（食品科学专业论文）紫苏中迷迭香酸的提取及紫苏提取物抗氧化性的研究.pdf

摘要 紫苏是一种在我国广泛分布的唇形科植物，是国家卫生部首批颁布的既 是食品又是药品的6 0 种中药之一，含有多种具有生理活性的化学成分，其中 的迷迭香酸具有很强的抗氧化性。本文研究了紫苏中迷迭香酸的提取方法及 紫苏提取物的抗氧化性。 首先，通过实验确定采用f e s 0 4 法测定迷迭香酸的含量时，乙酸乙酯萃 取的最佳萃取级数为3 次，料液溶剂比为5 ：3 ( v v ) 。对选定的热水浸提法的浸 提温度、浸提时间、浸提溶剂原料比三个因素进行了单因素实验，得到的浸 提温度为1 0 0 c 、浸提时间为3 0 m i n 、溶剂原料比为3 0 ：1 ( v w ) 。在此基础上进 行的三因素三水平的正交实验，得出最佳浸提条件为以4 0 ：1 的原料溶剂比， 在1 0 0 下浸提4 5 m i n ，再依据以上确定的萃取方法进行萃取，迷迭香酸的得 率为0 9 8 3 。萃取液经浓缩并真空干燥后得到了紫苏提取物。通过h p l c 定 性，f e s 0 4 法定量分析测得其中迷迭香酸的含量为3 7 4 9 ( w w ) 。 然后对紫苏提取物的抗氧化性进行了研究。结果显示，紫苏提取物清除 羟自由基的能力、对由f e 2 + 引发的卵磷脂脂质体过氧化的抑制作用、对h 2 0 2 引起的溶血反应的抑制作用及对温育小鼠肝匀浆过氧化脂质生成的抑制作用 均强于对照标准物一抗坏血酸。而紫苏提取物的还原力、清除超氧阴离子自 由基的能力稍弱于对照标准物一抗坏血酸，对脱氧核糖氧化损伤的抑制作用 则稍弱于对照标准物一硫脲。 关键词：紫苏，迷迭香酸，提取，抗氧化 a b s t r a c t f o l i u mp e r i l l a e ，w i d e l ys p r e a di nc h i n a ，w a si nt h el i s to fs t u f f s ，w h i c hw e r e b o t hm e d i c i n ea n df o o d ，a n n o u n c e d b yt h e c h i n am i n i s t r yo fh e a l t h ，a n d c o n t a i n e dm a n yk i n d so fb i o - a c t i v es u b s t a n c e s o n eo ft h e s es u b s t a n c e sw a s r o s m a r i n i ca c i d ，w h i c hh a dv e r y s t r o n ga n t i o x i d a n ta b i l i t y i n t h i s p a p e l t h e o p t i m u me x t r a c t i n gc o n d i t i o no f r o s m a r i n i ca c i d ( r o s a ) f r o mp e r i l l a el e a v e sa n d t h ea n t i o x i d a n ta b i l i t yo ft h ee x t r a c tw e r es t u d i e d f i r s t l y , c o n d i t i o n o fe x t r a c t i o nw i t h e t h y l a c e t a t e w e r ed e t e r m i n e da s e x t r a c t i n g 3t i m e sa n dt h er a t i oo fe x t r a c tt os o l v e n t 5 ：3 ( v v ) w i t h t h e s i n g l e f a c t o re x p e r i m e n t s ，s o a k i n gc o n d i t i o n so fh o tw a t e rw e r er e a c h e d a sf o l l o w ： t e m p e r a t u r eo ft h ew a t e r1 0 0 。c ，s o a k i n gt i m e3 0 r a i n ，r a t i oo fw a t e rt om a t e r i a l 3 0 ：1 ( v w ) 。w i t h t h eo r t h o d o x e x p e r i m e n t s ，t h eo p t i m u me x t r a c t i n gc o n d i t i o nw a s d e t e r m i n e d i tw a sc o n c l u d e dt h a th o tw a t e rs o a k i n g ，w i t ht h es o a k i n gr a t e ( w a t e r t om a t e r i a l ) 4 0 f f ( v w ) ，s o a k i n gt e m p e r a t u r e1 0 0 ，s o a k i n gt i m e4 5 m i n u t e sa n d t h er a t i oo fe x t r a c tt os o l u t i o n5 ：3 ( v v ) ，w a st h eb e s te x t r a c t i n gm e t h o d u n d e rt h i s c o n d i t i o n ，t h ee x t r a c t i n g r a t eo fr o s ac o m dr e a c h0 9 8 3 a f t e rd r i e du n d e r v a c u u m ，t h ep e r f l l a e e x t r a c tw a sc o l l e c t e d t h e q u a l i t a t i v ea n a l y s i sb yh p l c s h o w e dt h a ti tc o n t a i n e dr o s a , a n dt h eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i sw i 也f e s 0 4m e t h o d s h o w e dt h a tt h ec o n c e n t r a t i o no fr o s ai np e r i l l a ee x t r a c tw a s 3 7 4 9 ( w w ) s e c o n d l y , t h ea n t i o x i d a n ta c t v i t i e so fp e r i l l a ee x t r a c tw a s s t u d i e d t h ee x t r a c t s h o w e ds t r o n g e ri n h i b i t i n ga b i l i t yo fp e r - o x i d a t i o ni nl i p o s o m ei n d u c e db yf e ”， s c a v e n g i n ga b i l i t yo nh y d r o x y lr a d i c a l ( 。o h ) ，i n h i b i t i n ga b i l i t yo f t h eh a e m o l y s i s i n d u c e d b yh 2 0 2 a n d i n h i b i t i n ga b i l i t yo f t h e1 2 0f o r m a t i o ni nt h eh o m o g e n a t eo f r a tl i v e ri nv i t r ot h a na s c o r b i ca c i d h o w e v e rt h ep e r i l l a ee x t r a c ts h o w e ds l i 【曲f l y l o w e rr e d u c i n gp o w e rr s c a v e n g i n ga b i l i t yo ns u p e r o x i d er a d i c a l ( 。0 2 1 ) i nv i t r o t h a na s c o r b i c a c i d ，a n d l o w e r i n h i b i t i n ga b i l i t y o ft h eo x i d i z a t i o no f 2 - d e o x y r i b o s et h a n s u l f u o u r e a r o s aw a sas u b s t a n c es t a b l et ol i g h ta n dh e a t t h e n ，t h er e l a t i o nb e t w e e nt h e s t r u c t u r eo fr o s aa n da n t i o x i d a n t a b i l i t ya n di t sm e c h a n i s mw a sa n a l y z e di n t h e o r y k e y w o r d ：f o l i u mp e r i l l a e ，r o s m a r i n i ca c i d ，e x t r a c t ，a n t i o x i d a n ta b i l i t y 天津科技大学硕士学位论文 1 1 紫苏 1 前言 1 1 1 概述 紫苏亦称茬，又名桂茬、赤苏等，据本草纲目记载：“苏乃茬类，而味 更辛如桂，故而雅谓之桂茬。”图经本草记载：“苏乃紫苏也，高二三尺，茎 方叶圆，叶下紫色而气甚香，夏采茎、叶，秋采实，俱堪入药用之。”现代植物 学记载：紫苏为唇形科一年生直立草本，具特异芳香。茎四棱，主茎发达，紫 色或绿紫色，密被柔毛。 紫苏是国家卫生部首批颁布的既是食品又是药品的6 0 种中药之一【1 】含有 多种具有生理活性的化学成分，且紫苏的抗氧化性是草本植物中的佼佼者，其 中的迷迭香酸具有很强的抗氧化性。 1 1 2 紫苏的分布 紫苏 p e r i l l a e f r u t e s c e n s 阻jb r i t t 系唇形科( l a b i a t e ) - - 年生草本植物，为喜 温的短日性植物，适应性强，作为多用途的经济植物在我国已有2 0 0 0 多年的栽 培历史，我国南北广大地区均有种植，资源遍布全国近2 0 个省份。世界上主要 分布在不丹、印度、缅甸、印度尼西亚、日本、朝鲜、韩国和前苏联等国，近 年来美国、加拿大也已开始商业性栽培【2 】口紫苏现已大规模种植，但由于季节 性强，受环境条件的影响等原因，不同产地与品种紫苏的生物活性成分的含量 差别很大1 。 1 1 3 紫苏的成分及应用 ( 1 ) 紫苏色素 紫苏色素是从天然植物紫苏的叶子中，经提取、分离、精制而得到的 液体或固体水溶性色素，主要成分为紫苏素( s h i s o n i n ) 和紫苏宁( s h i s o l a n 蛐，在 p h = 2 3 溶液中呈紫红颜色，色彩瑰丽夺目。广泛应用于饲料、腌菜、糕点、糖 果、罐头、冷饮及孚l 制品的着色。 ( 2 ) 紫苏的挥发油成分( 4 】 紫苏所含的挥发油，在其叶中含量0 + 2 o 9 ，全草含量为o 2 0 0 7 8 。 挥发油的成分因品种、产地等因素，差异较大，主要有以下几种：1 ) 紫苏醛型： 主要是紫苏醛和柠檬烯；2 ) 呋喃酮醛型：主要是香蕾酮、紫苏酮、弯刀酮、异 白苏酮等；3 ) 苯基丙烷型：时萝油脑、榄香素和肉豆蔻醚等；4 ) 柠檬醛型： 1 前言 主要为柠檬醛，其他还有紫苏醇、紫苏酮、薄荷醇、薄荷酮、蒎烯、丁香油酚、 白苏烯酮等有机化学物质。 ( 3 ) 紫苏营养成分1 2 j 紫苏大叶中蛋白质含量高达2 2 以上，脂肪5 ，粗纤维1 4 4 ，钙1 1 ， 磷o 2 7 ，氨基酸种类齐全，既含有成人必需的8 种氨基酸，也含有儿童必需 的多种氨基酸。紫苏还含有1 3 一胡萝h 素、维生素c 、维生素e 等等，l k g 紫 苏中的主要营养成分为b 一胡萝h 素8 7 m g 、维生素c 5 5 0 m g 、维生素e 3 7 m g a 紫苏中的矿物质主要有z n 、f e 、c u 、c o 、m n ，其含量分别为3 8 2 5m g k g 、2 1 5 0 m g k g 、3 5 9m g k g 、1 0 8m g k g 、3 0 3m g c k g 。此外还含有p p ，p 等多种活性营 养物质。 1 1 4 紫苏的生物活性 紫苏作为一种具有上千年应用历史的传统中草药，其药理作用在历代著 作中多有收载。据中药大辞典，紫苏的叶、茎、苞、籽均可入药，集各家 论述，苏叶主要有解热散寒，止咳化痰，解鱼蟹毒，行气宽中，止痛，安胎， 抗菌，止霍乱呕吐，开胃下食，止脚气等功效；苏梗有理气，疏肝，和血， 解郁，止痛，化痰涎，安胎，散虚肿满等功效；苏子有下气消痰，除咳定喘， 清气开郁，润心舒肺，利隔宽肠，温中止痛等功效；苏苞则是治疗血虚感冒 的最佳部位。以上虽仅是将紫苏作为中药成分的研究，却预示其中含有丰富 的生物活性成分，近些年来科学家对紫苏的近百种化学成分进行了深入研究， 表明紫苏籽中的a 一亚麻酸是维持大脑神经系统功能所必需的因子，具有抗血 栓、降低血压、减肥、降血脂、预防癌变和抑制肿瘤转移的作用，提高学习 记忆力和视力功能、改变过敏体质等。紫苏提取物对皮肤癌、肺癌、大肠癌 等有抑制效果，这一点在动物试验中得到了确认【5 1 。紫苏的生物活性主要集 中于以下几点： 1 ) 抗氧化、防衰老作用 龙盛京等的研究表i 韭j 1 6 紫苏中含多种儿茶酚( 邻苯二酚) 类化合物，均 具有较强的抗氧化性，通过实验还证明其中的咖啡酸蒲烯酯比常规抗氧剂 b h t 能更有效地防止紫苏挥发油主要活性成分紫苏醛的氧化。日本的 n a k a m u r ay o s h i m a s a 等人【7 l 研究发现紫苏中含量较为丰富的迷迭香酸具有超 氧化物清除活性，能明显抑制变异的h l 一6 0 细胞内超氧化物和过氧化物的 形成。赵全等【8 l 对紫苏叶提取物保健功效的研究表明紫苏叶提取物具有一定 的消除自由基、防止脂质过氧化、阻断亚硝基类物质的作用，对于人类防衰 老、保健有很独特的意义。 2 1 抑制某些酶的活性 紫苏成分能对多种引发人体病变的酶起到有效的抑制作用。日本的 2 天津科技大学硕士学位论文 n a k a n i s h i 等【9 1 从紫苏中分离出的两种咖啡酸酯对黄嘌岭氧化酶有强抑制作用， 能有效控制痛风时血尿酸过多。f u j i t a 等 1 0 l 研究发现紫苏中的紫苏a 、c 及相 关的单蒲类葡萄糖苷对醛糖还原酶具有较强抑制作用，这种酶能引发糖尿病并 发症如白内障等疾病。y a m a m o t o 等从去脂紫苏籽中得到一些酚类物质，能 抑制花生四烯酸一1 2 一脂氧合酶和花生四烯酸一5 一脂氧合酶活性，防止与之有 关的动脉粥样硬化、肿瘤扩散及一些过敏类反应。另外，a s a d a 等【1 2 】从紫苏热 水提取物中纯化出的糖蛋白可以抑制透明质酸酶( 1 c s o ( 半抑制浓度) = o 4 2 m g m l ) 及蛋白激酶( p k c ) 的活性。m i z u s h i n a 等【1 3 】从紫苏中提取出的q 一扁桃腈葡萄糖苷能有效抑n d , 鼠的d n a 聚合酶b ，i c 5 0 值为1 5 0 m g m l 。 3 、抗菌性 早在1 9 4 7 年我国研究者徐振就发现紫苏叶能抑制葡萄球菌生成1 1 4 j 。1 9 8 7 年，日本的h o n d a 等1 1 5 】研究表明紫苏油中的紫苏醛、柠檬醛具抗真菌作用，且 抗真菌时二者表现出协同效应。后来，美国的r a n h a e lk a n g 等【16 】研究表明紫苏 的水蒸气提取物具有广谱抗微生物活性，其中的主要成分紫苏醛具中等广谱抗 菌活性。日本f u j i t a 等1 1 7 】专利说明：紫苏中的单蒲类d 一葡萄糖苷、紫苏苷b 和c 也具有抗菌活性。国内刘小琴等【1 8 】研究了不同种类紫苏的抗菌活性，发现 紫苏对真菌和细菌均有抑制作用，但皱紫苏对绿脓杆菌，白苏对克柔氏念珠菌、 白色念珠菌和绿脓杆菌抑制效果更为明显。 蚋镇静作用 紫苏在传统中药中可用作镇静剂。日本的h o n d a 等【1 9 l 从紫苏中分离出具镇 静活性的成分，可延长服用巴比妥的小鼠的睡眠，主要为紫苏醛和豆图醇：后 又从中提取出了莳罗油脑( d i l l a p i 0 1 ) ，可延长环己烯巴比妥引起的睡眠【驯，i c 5 0 值为1 5 7 m g k g 。 5 ) 抗肿瘤活性 紫苏抗肿瘤活性研究不多，研究表明1 2 1 】从紫苏热水提取物中得到分子量 3 0 ，0 0 0 1 0 0 ，0 0 0 的肿瘤转移抑制剂，对小鼠i c s o 为2 9 k g 。另外韩国的l c c k i n a m 等【2 2 l 研究发现紫苏的正丁醇可溶部分对人皮肤黑瘤细胞具细胞毒活性。 6 、降血脂作用 苏子脂肪油能有效调节脂质代谢，降低血脂。严少敏等1 2 3 】、徐章华等【2 2 】 先后用苏子脂肪油进行了小鼠高血脂症实验，发现苏子脂肪油具有降低血清总 胆固醇( t c ) 含量的作用，并通过进一步实验证明苏子油能明显降低血清低密 度脂蛋白胆固醇( u ) l c ) ，虽对血清高密度脂蛋白胆固醇( h d l c ) 无明 显影响，但却提高了h d l c t c 和h d l c u 儿一c 比值，这足以表明苏子 油具有明显的调节血脂的作用，有利于预防和治疗与血脂过高有关的动脉粥样 硬化等疾病。 7 1 其他活性 1 前言 性。 此外，紫苏中成分还具有促进肠蠕动【2 4 】、抗凝血【2 5 】、抗过敏2 卅等生物活 1 2 迷迭香酸 1 2 1 迷迭香酸的结构 迷迭香酸( r o s m a r i n i ca c i d ，简称r o s a ) 是有一定生理活性的一种酚酸类 化合物，最早由e l l i s 从迷迭香( r o s m a r n u so f f i c i n a l i sl ) 这种植物中发现的， 故而得名。1 9 5 8 年，s c a r p a t i 和o r i e n t e 首先从迷迭香中分离得到迷迭香酸，并 且首次用化学降解法确定了其结构。它是咖啡酸的二聚衍生物，分子式是： c 1 8 h 1 6 0 s ，其化学名称为j r ( e ) 】a 一1 1 3 一( 3 ，4 - 二羟基苯基) 1 一氧代一2 一丙烯基】氧 基1 3 ，4 一二羟基苯丙酸，结构如1 - 1 图所示【1 3 】： 图1 - 1 迷迭香酸的化学结构 o h o h 如图所示，分子中的酚羟基数目和可以形成氨键的数目与分子的抗氧化活 性正相关，也是r o s a 具有强氧化活性的重要因素1 2 7 。迷迭香酸是一种多功能 的天然活性物质，具有相当大的开发价值。 自从其结构被确定以来，特别是谱学技术的发展为人们鉴定天然产物和分 析结构提供了十分便利的条件，人们对迷迭香酸的研究日益活跃，发现迷迭香 酸的分布广泛，并且发现迷迭香酸是很多药材和中成药的主要成分，迷迭香酸 有很强而且是多方面的生物活性，在饮料、化妆品及食品的抗氧化等方面有着 广泛的应用。 1 2 2 迷迭香酸的分布 迷迭香酸在植物中分布广泛，从高等双子叶植物到低等苔藓类、蕨类植物 都有含有迷迭香酸的报道，但主要分布于唇形科伍a m i a v e a e ) ，紫草科 ( b o r a g l n a c e a e ) ，和伞形科( a p i a c e a ) r 和。另外，在屠形科的其他一些植物中也发 现了迷迭香酸，如m e n t h a s p i c a t a 、t h y m u sv u l g a r i s 2 8 1 ，近来的研究表明几乎在 所有的唇形科植物中均含有迷迭香酸。l a m a i s o 1 6 1 等对唇形花科中2 8 个属1 0 0 种植物进行了迷迭香酸的检测，发现所有被检测的s a t u r o j o i d a e 亚科植物都含 有迷迭香酸。我国台湾省学者对唇形花科的7 2 种植物进行了迷迭香酸的研究， 发现雪见草( s a l v i a p l e b e i ak b r ) 中的迷迭香酸含量高达1 7 0 3 ，并且发现唇 4 天津科技大学硕士学位论文 形花科鼠尾草属植物地上部分的含量高于地下部分。 迷迭香酸在不同植物中的含量各不相同，即使在同一种植物中，其不同部 位的迷迭香酸的含量也不相同，如在m e n 踊as p i c a 加叶中迷迭香酸的含量只有 0 0 0 9 ，而在m e l i s s ao f f f i n a 胁的根中迷迭香酸的含量达到了4 5 7 4 2 9 1 。另 外，在些植物的柄、叶等的细胞培养物中，也发现了迷迭香酸，在这些细胞 培养中迷迭香酸是作为一种植物生长过程的代谢物【1 6 l 而产生的。不同产地与品 种的紫苏的迷迭香酸的含量差别也很大。 1 2 3 迷迭香酸的生物合成研究进展 迷迭香酸是植物体内的二次代谢衍生物，关于它的生物合成研究最初是由 e l l i s 和t o w e r s 3 0 j 开始的，他们在1 9 7 0 年首次确定了生物合成迷迭香酸的前体 即苯丙氨酸和酪氨酸，苯丙氨酸氨裂解酶( p a l ) 和酪氨酸氨基转移酶( t a t ) 是迷迭香酸生物合成途径中的进入位点( e n t r yp o i n t ) 酶。在随后的研究中c o l e u s b l u m e i 和a n 拍u s ao f f l c m a 括的细胞悬浮培养中产生大量的迷迭香酸，在1 0 年之 后，人们才确定了迷迭香酸生物合成中的其他的酶：酪氨酸氨基转化酶、肉桂 酸4 一羟化酶、羟基肉桂酰连接酶、羟基苯丙酮酸酯还原酶、迷迭香酸合成酶f 2 9 】 等，从而确定了迷迭香酸的生物合成路径。 1 9 9 3 年p e t e r s e n 通过硫酸铵分级沉淀( 6 0 8 0 饱和度) 、疏水反应色 谱法、亲合性色谱法以及凝胶过滤纯化了迷迭香酸合成酶，使该酶专活性提 高了2 2 5 倍，产率高达9 ，并再次证实了迷迭香酸合成酶是单体酶，其分子 量是7 7 k d a | ”1 。 1 2 4 迷迭香酸的生物活性 迷迭香酸具有极强而且是多方面的生物活性，主要体现在以下几个方面， 如：抗氧化、抗菌、消炎、抑制h i v 整合酶作用、抑制透明质酸酶等活性。 1 ) 迷迭香酸的抗氧化性 中国西北轻工业学院食品工程系进行的评价试验证明，迷迭香抗氧化剂具 有比b h t 更强的抗氧化作用【3 2 】。 作为天然抗氧化剂，迷迭香酸具有极强的清除体内自由基的活性，其抗氧 化性强于咖啡酸、绿原酸、叶酸等。由于其抗氧化性，迷迭香酸还能抑制内皮 细胞调节的低密度脂蛋白的氧化。它对h 2 0 2 引起的大鼠红细胞溶血和脂质过 氧化有显著的抑制作用，对由v i t c - n a d p h 或f e 2 + o 半胱氨酸诱发的大鼠脑、 肝、肾微粒的脂质过氧化都有很强的抑制作用 3 l 。 2 ) 迷迭香酸抗血栓和抗血小板聚集作用【3 3 】 中国医学科学院药物研究所邹正午作了迷迭香酸在大鼠体内的抗血栓和抗 血小板聚集的研究，得出结论：迷迭香酸有抗静脉血栓形成的作用，能使胶原 5 1 前言 诱导的血小板聚集受到抑制，并缩短优球蛋白溶解时间。 3 ) 迷迭香酸的抗菌活性 1 9 9 9 年，李荣贵等【3 】人从紫苏愈伤组织中分离得到了迷迭香酸，并且对迷 迭香酸的抗菌活性进行了研究，结果发现迷迭香酸是一种广谱性抗菌物质，而 且不同菌种对迷迭香酸的敏感性不同，大肠杆菌( j m l 0 9 ) 对迷迭香酸最为敏 感，其最低的抑菌浓度( m i c ) 为3 0 0 1 1g m l ，真菌立枯丝合菌对迷迭香酸的 敏感性最差，其最低抑菌浓度( m i c ) 为8 0 0ug m l ，而金黄色葡萄球菌介于 二者之间，它的最低抑菌浓度( m i c ) 为4 0 0 ug m l 。 e g g e n s p e r g e r 等认为迷迭香酸还可治疗皮肤病，还能抑制弹性蛋白的降解， 研究表明迷迭香酸可抑制革兰氏阴性菌大肠杆菌的生长。北大医院真菌病研究 中心的真菌试验表明，迷迭香酸可抑制人的表层真菌红色毛藓菌和深层真 菌白念珠菌。 舢迷迭香酸对透明质酸酶的抑制作用1 3 4 】 透明质酸酶( h a a s e ) 是裂解粘多糖的酶之一，可催化透明质酸( h a ) 的 分解，关系到血管系统的通透性和炎症反应。透明质酸( h a ) 是由糖醛酸和乙 酰氨基葡萄糖组成的一种粘多糖，具有多种功能，如治愈创伤、使皮肤润湿健 康、润滑关节和防止炎症等。因此，从天然产物中筛选具有抑制透明质酸酶激 活、同时又具有较强的抗变态反应的活性成分作为先导化合物，进一步开发新 的抗变态反应药物。迷迭香酸因为有较强的抑制透明质酸酶的作用( i c 5 0 值为 7 2 0 m g m l ) ，有望作为其先导化合物。 5 1 迷迭香酸的抗病毒活性 通过对迷迭香酸、咖啡酸以及绿原酸的抗病毒活性进行研究【3 5 1 ，发现咖啡 酸和迷迭香酸都有抑制单纯性疮疹病毒的活性，而绿原酸基本上没有这种活性。 a r d a 等发现变豆菜的纯水提取物具有抗h i v ( 人类免疫缺陷病毒) 的活性， 其中发挥作用的主要物质是迷迭香酸，m a z u m d e r p a l 等的研究进一步表明，迷迭 香酸能抑制h i v 1 ( 人类免疫缺陷病毒1 ) 整合酶的活性，其i c 5 0 值小于 l o m m o l l 。h a n g a y 等的研究发现迷迭香酸是控制疱疹病的一种有效成份。 由于迷迭香酸具有很强的抗人体免疫缺损病毒活性、很强的抗氧化活性， 在国际上迷迭香酸用于化妆品已有多项专利。迷迭香酸能抑制透明质酸酶的活 性，可保持透明质酸在表皮细胞长时间存在，因此迷迭香酸是化妆品中优良的 添加剂，可起到抗感染、去色斑、抗氧化、增加弹性、去疱疹等功能。 6 ) 抗炎作用1 3 i 德国n a n e r m a n n 公司于1 9 9 1 年把它作为抗炎、镇痛、解毒药物投放市场。 迷迭香酸的抗炎机理可能是：与抑制花生四烯酸代谢中的5 一脂氧化酶( 5 一l 0 1 有关。对补体依赖性p g l 2 的合成产生抑制作用，干扰不同途径c 3 转化酶的 活性。抗氧化及消除自由基。 天津科技大学硕士学位论文 此外，r o s a 还具有其它方面的功能，k w a k 等在专利申请说明中介绍，r o s a 能抗急慢性感染，抑制免疫细胞的非正常增殖，降低感染引起的非正常酶的活 性。 1 3 提取方法简介 1 3 1 热水浸提法 热水浸提法多用于中草药有效成分的提取，具有投资少、效率高、操作简 易等优点。 1 3 2 乙醇浸提法 乙醇浸提法也是常用的一种浸提方法，具有提取温度低、效率高、溶剂无 毒易除去、浸提液杂质少等优点。 1 3 3 超声波提取法【3 6 1 超声波是指频率在声频以上，即超过人耳所能感受的频率2 0 k h z 的弹 性波。超声波的频率也有上限，一般认为是5 1 0 6 k n z 。超声波是一种在弹性 介质中的机械振荡。它在介质中主要产生两种形式的振荡，即横向振荡( 横波) 和纵向振荡( 纵波) 。超声波发生器是超声波的波源，通常有3 种类型，即机械 系统、磁致伸缩振荡器和电致伸缩振荡器。 天然植物药用成分大多为细胞内产物，提取时大多需要将细胞破碎。现有 的机械或化学方法有时难以取得理想的破碎效果。超声提取法的基本原理：利 用超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌等特殊作用， 可以破坏植物药材的细胞，使溶剂渗透到药材的细胞中，以便使药材中的化学 成分溶于溶剂中，再通过分离提纯以得到所需要的化学成分。 1 4 活性氡与天然抗氧化剂 1 4 1 活性氧 地球上除厌氧生物外，所有动植物和需氧生物都离不开氧气。氧气参与新 陈代谢，线粒体的呼吸和氧化磷酸化，产生能量a t p ，它几乎是一切生命活动 的基础物质之一。但是，氧参与生命活动的同时也产生氧自由基，过量会引起 细胞损伤，导致疾病发生，氧气是一切氧自由基的来源和引起氧自由基损伤的 物质基础【3 7 1 。 氧气本身就是一种自由基，因为在氧分予的轨道上有两个未成对电子。氧 分子属三重态，具有顺磁性，但它很容易转变为自由基和活性氧( r e a c t i v eo x y g e n 1 前言 s p e c i e s ，r o s ) 。氧气在机体内代谢还原，提供了生物能源，最后生成水，共 接受4 个电子。在这一还原过程中，每接受一个电子就产生一个氧自由基和活 性氧。活性氧包括氧的一电子还原产物超氧阴离子( 0 2 ) 、二电子还原产物 过氧化氢( h 2 0 2 ) 、三电子还原产物羟自由基( o h ) 和脂质过氧化的中间产物 等。活性氧一方面对于能量供给、细胞生长调节、细胞间信号传递以及重要生 物分子合成有重要作用，另一方面，它通过加成、消除、取代以及提取物等反 应对生物分子有相当的损害，导致各种相关疾病的发生。 自由基是人体生命活动过程中生物化学反应的中间产物。在正常情况下， 体内的自由基的产生和消除处在动态平衡之中，但若是体内自由基产生过多或 清除过慢，则自由基会在分子水平、细胞水平以及器官水平给机体造成损伤， 例如它们可以进攻碳水化合物、蛋白质、脂类、核酸等，可以加快机体的衰老 过程，并可诱发癌症、心血管疾病等诸多疾病 3 7 】。 1 4 2 检测自由基的方法研1 ( 1 ) 电子自旋共振( e s r ) 波谱解析技术 电子自旋共振( e l e c t r o ns p i nr e s o n a n c e ，e s r ) 又称电子顺磁共振( e l e c t r o n p a r a m a g n e t i cr e s o n a n c e ， e p r ) ，是研究电子自旋能级跃迁的一门学科，是检 测自由基最直接有效的方法。 ( 2 ) 化学发光法 在活性氧、氧自由基反应过程中，释放能量，产生化学发光。利用高灵敏 度的发光仪如超微弱发光仪就可以直接观察。为了提高观察的灵敏度，常用鲁 密诺等作为发光增效剂。活性氧可以使鲁密诺氧化激发，在回到基态时释放出 特定波长的光。使用化学发光检测活性氧，灵敏、快速、操作简单、价格低廉， 目前被广泛用于活性氧的检测和研究。 ( 3 ) 利用脉冲辐解( p u l s er a d i o l y s i s ) 测量自由基的反位速率常数 脉冲辐解是测量短寿命自由基反应速度非常有效的方法，羟自由基的反应 速率常数就是用脉冲辐解方法测量的。利用直线加速器的离子脉冲，直接辐照 样品产生自由基。通过选择适当条件，可以产生某些特定的自由基，并以微秒 的数量级跟踪这些自由基反应。因为不同自由基的光吸收不同，利用示波器可 以显示这些自由基反应动力学性质。这个技术对研究羟自由基和超氧阴离子自 由基同生物分子的反应机理是非常有用的。 ( 4 ) 利用氧消耗测定氧自由基的生成 一个体系有氧自由基生成，就要消耗该体系的氧气。通过检测氧消耗就可 以测定氧自由基的生成。目前通常使用的是氧电极法，最近又发展起来一种自 旋探针测氧法。 氧电极法：利用氧电极可以很方便地测定溶液中的氧浓度，因此，可以用 天津科技大学硕士学位论文 它检测一个反应体系中的氧消耗，研究自由基产生的动力学过程。 自旋探针测氧法：利用自旋探针e s r 波谱的超精细结构随氧浓度改变来测 量一个反应体系的氧浓度的方法。 ( 5 ) 氧自由基的化学测定法 超氧阴离子自由基的化学检测法：四硝基甲烷、氮兰四唑、细胞色素c 、 肾上腺素、还原型辅酶等都能与超氧阴离子自由基反应产生具有特定光吸收的 物质，可用于检测超氧阴离子自由基，但特异性不强，其它氧化剂或还原剂也 可以发生类似反应，因此需要加以验证。 羟自由基的化学检测法：二甲基亚砜和羟自由基反应生成甲烷，甲硫丙 醛与羟自由基反应生成乙烯，用气相色谱可以检测。对硝基二甲基苯胺可以和 羟自由基快速反应失去其原来的黄色，以此可以检测羟自由基的产生。苯甲酸 与羟自由基反应生成具有很强荧光物质羟基苯甲酸，在3 0 5 n m 有激发光，在 4 0 7 n m 有发射光。另外，色氨酸和脱氧核糖都可以与羟自由基反应生成有特征 吸收的物质，可以用于羟自由基的检测。但以上方法都需要羟自由基清除剂的 验证。 过氧化氢的化学检测法：莨当亭( g c o p p l e t i n ) 与过氧化氢反应产生在 3 6 0 n m 有激发和在4 5 0 n m 有发射的荧光物质，以此可以检测过氧化氢的产生和 存在。 1 4 3 抗氧化剂与天然抗氧化剂 对抗氧化剂的一个较严格和普遍接受的定义是：任何物质当以低于氧化底 物浓度存在时，可以明显推迟或抑制底物的氧化，该物质就成为抗氧化洲3 8 1 。 抗氧化剂有化学合成的和天然物质的提取物，前者有叔丁对甲氧酚制剂( b h a ) 或丁基羟基甲苯( b h t ) 等。随着科学的进步，越来越多的人认识到化学合成 抗氧化剂的危害，故而人们需要高效无毒的天然抗氧化剂。 广义的抗氧化剂应不仅指能切断脂质过氧化链式反应的物质，而应指一切 具有还原性可直接清除自由基，或抑制启动自由基链式反应，终止自由基反应， 或可提高内源性抗氧化物质水平的化合物【3 9 】。 生物体总是处于不断的氧化之中，因而在生物体内脂类的自身氧化过程中， 含氧自由基的产生是必然的。相应的，生物体内又具有对氧化反应和含氧自由 基能够起到调控作用和防御损伤的化合物，这就是天然抗氧化剂。许多天然抗 氧化剂不但对油脂和含脂食品具有比合成抗氧化剂( b h a 、b h t ) 更强的抗氧 化能力，同时具有在人体内消除羟自由基的活性，以保护细胞组织兔受氧化作 用的损害，从而起到保护心脑血管系统、抗癌和抗衰老等作用。 1 4 4 抗氧化剂抗氧化能力的检测方法3 研 9 1 前言 经过多年的对于抗氧化剂的研究，已经建立了一套筛选和研究抗氧化剂的 方法和模型，以期能够模仿生物体的实际情况，评估抗氧化剂在生物体内发挥 抗氧化性的能力。 目前，主要从以下几个方面开展：体外实验体系，包括溶液体系清除自由 基能力的检测，抗脂质体过氧化检测，抗自由基对蛋白质和核酸损伤能力的检 测，以及细胞或组织体系中清除自由基能力的检测等等；体内实验体系一般是 通过建立某种实验动物模型来检测与抗氧化清除自由基有关的生理功能，例如 降血脂、降低动脉硬化几率、抗衰老、抗癌以及与心肌再灌注缺血或其他疾病 等等，当然有的最终还需要人体试食或试用实验。其中，检测清除自由基能力 采用的溶液体系主要有利用f e n t o n 反应产生羟自由基的体系，光照核黄素 e d t a 体系或利用黄嘌呤黄嘌呤氧化酶产生超氧阴离子自由基的体系等等。检 测清除自由基能力的细胞体系有利用促癌剂p m a 刺激多形核白细胞呼吸爆发 的体系，组织体系有利用缺血再灌注损伤心肌的体系等。具体的检测方法则有 直接检测自由基的电子自旋共振( e s r ) 捕集技术，以及通过检测氧化产物的化学 发光法和比色法等。 不同抗氧化剂的抗氧化能力依赖于自由基的种类、产生过程、产生部位及 它所作用的靶【加 。故通过抗氧化试验确定抗氧化剂的抗氧化能力，应考虑采取 多种自由基，作用于多系统、多方面来进行。 1 4 5 本文选用的抗氧化检测体系简介 ( 1 ) 邻苯三酚自氧化盐酸终止剂法检测清除超氧阴离子自由基能力 超氧阴离子自由基( 0 2 ) 是基态氧接受一个电子形成的第一个氧自由基， 即它是生物体中第一个生成的自由基，又是所有氧自由基的前身，可以转化为 其它氧自由基，因此具有非常重要的意义【3 7 l 。 超氧阴离子自由基( 0 2 ) 是有毒的活性氧之一，几乎所有的高等生物体内 都有0 2 产生，0 2 。受控产生对机体有益，而0 2 的异常产生则会直接或间接 地损伤细胞，导致机体衰老、炎症、癌症及某些自由基疾病。超氧阴离子自由 基( 0 2 ) 的氧化作用：通过超氧阴离子夺取一个电子把其它物质氧化，本身被 还原，还原型细胞色素c 、还原型谷胱苷肽、半胱氨酸、维生素c 、维生素e 、 茶多酚、胡萝b 素、黄酮类、肾上腺素、没食子酸、n a d p h 等都可以被超氧阴 离子自由基氧化【3 7 】。能够产生0 2 1 的体系很多，如邻苯三酚、肾上腺素、6 一 羟基多巴胺的自氧化体系、黄嘌呤一黄嘌呤氧化酶体系、乳酸一乳酸脱氢酶体 系、核黄素光氧化体系、碱性二甲基亚砜体系等。检测0 2 的方法也很多，有 化学发光法、电子自旋共振法、电子顺磁共振法、放射免疫法、比色法f 采用细 胞色素c 、氮蓝四唑等) 、极谱氧电极法等。本文采用了邻苯三酚自氧化的比色 分析法，这种方法所用试剂及仪器比较简单，测试方便，稳定性好，重现性好， 天津科技大学硕士学位论文 其灵敏度与经典方法( 黄嘌呤氧化酶一细胞色素c 法) 相当，适宜于在般实 验室采用；邻苯三酚在自氧化过程中，产生0 2 。同时产生有色中间物质。如加 入0 2 清除剂，便可抑制邻苯三酚的自氧化，同时也抑制了有色中间物质的产 生，通过比色便可得出抗氧化剂对0 2 _ 的清除效力【4 2 】。 邻苯三酚( 1 ，2 ，3 - 羟基苯，焦性没食子酸，焦培酚) 法的主要原理是在碱 性条件下，邻苯三酚在迅速自氧化过程中产生有强烈光吸收的中间产物和0 2 ， 抗氧化剂能够抑制邻苯三酚自氧化反应。在p h 8 2 的条件下，邻苯三酚自氧化 过程中产生有色中间产物和0 2 ，这种中间产物的吸收波长为3 2 5 n m 。根据阻止 中间产物的积累而测定其活性f 4 2 1 。 邻苯三酚在弱碱性( p h8 2 1 环境中自身氧化分解产生0 2 的反应为： 一0 2 -+ 强烈光吸收的中间产物 该体系常用于测定s o d 或类似s o d 活性物质对0 2 的歧化活性。随着反 应的进行，0 2 在体系中会不断积累，导致反应液的吸光度( 3 2 5 n m 波长) 在 反应开始后5m i n 之内随时间变化而线性增大。因此在该时间内，于3 2 5 n m 处 测定含被测物反应液的吸光度随时间的变化率，并与空白液比较便可得出被测 物清除0 2 - 的能力【4 引。 ( 2 ) 苯甲酸荧光分光法检测清除羟自由基能力 羟自由基是己知最强的氧化剂，比高锰酸钾( k m n 0 4 ) 和重铬酸钾( k ：c r 2 0 7 ) 的氧化性还强，反应性极强，在水溶液中仅存在1 0 4 秒。但作用半径小，仅能 和它附近的分子反应。羟自由基通常发生抽氢反应和与芳环结构的物质发生加 成反应。主要由h a b e r w e i s s 反应和f e n t o n 反应产生【3 7 j 。 能够产生o h 的体系也很多，如f e n t o n 反应体系、还原型谷胱甘肽一过氧 化氢体系，烟酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸一h 2 0 2 体系、抗坏血酸一h 2 0 2 体系、抗 坏血酸- - c u 2 + 体系、水的辐射体系等，其中最常用的是f e n t o n 反应体系。对o h 的检测方法有气相色谱法、液相色谱法、电子顺磁共振法、电子自旋共振法、 化学发光法、比色法等，其中比色法比较简便，适宜在一般实验室采用，其他 方法则需要昂贵的仪器，操作也复杂。本文采用f e n t o n 反应产生o h ，以比色 法检测产生的o h 。f e n t e n 反应是生物体内产生o h 的主要反应，反应原理【4 6 l 可简单表示为： f b 2 + + h 2 0 2 ，f e 3 + + o h + o h 一 o h 可攻击芳环化合物( 如水杨酸) 产生羟基化产物( 2 ，3 一二羟基苯甲 酸等) ，这些羟基化产物与显色物质反应可呈色，以比色法可测得，如向反应体 系中加入o h 清除剂，则o h 减少，羟基化产物也相应减少，由此可推算o h 1 前言 清除剂清除o h 的效力1 4 ”。 由于o h 是反应性很强的自由基，存在寿命极短，故需要加入各种捕获剂。 本实验在该反应体系中加入苯甲酸，苯甲酸是一种荧光很弱的物质，生成的o h 用过量的苯甲酸捕捉，且o h 可以和其发生反应，生成具有强荧光的产物。当 紫苏提取物加入到含有o h 的溶液中时，可以和o h 结合，从而将其清除， 这样产物的生成量就会减少，造成其荧光强度降低。荧光强度越低，o h 清除 能力越高。因此，其荧光强度( f ) 可代表o h 生成的相对量【4 5 1 。 ( 3 ) f e 2 + 引发卵磷脂质脂体过氧化t b a 比色法检测抑制脂质过氧化能力 在自由基的作用下，脂质中的多不饱和脂肪酸( ( p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d ， p u f a ) 发生过氧化，其过氧化反应的最终产物丙二醛( m d a ) 在酸性条件下 与硫代巴比妥酸( t b a ) 加热( 1 0 0 ，2 0 6 0 r a i n ) ，生成粉红色物质，可显示 脂质过氧化的的情况。在实验过程中，过氧化物降解产生的自由基又可使其他 脂质分子过氧化，扩大反应的值，为消除之，可在加t b a 前加三氯醋酸改变 p h 值以防止实验过程中过氧化的扩大和干扰实验结果 4 0 i 。 脂质过氧化的检测方法主要有：电子自旋共振法、二烯共轭法和硫代巴比 妥酸法等。以上检测脂质过氧化的方法均可用于检测受试物是否可抑制脂质过 氧化反应，从而了解其抗氧化性。其中，t b a 法用于检测受试物是否对生物脂质 体系( 如红细胞、脂蛋白、组织匀浆、肝微粒体