（食品科学专业论文）马红球菌胆固醇氧化酶的研究.pdf

里壅些查兰堡圭堂垡堡主兰塾登堕些旦壁墨些堕塑! ! 垄摘要妲固醇氧化酶( e c l 1 3 6 ) 在食品、医药、生物抗虫方面的功能日益是到重视，为此蟮谋题从以下四方面研究胆固醇氧化酶( 从而为它的应用提供理论依据l 产高活力胆固醇氧化酶菌株马红球菌4 _ 2 的分离纯化和发酵条件的确定、胆固醇氧化酶的分离提纯、胆固醇氧化酶的特性研究以及在食品中的应用实验马红球菌4 2 产生的胆固醇氧化酶为诱导酶利用单因子和正交实验得到马红球菌产生胆固醇氧化酶的最佳发酵培养基配力伪l 眦h n 。2 9 ；k k p 0 ，0 5 9 = m g s o , 7 m o ，0 2 5 9 ：f e $ o 。7 h 力，0 2 9 ；胰蛋白胨，l g ；胆周醇，l g l 蒸馏水，1 0 0 0 m l ；培养基的初始p h 为9 0 l 最佳接种量为蛾；最佳通气量为培养基体积占三角瓶阵积的1 3 ；最佳培养温度为2 8 最佳提酶时间为培养2 8 小时1。j采用阴离子树脂、c m - c e l l u l o s e 、超滤浓缩、s e p h a d e xg 7 5 四个步骤提纯此酶，提纯后酶的比活为：5 2 7 u m g ，提纯倍数为：1 2 9 倍，用梯度活性胶( 4 0 = - - 1 2 ) 电泳证明已经达到电泳纯，剧分子量约为 0 0 k d a 1 经过s d s o p a g e ( 5 ，】2 ) 电泳后有四条带，证毗酶由四个分子量约为4 0 k d a 、3 2 k d a 、1 6 k d a 和1 5 k d a 的亚基组成用经典电转移的方法证啁经梯度活性胶电泳得到的唯一带为胆固醇氧化酶带，4 - 2 菌株胆固醇氧化酶的特性5 最适p h 为8 0 ；最适温度为5 0 左右；米氏常数为0 3 7 l n i i ，最大反应速度为o 0 1 7pw o l m i n ；l i + 、m 9 2 + 能明显促进此酶的活力，c u ”和s d s 明显抑制酶的活力。) 4 2 菌株的菌体、发酵液、提纯后的酶对肥肉馅和鸡蛋黄中的胆固醇均有一定的降解作用，其中纯化后酶的降解作用最明显，降解率分别为为3 2 9 和3 1 8 ，而且它们均不影响肉馅和鸡蛋黄的感官特性。f 因此，用胆固醇氧化酶降解食品中的胆固醇含量具有很强的现实意义。、7 乙关键词：马红球菌胆固醇每化酶分离纯化特蚌应用刊孽亿oj1a b s t r a c tt h ef u n c t i o no fc h o l e s t e r o lo x i d a s ei nf o o d ，m e d i c i n ea n db i o l o g i cr e s i s t i n gi n s e c t si sn o ws t u d i e di nm a n ya s p e c t s i nt h i sp a p e r ，c o n d i t i o n so ft h ec u l t u r eo fr h o d o c c u se q u i4 - 2 ，i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fc h o l e s t e r o lo x i d a s e ，t h ec h a r a c t e r so ft h ec h o l e s t e r o lo x i d a s e ，t h ea p p l i c a t i o no ft h ec h o l e s t e r o lo x i d a s ei nf a ta n dt h ey o l ko fe g g sa r ei n v e s t i g a t e d t h ec h o l e s t e r o lo x i d a s ep r o d u c e db yg h o d o c c u se q u i4 2w a sa ni n d u c t i v ee n z y m e t h em o s ts u i t a b l ec o n d i t i o n sf o rg h o d o c c u se q u i4 2w e r ec h o l e s t e r o l( 1 9 l ) 。a m o n i u mn i t r a t e ( 2 9 l ) ，b i t t e rs a l t ( 0 2 5 9 l ) 。d e t e r m i n e db yo r t h o g o n a la r r a y t h eb e g i n n i n gp ho fc u l t u r ei s9 0 ：t h eo p t i m u ma m o u n to fi n o c u l a t i o ni s4 ：t h ec u l t u r ev o l u m ei sat h i r do ft h et o t a lc o n t a i n e rv o l u m e ：t h eo p t i m u mc u l t i v a t e dt e m p e r a t u r ei s2 8 ：t h eo p t i m u mc u l t i v a t e dt i m ei s2 8h o u r s ac h o l e s t e r o lo x i d a s ep r o d u c e db y4 - 2w a sp u r i f i e dt oe l e c t r o p h o r e t i ch o m o g e n e i t yb yt h es t e p so fc o l u m nc h r o m a t o g r a p h yw i t ha n i o nr e s i n ，a i c e l l u l o s e ，s e p h a d e x - g 7 5 。a n du l t r a f i l t r a t i o n p u r i f i c a t i o no fa b o u t1 2 9f o l dw a sa c h i e v e d- i t ha no v e r a l ly i e l do f3 2 1 t h er e l a t i v em o l e c u l a rm a s so ft h en a t i v ee n z y m ei sa b o u tl o o k d aa n dt h a to f f o u rs u b u n i t sa r e4 0 k d a 、3 2 k d a 、1 6 k d aa n d1 5 k d ar e s p e c t i v e l yb yt h ea n a l y s i so fg r a d i e n tn a t i v e ( 4 - 1 2 ) a n ds d s p a g e t h ec h a r a c t e r so ft h ec h o l e s t e r o lo x i d a s e ：t h eo p t i m u mp hi s8 0 ：t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ei sa b o u t5 0 ：t h eg i s h ic o n s t a n ti s0 3 7 m 1 4 ；t h em a x i m a lr e a c t i o nr a t ei s0 0 1 7 “m o l m i n ：t h ei n h i b i t o rt h ec h o l e s t e r o lo x i d a s ei sc u 2 + a n ds d sa n dt h ea c c e l e r a n ti sl i + 、m f + r h o d o c c u se q u i4 - 2 ，t h eb r o t ha n dc h o l e s t e r o lo x i d a s ec a nr e d u c et h ec h o l e s t e r o lo ff a ta n dt h ey o l ko fe g g s ，a n dt h ee n z y m ei st h eb e s t i t sr a t i oi s3 2 9 a n d 3 1 8 r e s p e c t i v e l y ? h a t sm o r e t h ee n z y m ed on oh a r mt ot h eq u a ii t yo ft h ef a ta n dy o l k k e yw o r d s ：z h o d o c c u se q u i，c h o l e s t e r o lo x i d e s e ，i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ，c h a r a c t e r ，a p p l i c a t i o n2璺查些盔兰堡主兰垡堡塞呈塾壁堕望墅! 墨些壁塑塑塞1 前言1 1 胆固醇的生理功能胆周醇( c h o l e s t e r 0 1 ) 亦称胆甾醇，是最早发现的一种甾体化合物。胆固醇是构成动物细胞膜的必需成分，在人体中主要存在于血浆、肝和肾上腺中，具有一系列生化功能：胆固醇的两性特点可能对生物膜中脂类的物理状态有一定调节作用；胆固醇也是各种类固醇激素合成的前体，起代谢调节作用；由胆固醇合成的胆汁酸有助于食物中脂肪的消化吸收，能降低水和油脂的表面张力，使肠腔内油脂乳化成微粒；胆固醇与生物膜的透性、神经髓鞘的绝缘物质以及动物细胞对某种毒素的保护作用有一定的关系：另外，由胆固醇转化来的7 脱氢胆固醇在紫外线的作用下可形成维生素d 2 所以说，适量的胆固醇对维持人体正常的生理功能有着重要的意义“”。1 2 高血清胆嗣醇的危害虽然胆固醇对人体是必需的，但过多的胆固醇又有很多的危害作用血清中过剩的胆固醇与脂肪酸作用形成的胆固醇酯在血管壁上沉积引起动脉粥样硬化和冠心病。高血清艟固醇还会引发以心脑组织缺血、缺氧为特征的心肌梗塞、心绞疼、脑神经中风等病症此外还会引发尿结石、胆结石等病。目前，心脑血管疾病已成为导致人类死亡的第一杀手，因此高血清胆周醇的危害应引起人们的足够重视“2 ”。体内胆固醇平衡图”7 1膳食+血清和组织中的胆固醇卜一夕性激素3中性甾醇胆汁酸主里垒些查堂堡主堂垡堡奎兰塾苎堕望曼! 墨些壁! ! ! 堕从上图中可以看出，体内胆固醇水平与饮食有一定的关系，一般认为在o - 6 0 0 m g 天摄入范围内，每增加1 0 0m g 腮固醇1 0 0 0 k c a l ，血液中胆固醇含量会增加3 - 1 2m g 天虽然这种增加是线性的还是曲线的，目前还未定论”1 。许多高营养的动物食品如：肉类、乳脂、蛋黄、动物的脑肝心肾等脏器均含有较高的胆固醇，因此研究降低食品中胆固醇的方法，对降低高血清胆固醇的危害是十分有利的。1 3 降低食品中胆固醇的方法降低体内血清胆同醇水平，可以从药物治疗和改变饮食结构，及降低食品本身胆固醇含量等方面考廖。前者为医学界所关注，后者为食品技术专家所关心。从食品本身来看，主要是通过改变原料和生产方法来生产低胆固醇食品经食晶技术专家努力，目前已有多种方法来降低食品中的胆周醇”“2 ”1 有机溶剂提取，利用胆固醇溶于有机溶剂的特点来生产低胆固醇食品超临界流体萃取，利用某些流体在临界点以上时表现为介于气体和液体的性质，它具有高密度特性使它具有很高溶解能力，它的低粘度和高扩散特性使其易穿透物质到达食品内部，超临界流体这些特性对于食品分离来说非常有用。目前作为超临界的流体有二氧化碳、乙醇、甲醇、甲苯、丙酮、氮气等等，但是应用最多的是二氧化碳。b 一环状糊精包埋，b 一环状糊精内有非极性空穴，可用于包埋胆固醇，形成既不溶于水，也不溶于油脂的包含物，从而可除去食品中的胆固醇多糖沉淀，在酸性环境下，某些多糖与脂蛋白形成复合体，沉淀下来，大部分胆固醇也存在于此复合体中。这些多糖包括：海藻酸钠、羧甲基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶等。其中以阿拉伯胶使用最为广泛。蒸汽提馏法，它利用胆固醇在蒸汽压力下可被提馏的性质去除胆固醇分子蒸馏法，从原理上看，它包括了液态物料中的化合物从加热器表面蒸发，向冷凝器表面迁移的过程特别之处是：体系运作在中、高真空条件下。且加热器与冷凝器之间的距离很短，从而基本实现了体系组分分子的单向流动。食品中的甾醇类物质比甘油三酯更易挥发，这就成为了分子蒸馏法的物理基础。但是由于以上有的方法存在缺陷，比如：有机溶剂法所用的溶剂会有残留；超临界二氧化碳的投资很大，蒸汽法对设备的要求太高；分子蒸馏法很难实现工业化，所以限制了这些方法的使用”1 。于是食品专家们开始致力于其它方法的研究。尤其是生物方法。生物方法的效率高，对产品风味影响比较小，是经济有效的降低食品中胆固醇的方法。生物方法在国内报道的还不多，它包括微生物转化和酶转化。微生物对胆固醇具有吸附、同化、降解等多种作用，大多数细菌可将胆固醇吸附于细胞膜表面，进而同化为细胞器膜的组成成分。近来也报道了多种微生物能在胆固醇为唯一碳源的培养基上生长，利用胆固醇并获得生长繁殖所需要的碳源和能量，并产生多种有益的中间产物和酶”“。这些4史里查些查兰堡圭堂垡堡奎墨堑苎堕望哩曼壑些壁! ! ! 堕微生物有：诺卡氏菌属( n o c a r d i a ) 、链霉菌属( s t r e p t o m y c e s ) 、红球菌屑( r h o d o c c u s ) 、短杆菌属( b r e v j b a c t e r i u m ) 、节杆菌属( a r t h r o b a c t e r i u = ) 、假单孢菌属( p s e u d o m o n a s )等其实微生物降解胆固醇的原因还是由于它产生了能够降解胆固醇的酶酶法降解胆固醇的效率比微生物法要高，而且产物相对单一能够降解胆固醇的酶有胆固醇氧化酶、胆固醇还原酶等“1 ，其中以胆固醇氧化酶研究的最为广泛。1 4 胆同醇氯化酶的功能胆固醇氧化酶( c h o l e s t e r o lo x i d a s e 即c o x ) 是一种多功能的酶，它能将胆固醇氧化为胆甾4 一烯一3 一酮目前医院用胆周醇氧化酶检测血清胆固醇含量“1 ；胆固酵氧化酶可以降低食品中的胆固醇含量；此外近年来发现胆固醇氧化酶还能抑制鳞翅目昆虫的生长繁殖，是一种新型的生物杀虫荆”1 ”1 ；胆固醇的氧化产物胆甾4 一烯一3 一酮还具有抗肥胖和治疗肝病等药效1 5 胆固醇氯化酶的研究进展1 5 1国外的研究1 9 4 4 年，t u r f i t t 第一次从土壤中分离出能够降解胆固醇的微生物”，此后人们发现降解腮固醇是微生物产生的酶的作用。7 0 年代以后，主要是从不同的菌里分离提纯胆固醇氧化酶，并研究其特性”。另外在分离提纯方法上进行了探索，如盐析法、离子交换层析法、凝胶层析法“2 “”1 ，以及近年来的亲和层析法和双水相萃取法，主要就是为了找至种简单有效的提酶方法，从而为它的应用提供可能”“1 。应用方面有：1 9 8 8 年，a i h a r a h 等人采用酶法降低蛋黄中的胆固醇”“，效果显著，并证明没有氧化中间产物；1 9 9 0 年，x i a n g s h e n g 等人采用酶法降解乳中的胆固醇；1 9 9 3 年，s a t i o等人将胆固醇氧化酶用于低胆固醇乳品的开发中”1 ：澳大利亚c h y i s t o d o u l o u “”等用从诺卡氏菌、链霉菌、短杆菌和假单胞杆菌中提取的胆固醇氧化酶降解鸡蛋黄中胆固醇，其降解的效果是假单胞杆菌 诺卡氏菌 链霉菌 短杆菌。近年来，主要是利用胆固醇氧化酶杀虫的特性，将它的基因转入棉花中得到转基因抗虫棉1 ，促进农业的发展。1 5 2国内的研究国内胆固醇氧化酶的基础研究还不多，主要是无锡轻工的季文明等人在做它的分离提纯及转基因实验”1 。国内主要是用p 一环状糊精包埋( 宋嘉璋等人，1 9 9 9 ) ”“等方法降低食品中的胆固醇，用胆固醇氧化酶的还几乎没有。真正将胆固醇氧化酶应用于食品的也只有中国农业大学东区江正强等人”1 ，结果表明猪油脱除胆固醇明显，而且猪油理5里壅兰竺盔兰堡圭兰垡堡奎苎塾壁堕望墅壁墨! 兰竺竺翌塞化性质变化不明显。1 6 胆固醇氯化酶的作用机理及酶活力的测定方法胆固醇氧化酶对胆固醇的催化作用有两步氧化和异构化，首先胆固醇氧化酶将胆固醇3 位上的羟基氧化生成羰基即中间产物五烯三酮，然后将5 位上的烯烃双键异构成4 位上的烯烃双键，即终产物胆甾烯酮，同时将脱下的氢与氧气生成如如。1测定胆固醇氧化酶活性的方法有很多种如：胆甾酮分析法、过氧化氢分析法、液相色谱法、和薄层层析法等其中过氧化氢法比较简单，所需的仪器比较少，是常用的一种方法。它的反应机理如下；a n e s t e i i o li e s i aa 砒l $ t i “n r na c i dlh 2 0 l 瀚l t n 饨c l s t - 4 e h ，w eo_ 2oo - i 帕聃h i d y e胆固醇酯( c h o l e s t e r o le s t e r ) 在胆固醇酯酶( c e h ) 的作用下，反应生成胆固醇( c h o l e s t e r 0 1 ) 和脂肪酸( f a t t ya c i d ) 。胆固醇在胆固醇氧化酶的催化下，生成胆甾4 烯一3 一酮( c h o l e s t 一4 一e n 一3 一o n e ) 和过氧化氢。过氧化氢，4 一氨基一氨替比林( 4 - a m i n o a n t i p y r i n e ) 与苯酚( p h e n 0 1 ) 在过氧化物酶( h p o d ) 的催化下生成亚酲类呈6皇里奎些查堂堡主兰垡堡塞兰塾蔓堕望墅曼垫垡壁箜堡塞红色的化合物( q u l l n o n e l m l n ed y e ) 。胆固醇氧化酶的催化反应过程中，氧化l m o l 胆固醇，产生l m o i 过氧化氢。比色法是依据过氧过氧化氢在辣根过氧化物酶的作用下分解，可使反应体系中的4 一氨基一氨替比林与苯酚形成亚醌类星红色的化合物，在5 0 0 a m 处有最大吸收峰的原理，通过测量反应液在5 0 0 r i m 处的吸光度，就可以定量测定胆固醇被氧化的量，从而计算出胆固醇氧化酶的酶活单位。1 个单位的胆固醇氧化酶活力单位定义为：1 分钟氧化1pm o l 胆固醇的量，即生成lp 1 过氧化氢的量。其中过氧化氢的量与o d m 的关系要由实验作过氧化氢标准曲线而得到”“。1 7 胆固醇氧化酶的提纯方法目前胆圈醇氧化酶的提纯方法主要有；离子交换层析、凝胶层析、超滤以及近年来发展迅速的亲和层析和双水相萃取技术。离子交换层析：蛋白质分子主要靠与固定相的可解离基团进行交换，吸附于固定相上，用改变p h 或不同盐浓度的溶液将各组分分别洗脱下来，这样混合物中各组分即被分开，达到分离纯化的目的本实验采用的离子交换剂为阴离子树脂和c m - 纤维素超滤【1 1 | 】 4 0 1 ：它的工作原理是在一定的压力下( 外源n 2 或真空泵压) ，使溶剂和较小分子的溶质能通过一定孔径的薄膜，大分子的溶质则不能通过，从而可以使大分子物质脱盐、脱水和浓缩；在一定的条件下，还可以起到分离浓缩的作用超滤主要作为一种浓缩蛋白质和酶的方法，具有三大优点：( 1 ) 在整个过程中，条件温和。与蒸发、冻干等方法比较没有相的变化，可以维持原来的p h 和离子强度，并可在低温下操作，这样不致使蛋白和酶在浓缩的过程中变性、失活或自溶。因此对不稳定酶的浓缩尤其适用。( 2 )应用过程中不需添加任何化学试剂，设备和运转费用比较低廉，是一种比较经济的方法。( 3 ) 在浓缩的同时还可以除去一些低分子量的物质，具有定的纯化作用。目前主要的超滤方法有：平板超滤、离心超滤和中空纤维超滤。本实验主要采用平板超滤的方法。超滤膜为聚丙烯氰( p a n ) 膜，截留分子量为3 0 k d a 、6 0k d a 、1 0 0k d a 等。本实验胆固醇氧化酶的浓缩主要采用3 0k 1 ) a 的p a n 膜。凝胶层析：利用样品中分离物质的分子量大小及固定相具有分子筛的特点将被分离的物质按分子大小分开，达到分离纯化的目的。本实验采用的层析介质为：s e p h a d e xg - 7 5 。7中国农业大学硕士学位论文马红球菌胆圃醇氧化酶的研究1 8 本研究的目的及意义随着人们追求健康的呼声越来越高，高血清胆固醇带来的危害也渐渐深入人心，这使得一部分人对高胆固醇食品敬而远之，然而不能否认的一点是高胆固醇食品往往是营养非常丰富，而且难以替代的，比如动物性食品。这就给食品工作者提出了一个新的课题：在不影响食品原有色、香、味、营养成分，无副作用的前提下，对高胆固醇食品进行深度加工，使食品低胆固醇化、低脂化，从而更能满足新时代人们的需求。在众多降低食品中胆固醇的方法中，酶法是比较有效的一种，但是不足的一点是，酶比较难得。因此本实验是一个基础研究，争取为细菌生产胆固醇氧化酶商业化运作成功以及低胆固醇食品的大规模生产提供一些理论依据；同时也能为胆固醇氧化酶基因转入棉花中生产抗虫棉提供依据。82 材料与方法2 1 材料2 1 i实验菌种马红球菌4 2 ( 来源于蒙古野驴)2 1 2培养基2 1 2 1 发酵用液体培养基n h 。n 如2 9m g s 0 , 7 b o0 2 5 9胰蛋白胨1 9蒸馏水1 0 0 0 m l2 1 2 22 1 3k h 2 p 0 ,f e s o 7 h 2 0胆固醇p h9 01 2 1 灭菌2 0 m i n固体斜面培养基在液体培养基的基础上添加1 5 的琼脂缓冲液1p b s 缓冲液p h 7 5 ( 0 0 2 m o l l )n a 2 h p 吼7 1 7 9n a h 2 p o 2 7 8 9加水定容至1 0 0 0 m ln a o h 一甘氨酸缓冲液p h8 6 ( 0 o l m o l l )0 2 m 甘氨酸5 0 m l0 2 nn a o h4m 1加水定容至1 0 0 0 m l洗脱液a0 3 t r i t o nx 1 0 0洗脱液bp b s 缓冲液+ 0 0 8 mn a c l2 i 4 层析介质阴离子树脂c m c e l l u l o s es e 曲a d e x - g 7 59北京市有机玻璃制品厂g e r m a n ym n 3 0 0瑞典p h a m a c i a 公司0 5 90 2 91 9里查些查堂堡主兰篁堡奎兰塾蔓堕望堕堡墨堡壁! ! ! ! 堑2 1 5聚丙烯酰胺凝胶电泳2 1 5 1 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。12 1 5 1 1 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳样品缓冲液( 5 s a m p l eb u f f e r )蒸馏水1 4 m l1 mt r i s h c l ，p h 6 83 1 m l5 0 甘油5 m l! 遢酸兰q ：墅!l o m l2 1 5 1 2 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳5 电极缓冲液t r i s - g l y c i n e p h 8 8t r i sb a s e3 9甘氮酸1 4 4 9加1 l 蒸馏水2 1 5 2s l k s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 2 1 5 2 1s d s - p a g e 样品缓冲液( 5 s a m p l eb u f f e r )蒸馏水09ml1 mt r i s h c i p h 6 80 6 m l5 0 甘油5 m l1 0 s d s2 m l2一巯基乙醇05ml! ! 漶殴兰! !l o m l2 1 5 2 2s d s p a g e 5 电极缓冲液t r i s - g l y c i n e p h8 3t r i sb a s e3 9甘氨酸1 4 4 9s d sl g加l l 蒸馏水2 1 5 3 考马斯亮蓝染色2 1 5 3 1 考马斯亮蓝染色液，l l考马斯亮蓝r - 2 5 0甲醇蒸馏水冰醋酸2 1 5 3 2 考马斯亮蓝脱色液，1 l甲醇1 01 o g4 5 0 m l4 5 0 m ll o o m l皇里查些查兰堡主堂丝堡奎兰垒苎堕望璺壁墨些堕堕! 竖王蒸馏水冰醋酸2 1 5 4蛋白分子量标准：购自欣经科生物技术公司标准分子量蛋白溶液兔磷酸化酶b ( r a b b i tp h o s p h r o y l a s eb )牛血清白蛋白( b o v i n es e r u ma l u m i n )兔肌动蛋白( r a b b i ta c t i n )牛磷酸酐酶( b o v i n ec a r b o n i ca n h y d r a s e )胰蛋白酶抑制剂( t r y p s i ni n h i b i t o r )鸡蛋清溶菌酶( h e ne g gw h i t el y s o z y m e )2 1 6 蛋白免疫印迹( 经典电转移) ”2 1 6 1 转移缓冲液t r i s1 9 3 9甘氨酸9 9s d s0 0 8 9加蒸馏水至l l ，p h8 32 1 6 2p v d f 膜购自北京鼎国生物技术有限公司2 1 7 蛋白含量的测定( l o w r y 法) ”溶液i ，l o o m lc u s 0 4 5 h ? 00 5 9柠檬酸1 9溶液i i ，1 ln a 2 c 0 32 0 9n a o h4 98 0 0 m ll o o m l分子量9 4 ，0 0 06 6 ，2 0 04 3 ，0 0 03 1 ，0 0 02 0 ，1 0 01 4 ，4 0 0溶液i i i ，2 0 r n lf o l i n 酚l o m l ( 购自鼎园生物技术有限公司)n 2 0l o m l蛋白质标准：牛血清白蛋白( 购自欣经科生物技术公司)2 1 8 酶活力的测定2 0 2 m mh 2 0 z 溶液0 0 5 m 磷酸钠缓冲液l o o m l4 一氨基氨替吡呤0 0 3 9苯酚0079l m m 胆固醇溶液1 5 5 m l! 里窒些查兰堡主兰竺堡奎兰塾蔓堕望墅! 墨些堕塑! ! 堑辣根过氧化物酶5 3 u m l2 1 9 邻苯二甲醛法：( 测胆固醇)l o m g 邻苯二甲醛溶于l o o m l 冰醋酸中。作为母液从母液中吸取1 0 m l ，加入9 0 m l 冰醋酸中作为工作液。样品中加3m 1 工作液，2m 1 浓硫酸，测o d 5 0 0 n m 2 1 1 0 实验仪器蠕动泵中国上海沪西分析仪器厂自动部分收集器中国上海沪西分析仪器厂梯度混合仪中国上海沪西分析仪器厂紫外检测仪浙江温州孚华仪器厂超滤杯北京中科膜技术有限公司7 2 2 分光光度计上海第三分析仪器厂电泳仪中国上海沪西分析仪器厂垂直电泳槽北京六一仪器厂电转移装置北京六一仪器厂h y - 4 调速多用振荡器常州国华电器有限公司t s i 脱色摇床江苏海门市麒麟医用仪器厂w h 3 微型旋涡混合仪上海沪西分析仪器厂d h 计北京屹源电子设备仪器公司台式高速离心机上海安亭科学仪器厂酶联免疫检测仪中国人民第四军医大学国营华东电子管厂联合研制超声波细胞粉碎机宁波新芝科器研究所超声波细胞粉碎机隔音箱宁波新芝科器研究所恒温水浴锅北京医疗设备厂超净工作台上海整新电子设备厂手提式高压蒸汽灭菌器上海医用核子仪器厂电热恒温培养箱湖北黄石医疗仪器厂2 2 方法2 2 1 马红球菌4 2 的筛选、纯化、保存2 2 1 1 将实验室保存的2 9 株菌接入以胆固醇为唯一碳源和一些简单盐的液体培养基1 2中国农业大学硕士学位论文马红球菌胆周醇氧化酶的研究中，培养基中加入适量的溴百里香草酚蓝作为指示剂，于3 7 下摇床培养。能使指示剂变黄说明能够利用胆固醇产酸，根据变色时间、变色程度、测胆固醇氧化酶活力得到产高活力胆固醇氧化酶的菌株4 2 。将4 2 菌株在固体培养基上( 配方见“实验材料”) 划线挑单菌落进行纯化。纯化后的菌株用甘油管保存。2 2 1 2 马红球菌的鉴定及特性鉴定结果出自军事医学科学院。2 2 2 马红球菌4 - 2 培养条件的确定“”“”2 2 2 1 诱导酶实验分别以胆固醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉为唯一碳源进行菌种培养4 8 小时，测胆固醇氧化酶活力。为了排除接种的菌中带有胆固醇产生的误差，因此进行二次接种培养。2 2 2 2 培养条件确定“”2 2 2 2 1 碳源、氮源单因子实验n h n 0 3tl g ；l ( 1 1 2 p o ，0 2 5 9 ；m g s 0 4 7 1 t 2 0 ，0 2 5 9 ；f e s o 7 h 2 0 ，0 2 9 ；酵母粉，5 9 ；蒸馏水，1 0 0 0 m 1 分别加入1 的不同碳源：胆固醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉，柠檬酸三钠，培养4 8 小时。选择出最佳碳源。k h 2 p o , ，0 2 5 9 ；m g s o | 7 l h o ，0 2 5 9 ；f e s 0 4 7 f 1 2 0 ，0 2 9 ；胆固醇，1 9 ；蒸馏水，1 0 0 0 m l 。分别加入1 不同氮源：酵母粉、牛肉膏、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、n i 。n o a 、k n 0 3 、( n i l ) ：s o 。、n h n o 。+ 胰蛋白胨( 1 ：1 ) ，培养4 8 小时。选择出最佳氮源。2 2 2 2 2 正交实验”以最佳碳源、最佳氮源、磷源为三因素，选择三水平做三因素三水平的正交实验，从而得出晟佳的碳、氮、磷源的配比，即晟佳的培养基配方。2 2 2 2 3 培养基的初始p h 对产酶的影响将培养基的初始p h 分别调至5 、6 、7 、8 、9 、1 0 、1 l ，接入等量的菌，3 7 培养4 8 小时，测酶活力，得出最佳的初始p h 2 2 2 2 4 接种量对酶活力的影响计算种子液中的总菌数。接种量分别为2 、3 、4 、5 、6 、8 、1 0 ，除接种量以外其他培养条件相同，在3 7 c 下培养4 8 小时。测酶活力，得出最佳的接种量。2 2 2 2 5 通气量的影响选择1 5 0 m l 三角瓶，分别加3 0 m l 、5 0 m l 、7 5 m l 、l o o m l 、1 2 0 m l 培养基，中国农业大学硬士学位论文马红球菌胆固醇氧化酶的研究除通气量以外其他培养条件相同，在3 7 c 下培养4 8 小时，测酶活力，得出最佳的通气量。2 2 2 2 6 培养温度的影响选择1 0 、2 8 ( 2 、3 7 c 、4 2 c 、5 0 c 5 个温度进行培养4 8 小时，除温度以外其他培养条件相同，测酶活力，得出最佳的培养温度。2 2 2 2 7 生长曲线和酶活力曲线的测定在以上得出的最佳培养条件下，接种以后分别培养1 5 、3 、6 、1 0 、1 4 、1 8 、2 2 、2 6 、2 8 、3 2 、3 4 、3 8 、4 2 小时，测o d 6 4 0 n m 、o d 5 0 0 n m ，以培养时间为横坐标，o d 6 4 0 n m 为纵坐标，绘制生长曲线；以培养时间为横坐标，o d 5 0 0 n m 为纵坐标，绘制酶活力曲线。由此可以得出最佳的提酶时间。2 2 2 3 胆固醇氧化酶的分离、提纯”“3 ”12 2 2 3 1 制备胆固醇氧化酶的粗提液将种子液以4 的接种量，接入液体发酵培养基中，2 8 c 培养2 8 小时。将发酵液5 ，0 0 0 r p m 离心3 0 分钟，取上清液即为粗提酶液2 2 2 3 2 阴离子树脂柱层析将清洗干净的阴离子树脂柱用0 0 2 m o l l ，p h7 5 p b s 缓冲液平衡至出口的液体与进口的液体p h 一致上样粗提酶液，胆固醇氧化酶在此条件下不吸附，随p b s 缓冲液流出，收集活性商的部分备用2 2 2 3 3 删一c e l l u l o s e 离子交换柱层析将预溶胀的删一c e l l u l o s e 柱用0 o l m o l tp h8 6 的n a o h 一甘氨酸缓冲液平衡至出口的液体与进口的液体p h 一致。上样过阴离子树脂以后的酶液，先用0 o l m o l lp h8 6 的n a o h - 甘氨酸缓冲液洗去不吸附的杂蛋白，再用洗脱液a 进行胆固醇氧化酶的洗脱，酶液经紫外检测仪、记录仪后收集。合并活性高的酶液备用。2 2 2 3 4 超滤浓缩将经过c m c e l l u l o s e 离子交换柱层析以后的酶液用截留分子量为3 0 k d的超滤膜进行浓缩，体积由s e p h a d e xg 一7 5 凝胶的体积决定。2 2 2 3 5s e p h a d e xg 一7 5 凝胶过滤层析将固体煮沸溶胀好的s e p h a d e xg - 7 5 装柱( 1 6 x3 5 c m ) ，用3 5 倍体积的0 0 2 m o l l ，p h7 5 p b s 缓冲液洗柱。然后将经过浓缩以后的酶液上样，用洗脱液b 进行洗脱。控制流速为l o d m i n ，酶液经紫外检测仪、记录仪最后用部分收集器收集。按照记录仪上出峰的情况分管收集酶液。此时提纯完毕，准备进行纯度检测等实验。2 2 2 ，3 6 非变性梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳检测1 4! 里查兰竺查堂堡主兰些堡苎兰竺壁堕望堕! 墨竺壁! ! ! ! 塑梯度胶的配制( 4 一1 2 )丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺( 3 0 s t o c k )1 5 m o l lt r i s h c l ，p h 8 8去离子水2 2 m l蔗糖1 0 过硫酸铵( 新鲜配制)1t 础e d4 1 3 3 m l2 5 m l05 0 ull o u11 2 4 m 12 5 m 16 1 7 m l1 5 95 0 u5ull o m l1 0 m l取电泳样品1 0 0u l 加入2 0 u 1 样品缓冲液( 1 ：5 稀释) ，震荡均匀后上样电泳。电泳条件为1 2 0 v ( 稳压) ，2 5 小时电泳完毕，取出胶，用考马斯亮蓝染色液浸泡，于脱色摇床上缓慢摇2小时后去离子水洗两次，用考马斯亮蓝脱色液浸泡，于脱色摇床上过夜。2 2 2 3 7 非变性梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳带的检测( 经典电转移)为了证明经此电泳以后得到的蛋白带确为胆固醇氧化酶，因此需将此带用经典电转移的方法转移到p v d f 膜上以后进行活性检测，从而证明它为胆固醇氧化酶。配制i l 转移缓冲液并冷却至4 将电泳完以后的胶切好，放在冷的缓冲液中 5 m i n 同时切与胶大小完全相同的p v d f 膜。将膜依次放入甲醇、去离子水、缓冲液中各3 秒、2 分、3 秒。根据经典的电转移方法制成“三明治”，进行电转移。转移条件为：恒流1 5 0 m a ，2 小时。转移完毕，将对照采用考马斯亮蓝染色，根据对照切下所检测的带，加入反应体系中，如果变红而空白膜不变红则说明此带为胆固醇氧化酶。2 22 3 8s d s p a g e 检测浓缩胶制备( 5 )丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺( 3 0 s t o c k )0 5 m o l lt r i s h c l p h 0 6 8去离子水1 0 s d s1 0 过硫酸铵( 新鲜配制)0 6 7 m l2 5 m l2 2 m l1 0 0u 13 0 ul主璺查兰竺查兰堡主堂垡堡塞兰塾壁堕些墅壁墨些壁竺! ! 塑! 塑婴! qgl4 m 1分离胶制备( 1 2 )丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺( 3 0 s t o c k ) 4 m l1 5 m o l lt r i s h c l p h8 82 5 m l去离子水3 3 5 m l1 0 s d s1 0 0 11 0 过硫酸铵( 新鲜配制)5 0ul! 迦qg11 0 m 1取电泳样品1 0 0 i ll 加入2 0ul 样品缓冲液( 1 ：5 稀释) ，震荡均匀后沸水浴5 m i n ，1 0 ，0 0 0 离心l m i n ，上样电泳，m a r k e r 的处理方法相同。电泳条件为8 v c m ( 浓缩胶) ，1 5 v c m ( 分离胶) 。电泳完毕，取出胶，用考马斯亮蓝染色液浸泡于脱色摇床上缓慢摇2小时后去离子水洗两次，用考马斯亮蓝脱色液浸泡，于脱色摇床上过夜。2 2 2 4胆固醇氧化酶的特性研究。2 ”4 ”“1 2 2 2 4 1 胆固醇氧化酶的分子量此酶的分子量可以由非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳得到。亚基的分子量可以由s d s p a g e 得到。2 2 ，2 4 2 酶反应进程曲线的制作除了对照加酶液以外，其余均为1 0 0pl 反应体系加5 0ul 酶液，在不同的时间点2 、5 、7 、1 0 、1 2 、1 5 、2 0 、2 5 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 r a i n 加9 0ul l mn a 2 c 仉终止反应。测各时间的o d 5 0 0 ，以时间为横坐标，a 5 0 0 为纵坐标，绘进程曲线。2 2 2 4 3 胆固醇氧化酶酶活力的测定根据“材料2 i 8 ”配制反应体系。测 b 如标准曲线测样品的活力，查标准曲线得出酶的活力。由l o w r y 法测蛋白含量，从而得出酶的比活力。2 2 24 4 晟适温度及热稳定性最适温度：调不同的水浴温度到3 0 c 、4 0 c 、5 0 c 、5 5 、6 56 c 、7 5、8 5 c 。取1 0 0 u1 反应体系置于不同温度下1 0m i n ，加入酶液各5 0u1主曼垒些查兰堕主兰垒鲨壅呈塾壁堕里璺壁墼竺璧! 堕窒精确反应l o m i n 后用1 mn a 2 c 0 3 终止反应。测o d 5 0 0 t 以温度为横坐标，0 1 ) 5 0 0为纵坐标制图。得出最适温度。热稳定性：调不同的水浴温度到3 0 c 、4 0 c 、5 0 、6 0 c 、7 0 c 每个温度下放3 个管各加5 0 pl 酶液，3 个管分别在1 5 、3 0 、6 0 r a i n 时取出，用流动水冷却，全部热处理结束以后，加入反应体系1 0 0u1 ，精确反应l o m i n ，用l i dn a z c 0 3 终止反应测o d 5 0 0 。以o d 5 0 0 为纵坐标，以处理温度为横坐标，分别绘制处理时间为1 5 、3 0 、6 0 m i n 的稳定曲线。从而得出酶的热稳定范围。2 2 2 4 5 最适p h 及p h 稳定性配制p h 3 1 2 的缓冲液。最适p h ：将5 0ul 酶液与不同p h 的5 0 ul 缓冲液混匀，静置l o m i n ，从中取出5 0 u1 加入5 0u1 反应体系中，精确反应l o m i n ，用1 m n a z c 0 3 终止反应在3 7 下测o d 5 0 0 以p h 为横坐标，o d 5 0 0 为纵坐标制图，得出最适p h 。p h 稳定性：将5 0 u 1 酶液与不同p h 的5 0u 1 缓冲液混匀，3 7 静置1小时，加p u s 0 的缓冲液1 0 0 p1 在3 7 c 、p h 8 0 下测o d s 0 0 p h 为横坐标，o d 5 0 0 为纵坐标制图，得出p h 稳定性范围2 2 2 4 6 米氏常数l ( m 及最大反应速度v m 的测定配制无胆固醇反应体系和1 槲的胆固醇溶液。反应体系中加入不同体积的胆固醇溶液，使总体积达到2 0 0ul ，后加入5 0ul 酶液，p h 7 5 ，3 7 c 精确反应5 m i n 。由o d 5 0 0 查 k q 标准曲线，求出产生h 2 0 2 的浓度，并求出反应速度v ( pm o l l m i n ) ，i v ，还有底物浓度 s 和1 i s 。以l s 为横坐标，l v为纵坐标作图。由所得直线的横、纵轴截距求出l ( 1 l l 、v m 。2 2 2 4 7 金属离子和部分化合物对酶活性的影响将酶液在2 0 r a mp h 7 5 t r i s h c i 缓冲液中透析2 4 小时，检查活性有无明显变化。选取不同的金属离子，加入1 0 0ul 酶液中，使金属离子的终浓度为2 0 r a m ，振荡、放置l o m i n 测酶活力。2 2 2 5应用实验检验4 2 菌株的菌体、发酵液及其纯化后酶降解肥肉馅和鸡蛋黄中胆固醇的能力。加入2 n a c l 起到防腐的作用。菌体的制备：将5 0 0 ul 发酵液离心以后的菌体在无菌的条件下用灭菌的生理盐水清洗几次，并用生理盐水溶到5 0 0pl 。发酵液：将菌体发酵液经过3 0 k d a 的超滤膜浓缩到5 0 0u1 备用。2 2 2 5 1 实验方法在工作台上各称5 克肥肉馅，加入2 n a c l 混匀，装入灭菌试管，于沸水浴中煮3 0 分钟。然后分别加入5 0 0u1 4 2 菌体、发酵液及其纯化后酶，1 7中国农业大学硕士学位论文马红球菌胆周醇氧化酶的研究混合均匀，同时做两个空白对照。3 7 cf 放置2 4 小时。在工作台上取出鸡蛋黄，置于灭菌培养皿中打碎，加入2 n a c l 混匀，每支试管中吸入5 m l 液体蛋黄。然后分别加入5 0 0p1 4 2 菌体、发酵液及其纯化后酶，混合均匀，同时做两个空白对照。3 7 c 下放置2 4 小时。2 2 2 5 2 胆固醇的检测方法”“在每个样品中加入3 0 m 甲醇、l o m l 氯仿，捣碎2 分钟，再加2 0 m l 氯仿，继续捣碎1 分钟，加1 5 m l 水，再捣碎1 分钟。用布氏漏斗过滤于l o o m l 带塞量筒中，从滤纸上取下残渣，加3 0 m l 氯仿，再捣碎1 分钟，过滤于同一量筒中，最后用氯仿冲洗残渣，混匀量简中的滤液，将氮气通入滤液中5 分钟。静置过夜，以待分层。次日记下氯仿体积，弃去上层醇水溶液。吸取下层氯仿提取液2 m l ，置于带塞的2 5 m l 比色管内，在6 5 c 水浴中用氮气吹干，直至氯仿无味为止。加入无水乙醇4 m l 、5 0 k o i t o 5 m l ，混匀，在6 5 c 水浴中皂化1 5 小时，在每管中加入5 n a c l 溶液3m l 和石油醚1 0m i ，盖好，猛烈震荡1 分钟，静止分层。吸取石油醚层2 - 4m l ，放入一干燥试管中，在6 5 c 水浴中用氮气吹干，加入3m 1 邻苯二甲醛溶液，2m l 浓硫酸，混匀3 0 分钟，用分光光度计测波长为5 6 0 n m 的吸光值。1 8中国农业大学硕士学位论文马红球菌胆周酵氧化酶的研究3 结果3 1 菌种3 1 1 来源于蒙古野驴的4 2 菌株经军事医学科学院鉴定为马红球菌( r h o d o c o c c u se q u o 。3 1 2 以下是4 - 2 菌株对一些物质的利用情况：蛋白胨基质( 一) 、4 0 胆汁( 一) 、右旋糖葡萄糖( 一) 、蔗糖( 一) 、蜜二糖( 一) 、杆菌肽( 一) 、七叶灵( 一) 、乳糖( 一) 、海