（食品科学专业论文）鸭蛋黄中卵磷脂的分离提取.pdf

摘要 摘要 我国的禽蛋制品产量丰富但是附加值的开发力度不够，本论文主要围绕禽蛋制 品中的卵磷脂展开研究。当今卵磷脂是国内外学者研究的热点，很多学者对卵磷脂 的提取方法进行了研究，本文使用水相酶法有机相连续萃取提取卵磷脂，旨在寻找 安全、经济、高效的提取方法。 首先建立了卵磷脂检测的方法，使用无机磷法测定蛋黄粉中总磷脂的含量，紫 外分光光度法测定粗提物中卵磷脂的含量，薄层色谱定性分析粗提物中的卵磷脂， 而高效液相色谱用于精制卵磷脂的检测，具有准确、重复性高的特点。 本论文较为系统地研究了酶解脂蛋白粗提鸭蛋黄卵磷脂的工艺。研究确定了有 机溶剂加入水相的顺序、离心和抽滤等工艺路线。实验发现有机溶剂在酶解时加入 比酶解后加入的卵磷脂提取率高，抽滤分离卵磷脂的损耗较小，提取率比离心分离 的高。乙醇浓度会直接影响卵磷脂的提取效果，实验发现9 5 乙醇是经济、高效的 萃取溶剂。甘油三酯和卵磷脂分离使用的有机溶剂( 分离剂) 对分离效果也有影响， 比较常用的分离剂发现，乙酸乙酯的分离效果较丙酮的更好，水相和有机相的比例 直接影响酶解效果，实验确定水相和有机相的比例为1 ：8 时，酶解效果优化，卵 磷脂的提取率较高。在酶种类筛选时发现，不同蛋白酶的酶解效果相差较大，蛋白 酶1 酶解效果最佳，卵磷脂的提取率最高，达6 3 5 。通过上述实验确立酶解的工 艺路线之后，本论文又分析了影响卵磷脂提取率的主要因素为酶解时间、温度和加 酶量等。最后确定最佳酶解条件为：酶解温度5 0 1 2 ，反应时间为2 h ，加酶量为0 3 1 0 0 9 蛋黄粉，卵磷脂的提取率最高，达6 6 7 。 得到的粗提卵磷脂需进行进一步的分离纯化，比较不同纯化方法发现，层析法是 一种简单、快捷、纯化效果较好的方法。比较以氧化铝和硅胶为固定相的层析柱纯化 卵磷脂的效果发现，氧化铝为固定相，单一乙醇为流动相能够较好的纯化卵磷脂。另 外对层析的条件也进行了初步的探讨，主要为柱子型号和固定相的含水比例对纯化效 果的影响，实验结果表明中2 5 x 2 0 柱型、含水比例为8 ，卵磷脂纯化效果较佳，纯 化后卵磷脂的纯度达9 0 1 8 。 关键词：卵磷脂酶解分离纯化 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t 1 1 1 ep a p e rf o c u s e d0 1 1e g gy o l k 。w h i c hw a sa m p l ea n dn o tw e l ld e v e l o p e d 。r e c e n t l y s c i e n t i s t sh a v eb e e np a i dm o r ea t t e n t i o nt ot h ep h o s p h o l i p i d c o m p a r e dw i t hm a n y e x t r a c t i o nm e t h o d so fp h o s p h o l i p i d sf r o me g g y o l k , w ec h o o s ee n z y m a t i ch y d r o l y s i se g g y o l ka n ds y n c h r o n o u se x t r a c t i o no fp h o s p h o l i p i da n dt r i g l y c e r i d eb yo r g a n i cs o l v e n t , a i m e dt of i n das a f e ，c h e a pa n de f f e c t i v ew a y f i r s t , ad e t e r m i n a t i o nd h o s p h o l i p i d sm e t h o dw 嬲d e v e l o p e d i tj su s e f u lt od e t e r m i n e p h o s p h o r u st ok n o wt h ee q u i v a l e n tp h o s p h a t i d ec o n t e n ti nt h ee g gy o l kp o w d e r t h e n u l t r a v i o l e t - o b v i o u ss p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o dw a su s e dt od e t e r m i n et h ep h o s p h o l i p i d si n t h ec r u d ee g gl e c i t h i n a l s of o ft h ec r u d ee g gl e c i t h i n , i tw a sn e c e s s a r yt ou s et h i nl a y e r c h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) t od e t e r m i n et h ec h a r a c t e ro ft h ep h o s p h o l i p i d s t h eh i 曲- p e f f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a g h yw a sd e v e l o p e dt od e t e r m i n ee x a c t l yt h ec o n t e n to f p h o s p h o l i p i d s n l e r e s u l ts h o w e dt h a tt h em e t h o dw a sr a p i d a c c u r a t ea n dr e p e a t a b l e w h i c hi sf e a s i b l et o d e t e r m i n ep h o s p h o l i p i d s e c o n d , t h ee n z y m a t i ce x t r a c t i o nm e t h o dw a ss t u d i e ds y s t e m a t i c a l l y 1 1 地o r d e ro f t h es o l v e n ta d d e d ，c e n t r i f u g ea n df i l t r a t i o n 。t h ec o n t e n to fe t h a n o lw a si n v e s t i g a t e da n d t h eo p t i m a lp a r a m e t e r sw e r ea sf o l l o w s ：t h es o l v e n ta d d e db e f o r ee r t z y m e sh y d r o l y z a t i o n ， c e n t r i f u g ea n d9 5 e t h a n o li s b e t t e rt h a no t h e r s a sf o rt h es e p a r a t i o ns o l v e n to f p h o s p h o l i p i da n dt r i g l y c e d d e e t h y la c e t a t ei sb e t t e rt h a na c e t o n e n l cr a t i oo fw a t e rt o o r g a n i cs o l v e n tw a s1 ：8f o rt h eb e t t e re x t r a c t i n gr a t e d i f f e r e mp r o t e i n a s e sw g r eu s e dt o p r e - - h y d r o l y z eo fe g gy o l ki n d i v i d u a l l ya n db yt w op r o t e i n a s e su s e di ns e q u e n c e n l e r e s u l ts h o w e dt h a tt h eb e s te x t r a c t i n gr a t eo fd i f f e r e n tp r o t e i n a s e sw a s6 3 5 a f t e r c o m p a r e dw i t ht h e s e , t h er o u t eo fe n z y m a t i ch y d r o l y s i sw a sb u i l lt h e nt h i st h e s i s i n v i s t i g a t e dt h ef a c t o r so fe n z y m a t i ch y d r o l y s i s , t h er e s u l tw a sa sf o l l o w ：t e m p e r a t u r eo f e g gy o l ke n z y m a t i ch y d r o l y s i s5 0 ，t i m e2h o u r ，t h er a t i oo fp r o t e i n a s e ：s u b s t r a t e 3 ：1 0 0 0 t h eb e s te x t r a c t i o nr a t i oo f p h o s p h o l i p i dw a s6 6 7 1 1 l 硼t h ec o l u m nc h r o m a t o g r a p h yw a sa p p l i e di n t h ef u r t h e rp u r i f i c a t i o no f p h o s p h o l i p i d ，w h i c hw a sae a s y ，r a p i dw a y a f t e rc o m p a r i t a t i o n , a 1 2 0 3c o l u m n c h r o m a t o g r a p h yw i t he t h a n o la sd e s o r p t i o nw a sp r e f e r r e d i na d d t i o n 。也ef a c t o ro f c o l u n mc h r o m a t o g r a p h yw a sa l s os m d i e dw h i c hi n d i c a r e dt h a tt h ew a t e rc o n t e n ti na 1 2 0 3 p h a s ew a sl e s st h a n8 t h ev o l u m eo f a l 2 0 3p h a s ew a sb e t t e r k e yw o r d s ：p h o s p h o l i p i d ；e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ；s e p a r a t i o n ；p u r i f i c a t i o n j i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定；江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：蛆轰 导师签 日期： 第一章绪论 第一章绪论 从小农经济发展到庞大的家禽养殖业，我国家禽养殖的规模越来越大，已经成为 禽蛋生产第一大国。然而目前我国禽蛋市场销售状况不容乐观，已经由以前的供不应 求转变为严重的供过于求，这主要是禽蛋市场存在“三多三少”现象即普通蛋多，品 牌蛋少；带壳蛋多，深加工蛋少；直接食用蛋多，开发利用蛋岁“。随着人们对蛋黄 中的大量生理活性物质关注度的增加，其中以相应的生物学以及生化性质的关注度最 高，蛋黄中的生理功能成分的开发成为国内外学者的研究热点 2 1 。 因此，需要积极采用现代高新技术大力开发禽蛋深加工产品，提高禽蛋产品的附 加值，这对促进我国养禽业的全面健康发展显得尤为重要。本论文主要就鸭蛋黄卵磷 脂的开发利用工艺的革新进行探讨，试图寻找一条适合工业化的生产工艺路线，旨在 为更加有效利用禽蛋，尤其是禽蛋蛋黄资源以及更好开发鸭蛋卵磷脂产品提供参考依 据。 1 1 鸭蛋黄的成分 鸭蛋黄是鸭蛋的一部分，由蛋黄膜包围并起着分隔蛋黄与蛋清的作用，约占鸭蛋 重的2 6 - - 3 3 ，是一个复杂的体系，具有多种生理功能成分。蛋黄的结构复杂，其 化学成分也极为复杂，蛋黄约含有5 0 的水分，其余大部分是蛋白质和脂肪，两者的 比例约为1 ：2 ，此外还含有少量的糖类、矿物质、维生素、色素等。其主要成分见表 1 1 【3 】 表1 1 蛋黄的化学组成 其中蛋黄中的蛋白质大部分以脂蛋白质的形式存在。脂蛋白包括低密度脂蛋白、 卵黄高磷蛋白、卵黄球蛋白和高密度脂蛋白。各种含量见表1 2 【4 1 表1 2 蛋黄中各种脂蛋白的含量( ) 蛋黄高密度脂蛋白中包含有4 0 的中性脂类和6 0 的磷脂。在低密度脂蛋白中有 3 1 的磷脂、3 7 的胆固醇和6 5 的三酰甘油酯。磷脂形的脂类部分有3 5 的磷脂和 1 1 5 的胆固醇。在原生质中的低密度脂蛋白中含有7 5 的脂类和1 6 的磷脂。 现将二种脂蛋白的结构模型如图1 1 ，1 - - 2 t 5 1 由图我们可以看出：脂蛋白以三酰 甘油酯为轴心，磷脂、蛋白质、甾醇之类的具有极性基的分子覆盖在三酰甘油酯上。 与低密度脂蛋白相比，高密度脂蛋白含脂质量较少，而且脂质大部分存在于分子内部。 这就给磷脂的提取造成一定困难。 江南大学硕士学位论文 圈1 1 高密度脂蛋白结构模型图 图1 2 低密度脂蛋白结构模型 1 2 蛋黄磷脂 1 2 1 蛋黄磷脂的组成 蛋黄磷脂的理化常数见表1 3 ，种类和含量见表1 4 表1 3 蛋黄磷脂的理化常数 表1 4 蛋黄磷脂的组成 从表1 4 可知磷脂酰胆碱( p c ) 和磷脂酰乙醇胺( p e ) 含量较大，与大豆等植 物来源的磷脂质相比，蛋黄磷脂具有磷脂种类少、p c 含量高的特点。 磷脂是含有磷的单脂衍生物，按分子结构分为甘油醇磷脂和神经氨基醇磷脂。 甘油磷脂是磷脂酸衍生物。磷脂酸及其中的衍生物之一卵磷脂结构如下： 2 第一章绪论 j 落# 1 屿 j 蹿一黼 1 2 2 蛋黄磷脂的性质与功能特性 1 2 2 1 卵磷脂的物理性质 纯净的磷脂为白色蜡状固体，但由于其来源、制取方法或精制方法、产品种类、 储存条件等的不同，卵磷脂产品具有淡黄色至棕色。 卵磷脂能溶于脂肪烃、芳烃、卤代烃等有机溶剂，如乙醚、苯、三氯甲烷、石 油醚等。它只部分溶于脂肪族醇类，如乙醇，和其它非极性表面活性剂一样不溶于 极性的溶剂，如乙酸乙酯、丙酮。 ， 由于卵磷脂分子中既含有疏水性的脂肪酸，又含有亲水性的磷酸酰基；其电荷 分布上既含有磷脂酸型的阴离子，又含有季胺盐型的阳离子，使得磷脂成了优良的 水包油( o ，w ) 型的天然乳化剂。通常其乳化能力随着卵磷脂纯度的提高而增强。 1 2 2 2 卵磷脂的化学性质 l 、卵磷脂的分解。卵磷脂接触空气或在阳光照射下极不稳定，易氧化酸败而色 泽变深，但在无水的油脂中比较稳定。所以浓缩的大豆卵磷脂能防止卵磷脂的氧化 酸败，有利于卵磷脂的保存。卵磷脂在高温下不稳定，1 0 0 以上便逐渐氧化而分 解，2 8 0 时生成黑色沉淀。 2 、卵磷脂的水解。卵磷脂在碱性乙醇溶液或水溶液中加温易皂化，生成肥皂、 磷酸甘油脂盐、氨基化合物等，进一步加热生成甘油、胆碱及磷酸。酸化水解后生 成游离脂肪酸及上述化合物的游离物质。因此能够利用卵磷脂在酸碱条件下水解的 特性，水解掉其中某些脂肪酸，从而改变卵磷脂的亲水性。 3 、卵磷脂的酶解。卵磷脂在磷脂酶的作用下水解。至少有四种以上的磷脂酶， 分别是磷脂酶a 卜磷脂酶a 2 、磷脂酶c 、磷脂酶d ，不同的酶作用于卵磷脂不同 3 江南大学硕士学位论文 部位，得到不同的酶解磷脂产品，氢化卵磷脂可以用镍做催化剂在适当的条件下进行 氢化，使脂肪酸部分的不饱和键变为饱和，以增强卵磷脂的稳定性，同时也有脱色、 脱味的效果。卵磷脂氢化后生成白色固状氢化卵磷脂，可用于化妆品、医药、润滑 油等行业。 1 2 2 3 卵磷脂生理功能 卵磷脂有着重要的生理功能，主要是通过胆碱来实现的，主要生理功为调整肌 体膜功能。细胞表面覆盖一层膜，内质网膜纵横于整个细胞，使细胞具片状结构， 组成生物膜的磷脂以卵磷脂和脑磷脂为主，其排列成双分子膜的基质，可自由横向 移动，起保护层作用。随着年龄增长，肌体代谢产生的自由基攻击和破坏细胞而引 起人体衰老，而磷脂则有增强人体抵抗力作用，促进神经传导，提高大脑功能。磷 脂在美国曾一度被称为大脑食品。人脑约有1 5 0 亿个神经细胞，神经细胞之间的信 息传递依靠乙酰胆碱进行。食物中的卵磷脂经消化释放出胆碱。胆碱随血液循环系 统进入大脑，在胆碱乙酰转移酶的作用下，与乙酰辅酶a 反应，生成乙酰胆碱。乙 酰胆碱含量的增加能促进大脑神经突触迅速发达，从而使大脑中的神经细胞之间的 信息传递速度加快，提高注意力和思维功能，记忆力也得到加强。此外，卵磷脂还 能改善或配合治疗各种神经官能症，有助于癫痫和痴呆等病症的康复。人体进入老 年状态后，血液中胆碱含量明显下降，相应地大脑中的胆碱含量也下降，因此老年 人容易出现行动迟缓，记忆力衰退的情况。老年人补充卵磷脂能有效地减轻这种症 状。 乳化特性。从磷脂酰胆碱地结构我们可以看出，它是由磷脂型的阴离子和季胺 盐形式的阳离子组成，因此磷脂酰胆碱是天然的两性离子表面活性剂。卵磷脂，尤 其是高纯度的卵磷脂，具有良好的o w 乳化功能。其良好的乳化特性使得卵磷脂不 仅能阻止胆固醇在血管内壁上沉积，降低血清中的胆固醇水平，而且还能改善脂肪 的吸收和利用。另外，卵磷脂是血管细胞的重要组分，其数量减少会使血管壁细胞 容易硬化。因而卵磷脂对预防心血管疾病有重要的作用。另外，磷脂良好的乳化性 可以降低血液粘度，促进血液循环，改善血液供氧循环延长红细胞生存时间并增强 造血功能。补充磷脂后，血色素含量增加，贫血症状有所缓和，在应用于再生障碍 性贫血的配合治疗有不错的效果。 促进脂肪代谢，防止脂肪肝。胆碱对脂肪有亲和力，有促进月旨肪以磷脂形式由 肝脏通过血液输送出去或改善脂肪酸本身在肝中的利用，并防止脂肪在肝脏里的异 常积聚。卵磷脂是干细胞的重要组成成分，所有的肝细胞膜的损伤都与其缺乏有关， 而患肝病病人经常出现磷脂合成的障碍，因此肝病病人更需要补充磷脂，其在防止 脂肪肝、肝炎、肝硬化方面已经取得良好的效果。 改善血液循环，增强造血功能。随着年龄的增长，胆固醇在血管中沉淀引起动 脉硬化，诱发心血管疾病的出现，磷脂有良好的乳化特性，阻止胆固醇在血管内壁 沉积，降低血液粘度，使血色素增加，贫血症状减少。具有预防心血管疾病和障碍 性贫血的治疗。 防止动脉硬化和脑出血。磷脂中的胆碱成分可使对人体有益的高密度脂蛋白上 升，预防动脉硬化，心肌梗塞及脑出血等疾病，也可促进脂溶性维生素的吸收。促 进体内转甲基代谢的顺利进行。在肌体内，能从一种化合物转移到另一种化合物上 的甲基称为不稳定甲基，酯转化过程有重要的作用，诸如该过程称为转甲基过程( 或 酯转化过程) 。体内参与肌酸合成( 对肌酸的代谢很重要) 、肾上腺素之类激素的合成 并甲酯化某些物质以便使其从尿中排出。胆碱是不稳定甲基的重要来源，可使体内 4 第一章绪论 转甲基反应顺利进行卵磷脂及其衍生物的抗肿瘤功能。关于卵磷脂及其衍生物的抗 肿瘤作用越来越受到人们的重视，结果表明，研究人员对三种氮杂磷脂的抗癌作用 进行了药物屏不同磷脂衍生物对肿瘤的抑制效果不同，结肠癌和黑色素瘤对这三种 药物敏感，而白血病只对其中一种敏感。研究人员针对不同人体肺癌细胞，研究了 不同烷基的卵磷脂衍生物对其增生的抑制作用，结果表明十六烷基磷脂酸胆碱是一 种新的选择性抗癌药物，其作用比溶血卵磷脂更有效。卵磷脂具有免疫调节功能。 由磷脂组成的脂质体能够包容水溶性物质，一些抗原还能够通过共价或非共价键与 脂质体中质脂层结合，这一性质在免疫学上的应用己经受到重视。与其它脂质体相 比，磷脂由于其良好的生物降解特性，不会引起注射部位的肉芽肿，并且能够防止 被包埋的抗原可能引起过敏反应 6 1 。在免疫学研究中所采用的类脂一般是卵磷脂、 胆固醇和带负电性的二酰磷脂或磷脂酸，以及带正电性的十八烷。卵磷脂是脂质体 中最重要的组分，与磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和磷脂酸相比，卵磷脂是非常弱的抗 原。脂质体携带抗原和半抗原的作用能够调节免疫的功能，与游离的抗原相比，脂 质体包埋的抗原能提高抗体的滴定度 7 1 。 1 2 2 4 卵磷脂的应用 乳化剂，卵磷脂以多种形式存在于食品乳状液中，通常与其他乳化剂和稳定剂 相结合而起到乳化作用。卵磷脂可以用于水油( w o ) 和油水( o w ) 型的乳状液中。 抗氧化剂卵磷脂的抗油脂氧化目前己在油脂生产中得已应用。实验表明，卵磷脂在 油中含量 o 2 ，可以明显提高菜籽油、葵花籽油、鱼油等的抗氧化作用。据报道， 人造卵磷脂在某些金属离子存在的情况下，抗氧化活性很高【”。 新型保健食品，卵磷脂的诸多保健功能使其成为一种倍受人们注目新型保健食 品。美国食品和药物管理局( f d a ) 将卵磷脂列为公认安全物质，联合国粮农组织 ( f a o ) 和世界卫生组织( w h 0 ) 的专家委员会报告规定对卵磷脂的摄取量不做限量要 求【矾。 在医药上的应用，磷脂不仅可以直接应用于医药而且还可以作为合成其他药物 的原材料应用于医药。高纯度卵磷脂比普通磷脂乳化性能更好，作用的p h 值更宽， 可辅助治疗降低胆固醇及神经紊乱，以及作为脂肪注射液中的乳化剂。卵磷脂可以 配合其他材料用于制作脂质体，如：1 7 5 卵磷脂、o 8 7 5 胆固醇、o 8 7 5 脑磷脂、 7 乙二醇和8 2 p b s 为脂质体膜，结合n e o c a r z i n o s t a t i n 生产的抗癌脂质体 ( j p 0 7 ，2 7 8 ，0 1 6 ) ；卵磷脂、二肉豆范酞磷脂酰甘油和。y c l o s p o r i n 以摩尔比1 9 ：3 ：1 形 成脂质体，能抑制癌细胞的生长；以卵磷脂、磷脂酰甘油和c y c l o s p o r i n d e 摩尔比2 5 ： 3 ：1 和1 7 ：3 ：1 形成脂质体被用作免疫抑制和增强a n t i e o p l a s t i c s 对抗药性癌细胞的功 效。将磷脂酶d 作用于p c 时，可产生磷脂酸和胆碱，提供给人们使用。磷脂酶和 其他酶的单独作用或结合使用，己经用于医疗工业中制备稀少的磷脂酰丝氨酸、磷 脂酰甘油和其他特殊结构的磷脂，磷脂酸核昔酸可作为抗癌药，磷脂酰唾液酸能延 长药物的半衰期。磷脂酶a 作用于磷脂酰胆碱脱去s n - 2 位上的脂肪酸可得到溶血 卵磷脂，溶血卵磷脂有比卵磷脂更强的溶解性，在生物上有更为重要的作用。有研 究人员证明外源性溶血卵磷脂可诱导红细胞与成纤维状细胞的融合。许多例子显示 在膜上的溶血卵磷脂改变了酶的活性，某些溶血卵磷脂也具有抗肿瘤功能，据报道， 有的磷脂酰胆碱在体内具有抗肿瘤活性。另外，某些卵磷脂还有抗病毒活性或增加 抗病毒药物的效力p 】。 江南大学硕士学位论文 1 3 蛋黄磷脂的主要提取技术 1 3 1 干馏法 该方法为我国民间常用的传统制备方法。贾传春等报道 9 1 的制备步骤是：将鸡 蛋煮熟后去壳取蛋黄，置锅内文火加热，待水分蒸发后再用武火，在2 8 0 ( 2 左右即 可熬出蛋黄油，过滤装瓶备用即可。此法制备简便，但是出油率非常低( 公华等报道 f l o 大约是1 6 3 呦、质量也很差、色泽深褐、大量生产易使环境污染。其成分据肖小 年等报道【1 1 】基本不含磷脂，并另据孙哗等报道【1 2 】此法在高温条件下制备的蛋黄油有 较高含量的致癌物苯并芘，并且其它蛋黄成分不能利用。 1 3 2 有机溶剂法 该方法是工业上普遍所采用的，其原理是根据蛋黄油不溶于水，却溶于脂肪溶 剂如：乙醇、三氯甲烷、乙醚等的性质而进行分离的方法。但是由于溶剂的种类和 萃取的条件不同，被提取出来的脂质数量和组成也有很大的差异。国外多采用混合 溶剂法制备，例如采用正己烷一异丙醇0 3 - 1 4 】，一般提取率为7 5 ，产品质量较高， 但是混合溶剂相对单一溶剂而言残留更多，并具有一定的毒性。国内多采用乙醇制 备 1 5 - 1 叼，一般提取率为7 0 ，其中磷脂质含量较前者量高，质量较好，但同样会存 在溶剂残留。另外副产品蛋白块也变性严重。 1 ：3 3 超临界c 0 2 萃取法 这是一项现代颇为流行的高新萃取技术，其原理是在一定压力和温度下，c 0 2 变成超临界流体后作为溶剂将油从原料中浸出，然后改变压力和温度使c 0 5 变为气 态，从而使油滞留下来，达到萃取的目的。这项技术对应用于制备蛋黄油脂质而言， 蛋黄磷脂质是主要产品，蛋黄油( 甘油三酸酯和胆固醇) 是副产品。由于超临界c 0 2 萃取法要求以蛋黄粉为原料和所用萃取设备属高压设备。因此，生产成本相应偏高。 此法实验研究有较多报道，大规模的工业化生产还未实现。 1 4 课题的提出及国内外研究进展 据估测，1 9 9 9 年我国禽蛋总产量为2 2 5 9 3 9 万吨，人均占有1 7 公斤，禽蛋生 产连续十几年保持世界第一。目前我国禽蛋加工严重滞后，最常见的禽蛋消费形式 仍是鲜蛋、皮蛋和咸蛋。从市场的角度考虑，禽蛋作为大宗农产品，其价格的波动 就是明显的例证。因此，中国的蛋品工业要想进一步稳定发展，必须在保鲜鲜蛋、 蛋活性物质的提取上进行研究、开发生产，以拓展消费空间。 目前，国内外研究蛋黄卵磷脂所使用的蛋源都是鸡蛋，鸭蛋提取卵磷脂的研 究几乎是空白的，而鸭蛋黄中含有丰富卵磷脂，卵磷脂具有多种保健功能，在医药、 食品、化工、保健品、化妆品行业中有广泛应用。因此，有必要对鸭蛋黄卵磷脂进 行研究。 目前，卵磷脂的提取方法中主要有干馏法、有机溶剂法、超临界萃取法等。干 馏法在高温条件下制备的蛋黄油有较高含量的致癌物苯并芘，并且其它蛋黄成分不 能利用。采用混合有机溶剂法提取的卵磷脂产品的溶剂残留较高，具有一定的毒性。 6 第一章绪论 国内多采用乙醇制备但同样会存在溶剂残留，另外副产品蛋白块也变性严重。而超 临界萃取法的生产成本过高，对设备的要求较高。鉴于蛋黄卵磷脂作为禽蛋中的高 附加值产品，以及目前国内外蛋黄磷脂主要制备技术存在的缺点，因此有必要研究 出一种新型的制备工艺来弥补上述的不足。 酶法取油的作用原理是通过酶的作用降解细胞壁或脂蛋白、脂多糖等脂类复合 体，从而促使油脂的释放【l 。”。酶解反应可以避免传统工艺的溶剂残留现象，具有 工艺流程短、设备简单、反应条件温和等优点，并且特别适合于直接从高水分原料 中提油。对于蛋黄中脂蛋白之类的复合体，如能实现酶解分离，则在制备提取油脂 的同时，余下的蛋白质部分也将是综合利用价值很高的副产品。因而，酶法具有传 统制油工艺所不能比拟的优势。 国内外许多学者对水酶法制油进行了广泛的研究，认为温和的酶处理条件在提 高油脂的品质、提取率以及提高副产品质量方面存在优势。1 9 7 9 年，o l s e n o s 将蛋 白酶应用到大豆油和蛋白质水法分离中，以酶解脂蛋白释放油脂，开始了水相酶处 理提取油脂的研究。1 9 9 3 年，s o s a l k i0 9 等人对c a n o l a 油料先进行酶处理再进行压 榨，未经酶处理的c a n o l a 油料出油率仅为7 2 ，经过酶处理后可达9 0 - 0 3 。王 璋【2 0 1 等人研究了酶法从全脂大豆中同时制备大豆油和大豆水解蛋白的工艺，水提过 程的最佳工艺条件为固液比l ：1 0 。温度4 4 ，p h7 7 和提取时间3 6m i n 。含油大 豆蛋白进行2 次有控制的酶解，从乳化油分离得到纯度较高的大豆油，水解蛋白和 油的得率分别达到7 4 和6 6 。钱俊清【2 l 】等人研究了用中性蛋白酶水解大豆，开 创了大豆水相酶法有机溶剂萃取提取大豆油的工艺并对其进行优化，使油的酶法制 取成为现实。这个工艺是在水相提油工艺的基础上加入与水不相溶的有机溶剂，以 提高提油效果，有机溶剂可以在酶处理之前加入也可以在酶解之后加入。钱志娟1 2 2 1 等人也在国外酶解预处理的研究基础上建立了玉米胚水酶法提取油脂及蛋白质的 新工艺，对热处理工艺进一步优化，同时对酶配方进行了研究。刘志强幽1 等人为降 低花生水酶法制油的花生蛋白残油率，以花生含油蛋白水提液为研究对象，研究酶 解花生蛋白条件对残油率的影响。曾云龙【2 4 】等人采用水相酶解法提取菜籽油和菜籽 蛋白。酶法提油取代传统的预榨一浸出或溶剂浸出工艺，安全可行、意义深远，若结 合油料蛋白的开发，则能更好的利用废弃资源。 采用低水分酶法预处理制油工艺时，可以提高传统制油工艺的出油效率，尤其 对于高油分油料。而鸭蛋黄作为一种高油料物质，可以进行这种尝试。王辉等利用 酶法一溶剂法分离提取蛋黄油【2 5 1 ，这种方法能减少溶剂残留，但酶解结束后蛋黄成 稀粘稠的状态，溶剂的使用量偏大，出油条件难以控制，先酶解再萃取的方法，增加 了操作的时间，对卵磷脂的品质有一定影响。因此，使用水相酶解同时有机相连续 萃取的方法不失为一种新的尝试，这种方法的在蛋制品方面的报道在国内还未见。 1 5 本论文研究的内容 1 卵磷脂检测方法的建立。根据卵磷脂的性质和卵磷脂提取的各个过程的特点， 采用了不同的检测方法，分别为无机磷法，紫外分光光度法，薄层扫描和高效液相 色谱法。 2 酶解蛋黄粉工艺路线的确立，以及工艺条件的优化。通过大量实验分析，确立 了水相酶解有机相连续萃取的方法。在工艺条件部分，对溶剂种类、酶种类、酶组 7 江南大学硕士学位论文 合进行实验比较，找出最佳组合。确立工艺后，对酶解的各个因素，温度、时间、 加酶量进行单因素和正交实验分析，优化工艺条件。 3 蛋黄磷脂租产品的精制。本文精制卵磷脂的方法以安全、经济为前提，对精制 方法进行比较分析后，初步探讨了柱层析法精制卵磷脂的工艺条件。首先比较了硅 胶、氧化铝为固定相层析柱的卵磷脂精制效果，并对固定相的含水量、柱型对精制 的影响进行了研究，初步建立了以氧化铝为固定相，单一乙醇为流动相的精制方法。 最后，层析的洗脱液经过浓缩、干燥，制成了高浓度卵磷脂产品。 8 第二章检测方法的建立 2 1 引言 第二章检测方法的建立 蛋黄磷脂检测方法通常有多种，汪勇【2 6 】等通过测定无机磷含量测定磷脂的总含 量。e w aw a s z k o w s k a 2 7 】等使用紫外分光光度法测定保健品中卵磷脂的含量，原理 是在卵磷脂的最大吸收波长处，卵磷脂含量和吸光度值成一定关系，这种方法较简 便，检测结果较准确。彭一叫船】等使用薄层扫描法定性卵磷脂，定性结果较合理。 t a eh oy o o n 2 9 1 、胡新平【3 0 】利用高效液相( h p l c ) 检测高纯度卵磷脂样品，通过 高纯度卵磷脂标样的检测，高效液相色谱可以定性、定量样品中的卵磷脂，具有简 单、准确、快速的优点。 然而各种方法存在各自的不足，因此，对于不同分离提取阶段的蛋黄磷脂，可 以用不同的检测方法定性、定量。结合各种方法的优点，本文分别使用了无机磷测 定、紫外分光光度法、薄层色谱和高效液相四种方法。 2 2 实验材料和设备 2 2 1 材料和试剂 鸭蛋 磷脂酰胆碱( p c ) 异丙醇( 分析纯) 正己烷( 分析纯) 三氯甲烷( 分析纯) 甲醇( 分析纯) 0 4 羧甲基纤维素钠溶液 9 5 乙醇 2 2 2 实验仪器 d e l t a 3 2 0 - sp h 计 t d l - 4 0 b 型台式离心机 超级恒温水浴锅 s c 一2 型磁力搅拌器 7 2 1 紫外分光光度计 日立高效液相色谱 p b2 0 0 2 - n 型电子分析天平 p b 2 0 3 - n 型精密电子分析天平 市售 s i g m a 公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 梅特勒托利多仪器公司 上海安亭科学仪器厂 上海实验总厂 上海线曹行无线电元件厂 上海市第三分析仪器厂 日立公司 梅特勒一托利多仪器( 上海) 有限公司 梅特勒一托利多仪器( 上海) 有限公司 1 0 1 3 b s 电热恒温鼓风千燥箱上海跃进医疗器械厂 9 江南大学硕士学位论文 分蛋器 2 3 实验方法 2 。3 。1 蛋黄粉的割备 市售鸭蛋，分离蛋黄、蛋清，蛋黄用冷冻干燥机干燥成块状，研碎成粉状，放 入干燥器备用。 2 3 2 无机磷法测定蛋黄粉中磷脂总含量 蛋黄磷脂中含有多种磷脂，如磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺等，如果分别测定各 种磷脂含量，容易引起较大的误差，检测也较繁琐。因此，可以通过测定无机磷含 量最终测定磷脂总含量。 2 3 2 1 磷脂分析：按( ；b 5 5 3 7 8 5 来测定 ( 1 ) 溶液配制： a 2 5 钼酸钠稀硫酸溶液：量取1 4 0 m l 硫酸注入3 0 0 m l 水中，摇匀，冷却 至室温，加入1 2 5 9 钼酸钠，溶解后加水至5 0 0 m l ，摇匀，静置2 4 h 备用。 b 磷酸标准溶液：称取无水的磷酸二氢钾0 4 39 1 8 溶于1 0 0 0 m l 水中，作为1 号液；取1 号液，稀释至含磷量0 0 0 1 m g m l ，作为2 号液，比色用。 c 绘制标准曲线：取5 0 m l 比色管，编成l ，2 ，4 ，6 ，8 五个号码，按号码顺序分 别注入磷标准溶液2 号液1 ，2 ，4 ，6 ，8 m l ，再按顺序分别加水9 ，8 ，6 ，4 , 2 m l ，接着向5 支管内各加0 0 1 5 硫酸铜溶液8 o m l g 各加钼酸钠稀硫酸溶液2 ，o m l ，加塞，摇匀。 去塞，将5 只管置于正在沸腾的水浴中加热l o m i n ，取出冷却至室温，用水稀释至 5 0 m l ，充分摇匀，经l o m i n 后，用分光光度计在6 5 0 h m 波长下，用3 c m 比色皿， 用水调整零点，分别测定消光值。以消化值为纵坐标，以磷量( o 0 1 ，o 0 2 ，o 0 4 ，0 0 6 ， 0 0 8 m g ) 为横坐标绘制标准曲线。 、 d 制备被测液：用柑祸称取试样约o o l g ( 准确至0 0 0l g ) ，加氧化锌o 5 9 ，先在 电炉上加热炭化，然后送入5 5 0 一6 0 0 的高温炉中灼烧灰化；( 白色) ，灼烧时间约 2 h , 取柑锅冷却至室温，用热盐酸1 0 份溶解灰份，并加热微沸5 m i n , 将溶解液过滤注 入l o o m l 容量瓶中，用热水冲洗塔锅和滤纸，待虑液冷却至室温后，用5 0m l 氢 氧化钾溶液中和至出现混浊，缓慢加盐酸使氧化锌沉淀全部溶解后，再滴2 滴，最 后用水稀释至刻度，摇匀。 e 比色：用移液管吸取被测液，根据含磷量计算出所需移取得被测液d ，将被 测液加入0 0 1 5 硫酸联氨8 o m l ，加2 o ml 钼酸钠稀硫酸溶液，加塞摇匀。去塞， 将比色管置于正在沸腾的水浴中加热l o m i n ，取出冷却至室温，用水稀释至5 0 m l ，充 分摇匀，经l o m i n 后，用分光光度计在波长6 5 0 n m 下，用3 c m 比色皿，用水调零 点。 测定消光值。 1 0 第二章检测方法的建立 2 3 3 紫外分光光度法测定蛋黄磷脂粗提物的含量 蛋黄磷脂粗提物含有卵磷脂、脑磷脂和少量脂肪，是一个复合组分，用紫外分 光广度法对这个体系的卵磷脂含量进行测定。过程如下： & 确定卵磷脂样品的最大吸收波长。首先用紫外扫描仪扫描蛋黄磷脂粗提物、 高纯度卵磷脂标样的最大吸收波长，比较两个样品的扫描结果，确定最大吸收波长。 b 标准曲线的建立：以高纯度卵磷脂为标样，分别以不同卵磷脂浓度为横坐标， 吸光度值为纵坐标，制定标准曲线。 c 样品处理：准确称取一定量试样，加入l o o m l 乙醚，室温浸泡2 4 h ，不断摆 动。用滤纸过滤于2 5 0 m l 凯氏烧瓶中，水浴中蒸干乙醚，加浓硫酸和浓硝酸各l o m l ， 加热消化，并不断补加浓硝酸，直至消化完全，溶液呈透明无色，定容至5 0 m l 、 摇匀。 d 比色测定：定吸取2 m l 稀释液，加入3 m l 定磷试剂，用水定容至2 5 m l ， 于4 5 水浴中显色2 5 r a i n ，冷却至室温，在相同条件下测其光密度( e ) 。 e 计算。 加标准品做回收率实验，向一定浓度的样品中精确加入一定量的标准品，用 紫外分光光度法测定卵磷脂含量，做回收率实验。 2 3 4 薄层色谱法对磷脂粗提物中成分的定性 蛋黄磷脂粗提物中含有多种成分，如卵磷脂、脑磷脂等磷脂和少量脂肪、蛋白 质等物质。在这个含有多种组分的物质中，需要对粗提物中的卵磷脂进行定性，而 薄层色谱是对卵磷脂定性的较好方法。 荐层层析法( t l c 法) 【3 l 】薄层层析法是过去几十年来发展起来的一种重要分析 方法，具有设备简单、快速、吸附剂和展开剂选样灵活、适合于小样分析、分析结 果直观等优点。其过程如下： 氛制板：称取2 0 9 孔径为6 r i m 的硅胶6 0 ，用4 5 m l lm o l l 的碳酸钠溶液稀释， 置于研钵中研磨，调成均匀的糊状物，用涂布器将糊状物均匀地铺在玻璃板上， 铺完后于室温下风干，使用前在1 l o 烘箱中活化。 b 点样：用毛细管在层析板距下端2 5 e1 1 1 处点三个样，分别为自制卵磷脂标准品、 自制卵磷脂样品和标准品和卵磷脂粗品，样点的间距为3 e m 。 c 展开：将展开剂置于层析缸中平衡3 0 m i n ，使溶剂的蒸气压在层析缸中达到平 衡，然后放入层析板，溶液自下而上在层析板上展开，上升速度约6 e m h , 当展 开到层析板高度的3 4 处即可取出，置室温下干燥。 d 显色：将显色剂均匀地喷雾在层析板上，可立即看到有黄色斑点出现。 2 3 5 高效液相( h p l c ) 法测定精制卵磷脂的含量 精制的卵磷脂成品纯度较高，一般的简易检测方法容易引起较大误差，本实验 使用高效液相色谱定量精制后的成品。高效液相色谱( h p l c ) 法是7 0 年代发展起来 的一种色谱分离方法，经过3 0 多年的发展，现在高效液相色谱法具有分离效能高、 选择性好、检测灵敏度高和检测速度快的特点，是目前国内外专家公认的准确测定 物质有效成分的先进方法，此法是目前在检测磷脂方面使用最广泛的方法。磷脂经高 江南大学硕士学位论文 效液相色谱分离后可用多种检测器进行检测。主要有h p l c r i 、h p l c u v 、 h p l c - m s 、h p l c e s l d ( 蒸发光散射检测器) 等。本文使用h p l c u v 进行检测。 主要步骤如下： ( 1 ) 标准溶液的配制，用十万分之一电子天平准确称取高纯度的p c 的标准样 品2 0 1 8 m g ，用少量氯仿溶解，超声波处理1 0 m i n ，然后用正己烷定容于1 0 0 m l 的 棕色容量瓶中，保存，备用。 ( 2 ) 样品制备，称取少量精制卵磷脂于5 0 m l 的容量瓶中，用少量氯仿溶解， 正己烷定容，从容量瓶中移取l m l 液体于t o m l 容量瓶中，再用正己烷定容到1 0 m l 。 ( 3 ) 色谱条件的初探。流动相的配比将直接影响峰形、出峰时间等，从而影 响样品的分离效果。文献p 2 1 报道正己烷、异丙醇、水成混合流动相对h p l c 法测定 卵磷脂的效果较好，本文探讨正己烷、异丙醇、水的不同配比的流动相对分离效果 的影响。 ( 4 ) 加标回收率实验。 2 4 结果与讨论 2 4 1 无机磷含量测定 以磷量0 m g ，0 0 1m g ，o 0 2 m g ，0 0 4 m g ，0 0 6 n a g ，o 0 8 m g 分别测定消 光度值，测定结果见下表： 表2 1 磷含量和消光度值 堡盒星! 型丝! qq ：! !q ：! ! ：! 兰q ：! ! ：! ! 消光度0 o 0 6 1o 11 20 2 2 7o 3 4 9o 4 6 8 0 5 o 4 越o 3 采 辨o 2 d 1 0 00 0 20 0 40 0 6 磷含量( r a g m l ) 图2 - 1 磷含量和消光度关系图 由图2 一l 可以看到，标样曲线在磷含量o o 0 8 m g 范围内线性关系良好。因 此以图2 一l 为磷含量的标准曲线。 1 2 第二章检测方法的建立 测定蛋黄粉中各组分的实验结果如下： 表2 2 蛋黄粉及各组分的消光度值 由公式y = 5 8 3 4 7 x - - 0 0 0 1 4 计算得到蛋黄粉中磷含量，最终得到蛋黄粉中磷脂 总含量。 2 4 2 紫外分光光度法 分别对卵磷脂标样和粗提卵磷脂做紫外波长扫描，扫描曲线见下图： 瓿 1 0 0 0 ；，。* 一一。4 。- _ 。_ 。_ 。_ _ _ _ 十。一一