（食品科学专业论文）超临界COlt2gt萃取银杏黄酮类物质工艺的研究.pdf

超临界c 0 2 萃取银杏黄酮类物质工艺的研究 食品科学专业 研究生何扩指导老师李玉峰 银杏黄酮类活性成分是天然药物研究的重点，文献中报道的银杏黄酮提取 的方法很多，大致可分为两类：类是用有机溶剂进行萃取，主要是用于制备银 杏叶粗提物：另一类方法是在前一类方法的基础上进行精加工，采用树脂法、色 谱法或酶法制取精提物。这些方法或多或少存在着一些不足之处，如回收率低， 产品得率不高：使用了乙醇以外的丁酮、甲醇、氯仿等有害有毒溶剂等，产品 中无法避免这些物质的残留；特别是最终精制品的质量不够稳定，银杏叶中的 有毒物质银杏酚类没有得到有效控制，个别样品的含量竞高达1 7 0 c ! 鸩g 以上。 超临界是近来发现的一项新技术，在食品，医药，化工方面都有一定的应用。 应用在食品方面主要有：酒花及咖啡因，香精，色素以及脂类物质等，由于其 分离效果好，速度快，操作简便，纯度高，无毒，被誉为绿色提取方法。 本文研究的主要内容为：( 1 ) 液体进料超临界萃取银杏黄酮，液体进料是 将传统的乙醇提取与先进的超临界萃取相结合，用乙醇提取银杏黄酮的粗产 品，再用液体进料进行超i 【每界萃取，是本试验研究的重点，通过单因素和正交 试验方法确定最佳工艺。( 2 ) 固体进料超临界萃取银杏黄酮，固体进料法是将 银杏烘干直接萃取，通过单因素和正交试验方法确定最佳工艺。( 3 ) 传统的乙 醇水溶液提取法，在提取过程中考虑乙醇浓度、固液比、温度、时问对实验结 果的影响，最后通过正交试验确定最佳工艺。 理论分析和实验结果表明： ( j ) 超i 临界c 0 2 液体进料萃取银杏黄酮，在较低的压力条下，基本实现了 银杏黄酮与鞣质、原花色素等大分子物质以及脂小分子物质的分离。萃取压力、 萃取温度、萃取时间、c 0 2 流量对黄酮提取率和纯度都有影响，最佳工艺， 为压力3 0 m p a 、温度为3 0 、时间为4 0 m i n 、c 0 2 流量为2 4 l m 在上述条件 下重复做实验三次，得出提取率为3 2 7 ，纯度为6 4 7 。 ( i i ) 超临界固体进料法整过实验过程所需不仅压强大，而且提取率很低。 在j 下交试验知道本实验的萃取的最佳工艺，粒度为1 0 0 目、温度为4 5 、时间 为1 2 0 m i n 、c 0 2 流量为1 8 l 小，在上述条件下重复实验三次，得出提取率为 o 0 6 9 ，纯度为5 3 7 。 ( i i i ) 乙醇一水溶液提取银杏黄酮，提取温度、提取时间、固液比、乙醇 浓度对总黄酮含量都有影响，提取的最佳工艺为温度为6 0 、固液比为1 ：2 5 、 乙醇浓度5 0 、时间3 h ，在上述条件下重复实验三次，得出提取率为3 5 1 ， 纯度为7 8 。 关键词：超临界c o ：萃取；银杏叶：黄酮类化合物；鉴定 s t u d i e so e x t 均c t i o ng i n l e g on a v o n o i d sp m 。略so f 锄p e r c d t i lc 0 2 m 司o r ：f b o ds c i e n g r a d u a t eh e k u o a d vis o rl iy u f e n g a b s t l l c t 1 h ea c l i v e i n 掣e d i e n t so fn a t u r a lp m d u c t s a r ei i l l p o r t 如tr a wm a t 喇a l si n p h a m a c e u t i c a li n d u s t i y ，m c 舀n k g of l a v o n o i d sa r ce s p e d a l l yt h er c s e a r c hf o c u si n t h es t u d yo fc h i n e s e 仃a d i t i o n a lm e d i c i n e t h es 印a r a t i n gm e t h o d so fg i i i l c g o n a v o n o j d sa p p e a r e dm a n yt i m e si i id o c t l m e n t s i ti n d u d e st 、0 姑n d s ，o n ei ss o i v e n t d i g e s t i o n ， t h j sm e t h o d a p p l i e s t o m a k 洫gp r i m a r yp m d u d ， c h eo t l l e ri s d e e p p r o c e s s i n gu s i n gc o l o p h o n y c h r o m a t o g r a p h ya n de m 可m e a l l m c s em e m o d s h a v es h o r t c o m i n g s ，s u c ha si a wy i e i da 1 1 dr e c o v e 阱t h ep m d u c tc a n ta v o i dr e l n a i n d e r d u et ou s i n gb u t a n o n e 1 c t h a i l o la i l dc h l o 叫b r n l ，e s p c c i a l l yi n s t a b i l j t y p o i s 彻o u s g i n k g o i ca c j di s n o te f f 色c t i v e l yc o n t r o l e d c o n t e n to fi tr e a c h e d1 7 0 叩g 喜i ns o m e s a r n p l e r s ，s f ei s an e wt e c h n i q u e i ti sa p p l i e dt of o o d ，m e d i c i n ea n dc h e m i c a l e n g i n e e m g i n df i e l d ，i ti i l c l u d e sh o p ，c a f f e i n e ，e s s e n c ea n dp i g m e n t s f eh 腿 b e e nc a l l e dg r e e ne x t r a c t i o n b e c a u s ei ti m p o s e s9 0 0 ds e p a m t i o n ，f a s tr a t i o ，e a s y o p e r a t i o n h i g hp u r i t ya n dn op o i s o n 1 i lt h i sp a p e r f i r s t ，s c fc x t r a c l i o nw i t hl i q u j dw a ss t u d i e d ，t l l i sm e m o dc o l b i n e d s f ee x t r a c t i o nw i t he t h a n o le x t r a c t i o n nw a st t l ek e y s t o n eo ft h ep a p e r w ef o u n d o p t i m u mt e c h n o l o g yb ys i i l g l ef a c t o r 卸do n h 0 9 0 n a lc x p 丽m e n t s e c o n d ，w e s t l l d i e d s c fe x t m c t i o nw i t hs o l i d ，t h i sm e t i l o dc a _ t r i e do nd i r e de x t r a c t j o n ，w ea l s og o t o p t i m u mt e c l l i l o l o g yo ft h i sm e t h o d t h i r d ，w es t u d i e dm e t h o do fe t h a r i o lc x t m c i j o n w ec o n s i d e rp r o p o r t i o no fm a t e r i a la i l dl i q u i d ，e x t r a c i i o nt i m e ，t e m p e r a t u r ea n d e t h a l l o lc o n c e n t r a t i o n a tl a s 匕w eg o t 叩t 油u mt e c i l i l o l o g y n i et h e o r e t i c a l 孤a i y s e sa i l de x p e r i r n e n t a h e s u i t ss 1 0 w e dt h a t ： ( i ) c 0 2s c f w i t hl i q u i de x 订a c t e d 舀1 1 l 【9 0f l a v o n o i d s ht l l ec d n d i i j o n0 fl a wp r c s s u r e ， t h ef a c t o r so fp r e s s u r c ，t i m e ，t e m p e r a t u r ea l la 氐d e di t f 1 a v o n o i d sw e r cs e p a r a t e d f m mt h es t f o n gp o l a r i t ys u b s t a l l c ei n d u d i n gp r o a n t h o c y a i l i d j na n dt a l l n 沁s ，a i i dt h e l o wm o 】e c u i a rl j p j ds o l u b i es u b s t a n c e t h eo p i m u mt e c h n o l o g yo fe x n a c t j o nr a 把 w a s3 0 m p a ，4 5 ，4 0 m i n ，2 4 l nb yo m l o g o n a le x p e r i m e n c ，b u l t h cp u r j t yw a s 3 0 m p a ，3 0 ，4 0 m j n ，2 4 i 抽，s os y n t h e s i st h e m ，p r e s s u r cw a s3 0 m p a t e m p e i a t u r e w a s3 0 ，t i m ew a s4 0 m i n ，c 0 2n o ww a s2 4 l 巾mt l l i sc o n d i t i o n w ed i d e x p e r j m e mt h r e et i m e s t h ee x t r a d i o nr a t er c s u l tw a s3 2 7 ，t h ep u r i t yw a s6 4 7 t h ea n o v as h o w e dp r c s s u r ca f f e d e d e v j d e n l 】y ( j i ) c 0 2s c f w i t hl i q u j dw i t 】1s o l i dn e e d e dh i g hp r e s s u r e ，t h ee x t r a c t i o nr a t ew a sl c l w t h eo p t j m u mt e c h n o l o g yo fc x t m c t i o nr a t ew a s1 0 0i t e m ，3 5 ，6 0 l n i n ，1 8 l hb y o n h o g o n a le x p e r i m c n t ，b u tt h ep u r i t yw a s1 0 0i t e m ，4 5 ，1 2 0 m i n ，1 8 l m s o s y n t h e s i st h e m ，m a t e r i a ls i z ew a s1 0 0i t e m ，t e m p e r a t u r ew a s4 5 ，t i m ew a s1 2 0 m j n ， c 0 2n o ww a s1 8 i 抽i nt h i sc o n d i t i o n w ed i de x p e r i m e n it l l r e et i m e s t l l ee x t r a c t i o n r a t er c s u nw a so 0 6 9 ，t 1 1 ep u r i t yw a s5 3 7 ( i j i ) s o l v e n to fe t h a n o l 柚dw a t c rc x t r a c t 百i l l ( g of l a v o n o j d s ，t e m p e r a t u r c ，咖n e ， e t h a n o ic o n c e n 仃a t i o n ，a n d 脚叫i o no fm a t e r i a la n dj i q u i da j la f f b d e dr e s u i t ，t h e o p t i m u mt e c h n o l o g yo fe x t r a c t i o nr a t ew a s8 0 ，p m p o r t i o no fm a t e r i a l 卸dl i q u i d 1 ：2 0 ，e t h a n o lc o n n t r a t i o n5 0 ，t i m e3 hb yo r u l 0 9 0 1 1 a lc x p 酣m e n t ，b u tm ep u r i t y 啪s6 0 ，p 婶o n j o no fm a 把订a la n d j i q u j d1 ：2 5 ，e 岫玎0 】n 鲫t a 石衄5 0 ，t j m e3 h ， s os y n t h e s i s e dt h e m ，p r o p o r t i o n0 fm a t e r i a la i l dl i q u i dw a sl ：2 5 t e m p e 魁【u r ew a s 6 0 ，“m ew a s3 h ，e t l l a n o lc 0 刀c e n t r a a o nw a s5 0 i nt 1 1 j sc o n d i f i o n w ed i d e x p e f i m e n tt h r e et i m e s t h ee x t m d i o nr a t ef e s u l tw a s3 5 1 ，t h ep u r i t yw a s7 8 k e yw o r d s ：s u p c r c r j l j c a lc 0 2 e x t f a c t i o ng i n k 9 0l e a f f l a v o n o j d si d e n i i 位a t i o n 西华大学硕士学位论文 1 引言 银杏叶随处可见。银杏叶中含有丰富的黄酮、维生素、芦丁、槲皮素、胆碱、 三萜类化合物、多种氨基酸及铁、锌、钙等对人体健康有益的非药性营养成分。 银杏叶的应用，早载入本草纲目等祖国医药典籍。银杏叶有清热、润肺、止 渴作用。用于治疗冠心病、心绞痛等。 银杏叶主要药用成分为黄酮类化合物。目前，已发现的黄酮化合物有芦丁 ( r u t i n ) 、黄芪( a s t r a 西i n ) 、异槲皮素( i s o q u e 础r i n ) 、山萘酚( 勋槲皮素、金丝桃甙、 杨梅树皮甙1 等。银杏叶中黄酮的成分主要以甙类形式存在，提取时多采用水、甲 醇、乙醇溶液作溶剂，黄酮类化合物在许多植物中分布广泛，具有多种生物活性 和药理作用。如：抑菌消炎、抗病毒、抗肿瘤、抗癌、治疗心血管疾病，特别是 有关它的抗氧化效应的研究，不时见之于文献。黄酮类化合物可以直接从食物中 获得如：大豆、橙等，也可以从富含黄酮类化合物的植物中提取，作为食品添 加剂制成各种保健食品。银杏黄酮具有降血压功能及促进植物生长作用，是具有 实用价值的作物、瓜果增产剂和很有前途的天然降血压药。 由于新药开发存在环保和耗资巨大，且合成药副作用较严重，从天然资源中 寻找新药已越来越受到各国医药科学工作者的重视，特别是传统药物，从天然药 物和传统药物中寻找有效成分，是当前新药研究开发的一个很重要的方向，对化 学工作者来说，如何经济、有效地将这些有效成分，尤其是那些微量成分，从天 然产物中提取分离和富集是天然药物研究过程中的主要问题。 本课题利用超临界绿色提取法萃取银杏黄酮，先用乙醇一水溶液法对银杏叶进 行粗提，确定乙醇一水溶液法浸提的最佳工艺。将用乙醇水溶液法粗提的物质再 用超i 临界进行精提，通过单因素和正交试验确定了超临界萃取银杏叶中黄酾类化 合物的最佳工艺条件，基本实现了银杏黄酮与鞣质、原花色素等大分子强极性物 质以及脂溶性小分子物质的分离，且产品无溶剂残留。 西华大学硕士学位论文 2 综述 银杏树，又名白果树，俗称“活化石”。是我国特有的珍稀树种。银杏树浑身 是宝，经济价值很高。其果仁、干叶、木材可多层次地开发利用。尤其是银杏叶、 果的独特的药用功能在当前国内国际市场上已产生着重大的影响。银杏叶所提取 的黄酮、内酯、长醇是治疗中老年人心脑血管疾病、老年性痴呆症、脑功能不全、 精神障碍、泡忆功能衰退、冠心病、高血压、高血脂、心绞痛等症药品的主要元 素，又是延长心脑血管机能衰退，抗衰老、皮肤抗皱等保健用品的主要元素。银 杏仁( 即白果) 的营养成份也极为丰富，含有人体所需要的多种元素，是一种极 为高档的食品。2 0 世纪，科学家和医学家们经过多年的努力，终于发现了银杏对 人类健康的巨大潜在价值l “。 2 1 银杏叶的化学成分研究 2 1 1 黄酮类化合物 银杏叶中的主要有效成分是黄酮类化合物。目前，已发现的黄酮类化合物有 芦丁、黄芪甙t r a g l i n ) 、异槲皮素( i s o q u e r c i t r 哟、山萘酚3 o b 一葡萄糖甙 ( k a e m f e t 0 i - 3 一o b d 一舀u o 叩y r a n o s i d e ) 、山萘酚( k a e m f e f 0 1 ) a - 槲皮素( q u e r c e l i n ) 、山 萘酚3 - o - 8 一l 鼠李糖甙( k a e m p f e t o l 3 一o 一工，r h a m n o p y r a n o s i d e ) ，山萘酚3 b d - 木糖甙 ( k a e m p f c r o l 3 - b d x y l o p y r a m o s i d e ) 山萘酚3 0 - a l 阿拉伯糖甙 ( k a e m p f c r o l 3 - o - a - o a m b n o p y r a n o s i d e ) ，槲皮素3 - 0 掣o 一( 3 4 5 - 三羟基苯甲酰) 】一 葡萄糖苷( q u e r o e t i n 3 0 一( 2 一o g a l l o y l ) 一b d 翻u c o p y r a n o s i d e ) ，金丝桃苷( 槲皮素3 半 乳糖苷1 、杨梅树皮苷等【3 l o 2 1 2 三萜粪化合物 银杏叶中含有多种三萜类化合物。如：桦木酸( b e t u l i c a c i d ) 、齐墩果酸 ( o l e a i l o l i c ) 、乌苏酸( u r s o j i c a c i d ) 、熊果试( u v a s 0 1 ) 等【4 5 引。 2 西华大学硕士学位论文 2 1 3 酚类 这类成分在白果中含量较高，有白果酸( g i n k 舯l i c ) 、氢化白果酸 ( h y d r 吲l l l ( g o ca d d ) 、氢化白果亚酸( 舀n k 9 0 i l j ca c i d ) 、白果酚( g i i l k g o 】) 、白 果二酚( b j l o b 0 1 ) 、还有漆树酸( a 1 1 a c a r d i ca c i d ) 1 3 1 。 2 1 4 醇类 从银杏中分离出聚异戊烯醇混合物，暂名银杏a ，a 己烯醇( a - h c x c n d ) 、红杉 醇( s e q u o y i t 0 1 ) 、蒎立醇( p i n i i e ) 、二十六醇1 ( h e x a c o s a l l o l 一1 ) 、白果醇( 百n n 0 1 ) n 2 1 5 有机酸类 银杏中含有奎宁酸( q u i i l i ca d d ) ，亚油酸( 1 i n o k i ca c i d ) 、莽草酸( s h i k i m i c a d d ) 、抗坏血酸( a s o r b i ca c i d ) 。外种皮含有甲酸( f o m i ca c i d ) ，丙酸( p r o p i 0 i l i c a c i d ) 、丁酸( b u t y r i ca d d ) 、辛酸( c 印r y l i ea c i d ) i 1 。 2 1 6 其它成分 银杏中含有一种生物碱，暂名银杏b ，为喹啉衍生物。含一种木酯素，为芝 麻素( d s e s 锄i ca c i d ) 。内有白果酮。此外，白果种子含少量氰甙( c y 卸叩h o r i o 9 1 u s j d e ) ，赤霉素( g i b b e r e m n ) 和动力精样( c ”0 k i n i nl i k e ) 物质。内胚乳中还 分离出两种核糖核酸酶。外种皮有天门冬素，除此以外还含有1 6 中氨基酸和微量 元素1 1 0 翔，其种类和含量见表2 1 。 西华大学硕士学位论文 表2 1 银杏叶中氨基酸、微量元素的种类和含量 n b j e 2 1 t h e k i n d s 卸dq u a n l i i y o f a m i l l oa c i da l l d m i c r d e l e m e n t 加g i l l k 9 0 2 2 黄酮类化合物的性质 黄酮类化合物( n a v o n o i d s ) 以前主要指2 苯基色原酮为基核的化合物，目前已 扩展为具有2 个芳环，通过3 个碳键结合的化合物，即c 6 - c 3 c 6 骨架的化合物。 根据中央三碳链的氧化程度、b 环连接位置( 2 或3 位) 以及三碳链是否构成环 状等特点，可将重要的天然黄酮类化合物分为1 4 t 1 5 t 1 6 1 西华大学硕士学位论文 埘瓢( n a v o n c s ) o 、黄酮醇( n a v o n o i ) 6 = 氯赞酮( n a v a n o n e s )鼬 r 气r 。、“) 氧黄酮醇c n a v a n o l l 0 1 ) 弋。o 浮。、 花：鱼豢。，。i。i。，：!：i：!i：【：=、 舻 l 异黄剩 o 、 ：电4 查耳酮 “ g 等i i m 。 天然的黄酮类化合物几乎在a ，b 环上均有取代基，一般是羟基、甲氧基和异戊烯 基等。植物体中，黄酮类化合物因其所在组织不同，其存在状态也不尽相同。在 木质部中，多以苷元形式存在：而在花、叶、果实等器官中，多以糖苷形式存在。 除0 糖试外，尚有c - 糖苷。此外，还有一些特殊类型的黄酮类物质，如：水飞蓟 素( s i l y b i n ) 属木脂体黄酮、榕碱咂c i n e ) 及异榕碱( i s o f i d n e ) 则为生物碱型黄酮等。黄 酮类化合物具有以下性质： ( 1 ) 黄酮类化合物多为晶形固体，少数( 女黄酮苷类) 为无定形粉末，有较高 的熔点，分子结构中，大多带有酚性羟基，因此具有酚类化合物的通性。另外， 分子中还常带有毗酮环或碳基，构成了生色团的基本结构，根据羟基的数目，结 合的位置与交叉共扼体系，构成了黄酮类化合物的呈色。一般来说，黄酮及黄酮 醇和其苷类多呈灰黄到黄色。 ( 2 ) 黄酮类化合物的溶解度，因结构及存在状态( 苷或苷元，单糖苷，双糖苷 或三糖苷1 不同而有很大差异。一般游离苷元难溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸 乙酯等有机溶剂及稀碱液中：而黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等极性溶剂， 难溶于或不溶于苯、氯仿等有机溶剂。 ( 3 ) 黄酮类化合物多具有强的荧光，在紫外灯照射下呈亮黄、黄绿、亮蓝暗 5 西华大学硕士学位论文 棕等颜色。 ( 4 ) 黄酮类化合物对盐酸镁粉或汞齐呈鲜红、紫色或黄色反应。结构中带有 3 o h 。5 o h 或邻位羟基者，均能与金属盐类试剂，如：铝盐、镁盐、镁盐和铁盐 等形成颜色较深的络合物。 天然黄酮类化合物多以苷类形式存在，并且，由于糖的种类、数量、联接位 置及联接方式不同，可以组成各种各样的黄酮苷类。 2 3 黄酮类化合物的药理作用 黄酮类化合物是药用植物中主要活性成分之一，具有消除氧自由基、抗氧化、 抗过敏、抗炎、抗菌、抗突变、抗辐射、抗肿瘤、抗病毒、抗自由基氧化和抑制 酪氨酸酶活性的功能；还具有降血压、降血脂、降而糖、降胆固醇、降低血液粘 稠度等功能：保护心脑血管系统、养胃护脾、利肝、利胆、利肾和调节内分泌功能 以及杀虫等广谱的生理活性1 1 51 6 “棚】。 2 3 1 改善血流量，增加脑供血 随着年龄的增长及用脑过度，人体中含氧的血液通过大脑中细小的毛细血管 的能力逐渐下降，这种情况被称为脑供血不足。据统计，约8 0 以上的人存在不 同程度的脑供血不足l n 】。银杏叶能够显著改善脑供血不足的症状，因为银杏叶能 通过扩张血管和降低血液粘稠及组织血小板沉积来改善血液循环。增加大脑血养 供给、激活脑细胞，对组织增加氧气的供应。银杏叶提取物又是强力自由基清除 剂和代谢增强剂，能够阻止有害游离基对大脑细胞的氧化，促进脑细胞代谢，从 而显著增强大脑功能，延缓大脑老化1 1 3 】。 所以，从中年丌始每天服用4 0 一8 0 毫克的银杏叶产品，有助于在年老时保持大脑 功能的健全【1 0 1 。 2 3 2 调节血脂、改善血稠；抗心血管疾病 大多数中年人常常受到高血脂、血稠的困扰。银杏叶有助干血液的稀释，抑 制血栓形成，改善血液循环，而且几乎没有任何副作用。同时，银杏叶可以降低 西华大学硕士学位论文 血清胆固醇及甘油三酯，并提高高密度脂蛋白含量，从而改善血脂，防止动脉硬 化有效减少心脑血管疾病的发生1 4 9 】。 目前欧美各大医院中，银杏叶制剂被普遍使用，使患者血管末梢的血液畅通， 血液循环改善。银杏叶制品可以促使脑动脉或末梢的血管强壮，使硬化血管恢复 弹性，扩张变窄的血管：促使血管的直径正常，甚至可以降低血液中的胆固醇水 平同时也是血管调节剂，抗血管栓塞剂，抗心血管疾病，还对高血压患者有降 压作用1 5 05 ”。 2 3 3 抗衰老，消除人体自由基 银杏叶内酯具有神经保护和抗神经末梢衰老的作用。同时，银杏叶中的萜类 和黄酮类成分可抗细胞过氧化、抗细胞坏死、清除自由基，所以银杏叶能起到抗 衰老作用；银杏叶提取物可促进微血管循环，改善皮肤血液循环，促进和刺激毛 发生长及皮肤护理俱有美容及延缓衰老的功效。 研究发现，银杏叶中萜类和双黄酮，可有效防止细胞质过氧化，抗细胞坏死 和清除自由基。银杏叶是一种强抗氧化剂，可以减缓自由基的合成( 有人认为自 由基是造成早衰、癌症和其他疾病的原因) 【5 2 5 引。 2 3 4 改善记忆，激活思考力 中年以上人的思考力与集中力减弱。这是因为管理该功能的脑细胞萎缩、细 胞老化增加所致。黄酮可通过降低血黏度，改善血液循环，增加脑血流量，改善 脑供氧，促进脑循环，直接保护神经组织。提高脑耐缺氧能力和对局部缺血的脑 组织具有保护作用，回而被称作“认识激活剂，或“认识增强剂”阻】。 2 3 5 消除手脚麻木 造成手脚麻木最多的原因是动脉硬化、或者硬化现象引起的血液循环不良。 在国外各大医院中，经常利用银杏叶制剂来冶疗因动脉硬化所引起的各种病症。 它能扩张血管，使血液循环恢复难常因而能改善中年以后手脚麻木现象陋5 6 5 训。 西华大学硕士学位论文 2 3 6 调节血压 银杏叶制剂中含有黄酮醇，可强化动脉、静脉与毛细血管，也可以强化末梢 血管的抵抗能力。消除淤血，防止内脏各种障碍，促使血管功能正常，这些效果 除了由多次的动物实验证实外，从各大医院的临床实验也能证明，银杏叶铺剂对 高血压的患者是非常合适的p 8 5 9 删。 2 4 银杏黄酮的开发现状 自本世纪6 0 年代以来，西德、法国、瑞典等北欧学者对银杏叶的化学成份、 药理及临床应用进行了大量的研究，发现其提取物制剂能改善细胞血液循环，活 化细胞代谢，因而对老年痴呆症、脑损伤后遗症、脑血栓及心血管方面的疾病疗 效显著：同时因能抑制亚硝酸等致痛物而有良好的抗癌作用；近年来的研究还表 明银杏叶提取物中的苦内酯能阻断血小板激活因子的活性。医师们试用其治疗 哮喘和变态反应己获得了令人鼓舞的结果。由银杏叶提取物( e g b ) 生产的制荆在 欧洲白投放市场以来，一直大量欢迎，其制造商们也因此大获其利。西德( a c h w a b e ) 公司生产的银杏叶制剂( 包括针剂、片剂、液剂及口服液) 年销售额达6 0 0 万美元， 法国天然合成制剂公司仅银杏液剂一项年销售额就达6 0 0 0 万美元，日本每年向 欧洲出售数百吨的银杏叶生药。美国、加拿大、墨西哥、西班牙、瑞典等国也有 银杏叶制剂出售。全世界每年该制剂的销售总额约5 亿美元l 洲。 国内起步虽晚，进展快且成果喜人。具体表现在3 个方面，一是银杏叶新药 品陆续上市；二是g b e 干浸膏达到国际同类标准指标：三是银杏叶保健食品、 化妆品不断出现。银杏叶制剂舒血宁、冠心酮、天保宁、银可络片，斯泰隆等产 品。有片剂，口服液，胶囊。银杏叶浸膏( g b e ) 达到国际同类技术指标并大量出 口。过去几年，我国只能廉价出售银杏叶，而1 9 9 2 年后全国有十多个生产厂家 向国内外销售g b e ，1 9 9 3 年销往韩国、同本、澳大利亚、新加坡，获益2 0 多万 元。上海天工植物提炼厂与江苏植物研究所共同研制银杏叶中同体，销往瑞典5 0 0 美元k g 。湖北安陆药厂每年加工银杏叶1 0 吨，每吨提取黄酮l o 公斤，仅此一 项创1 2 0 0 多万元。银杏叶保健口服液、啤酒、饮料、毛发营养剂等保健食品、 化妆品丌发较热，银杏保健食品厂江苏有2 4 家，仅泰兴就有1 8 家。开发银杏叶 药品具有重要现实意义，前景广阔【8 l 】。 r 西华大学硕士学位论文 2 5 酮类物质检测方法研究现状 目前，有关银杏叶黄酮类化合物的测定国内外没有公开普遍的控制质量标 准，常用络合分光光度法、气相色谱法、h p l c _ u v 法、薄层扫描法、库仑滴定 法、毛细管电泳法等。 络合分光光度法国内使用较多的是“络合分光光度法”。黄酮母核在n i b _ 0 2 的碱性溶液中，与a 1 ( n 0 3 ) 3 络合后产生黄色络合物，以芦丁为标准溶液。在 u v 5 1 0 i l m 处作紫外分光光度法的比色测赳7 0 l 。雷天乾等对分光光度法和高效液 相色谱测银杏叶提取物总黄酮含量的测定方法，作了比较分光光度法的结果较 h p l c 偏高，如果乘以校正因子o 7 8 ，结果与h p l c 接近1 7 l 】。此法的测试设备价 廉，操作简便易学，但因样品组分复杂，受杂质干扰，定量测定误差较大。 h p l c u v 法h p l c 是测定银杏叶及制剂中黄酮类化合物的有效方法，多采 用反相c 1 8 柱，梯度洗脱，紫外检测。秦燕等采用梯度洗脱，流动相l o m m o l ，l 的磷酸盐缓冲液( ( p h = 2 眵甲醇( 5 0 ：5 0 ) ，紫外检测波长：3 6 0 n m 。外标法定量，建 立了h p l c 测定银杏提取物中三种黄酮类化合物的优化方法1 7 “。佳红等用 s f e h p l c 测定银杏粗体物中黄酮的含量，流动相甲醇一0 4 的磷酸( 6 0 ：4 0 ) ，流速 1 m l m i n ，检测波长：2 6 6 n m 【7 3 l 。方子季等建立了高效液相色谱内标法测定银杏总 黄酮的含量，以水杨酸为内标物甲醇0 4 磷酸( 1 ：1 ) 为流动相，于2 5 4 n m 出测 定银杏叶制品中总黄酮含量i 。 薄层扫描法李俊等利用苷元与苷的极性不同，采用高效硅胶薄层板二次展开 法，扫描测定5 种黄酮成分。将精制样品液点样于薄层板上，薄层板在层析缸内 用展丌剂：石油醚( b p 6 0 - 9 0 ) 乙醚一甲酸一醋酸乙酯( 6 0 ：3 0 ：6 ：4 ) 的上层饱和5 m i n ， 分离槲皮素、山萘素和异鼠李素，当样品都分离得较好时，取出薄层板，挥于溶 剂，扫描测定斛皮素、山奈素和异鼠李素的含量。以展开剂：氯仿一甲醇水( 6 ：4 ：2 ) 的下层乙酸( 1 5 ：1 1 对同一薄层板进行展开分离槲皮苷、异鼠李苷，挥干溶剂，扫 描测定槲皮苷、异鼠李苷的含量【吲。李吉来等用硅胶g 薄层板点样精制样品，以 氯仿一苯一无水乙醇一冰乙酸水( 5 5 ：2 ：1 ：0 5 ：1 ) 4 1 0 放置的下层溶液为展开剂，上行 展丌后，晾干，薄层扫描法测定异鼠李素、山奈素和斛皮素三种黄酮1 7 6 j ) 。 库仑滴定法胡卫兵等探讨了库仑滴定法测定银杏叶中总黄酮含量的条件。银 含叶经乙醇回流提取，聚酞胺柱分离纯化，以2 m 0 1 仰c 1 - h n o l i k b r 一无水e t o h q 西华大学硕士学位论文 ( v ( h c l ) ：v ( k b r ) ：v ( e t 0 h ) = 3 ：3 ：2 ) 混合液为电解液，死停法确定滴定终点，以芦丁为 对照品，计算出银杏黄酮的含量阳。 毛细管电泳法毛细管电泳以高效、快速、用样量少、耗溶剂少重现性好、不 易污染等优点，近几年用于分析天然产物得到较大的发展。毛细管电泳的原理是 在缓冲体系中引入表面活性剂，利用溶质在水相和胶束相中的分配差异进行分 离。p j t t a p 对毛细管电泳( c e ) 和h p l c 这两种方法分析银杏黄酮做了比较，作 者认为用梯度洗脱的h p l c 不但不简单反而速度馒【7 8 】。y u n h a n c a o 建立了快速高 效商灵敏度相对简单的毛细管电泳一电极法测定银杏黄酮的方法，采用+ 3 0 k v 做 电压，7 0 c m 长2 5 内径的熔融石英毛细管，在毛细管的出口处装有一个直径为 3 0 0 碳盘工作电极，含有三电极( 碳盘工作电极铂辅助电极饱和汞参比电极) 的 单元与b a s l c 4 c 电流测定仪相连，通过记录图形完成电色层分析，在最佳条件 下分离了儿茶索芦丁芹黄素槲皮黄酮等银杏叶黄酮类化合物| 7 ”。 根据以上分析以及本实验室的具体条件，作者选择了紫外分光光度法作为银 杏黄酮的分析检测手段。 2 6 黄酮类物质提取分离的研究现状 2 6 1 水蒸气蒸馏法 将银杏叶干燥、粉碎后，水蒸气减压浸提，提取液冷却后浓缩，过滤，滤液 用大孔树脂吸附精制，然后用乙醇洗脱、蒸干，即得银杏叶提取物。该方法设备 简单，成本低，且符合环保要求，但由于目前水提法提取率低，杂质含量高，后 处理工艺难度大，因此应用的较少【吲。 2 6 2 有机溶剂提取法 这是目前国内外使用最广泛的方法，该提取工艺的专利也较多，可归纳为两 大步骤：第一步制备银杏叶粗提物。银杏叶干燥粉碎后用有机溶剂浸泡、萃取、 过滤，再减压蒸馏除去滤液中的有机溶剂，即得银杏叶浸膏粗提物( 黄酮类含量约 7 1 0 ，萜类内酯约为o 6 一1 0 1 。第二步，在粗提物基础上进一步精制。常 用的方法有液一液萃取、沉淀法f n h o h 或p b ( a c ) 等沉淀剂) ，吸附一洗脱法( 用大 孔树脂、硅藻土或硅胶等吸附剂、。精提物中黄酮类含量约为2 0 2 6 ，萜类内 1 0 西华大学硕士学位论文 酯达6 左右。胡敏、张声华探讨了溶剂萃取和树脂吸附精制银杏叶黄酮的原 理，经过比较证明树脂吸附法优于溶剂萃取精制法。树脂吸附优点是成本低、回 收率高、有机溶剂残留少，该方法近年来有较大的发展，国内银杏叶加工厂多达 2 0 0 家，基本都采用树脂吸附。 2 6 3 高速逆流色谱技术提取法 高速逆流色谱技术( | i s c c c ) 提取法是种不用任何固定载体的液一液分配色 谱，具有分离效率高、产品纯度高、无吸附现象、无污染等优点，特别适合于制 备性分离，是制各银杏黄酮苷元以及银杏内酯和白果内酯对照物的较佳手段。应 用h s c c c 技术提取分离银杏叶中活性成分已引起各国的重视，国内已有学者1 6 2 j 利用h s c c c 成功分离制得白果内酯单体和以g a 、g b 为主要成分的化合物。蔡定 国等报道了应用h s c c c 技术，从银杏叶提取物中分离纯化得到了槲皮素、山奈 素、异鼠李素3 种主要苷元。 2 6 4 微波提取法 微波提取法能对萃取体系中的不同组分进行选择性加热，使目标组分直接从 基体分离，因此具有较好的选择性。另外，微波法还具有热效率高、升温快速均 匀、萃取效率高、大大缩短提取时间等优点。李嵘等俐对微波提取银杏叶黄酮苷 进行了研究，以水为介质对银杏叶进行微波处理，提高了银杏叶黄酮的提取率， 并缩短了提取时间。该方法将传统水提法与高效微波法相结合，即降低了成本， 又提高了效率，是一种有发展前景的新工艺。 2 6 5 超声波提取法 超声波技术具有能耗低、效率高、不破坏有效成分等优点，近年来逐渐被应 用于天然产物提取。郭国瑞等【6 5 1 以水为介质，低温下对银杏叶进行超声波处理， 结果表明，超声波提取法是常规水浸提效率的3 倍左右。超声波提取法省对、高 效、节能、且属绿色提取技术，具有广泛的应用前景州。 西华大学硕士学位论文 2 6 6 超临界流体提取法 超i 临界流体提取法是近年来发展起来的种新型技术，它利用超临界流体作为 萃取剂从液体中提取某种高沸点成分，以达到分离提纯的目的。与传统的提取工 艺比较，超临界流体提取法具有提取效率高、无溶剂残留聋胜、天然植物中活性 成分和不稳定成分不易被分解破坏而保持其天然特性等优点，同时还可通过控 制临界温度和压力的变化来达到选择性提取和分离纯化的目的。但是超临界流体 需要在较高的压力下操作，设备费用比较昂贵，操作较困难，难以用于较大规模 的生产，目前尚未工业化大规模生产陋6 7 】。 2 6 7 酶法提取 闩本专利i 删曾提出通过加入淀粉部分水解产物及对葡糖基有转移作用的葡 糖营酶或转糖苷酶，使油溶性或难溶于水或不溶于水的有效成分转移到水溶性营 糖中，既提高了有效成分的提取率，又促进难溶于水或不溶于水的有效成分在体 内的吸收。中南大学的王晖等【l 研究了银杏黄酮的酶法提取工艺，证明在常规 的醇一水浸提之前用纤维素酶对原料进行酶预处理( 酶解时间为2 h ) ，总黄酮得率 可达到2 0 1 ，远远高于直接醇一水提取的得率( i 2 9 ) 。 2 7 超临界萃取技术概述 超临界流体萃取技术是一种高效、选择性强的提取分离技术。近二十多年来 引起了人们极大的兴趣并得到迅猛发展，内容涉及超临界流体萃取、超l 缶界色谱、 超临界条件下的化学反应、超临界流体细胞破碎技术、超临界流体结晶技术、超 临界流体染色技术及超临界干燥技术等【1 7 - 酬。超临界流体技术在食品工业、化学 工业、医药、环保、石油等领域得到普遍应用，己初步形成一个新的产业。随着 人们对环保重视程度的提高，一些有机溶剂萃取法将被淘汰，而超l 临界c 0 2 流体 因其无毒、无味、清洁、便于操作等优点将在这一领域发挥更重要作用。 2 7 1 超临界流体萃取的含义、原理、特点 超临界流体( s u p e r c r i t i c a ln u i d 简称s c f ) 一般用临界温度和l f 每界压力的形式柬 定义。气液两相呈平衡状态的点叫临界点，如图2 1 所剥2 4 _ 捌。在i 临界点时的温 1 2 西华大学硕士学位论文 度和压力称为临界温度和临界压力。高于临界温度和临界压力而接近l 临界点的状 态称为超临界状态。处于超临界状态时，气、液两相性质非常接近。s c f 不同于 一般的气体，也有别于一般的液体，它兼有气体和液体的双重特性，扩散系数大， 粘度小，渗透性好，与液体溶剂相比，可以快速完成传导，达到平衡，实现快速 分离。在图2 1 中，高于临界温度和临界压力的区域称为超临界区。如果流体被 加热或被压缩至高于其临界点时，该流体即成为超临界流体。 超临界流体萃取( s u p e r 砸“c a lf l u i de x t f a c 幻n ，简称s f e 或s c f e ) 的原理是利用 超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能 力的影响而进行的【。在超临界状态下，压力和温度发生微小的变化，密度即发 生改变，从而引起溶解度的变化。将压力或温度适当调整，可使溶解度在1 0 m 1 0 0 0 的范围内波动，由此可实现目标物质的分离。在一定压力范围内得到的萃取物虽 非单一成分，但可以通过萃取条件的控制得到目标成分含量最高 10 9 10 e ； ： 艏10 7 州 10 6 0 蹋境fc ) 图2 1 纯物质的压强图( c 0 ：) f i g 2 - 1p f e s s u r ec h a p i e ro f p u r em a t t e r ( a 巩) 的萃取物，然后借助减压、升温的方法使超临界流体变成普通