（食品科学专业论文）转反义LeEIL2基因番茄植株鉴定及采后生理特性的研究.pdf

摘要 乙烯是一种结构最简单的植物激素，调控植物自身的生长发育和成熟衰老通过它的感受及 信号转导实现其生理作用。乙烯的生物合成途径早在上世纪7 0 年代末就已经阐明并得到广泛的 研究。9 0 年代建立了拟南芥乙烯信号转导途径模型：q h 2 一e 豫一c z r e 日记一e m 一职f 一乙 烯反应。e i n 3 基因首先是从拟南芥的突变体中克隆得到的，作用于c t r 下游，位于核内，编码 转录因子。l e e i l 2 是从番茄离体叶片中克隆得到的e i n 3 的同源基因。本实验室人员在研究l e e l l 2 基因序列的基础上，克隆得到l e e l l 2 基因序列，成功构建了反义l e e i l 2 植物表达载体，利用农 杆菌介导法进行遗传转化。成功获得了9 8 株具有抗性的转反义l e e i l 2 基因番茄植株。 本研究对具有抗性的转反义l e e i l 2 基因番茄植株进行了p c r 检测和杂交鉴定，筛选出阳性 植株，继而对阳性植株采后番茄果实及叶片的相关生理特性进行研究，希望能进一步认识l e e i l 2 基因在番茄成熟衰老进程及乙烯信号转导途径中的作用和生理功能。 本实验主要进行了以下三方面的工作，并取得了相应的研究结果： ( 1 ) 具抗性转反义l e e i l 2 基因番茄檀株的移栽及鉴定：从生根培养基上筛选出长势较好的 抗性苗，移入营养土中进行培养，进而定植于温室中。总共移植成活了9 8 株具有抗性的转反义 l e e i l 2 基因番茄植株。取番茄植株叶片进行p c r 检测，初步获得7 2 株p c r 水平呈阳性的转基 因植株。进而对这7 2 株植株进行s o u t h e r n 杂交鉴定，最终获得了5 8 株阳性转反义l e e i l 2 基因 番茄植株。 ( 2 ) 转反义l e e i l 2 基因番茄檀株果实采后生理特性研究；实验测定了与果实采后成熟衰老、 品质变化及贮藏性能相关的一系列指标，如乙烯生成量、呼吸速率、果实硬度、可溶性固形物含 量、番茄红素含量、激素含量、a c s 和a c o 活性等。测定结果从各个角度充分说明，转反义l e e i l 2 基因番茄果实与普通番茄相比，其果实的成熟衰老进程极大程度受到抑制。果实品质得以提高， 果实耐贮性也相应增强。 ( 3 ) 转反义l e e i l 2 基臣番茄檀株离体叶片生理特性研究：实验对番茄植株离体叶片伤乙烯、 膜透性和叶绿素含量分别进行了测定。结果显示转反义l e e i l 2 基因番茄与普通番茄相比，离体 叶片伤乙烯释放受到抑制、叶绿素含量高于同时期普通番茄，并且膜电解质渗出率相应降低，说 明转反义l e e i l 2 基因番茄叶片的衰老进程可能受到抑制细胞膜稳定性得以增强，从而提高了 植株的抗逆能力。 关键词：番茄，乙烯，转基因，s o u t h e r n 杂交，成熟衰老，采后生理 a b s t r a c t e t h y l e n ei sap h y t o h o l o n ew i t hs i m p l es t m c t o r ea n di si n v o l v e di nm a n yp b y s i o l o g i c a lp r o c e s s e d ， i n c l u d i n gg r o w t hd e v e l o p m e n t , s t r e s s s p o n s e ，f r u i tr i p e n i n ga n ds g l l c s e e f l c e e t h y l e n eb i o s y n t h e s i s p a t h w a yh a sb e e ns t u d i e di n t e n s e l y m7 0 o f2 0 t hc e n t u r ya n dt h ew b 0 1 。p a t h w a yh a sb e e ne l u c i d a t e d e t h y l e n es i g n a l i n gm o d e lh a sb e e ne s t a b l i s h e dm l a s t2 0y e a r sa sf o l l o w s ：g | h 2 一e 玎卜- c 豫一l 2 一 e i n 3 - - e r f e t h y l e n er e s p o n s e e 1 n 3w a sf i r s tc l o n e di na m b i d o p s i st h a l i n am u t a n t a n di th a sb e e n s u g g e s t e dt h a te 凸日a c t e dd o w n s t r e a mt oc t rl o c a t e di nn u c l e a ra n de n c o d e dt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s k e l l 2w a sae l n 3g e n ec l o n e df r o mt o m a t ol e a v e s r e s e a r c h e r si no u rl a bh a sc l o n e dt h ew h o l e s e q u e n c eo f 工e e l 2 c o n s t r u c t e di ti n t oa l la n t i - s e n s ev e c t o r , t r a n s f o r m e dt h ev e c t o ra n d9 8t r a n s f o r m e d t o m a t op l a n t sw e r eo b t a i n e d t h i ss t u d yf o c u 辩d0 nt h ei d e n t i f i c a t i o na n dp h y s i o l o g ya n a l y s i so ft o m a t oe x p r e s s i n ga n t i - s e n s e l e e i l 2 , i no r d e rt op m v i d em o r ei n f o r m a t i o na b o u tt h er o l eo f l e e l 2i nr i p e n i n ga n ds e n e s c e n c ea n d e t h y l e n es i g n a l i n gp a t h w a y ( 1 ) t r a n s p l a n ta n di d e n t i f i c a t i o no ft o m a t oe x p r e s s i n ga n t i s e n s el e e i l 2 ：7 2t o m a t op l a n t sw e r e s e l e c t e da sp o s i t i v ea c c o r d i n gp c rt e s tf r o m9 8p l a n t s 5 8p l a n t sw e r et e s t e da st o m a t oe x p r e s s i n g a n t i s e n s el e e i z 2i nf u r t h e rs e l e c t i o nu s i n gs o u t h e mb l o t t i n g ( 2 ) p o s t h a r v e s tp h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft o m a t o 心u i l se x p r e s s i n ga n t i s e n s el e e i l 2 ：s o m e p a r a m e t e r sa b o u tf r u i tr i p e n i n g , n u t r i t i o n a lc h a r a c t e ra n ds t o r a g ep e r f o r m a n c ew e r em e a s u r e d ， i n c l u d i n ge t h y l e n ep r o d u c t i o n ，r e s p i r a t i o nr a t e ，f l e s hf i r m n e s s ，l y c o p e n ec d n t a n t ，p h y t o h o r m o n e c o n e e r t r a t i o na n da c sa n da c ea c t i v i t i e s ，a n dr e s u l t ss u g g e s t e dt h a t , c o m p a r e dw i t hw i l dt o m a t o f r u i t ，t o m a t of r u i te x p r e s s i n ga n t i s e n s el e e i l 2s h o w e dad e l a y e dr i p e n i n gp r o c e s s ，p r o m o m d n u l t i t i o n a lv a l u ea n ds t o r a g ed u r a t i o n 0 、p h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e ro f 怯凼e dl e a v e s o ft o m a t oe x p r e s s i n ga n t i s e n s e 厶匠旺五w o u n d e t h y l e n e m e m b r a n ep e r m e a b i l i t ya n dc h l o r o p h y l lc o n t e n tw e m e a s u r e da n dr e s u l t si n d i c a t e dt h a t w o u n de t h y l e n ei ne x c i s e dl e a v e sw a si n h i b i t e d ，w h i l ec h l o r o p h y l lc o n 啪tw a sh i g h e rt h a nt h a to f w i l dt o m a t o , a n dm e m b r a n ep e r m e a b i l i t yw a sl o w e at h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a ts e n e s c e n c ew a s i n h i b i t e da n ds t a b i l i t yo fc y l o l e m m aw a ss t r e n g t h e n n e di nt o m a t ol e a v e se x p r e s s i n ga n t i s e n s e f e n 。2 k e yw o r d s ：t o m a t o ，e t h y l e n e ，t r a n s g e n e ，s o n t h e mb l o t t i n g ，f r u i tr i p e n i n g ，p o s t h a r v c s tp h y s i o l o g y 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：哒阃： 岁s 年f 窍t 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 导师签名： 时间：矿s 年月，钿 时闻： 口e 年g 只菇e t 哆 饧 、p 云 曙厂 中国农业大学硕士论文第一章文献综述 第一章文献综述 n e l j u b o v 于1 9 0 1 年首先提出乙烯是植物发育的调节剂。当空气中乙烯浓度达到o 1 m g k g 时， 就对植物的发育具有明显的作用( s i s l e r , 1 9 9 5 ) 。乙烯参与植物生长发育过程中许多方面的调控， 如发芽、开花、脱落和衰老等。同时乙烯对植物在胁迫条件下，如机械损伤、病虫害、旱、涝等 条件均有较强的相关反应( k i e b e r , 1 9 9 3 ；s t e p a n o v ae ta 1 ，2 0 0 0 ) 。1 9 2 4 年e e d e n n y 发现乙烯能促 进柠檬脱绿，1 9 5 9 年气相色谱技术应用于乙烯检测，大大促进了乙烯研究的发展，最终确定了乙 烯是植物体内源产生的天然激素。乙烯作为影响采后果蔬生理的最重要因子，同时又是控制果蔬 衰老的关键所在，一直以来也是人们研究采后生理及贮藏保鲜方面的重要课题。乙烯的生物合成 途径早在上世纪7 0 年代末就已经阐明并得到广泛的研究。9 0 年代，又建立了拟南芥乙烯信号转 导途径模型：q 娲正口卜- c 刀t e 口v 2 一e 口v 了一e r f 一乙烯反应( k i e b e re ta 1 ，1 9 9 3 ；e c k e re ta 1 ， 1 9 9 5 ；c h a n g e t a l ，1 9 9 6 ；c h a o e t a l ，1 9 9 7 ) 。 番茄是研究乙烯与果实成熟衰老关系的理想模式植物。目前在拟南芥乙烯信号转导研究的基 础上，番茄乙烯感受及信号转导途径以及与果实成熟衰老关系的研究已展开。 1 1 乙烯的生理作用及生物合成 1 1 1 乙烯的生理作用 果蔬按成熟过程中呼吸特性分为跃变型果实( c l i m a c t e r i cf r u i t ) 和非跃变型果实( n o n - c l i m a c t e r i c f r u i t ) 。跃变型果实在果实成熟过程中会出现一个明显的呼吸高峰。伴随呼吸高峰的出现，果实中 叶绿素迅速降解，胡萝h 素和番茄红素合成，果实呈现出红、黄、橙等特征性色泽。同时果实淀 粉含量下降，糖含量上升，细胞壁物质被分解，质地软化，芳香物质迅速合成，使果实的品质显 著提高，这些都成为果实成熟最明显的标志。研究发现，果实的呼吸高峰出现之前，伴有一个乙 烯的合成高峰，去除环境中的乙烯或施加乙烯合成或感受的抑制剂( 如a v g 、d a c p 、1 - m c p 和 a g + 等) 能延缓或抑制果实成熟；而施加外源乙烯或其同源物( 如丙烯) 可以加速果实成熟过程 ( l i o n c o l ne t a l ，1 9 8 7 ) 。可见，呼吸高峰是由乙烯的刺激而产生的( j u r g e t a l ，1 9 9 5 ) 。 根据跃变和非跃变型果实对乙烯生成特性和对乙烯反应的不同，提出了关于乙烯合成系统i 和系统i i 的假设( m c m u r e h i e 甜a 1 ，1 9 9 2 ) 。他们用丙烯处理两类不同的果实，发现跃变型果实在跃 变前乙烯的合成水平及速率很低，在果实生长期至跃变前这一段时期，乙烯保持稳定的低水平 与采后跃变期乙烯的大量生成有明显区别，这时的乙烯合成系统为系统i ，负责跃变前果实中低 速率基础乙烯的生成。跃变期乙烯的迅速大量生成称为系统，负责跃变期采后成熟过程中乙烯 的自我催化，即果实的成熟过程一旦启动，果实便可自动生成乙烯。跃变型果实的呼吸高峰及与 成熟衰老相关的变化可能都是由于受系统i i 乙烯的作用。在跃变型果实的成熟过程中，乙烯起启 动呼吸跃变和促进果实成熟的作用。 在果实成熟过程中，伴随有大量的r n a 和蛋白质的合成过程，乙烯可促进来熟果实中新r n a 中国农业大学硕士论文第一章文献综述 和蛋白质合成，如与成熟有关的p g 酶，其中r n a 和蛋白质含量在成熟时迅速增加，与乙烯生 物合成有关的酶类如a c c 合成酶，a c c 氧化酶含量均有明显升高。大量结果显示，乙烯是通过 调节果实中的基因表达而影响成熟过程( d e i k m a ne ta l ，1 9 9 7 ；l e l i e v r ee ta l ，1 9 9 7 ) 。使用r n a 合 成抑制剂和蛋白质合成抑制剂可抑制果实的成熟过程。非跃变型果实的成熟过程，虽然没有呼吸 高峰出现，但也伴有许多基因的表达，但究竟是哪种因子起着主要的调节作用，目前还不太清楚 ( l e l i e v r ee t 口，。1 9 9 7 ) 。 近年来，成熟相关基因的克隆和基因表达的研究为阐明果实成熟衰老机理、乙烯与果实成熟 的关系以及果实成熟衰老的人工调控提供了丰富的依据。通过对果实c d n a 文库的筛选，已经分 离了十九个与成熟有关的t o m 系列c d n a 克隆，这些克隆在成熟果实中表达较强，而在其它组织 中则不表达，说明这些克隆与成熟过程密切相关。m a n s s o n 等人( 1 9 8 5 ) ，通过乙烯处理果实分离 了一些受乙烯诱导表达的基因克隆，如e 、e 8 、e 1 7 等。p i n c t o n 等人通过对番茄成熟前期正常果 实和成熟突变体咖c d n a 文库的筛选，分离出了在正常果实中表达而在r i n 突变体中不表达的e t r 系列基因克隆。这些基因的分离与定性对研究果实的成熟衰老过程起了积极的推动作用。 通过植物生物技术我们可以增强或抑制植物中某些内源基因的表达，或将外源基因导入植物 中使之表达，从而产生植物自身所不能合成的某些物质。对于跃变型果实而言，可以通过控制乙 烯生物合成来调节成熟过程，可以通过反义r n a 技术来抑制乙烯生物合成过程中的某些基因的表 达，或增强乙烯合成前体物质的代谢过程来实现。同时还可通过乙烯对转录翻译过程的调控来实 现。同时，这些能影响果实成熟的转基因植物材料，对我们进一步研究果实成熟的分子机理具有 十分重要的作用( 李正国，2 0 0 0 ) 。 传统的采后生理及贮藏保鲜的理论和技术虽然经过不断的深入和完善，但已经无法满足现代 果蔬生产的需要。要实现果蔬贮藏技术大的飞跃，必须依靠先进的生物技术手段认识果蔬采后成 熟衰老的本质，通过基因工程技术对果实的成熟衰老进行有效的调控，才能达到理想的贮藏效果 ( 罗云波，1 9 9 5 ) 这就是果蔬采后生物技术所要研究的内容。也是目前国内外果蔬采后生理研 究工作的一个非常活跃的领域。目前对果蔬采后生物技术的研究主要集中在以番茄为材料的乙烯 的生物调节以及乙烯对果蔬成熟衰老的作用机制上。同时，一些与成熟有关的酶以及编码这些酶 蛋白的基因也正在被广泛的研究。 1 1 2 乙烯的生物合成 7 0 年代末期，杨祥发等人发现1 氮基环丙烷羧酸( a c c ) 是乙烯生物合成的直接前体，确 定了植物体内乙烯生物合成的途径。目前，乙烯生物合成途径及其调节已基本清楚，即巳t s a m a c c c 溅。在乙烯的生物合成过程中，每一步反应都是在特定的酶催化下完成的，只有 了解这些酶的特性，才能有效地调控乙烯的生物合成过程，并最终为生产所利用。其中两个关键 酶a c c 合成酶( a c s ) 和a c c 氧化酶( a c o ) 已分离定性，a c c 合成酶和a c c 氧化酶基因的 克隆也己获得成功。因此，研究乙烯生物合成过程中的各种酶及其调控，便成为上个世纪七、八 十年代乙烯研究中的重要内容。图1 - 1 为乙烯的生物合成及其调控原理图。 2 中国农业大学硕士论文第一章文献综述 圈1 - 1 乙烯的生物台成及其调控 f 培1 - 1 b i o s y n t h e s i s p a t h w a y a n dr e g u l a t i o n o f e t h y l e n e ( w a n ge t a l ，2 0 0 2 ) 1 1 2 1a c c 合成酶( a c s ) a c c 合成酶是各组织及各生理过程中乙烯生物合成的关键酶。该酶于1 9 8 6 年首次从番茄果 实中纯化( b l e e c k e r e t a l ，1 9 8 8 ) ，其基因于1 9 8 9 年首先从小西葫芦果实中获得( s a t o e t a l 1 9 8 9 ) 。 a c c 合成酶以单体或二聚体( 汤福强等，1 9 9 4 ) 甚至三聚体( n a k a j i m ae ta 1 。1 9 9 0 ) 形式存在， 以单体存在时活性较强( 汤福强等，1 9 9 4 ) ，在催化反应时较不易失活( s a t o he t a l ，1 9 8 8 ) 。单体 分子量约在4 5 - 7 0 k d 左右。 a c c 合成酶由多基因家族编码，不同因子可诱导该家族中不同成员表达，不同来源或同一 来源的基因家族不同成员在序列上均存在8 个保守区，并且与氨基转移酶基因家族具有一定同源 性。不同成员编码区长度与序列略有差异，非编码区同源性则很差( 金勇丰等，1 9 9 6 ) ，内含子 数目并不保守( r o t t m a ne ta l ，1 9 9 1 ) 。这一家族中不同成员受不同因子诱导而产生乙烯。在番茄 中至少有9 个a c s 基因，其中有两个直接调控果实成熟l e d c s 2 和l e a c s 4 。o e u e r 等( 1 9 9 1 ) 将反义a c s 基因转入番茄中，几乎完全抑制了成熟过程中l e a c s 2 和l e a c s 4 基因的表达，明显 抑制乙烯合成。 1 _ 1 2 2a c c 氧化酶( a c o ) a c c 在a c c 氧化酶催化下生成乙烯，这是乙烯生物合成途径中最后一个步骤，催化这个过 程的酶是a c c 氧化酶( a c o ) 把外源a c c 供给植物组织就能使乙烯生成量增加，表明这个酶是 固有的。同a c c 合成酶的情况一样，当植物受外界刺激乙烯合成增加时，a c c 氧化酶的活性也 相应升高，如果实成熟( d o n g e t a l ，1 9 9 2 ；b a l a g u e e t a l ，1 9 9 3 ) ：花的衰老( w a n ga n d w o o d s o i l 1 9 8 9 ) ： 伤害反应( b a l a g u e e t 以，1 9 9 3 ) ；对乙烯的反应( b a r r y e t a l ，1 9 9 6 ) 等。 h a m i l t o n 等1 9 9 1 年从与番茄成熟有关的基因克隆中筛选出克隆p t o m l 3 并证明t o m l 3 是编 码a c c 氧化酶的基因。g r a y 等1 9 9 2 年在番茄基因组中发现多个与p t o m l 3 同源的基因。说明a c c 3 中国农业大学硕士论文 第一章文献综述 氧化酶可能存在多种同工酶。目前的研究表明：a c c 氧化酶至少有三种同工酶。a c c 氧化酶是由 一个小的基因家族编码，基因间的表达差异不大。目前，已分别从鳄梨、苹果、桃、矮牵牛、番 茄和甜瓜中分离到a c c 氧化酶基因。b a r r y 等从番茄中分离得到的三个a c o 基因分别为l e , l c 0 1 ， l e a c 0 2 和l e a c 0 3 中，l e a c 0 1 和l e a c 0 3 在花和成熟果实中表达，而l e a c 0 2 只在受伤叶片和 花的发育过程中表达。 1 2 乙烯信号转导 乙烯对植物各种生理效应的研究一直集中在生物合成途径的调控上，对于植物从感受乙烯到 作出生理反应的信号转导途径我们了解很少。但最近几年。由于分子遗传学研究取得了长足的进 展。从而加速了乙烯信号转导的研究。图1 - 2 显示了植物体内乙烯信号转导的途径。 圈1 - 2 乙燔信号转寻途径( 拟南芥) f 培1 - 2 b 【h y l c n cs i g m t r a n s d u 曲o n p a t h w a y i n a m b i d o p s i s ( w a n g ，e t a l ，2 0 0 2 ) 目前的研究表明，乙烯的感受是通过一个膜内受体家族来完成的。在拟南芥中，至少有5 个 受体家族成员参与乙烯的感受：e t r i 、e t r 2 、e i n 4 、e r s l 和e r s 2 ( c h a n g e t a l ，1 9 9 3 ；h u a e t a ， 1 9 9 5 ，1 9 9 8 ；s a k a ie t a ，1 9 9 8 ) 。乙烯通过一个辅因子( 铜) 结合到受体上( r o d r i g u e z e t a t ，1 9 9 9 ) 。 遗传学研究认为，乙烯的结合使受体失活( h u a e t a ，1 9 9 8 ；h i x a y a m a e t a l ，1 9 9 9 ) 。在没有乙烯存 在的情况下，受体被假定为是具有活性的组氨酸激酶，它能激活一个与动物r a f 蛋白相似的丝 苏氨酸激酶c t r l ，它也是乙烯信号转导途径的一个负调控因子( k i e b c re ta 1 ，1 9 9 3 ) 。遗传学研究 还推测e i n 2 、e i n 3 、e i n 5 和e i n 6 是乙烯反应的正调控因子。e 1 n 2 是一个与金属离子转运相关 的膜内蛋白，它的功能还不十分清楚( a l o s o n e t a ，1 9 9 9 ) 。e i n 5 和e i n 6 蛋白的序列和功能目前 正在研究之中。核蛋白e 口访和它的同源物e i n 3 - i _ j k e 蛋白( 肌s ) 是转录因子，它与乙烯反应基 因结合，并启动一系列调节乙烯目标基因表达的转录级联反应( c h a oe t 以，1 9 9 7 ；s o l a n oe t 以， 1 9 9 8 ) 。 4 中国农业大学硕士论文第一章文献综述 1 2 1 乙烯受体家族 在拟南芥中利用“三重反应”表型鉴别了第一个乙烯不敏感突变体e r r l 。其结合乙烯的能力 只有野生型的1 5 ，在乙烯存在的条件下，不表现“三重反应”。把e t r l 基因转入酵母，获得的 酵母菌株具有明显的乙烯结合能力，而野生型酵母菌株不能结合乙烯，由此推断e t r l 基因为乙 烯受体蛋白基因( s c h a l l e r e t a l ，1 9 9 5 ) 。乙烯受体蛋白由多基因家族控制，目前，已先后从拟南芥 中分离了5 个受体蛋白基因，e t r l 、e r s l 、e t r 2 、e i n 4 和e r s 2 。番茄中也分离了5 个乙烯受 体蛋白基因l e e t r l 、l e e t r 2 、n r 、l e e t r 4 和l e e t r 5 。其中l e e t r l 、l e e t r 2 、l e e t r 4 和l e e t r 5 与e t r l 的序列同源性分别为9 0 、8 0 、4 2 和4 0 ，r 突变株果实不能成熟( p a y t o ne t a l ，1 9 9 6 ；j a c k q 、w i l k i n s o n e t a l ，1 9 9 5 ) 。 1 2 2 口，芹 c t r l 基因产物是乙烯信号转导的中心组分，编码一个大约9 0 k d 的蛋白，但不含明显的膜 结合区域，是乙烯反应途径中由于基因功能缺失而形成的一个乙烯反应负调节因子。拟南芥中 c t r l 基因编码的蛋白位于e t r l 受体蛋白的下游。c t r i 蛋白的羧基端与丝，苏氨酸蛋白激酶的 r a f 家族具有显著的相似性，r a f 是细胞信号转导级联反应的一部分，它参与了包括促有丝分裂 原、生长激素等的信号级联反应( k i e b e re ta 1 ，1 9 9 3 ；h u h re ta l ，1 9 9 6 ) 。c t r l 具有r a f 蛋白的三 区结构，在氨基酸组成上具有相似性，其羧基端与r a f - 1 激酶区的保守序列具有高度的相似性， 它的结构与致丝裂索活化的蛋白激酶激酶激酶( m a p k k k ) 相似，它相当于酵母渗透胁迫反应途 径中的s s k 2 s s k 2 2 ( c l a r ke t 以，1 9 9 7 ) 。c t r l 的n 端含有r a f 蛋白具有的高度保守的半胱氨酸 结构和富含丝，苏氨酸的区域，可能起调节c 端激酶区的作用。c t r l 基因的两点突变使激酶区的 固定残基发生变化，提示c t r l 引起下游靶蛋白磷酸化，从而抑制了乙烯的作用。 c t r l 基因突变时导致激酶活性的丧失。而c t r l 突变体表现为组成型三重反应，说明c t r l 的激酶活性是负调控乙烯的。与c t r l 同源的基因已从番茄中分离出来，但目前对其功能及后续 转导途径尚不明了( c h a n g e t a l 1 9 9 6 ) 。 】2 3e z 2 e i n 2 是乙烯和胁迫反应的一个双功能传导蛋白，在拟南芥中，还参与了生长索、细胞分裂 素和脱落酸等植物激素的作用，以及延迟叶片衰老的作用。是乙烯信号转导途径下游一个重要的 中心成员，它介导蛋白激酶c t r l 和转录因子e i n 3 e i l 之间的信号传递。还可能与乙烯受体发挥 作用，与所需要的二价阳离子的转运有关( a l o n e t a l ，1 9 9 9 ) 。 研究表明，e i n 2 位点的突变对外源及内源乙烯均不敏感( r o m a ne ta l ，1 9 9 5 ；c h e ne ta l ， 1 9 9 5 ) 。e c k e r 等人于1 9 9 0 年分离出了拟南芥乙烯不敏感突变体e i n 2 ，它是一个隐性突变。目前 已分离出2 5 个e i n 2 突变的等位基因，其中除了e i n 2 9 之外，所有e i n 2 突变在形态、生理及分子 水平上均表现出完全的乙烯不敏感性。另外，在筛选生长素转录抑制剂、细胞分裂素、脱落酸， 以及延迟衰老的突变体中也发现了e i n 2 ，而未发现其它任何乙烯不敏感位点。e n 2 是目前已知的 唯一一个其功能突变导致完全乙烯不敏感的基因( r o m a n e t a l ，1 9 9 5 ) 。而且它可能是几种植物激 5 中国农业大学硕士论文 第一章文献综述 素信号转导途径的共同组分，参与植物激素之间的协同作用。 1 - 2 4 乙烯反应元件及结合蛋白 受乙烯调控表达的基因在其启动子上游都有一个乙烯反应元件( e t h y l e n er e s p o n s ee l e m e n t ) ， 它能与被称为是转录因子的结合蛋白结合，诱导该基因的表达。目前，在番茄中分离出与乙烯反 应元件结合的乙烯反应元件结合蛋白( e t h y l e n er e s p o n s ee l e m e n ta n db i n d i n gp r o t e i n s ) 。乙烯反应元 件结合蛋白由e i n 3 e i l 基因编码蛋白诱导表达，从而建立了乙烯与被诱导表达基因之间的关系。 1 2 5e i n 3 基因及其编码蛋白的结构和功能 对拟南芥e i n 3 突变体的研究发现，拟南芥e i n 3 突变体对乙烯反应减弱，幼苗缺乏对乙烯的 三重反应，依赖乙烯的基因表达和叶片的衰老减弱，说明e i n 3 基因是乙烯信号转导中一个必需 的调节因子。拟南芥中分离和定性e i n 3 基因，显示其编码一种核结合蛋白( c h a oe ta l ，1 9 9 7 ) 。 虽然e i n 3 基因的氨基酸序列分析未发现与已有的蛋白同源，但e i n 3 的氨基酸组成、结构特点和 基因功能与三个e h 归相似( e n 3 - l i k e ) 蛋白有很好的同源性。基因分析表明，e l l l 和e l l 2 能 恢复e i n 3 突变体的生理功能，说明它们参与了乙烯信号转导过程。高水平表达e i n 3 和e i l l 的 转基因植株，并不需要e i n 2 蛋白参与乙烯信号转导过程，在生长发育的各个时期均表现为组成 型的乙烯反应生态型，表明它们可以在缺乏乙烯的情况下活化乙烯的反应过程( s o l a n oe t a l ，1 9 9 8 ) 。这说明e i n 3 e i l 可能作用于e i n 2 下游。在e i n 3 、e i n 2 双突变幼苗中也未发现幼苗对 乙烯的其它效应，这也说明它作用于e n 2 下游( r o m a ne t 以，1 9 9 5 ) 。但是，e i n 3 e i l 家族蛋白 的生理功能仍不清楚，对于其生化活性的研究由于缺乏目标基因而无法进行。 e i n 3 基因编码的蛋白质具有以下几个结构特征：( 1 ) 在n 端具有一个富含酸性氨基酸的区 域；( 2 ) 中部有一个脯氨酸富集区：( 3 ) 有一个超螺旋结构：( 4 ) 有几个强碱性氨基酸区域；( 5 ) e i n 3 和e l l l 蛋白在c 端分别有几个由重复的天冬酰胺或谷氨酰胺组成重复序列。酸性氨基酸区 域、脯氨酸富集区、谷氨酸富集区已被认为是转录的活化调节区( m i t c h e l le ta l ，1 9 8 9 ) 。说明 e i n 3 e i l 蛋白可能是转录调节因子。 螺旋结构被认为是蛋白质与蛋白质相互作用的一个特征它可直接与d n a 结合 ( l u p a s ，1 9 9 6 ) 。e 1 n 3 和所有的e i l 蛋白所显示的螺旋结构表明，它们作为二聚体( 同源或异源 二聚体) 或寡聚体而发挥作用的。靠近n 端的a 螺旋结构和富含碱性氨基酸的特点，与植物中 的一种转录因子b z i p 家族的d n a 结合区十分相似。虽然e i n 3 和e l l 蛋白并不含已知的d n a 结合区，但其中含的q 螺旋结构和碱性氨基酸区似乎可以作为一种新的d n a 结合区而取代b z i p 家族中的碱性拉链( b a s i c - z i p p e r ) 结构。在e i n 3 和e i l 蛋白中的这些位点的保守性表明，它们 是作为一种转录因子而发挥作用。 图1 3 显示了拟南芥e 3 基因和e 1 n 3 e i l a 编码蛋白的结构特点： 6 中国农业大学硕士论文 第一章文献综述 圈1 - 3e i n 3 基因和e i n 3 e i z a 编码蛋白的结构特点 f i g 1 - 3 s c h e m a t i c s t m c t m a l d i a g r a m o f e i n 3 9 r i l l e a n d e i n 3 e 1 l s p o l y p c p t i d e s ( c h a o 等，1 9 9 7 ) 1 9 9 8 年，s o l a n o 等从拟南芥中分离了一个乙烯早期反应基因，称为乙烯反应因子1 ( e t h y l e n e r e s p o n s e - f a c t o r1 e r f l ) 。基因分析表明它作用于e i n 3 及其它已知的乙烯信号转导因子的下游。 e i n 3 基因的表达对删基因的转录是必须和足够的。高水平表达的e i n 3 植株，其e r f l 也表 现为活化所有的乙烯反应过程。e i n 3 和e r f l 的d n a 形成的结合蛋白为乙烯信号转导复合体提 供了一个新作用位点。研究显示，e n 3 和e 正l 蛋白与早期乙烯反应因子e r f l 的启动子结合，这 种转录因子复合体的形成可能作为一种输出信号或影响最终调节复合物来调节乙烯的生理反应 过程( s o l a n o e t a l 1 9 9 8 ) 。 圈1 4e i n 3 e i l s 蛋白在乙烯反应中的作用 f i g 1 - 4 r o l ef o re 1 n 3 e i i , sp r o t e i n si nt h e 甜i y l e r e 8 1 n s e ( t r e n t m a n n ，2 0 0 0 ) 7 中国农业大学硕士论文第一章文献综述 t r e n t l l n a n n 于2 0 ( g 年从拟南芥中分离出一个新的受乙烯调控的核定位蛋白，命名为e r n l ， 它作用于点嬲下游。e r n l 被认为是乙烯反应的负调节因子，因为乙烯能够抑制整个转录过程中 e r n l 的表达。研究表明乙烯可能是通过e 册脚孙蛋白抑制e r n l 转录水平的( t r e n t m a n n ，2 0 0 0 ) 。 因此，e i n 3 在某些情况下可能作为转录抑制因子而起作用。 e i n 3 基因的表达是必须而且足够活化已知的乙烯信号转导过程。见图1 - 4 ，但对下游其它乙 烯信号转导突变体，如e i n 5 、e l n 6 和e i n 7 基因功能和作用仍不清楚。本实验室利用反义r n a 技 术拟对番茄中的e i n 3 基因进行转基因研究，希望为进一步研究e i n 3 的功能奠定基础。 1 2 6 乙烯感受和信号转导的调控模式 目前的研究认为，已知的各个相关基因中，受体e t r 基因家族和激酶c t r 是负调节因子， 而下游的e i n 2 和e i n 3 是正调节因子。在没有乙烯存在的情况下，乙烯受体中的组氨酸激酶和 c t r l 激酶呈活化状态，丽下游组分e i n 2 和e i n 3 受到抑制，乙烯反应不能发生。当有乙烯存在 时，作为乙烯受体的e t r 家族感受乙烯后改变自身构型，组氨酸激酶失活，使得c t r 组氨酸激 酶活性关闭，导致下游组分e i n 2 和e i n 3 激活而表达乙烯诱导基因，结果产生乙烯反应 ( k i e b e r , 1 9 9 3 ) 。该过程是通过一系列磷酸化级联反应来完成的( t h e o l o g s 。1 9 9 8 ；e c k e re ta 1 ， 1 9 9 5 ；c h a n g , 1 9 9 6 ) 。图1 5 是一个乙烯感受和信号转导的初级调节模式( t a k e s h i e t a l 2 0 0 0 ) 。 圆圃 叵乎正回 田1 - 5 乙烯信号转导调控模式 f i g 1 - 5 a m o d e l o f t h e i l e g u l a t i o n o f e t h y l e n es i 驴a l t t a n s d u c f i o n ( t a k e s h ie t a l ，2 0 0 0 ) 综上所述，近几年来通过对拟南芥乙烯反应突变体的分子遗传学研究，使得乙烯信号传导的 研究进展十分迅速，相继克隆了乙烯信号转导途径中几个重要的基因，乙烯信号转导途径中各基 因的位置关系及功能基本确定，但对于各组分之间相互作用的具体机理尚不清楚，有待进一步研 究。分子生物学、生物化学的飞速发展，必将为我们研究乙烯信号转导途径提供新的方法，相信 在不久的将来，这些问题可望得到解决。乙烯信号转导途径的阐明也必将为我们控制果实成熟提 供新的可供利用的基因，将对认识乙烯在果实中的作用及其作用机理，揭示果实成熟的分子机理 8 中国农业大学硕士论文第一章文献综述 具有重要作用。 1 3 研究目的与意义 e i n 3 是乙烯信号转导过程中的下游因子，作用于c j 限的下游，位于核内，编码转录因子， 本实验室徐晶宇博士利用筛选番茄c d n a 文库的方法，获得了番茄中的三个e i n 3 同源基因，命 名为l e e i l l 2 3 ，并对其功能进行了初步的研究，研究结果表明( 徐晶宇，2 0 0 2 ) ：在普通番茄果 实的不同成熟时期l e e l s 基因都有表达。其中l e e i l i 在果实成熟的各个阶段都以较高的水平表 达；l e e i l 2 随着成熟度的增加而基因表达增强，在果实的未熟和绿熟期表达量较低，从破色期开 始表达增强，粉红期l e e i l 2 基因的表达最强，在全红期后减弱：l e e i l 3 基因在果实成熟的各个 时期都以稳定的低水平表达。l e e i l s 基因( 特别是l e e i l 2 ) 表达的变化趋势与普通番茄果实的 不同成熟时期的乙烯生成情况具有较强的相关性。其中番茄l e e i l 2 与烟草t e l l 在核苷酸水平上 的同源性为8 1 。 番茄果实具有明显的成熟衰老过程和典型的呼吸跃变特性，有许多成熟突变体，其染色体基 因图谱研究的比较清楚，并有一个好的遗传转化系统，是研究乙烯与果实成熟衰老关系的理想模 式植物。目前，在拟南芥乙烯信号转导研究的基础上，已经初步分离出了一些番茄乙烯信号转导 相关基因如l e e t r l - 5 、l e c t r l 等，但其它的乙烯信号转导途径的重要组分仍然是未知的。因 此，还难以确定番茄中乙烯信号转导的途径，以及乙烯是怎样通过一系列的信号传递来调控果实 成熟衰老中的各种变化的。 在徐晶字博士获得的l e e i l 2 基因片段的基础上，本实验室薛印革硕士构建了一个反义片段 表达载体，随后又构建了全长l e e i l 2 基因的反义与正义表达载体，并将