酸激酶结构域，该结构域可能与c t r i 蛋白有一个微弱的联结。t r a i n n o t t i 等【3 】由此推断即使成熟的草莓产生少量的乙烯，就有可能有效 地启动与成熟相关的一些生理反应。因此，深入研究f a e t r l 基因功能将为培育耐贮性草莓品种 奠定基础。r n a 干扰现象的发现为基因功能的研究提供了新的技术手段。本研究在已报道的 f a e t r l 基因序列p 】的基础上，克隆草莓乙烯受体e m l 基因部分特异序列，构建反义和r n a ie 纠 植物表达载体，通过反义和r n a 干扰技术抑制草莓中乙烯受体基因表达，为进一步研究e t r l 基 因功能，并通过生物技术手段延缓草莓果实的成熟衰老奠定基础。 “全明星”是我国华北地区应用最久的主栽品种。该品种为中晚熟品种，是美国农业部马里 兰州农业试验站以u s 4 4 1 和m d u s 3 1 8 4 杂交选育而成。1 9 8 5 年，河北省满城县从美国将其引入 我国。其植株长势旺盛，分枝力和抗病性强，丰产性能好。果实大，果形整齐，色泽鲜艳。果肉 汁多，酸甜适口，有香味。适合鲜食，也可加工制酱。全明星的综合性状优良，引入我国后栽植 较广。因此，本试验选择的草莓品种是“全明星”。 l 草莓果实贮藏保鲜技术的研究进展 传统的草莓贮藏保鲜方法有氯化钙处理【5 l 、化学防腐保鲜剂处理嘲、热处删6 】、低温 - r j 、气调 1 8 , 9 、臭氧( 0 3 ) 【姗、涂膜保鲜、保鲜袋【1 、高氧处理【1 2 1 、辐照保鲜【k 1 卯、生物保鲜1 锄1 等。常规 贮藏方法如热处理、氯化钙处理等，保鲜剂处理等贮藏期短，而且草莓贮藏过程中固形物含量明 显下降，维生素c 损失严重。化学防腐保鲜剂处理则容易有化学残留，由于环境和健康等因素， 其在果实保鲜领域的应用将逐渐被淘汰。辐照保鲜可以在一定程度上减少v c 损失，但剂量掌握 不当易引起草莓质地和色泽变化1 2 卅，而且大剂量却加速草莓果实组织软化目前，虽然此技术 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 能有效地控制草莓果实病害，但草莓的成熟季节集中，体积比较大，具体操作起来困难。气调处 理需要特殊的设备，且成本高。速冻草莓在较低温度贮藏可最大程度地保持草莓原有品质，延长 贮藏期。但创造较低的贮藏温度将花费很大的代价，所以其应用范围受到了限制1 2 6 j 。生物保鲜剂 的研究解决了环境污染以及残留的问题，但研究还处于起步阶段。目前在生物酶、抗菌肽以及微 生物菌体对草莓进行生物保鲜的研究和应用中还存在一些问题，比如，生物酶的抗菌谱较窄、抗 菌肽以及微生物菌体代谢产物的杀菌抑菌成分稳定性较差等问题，有待进一步研究解决1 1 6 j 。综上 所述，由于传统的贮藏保鲜方法贮藏效果不理想，目前应用于生产的并不多。草莓的贮藏保鲜问 题近年来仍没有得到很好的解决。 2 乙烯与果实的成熟衰老 乙烯( c h 2 = c h 2 ) 是具有生物活性的简单气体分子，是五大类植物激素之一，它是一种内源 性的调节因子，在植物生长发育和许多生理过程中起重要作用，如种子萌发、根毛发育、植物开 花、果实成熟、器官衰老及植物对生物和逆境胁迫的反应，器官脱落和果实成熟等。乙稀对植物 的各种影响都是由控制乙稀生物合成和感受因子所调节的。乙烯是调控果实成熟衰老的关键因 子，在果实成熟过程中起着重要调节作用，因此，有效的控制乙烯的生物合成和感受因子，从而 有效的调控果实的成熟衰老，是解决果蔬贮藏保鲜的关键所在。 乙烯作为成熟激素调控跃变型果实成熟的理论已被人们认可。乙烯参与非跃变型果实成熟的 机制研究很多，但目前没有结果明确表明乙烯和非跃变型果实成熟的关系p 刀j 。草莓等非跃变型 果实也能合成乙烯，在某些情况下乙烯可能参与非跃变型果实的成熟，关于乙烯和草莓成熟之间 的关系，不同的实验得出的数据彼此矛盾，目前并没有明确的结论1 2 引。w i l l 【2 9 1 等人研究得出，在 0 时，0 0 l 肛l l 1 的乙烯会促进草莓果实的软化，缩短贮藏期；随后，他们i 刈又发现，在2 0 时，草莓果实的贮藏期和乙烯浓度间呈线性关系。t u r n 3 l 】等人研究表明，乙烯浓度0 5 1 0 0o l l - 1 之间时，草莓的硬度明显降低。但也有实验表明乙烯对草莓成熟没有影响，s i r i p h a n i c h p 2 j 发现草 莓贮藏在空气中和贮藏在l oi i l l _ 1 或1 0 0p l l 1 的乙烯中质量和颜色没有差异。乙烯感知和信 号转导的初始成分是乙烯受体，乙烯的生理作用最终是通过乙烯受体及其信号转导过程完成的。 t i a n l 3 1 瞎人通过用乙烯和i - m c p 处理草莓，推测草莓可能存在不同于跃变型果实的乙烯受体或 乙烯受体在非跃变型果实中起到的作用不同于跃变型果实。l i v i 0 1 3 1 等克隆出3 个草莓乙烯受体基 因：f a e t r l 、f a e r s l 和f a e t r 2 ，他们认为乙烯可能通过这3 个受体在非跃变型果实草莓的成熟 过程中起重要生理作用。e t r l 是草莓中重要的乙烯受体，在草莓果实成熟的过程中表达量比较丰 富，深入研究e t r l 基因的表达及获得反义及r n a 干扰植物表达载体，对研究乙烯对草莓成熟的 影响、草莓乙烯信号转导及e t r l 在信号转导中的作用模式有着重要的作用。 3 乙烯的生物合成 乙烯是重要的植物激素之一，对植物种子的萌发、叶片衰老和果实成熟等过程都有调节作用， 是控制果实成熟衰老的关键因子，因此，有效的调控乙烯的生物合成及信号转导是控制果实成熟 的关键。 2 草莓乙烯受体e t r l 基因克隆及其植物表达载体的构建 1 9 6 4 年，l i e b e r m a n l 3 3 j 等提出乙烯来源于蛋氨酸。1 9 7 9 年，a d a m s 和y a n 9 1 3 4 】研究发现，a c c 是乙烯生成的直接前体，并确定了乙烯在植物体内生物合成的途径，即：蛋氨酸( m e t ) - + s - - 腺苷蛋氨酸( s a i m ) - - , a c c - - ) 乙烯。在乙烯这一生物合成过程当中，每一步反应都为特定的酶所 催化，包括蛋氨酸腺苷转移酶、a c c 合成酶、a c c 氧化酶、s a m 水解酶、a c c 脱氨酶等。其中 a c c 合成酶和a c c 氧化酶是乙烯合成过程中的两个关键酶。研究乙烯合成过程中的关键酶是一 项很重要的工作。 a c c 是乙烯生物合成的直接前体，植物内a c c 合成酶( a c s ) 催化s a m 到a c c 的反应是 乙烯合成的限速步骤。a c c 合成酶是乙烯生物合成的关键酶，此酶专一的以s a m 为底物、以磷 酸吡哆醛为辅基的酶。a c c 合成酶最早是在番茄果皮组织中发现的1 3 5 ) ，1 9 9 0 年v a nd e r 等1 3 6 】从 番茄果实的c d n a 文库中分离得到了a c c 合成酶基因的第一个c d n a 克隆。目前，已从柿果实 【蚓、康乃掣3 7 1 、土豆【3 研、苹果【3 9 1 、梨删、黄瓜1 4 l j 、桃【4 2 】、香蕉【4 3 1 等多种植物中克隆到不只一 个a c s 基因，所有a c s 编码区都有一定的同源性，d n a 核苷酸序列同源性约为6 0 ，氨基酸 同源性约为4 8 - - + 9 7 。 a c c 氧化酶又称乙烯形成酶( e f e ) ，是乙烯生物合成途径中最后的一个酶，也是乙烯生物 合成过程中的关键酶之一，直接催化a c c 转化为乙烯。a c c 氧化酶是植物中一个固有酶系，该 酶不够成对乙烯途径中的限速步骤，需要抗坏血酸和氧作共底物，f e 2 + 和c 0 2 作辅助因子1 4 4 。目 前，已从柿果实1 4 5 1 、猕猴桃、苹梨4 7 1 、哈密瓜1 4 8 1 、香蕉1 4 9 、康乃馨5 0 5 、桃j 5 2 5 3 】、等中克隆 到了多个具有同源性的a c c 氧化酶基因，a c o 与a c s 一样，也为多基因家族所编码。不同植 物的a c o 基因的同源性比a c s 高，蛋白质水平上它们的同源性都在8 0 以上。 4 乙烯信号转导研究进展 随着人们对乙烯生物合成研究的不断深入，植物体内乙烯的生物合成途径及其调节己基本研 究清楚。而乙烯在植物体内合成以后，乙烯受体是如何感受乙烯，感受到的信号是如何传输到细 胞核内，从而启动与成熟相关基因的表达，进而产生一系列与成熟相关基因的生理反应为弄清这 些问题，从上个世纪9 0 年代初，人们开始了对乙烯受体和信号转导的研究。 许多研究表明，e 豫l 蛋白具有感受乙烯的功能，是乙烯的受体。e t r l 位于影响乙烯信号 转导的其他基因座的上游序列。e t r l 蛋白由e t r l 基因编码，应用图谱克隆技术分离到e t r i 基因，此基因编码二元环境敏感元件，该元件包括两个结构核心为传递元件和接受元件，构成细 菌蛋白交互模型。这两个元件以复杂的组合排列，其中以最简单形式排列的敏感元件监视组氨酸 激酶的活化。1 9 9 3 年，c h a n g 等1 5 4 】利用染色体行走和定位克隆方法第一次从模式植物拟南芥乙 烯反应突变体中分离出乙烯受体蛋白e t r i 基因后，对乙烯受体的研究取得了很大的进展。近年 来人们已从拟南芥中分离克隆了5 个同族的乙烯受体基因e t r i 、e t r 2 、e r s i 、e r s 2 和e i n 4 5 5 】， 番茄中也分离到了e t r i 、e t r 2 、e t r 3 ( 厂) 、e t r 4 、e t r 55 个乙烯受体基因1 5 6 1 ，在甜瓜1 5 7 1 、 马铃薯l 矧、香蕉f 5 9 , 删、荔枝6 1 1 等植物中分离得到了多种乙烯受体的同源基因。转基因试验表明， 改变植物体内乙烯受体基因的表达特性，可以调节植物的生长发育过程。将含有突变序列的e r r - 1 基因转入拟南芥，转基因植株的乙烯结合量减少了8 0 t 6 2 】。将拟南芥e t r - i 基因的序列转入番茄 和矮牵牛中，转基因植株除了表现出对乙烯不敏感外，果实的成熟、花的衰老和脱落也被显著抑 3 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 制f 6 3 1 ，表明乙烯受体及乙烯信号转导有关的基因，在调节植物乙烯作用和延缓果实成熟等方面 具有一定的内在关系。 最近研究发现，植物体中乙烯信号转导途径与酵母中渗透感受信号途径相似。e t r l 蛋白和 s l n l 蛋白分别在乙烯反应和渗透胁迫反应的早期起作用。目前，果实成熟的分子生物学基础及 果实成熟调控基因工程的研究目前主要集中在跃变型果实番茄上，对跃变型果实的成熟机理研究 的已经比较透彻，而非跃变型果实的研究则比较薄弱。草莓为典型的非跃变型果实，对其果实成 熟的分子生物学基础的深入研究，将有助于探明非跃变型果实成熟的机理，从而为利用基因工程 技术解决草莓采后保鲜问题奠定基础。 5 与草莓成熟有关的基因研究进展 “成熟”是草莓重要的生理过程。草莓新鲜果实易软化，且随成熟度增加果实硬度降低。在这 个过程中，硬度的变化、着色、糖分的积累直接影响果实的市场价值。通过了解成熟过程伴随的基 因表达的变化可以更好的了解成熟这一过程，减少采后损失。1 9 5 0 年，n i t s c h e l 6 4 1 阐明绿色果实发 育过程中瘦果对生长素产生有刺激作用。此后，差异表达分析如：差减杂交、差异显示、甚至果实 特异性的基因文库测序都用来对成熟有关的转录物进行鉴别及定性 6 5 - 6 6 1 。尽管这些研究对成熟有关 的转录物进行了鉴定，但这些转录物无一与成熟机制有关。 此后，许多与草莓成熟有关的基因都先后被克隆出来，并研究了其表达特性1 6 7 1 。包括二氢黄 酮醇还原酶i 删( d f r ) 和果胶酶1 6 9 1 、膨胀素及其基因家族【7 0 】、草莓多聚半乳糖醛酸内切酶基因【7 l 】、 编码9 1 , 4 葡聚糖酶f f j 基n - - c e t 7 2 l 及其基因家族成员1 7 2 l ( f a e g l 和f a e g 3 ) 、编码胱硫醚y 合 酶的基因1 7 3 ，编码肉桂( 酰) 基醇脱氢酶和苯乙烯醛基辅酶a 还原酶转录物的相应基因( f x a c a d l ) 7 4 1 等。 草莓是非跃变型果实，其果实成熟软化的生理机制与跃变型果实不同，但相关研究尚无定论。 有报道说多聚半乳糖醛酸酶( p g ) 对草莓果实的成熟软化无明显促进作用，草莓果实的软化可能与 果胶裂解酣7 5 1 和纤维素酶7 b 7 8 1 有关。b e f l i t e z - b u r r a c , 0 1 7 9 1 从“c a n d l a r ”草莓中分离出两种果胶酶基 因p a 和p l b 。s o u t h e r n 杂交显示，邮为单基因编码，p l b 可能为小的多基因家族编码。实时定 量p c r ( q r t - p c r ) 分析表明，这两个基因的时空表达模式与p l c 不同。三种果胶酶( p l a 、p l b 、 p l c ) 都是在果实成熟阶段，在果实中特异性表达的。摘除绿色瘦果可诱导p 明、p l b 表达，但当 应用外源生长素时，p 翻、p l b 表达量降低，p l c 表达量上升。果实采后在高浓度的c t h 条件下进 行气调贮藏，p l d 、p l b 表达量大大降低。免疫定位分析表明果胶酶基因( to 在未成熟果实的花 托薄壁组织中表达，而在成熟果实花托薄壁组织中不表达，说明基因与细胞壁解体和果实软化 有关。s i l v a 等i s o l ( 2 0 0 2 ) 用3 5 s 启动子驱动的果胶酶反义表达载体转化草莓植株。结果表明，反 义转基因植株的果实硬度显著高于对照。选取了六株转基因植株进行进一步的研究发现，成熟转 基因果实中果胶酶基因的表达量比对照降低了3 i p a 。转基因果实在白熟期向红熟期转变的过程中 硬度降低最为缓慢。w o o l l e y 等【引】将反义纤维素酶基因l 转入草莓后，发现转基因果实中该基因 m r n a 积累减少了，但纤维素酶基因2 却大量表达，以致所获得的转基因果实的软化与未转化果 实无明显差异。这说明了引起果实软化的生理生化因素很复杂，可能不只与一个或两个因素有关， 而是几个因素共同作用的结果。 4 草莓乙烯受体e t r i 基因克隆及其植物表达载体的构建 瘦果和生长素在对果实成熟和相应的基因表达有显著影响已为人们所知，但乙烯在草莓成熟 中的作用却知之甚少。尽管草莓是非跃变型果实，但乙烯在绿熟果实中产生量却是很丰富的i 翻。 两种方法试图验证乙烯对成熟有作用的假设。首先是在果实成熟的四个阶段应用乙烯竞争性抑制 剂l - 甲基环丙稀，然后用c d n a a f l p 检测基因表达的差异性。许多转录物包括果胶酶、b - d 葡 聚糖酶及b 半乳糖苷酶在绿色果实而不是其他阶段起作用1 6 7 明。成熟也会影响各种乙烯受体自身 的表达，表明可能存在一种乙烯控制成熟过程的机制。应用p c r 技术三种乙烯受体被克隆出来【3 l 。 它们表达受乙烯诱导，并且在果实成熟过程中，i 岱磁矗玎a n df a e r s r l ) 型受体的含量较多，可能 是乙烯介导的对成熟的影响机制。关于草莓乙烯受体的进一步的研究报道很少，仅朱海生等队明 构建了三种乙烯受体基因的反义植物表达载体。 6 调控果实成熟的基因工程研究 分子生物学的研究表明果实成熟是分化基因表达的结果，果实的成熟受基因调控。因此近年来 有关果实成熟的基因工程调控研究已引起了人们的广泛关注和应用。基因工程手段将外源基因导入 细胞，特别是利用反义r n a 技术阻断或抑制翻译过程或正反义r n a 杂交降解，影响基因的表达。 从而达到调控果实成熟的目的。 通过基因工程的方法控制果实成熟的主要原理就是基因干涉。目前常用的是反义r n a 技术 和r n a j 技术。 6 1 反义r n a 技术 反义r n a 技术是8 0 年代后发展起来的一项新技术，主要是将与目的基因互补的d n a 序列 转入植物体内，使该序列在植物体内转录合成k n a ，k n a 在体内的大量合成与积累，可以阻止 目的基因的表达，从而抑制了由于目的基因的表达而引起的植物成熟衰老过程【硒】。 反义r n a 技术是原核生物中广泛存在的一种调节因子，对转座子活性、质粒复制、细菌或 噬菌体的发育过程起调节作用。受原核生物中天然存在的反义r n a 调节基因表达机理的启示， 研究发现人工构建的反义基因能有效抑制特异基因的表达。一般认为反义r n a 与靶k n a 具有特 异互补性，从而阻止m r n a 转译产生蛋白质，这样即使基因有活性也不会有蛋白质产物，从而 抑制基因的表达1 87 。 反义r n a 的作用特点，第一是作用区域的特异性，m r n a 区域特异性的差异可能与其存在 的