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雅致放射毛霉蛋白酶的液体发酵生产及应用研究 摘要 雅致放射毛霉卅c 珈d m w d re l e g a n s ) 是腐乳酿造业的主要生产菌株之一。本文主要研究 了在液体培养条件下雅致放射毛霉产蛋白酶特征和蛋白酶的酶学性质，并对雅致放射毛霉蛋 白酶在新型腐乳生产中的应用进行了探讨。 研究结果表明：在温度2 8 、初始p h 值8 5 、摇床转速2 2 0 2 5 0r m i n 的条件下有 利于雅致放射毛霉a s 3 2 7 7 8 蛋白酶的生产。通过均匀设计方法优化了毛霉蛋白酶的产酶培 养基。菌体的生长符合l o g i s t i c 模型，毛霉蛋白酶的合成符合l u e d e k i n g - - p i r e t s 方程。 对雅致放射毛霉蛋白酶的酶学性质研究表明，毛霉蛋白酶属于中性蛋白酶，该酶的最适 p h 值为7 8 ，最适作用温度为4 0 5 5 。该酶的分子量在3 0k d 以上，主要是由高分子 量和中分子量的组分组成。 为了改进腐乳的传统生产工艺，将现代生物工程技术应用于腐乳生产，本实验尝试了酶 法生产腐乳的新工艺。优化后得到的水解工艺参数为：底物浓度1 4 ；毛霉蛋白酶添加量 3 7 4u g ：反应温度4 0 ；p h 值8 5 。在此基础上又进行了混合发酵和调质、调味实验， 最终产品的质量与市售红方腐乳近似。 本实验为腐乳的酶法生产积累了经验，提供了有益的数据。 关键词腐乳，雅致放射毛霉，蛋白酶，水解 t h e s t u d y o nl i q u i df e r m e n t a t i o na n da p p l i c a t i o no f a c t i n o m u c o re l e g a n sp r o t e a s e a b s t r a c t a c t i n o m u c o re i e g a n si so n eo ft h e 皿m a r ys t r a i n su s e di nt h ef e r m e n t a t i o no fs u f u t h e f e r m e n t a t i o no fm u c o rp m t e a s ei nc o n d i t i o no fl i q u i ds u b m e r g e dc u l t u r eo fa s 3 2 7 7 8a n dt h e c h a r a c t e r i s t i c so ft h ep r o t e a s ew e r es t u d i e di nt h i sr e s e a r c h t h ea p p l i c a t i o no fm u c o rp r o t e a s ei n t h en o v e lw a y so f s u f uf e r m e n t a t i o nw e r ea l s os t u d i e di nt h i sp a p er t h er e s u l t so ft h ee x p e r i m e n t ss h o w e dt h a ta c t i n o m u c o re l e g a n sa s 3 2 7 7 8c a np r o d u c e m u c o rp r o t e a s ew e l la t2 8 、i n i t i a lp h8 。5o nar o t a r ys h a k e rw i t has p e e do f2 2 0 2 5 0r r a i n t h ec o n s t i t u t i o no fm e d i u mo fp r o t e a s ep r o d u c e db y a c t i n o m u c o re l e g a n sw e r eo p t i m i z e dt h r o u g h u n i f o r m i t yd e s i g n i t sg r o w t ha c c o r d e d w i t ht h eg r o w t hm o d e l o fr o g i s t i c ，a n dt h er u l eo fm u c o r p r o t e a s ep r o d u c t i o nf i t st h el u e d e k i n g - - p i r e t se q u a t i o n t h es t u d yo fm u c o rp r o t e a s ec h a r a c t e r i s t i c ss h o w e dt h a tm u c o rp r o t e a s eb e l o n g e dt on e u t r a l p r o t e a s e ，t h ei d e a lc o n d i t i o n sf o rt h ep r o t e a s ea c t i v i t yw e r e4 0 5 5 ，p h7 8 t h ed i s t r i b u t i o n o ft h ep r o t e a s em w sw e r ea b o v e3 0k d ，a n dw e r em a d eu po fh i g ha n dm e d i u mp a r t s i no r d e rt oi m p r o v et h et r a d i t i o n a ls u f uf e r m e n t a t i o na n da p p l yt h eu p - t o d a t eb i o - t e c h n i q u e 幻t h em a n u f a c t u r i n gp r o c e s so fs u f u w em a d er e s e a r c ho np r o d u c i n gp a s t e - p a t t e r ns u f uw i t h e n z y m e s t h eo p t i m u mt e c h n i c a lc o n d i t i o n sf o rh y d r o l y z a t i o nw e r ea sf o l l o w s ：t h ec o n c e n t r a t i o n o fs u b s t r a t ew a s1 4 ，l h ec o n e e n h a t i o no fp r o t e a s ew a s3 7 4u g ，t h e t e m p e r a t u r eo f h y d r 0 1 y z m i o nw a s4 0 ，t h ep hw a s8 5 t h eh y d r o l y z a t i o nw e r ef o l l o w e db yt h ee x p e r i m e n t so f m i x e dc u l t u r e ，a d j u s t i n gt e x u r ea n dt a s t e t h eq u a l i t yo ff i n a lp r o d u c tc o u l dm e e tt h eq u a l i t yi n d e x o fc o m m e r c i a lr e ds u f u i tw a sc o n s i d e r e dt h a to u rr e a s e r c hm i g h tb eu s e f u lf o rp r o d u c i n gs u f uw i t he n z y m e s k e y w o r d s ： s u f u ，a c t i n o m u c o re l e g a n s ，p r o t e a s e ，h y d r o l y z a t i o n i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：彳锄；钾 时间： 勿。矿年，月玎日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 和；蠢耳 时间： 细年月万日 导师签名 弘 帆艄年彳月塑佃 中国农业大学颁上学位论文 第一章绪论 1 1 雅致放射毛霉简介 第一章绪论 雅致放射毛霉( a c t i n o m u c o re l e g a n s ) a s 3 2 7 7 8 属于结合菌亚门( z y g o m y c o d n a ) ，结 合菌纲( z y g o m y c e t e s ) ，毛霉目( m u c o r a l e s ) ，毛霉科( m u c o r a c e a e ) ，放射毛霉属 ( 爿c t i n o m u c o r ) 嘎 毛霉目( m u c o r a l e s ) 真菌是典型的陆生腐生菌，广泛分布在土壤内和腐败的有机物质 上。菌丝发达，生长繁密，大多无隔多核，只有在形成生殖器官或生长末j i 形成全封闭的隔 膜。茁丝体可分为两类，生长于基质内的可称为营养菌丝体；生于空气中，上有繁殖体的可 称为气生( 繁殖) 菌丝体。有的菌丝特化为假根和匍匐枝；有的形成厚垣孢子或芽孢子。在液 体培养基内，当二氧化碳过量时常呈酵母状细胞，当供氧时又长出菌丝体，这种现象称为二 型性。细胞壁组成复杂，以甲壳质为主。 毛霉的繁殖过程包含有性繁殖和无性繁殖两种方式。无性繁殖产生不能动的孢囊孢子， 这种孢子被包含在一个球形或梨形的孢子囊内。孢子囊可以单生在孢囊梗的顶端或着生在一 个具分枝的孢囊梗上。一般人型孢子囊单独着生在孢囊梗的顶端，球形的小型孢子囊着生在 孢囊梗中下部生出的短梗上，而柱孢子囊都集中在孢囊梗顶端，或在膨大的球体上放射状着 生或并列着生在一侧。 毛霉的有性繁殖是由配子囊接合形成接合孢子。此种接合最初是由两个邻近异质的菌体 各想对方发生一侧枝，称原配子囊。原配子囊接触后逐渐膨大各自发生一隔膜，在顶端隔出 一细胞，此细胞即成为配子囊，原配子囊其余的部分称为配囊柄。随后二配子囊间的隔膜消 失，最后发生一厚壁是为接合孢子。 放射毛霉属( a c t i n o m u c o r ) 苗落形态大致与毛霉近似，有匍匐菌丝和假根。孢囊梗分 枝。孢子囊球形，成熟后孢囊壁消解或开裂。囊轴各种形状。孢囊孢子单孢，光滑。菌丝上 有厚垣孢子，结合孢子未知。此属只有雅致放射毛霉一个种。 雅致放射毛霉( a c t i n o m u c o re 如期n s ) 菌落形态近似毛霉，棉絮状，高度超过1 厘米， 起初白色或浅橙黄色，后深青褐黄色。有匍匐菌丝和假根。包囊梗直立分枝多集中在顶端， 其主枝顶端有一较大孢子囊，其下有3 8 轮生分枝，每一分枝顶端各生孢子囊。包囊梗主 棱约3 0 微米，有时可达1 2 0 微米。分枝上的直径2 0 5 0 微米。老后深黄色，壁粗糙，有草 酸钙结晶，成熟后包囊壁消解或开裂，消失后留有囊领。囊轴不一致，在较大的孢子囊内长 卵形至梨形，5 0 6 0 3 0 4 0 微米。在较小的孢子囊内球形至扁球形直径1 2 3 0 微米。 包子囊圆形光滑或稍粗糙，壁厚，直径5 8 微米。气生菌丝上有厚垣孢子，圆形、壁厚、 黄色、有刺，内含油脂，接合孢子未知”l 。 雅致放射毛霉在2 5 3 0 ，湿度9 7 左右，可较好生长并产生酶。分泌的胞外酶系 主要包括蛋白酶、a 一淀粉酶、a j p 乳糖酶和脂肪酶等 3 】，酶系中以蛋白酶为主，其他酶的 酶活相对较低。雅致放射毛霉是我国腐乳生产用的主要毛霉菌种之一。 1 2 腐乳生产与雅致放射毫霉 1 2 1 腐乳的传统生产工艺 腐乳又称乳腐、乳豆腐、霉豆腐、酱豆腐，英文译名有s u f u ，t o s u f u ，f u s u ，f u y u 等十几种 4 1 是中国独有的传统发酵豆制品，它是以豆浆的凝乳状物经多种微生物复合发酵 制成的一种植物蛋自乳酪型食品。 腐乳的营养价值很高。腐乳中蛋白质含量在1 2 1 7 之间，除了含有大量的水解蛋白 质、丰富的游离氨基酸和游离脂肪酸以外，由于微生物的作用，还产生了相当多的维生素 b m 其含量仅次于乳制品的维生素b ，：含量。此外，腐乳中核黄素的含量比豆腐高6 7 倍， 还含有丰富的钙、磷、铁、锌等矿物质，且不含有胆固醇，具有质构细腻柔滑、滋味鲜美、 诱人食欲的特点，是人们喜爱的开冒佐餐食品和调味品，在众多的豆制鼎中占有十分重要的 位置，在欧美，因其质构类似软干酪而被称为中国干酪( c h i n e s e - c h e e s e ) 哪。 高效液相色谱分析表明1 6 ) ，腐乳中多肽的种类丰富，其分子量的分布近乎连续，这些肽 中极有可能含有抗氧化性肽、降血压活性肽等物质，有可能成为重要的生理活性肽的资源库。 经过发酵，腐乳中氨基酸的组成发生了明显的变化：腐乳的必需氨基酸与组成氨基酸的比值 从大豆蛋白的3 1 ，0 上升到3 6 1 ；疏水性氨基酸占组成氨基酸的比例从大豆蛋白的 3 6 7 上升到4 5 6 。疏水性氨基酸比例的增加，意味着腐乳有可能成为降胆固醇的功能 食品。 腐乳在中国具有1 5 0 0 多年的生产历史，北魏时期就有腐乳生产的记载，至明清时腐乳 生产的发展到达鼎盛时期。在漫长的发展历史中，腐乳的生产工艺经历了几次重大变革。最 初的腐乳生产是将豆腐直接用盐腌制进行发酵古代典籍中有“干豆腐加盐成熟后为腐乳” 的记载。由腌制型腐乳到发霉型腐乳是最重要的一次进步，现代腐乳生产又从天然发酵进步 到纯培养微生物发酵。 腌制法腐乳的生产工艺流程川如下： 食盐 t 豆腐+ 压干叶腌渍 _ +切块- 日晒叶蒸干。 乳腐 一 成 虮熟 密 一 味 麟+ 料 酒 一 燥千 2 一 净洗 一 躺 一 剌 中国农业大学硕上学位论文 第一章 绪论 从上述流程可以看出，腌制型腐乳的生产中由于没有前期培菌工序，故即使在后期陈酿 中加入了酒和调味料。其产品的风味比较单调，品质不能令人满意。这主要是因为缺少毛霉 所分泌的蛋白酶的作用。这种工艺是原始的腐乳生产工艺，早已被发霉法的发酵工艺所取代。 目前只有个别品种的腐乳还在沿袭腌制法制腐乳的工艺。 由予采用腌制法生产的腐乳品质不能令人满意，于是就出现了天然发霉型酿造腐乳的方 法。该方法的出现旱于我国明代，至明代万历年问，我国江浙一带已经成为腐乳的主要生产 基地。到了清代，腐乳的生产水平又有了进一步发展。随着腐乳的产量增加，出现了许多花 色品种，生产工艺的不同导致了自方、红方、青方、油方、糟方、酵方等产品种类的产生， 后酵期间配料的不同又产生出各种不同风味的花色腐乳，根据后酵期间是否配汤又有固态辅 料腐乳和液态辅料腐乳的区分。随着纯培养技术在生物工业领域的大规模应用，传统的腐乳 生产工艺在上个世纪又有了一次重大飞跃。1 9 4 2 年方心芳先生从腐乳毛坯上分离出一株菌 株，定名为五通桥毛霉( m u c o rl $ k t u n g k i a o ) a s3 2 5 ，自此开始了纯种发酵生产腐乳，许 多厂家开始使用优质纯种进行接种培养毛坯p ，9 】。因此，人们又将天然发霉型腐乳工艺称为 老法，将后者称为新法。 发霉型腐乳的生产工艺流程如下： 豆腐白坯+ 接种毛霉、前酵+毛坯+ 腌坯+盐坯 腐乳 总的来说。发霉型腐乳的生产工艺的发酵过程分为两个阶段：首先是腐乳的培菌过程， 包括处理坯、摆笼、接种培养、搓毛等操作是菌种在白坯上生长代谢、分泌酶类，同时生 成的苗丝体使坯体包裹成型、蛋白质部分降解成水溶性蛋白质的过程：在腐乳发酵的第二阶 段，是将搓毛后的白坯进行腌坯、配料、装瓶、后酵直至成熟的过程，后酵是坯体中蛋白质 等大分子物质在前酵中分泌的酶系与后酵时加入的汤料中的微生物和化学物质的协同参与 下降解与酯化成香的过程【l q 。腐乳后酵汤料配制是用面黄( 做酱的半成品) ，加腐卤澄清液泡 面黄，一层酱，一层豆腐。在面黄中含有大量的酶系，它们在后期陈酿间，经过一系列复杂 的化学变化产生了独特的风味。经过两步发酵后，腐乳形成了特有的色、香、味、体，细嫩 柔糯、富有营养。 1 2 2 雅致放射毛霉在腐乳生产中的作用 腐乳的生产是一个复杂的生物化学过程，其中微生物起着非常重要的作用| 1 l 】。腐乳前 期的培菌过程就是个由微生物分解并利用原料来生长和产酶为主导的生物化学过程。从腐 乳毛坯上分离出来的菌株，如五通桥毛霉a s3 2 5 、鲁氏毛霉、雅致放射毛霉a s3 2 7 7 8 等 都是从自然界筛选出的，并且经过长期诱变驯化，适应在以豆腐坯作为底物的环境下生长和 产酶的优良菌种。雅致放射毛霉作为腐乳的种主要生产菌株，在腐乳酿造过程中起到了以 下作用： 1 毛霉住固态培养基上的菌丝粗壮、致密、具有定的粘性和韧性，可以在腐乳表面形成 3 中圊农业人学硕士学位论文 第一章 绪论 一层0 2m m 厚的皮膜，对腐乳块型的形成和保持具有积极作用。毛霉菌丝形成的皮膜本身 也是腐乳的主要特色之一，对汤料中不同成分的透过具有选择性，保证了腐乳坯体在后酵时 保持一定内部的环境，形成柔弄l j 的黄色与鲜美的风味。毛霉菌丝体色泽洁白，有助于形成腐 乳鲜亮的色泽。 2 毛霉的生长繁殖速度较快，呼吸作用和代谢能力强，在较短的时间内进入对数生长期。 因此，在接种之后快速在豆腐白坯的表面形成菌丝膜，能有效地防止其他杂菌的污染。 3 毛霉在培养期间产生以蛋白酶为主的多种酶系能快速分解大豆蛋白等原料。研究表明 i o i ，到前期培菌结束时，豆腐坯中的水溶性蛋白质由原来的3 6 1 迅速上升到5 5 5 4 。除 蛋白酶外在腐乳的毛坯中还检测到了淀粉酶、脂肪酶、糖化酶、儿茶酚氧化酶的活力，这些 酶的协同作用对于腐乳色、香、味的形成起到了重要作用。 1 3 毛霉蛋白酶的研究现状 从腐乳的生产工艺中可以看出，发酵是腐乳生产的重要部分，酶在发酵过程中起着至关 重要的作用，可以说，没有酶的作用就没有腐乳的生成。由于蛋白质是腐乳白坯中除水以外 含量最多的成分，因此腐乳的发酵过程主要是以蛋白酶作用为主的生物化学过程。 在腐乳的前期培菌过程中，当白坯被接种后，孢子开始了生长繁殖，生成菌丝，并产酶、 分泌以蛋白酶为主的酶系。随着酶系的分泌，豆腐坯中的蛋白质等大分子物质开始被水解。 腐乳的后酵是大分子物质降解与酯化成香的主要过程，在此期间，蛋白质的水解程度被认为 是影响豆腐乳风味、质地的主要因素。毛霉红腐乳蛋白质的s d s - p a g e 分析表明【1 2 1 ：由于受 微生物分泌的蛋白酶的作用，无论在腐乳汤汁中，还是在腐乳表层和腐乳块中，都不存在完 整的大豆蛋白质，大豆蛋白已经水解为分子量较小的肽类等。这说明，在蛋白酶的作用下， 腐坯中大豆蛋白质的空间结构已经被破坏，豆腐坯变的柔嫩、充满鲜味，组分易于消化吸收， 营养效价大大增长。瘸乳发酵成熟后，小分子短肽约占腐乳水溶液部分总氮量的8 6 4 8 8 9 ，并与腐乳的鲜味有密切关系。对于毛霉蛋白酶的研究有助于揭示腐乳的酿造机理， 改造传统腐乳的生产工艺，为实现腐乳的大规模工业化生产奠定基础。 目前与毛霉蛋白酶相关的研究主要集中在以下三个方面：毛霉蛋白酶生产菌种的选育和 生长特征研究；毛霉产酶特性的研究；毛霉蛋白酶的酶学特性的研究。 从1 9 2 8 年魏品寿先生分离得到第一株腐乳生产用毛霉一腐乳毛霉开始，寻找新的腐 乳生产菌种的工作就一直在进行着。目前已经应用于腐乳生产的毛霉菌种就有腐乳毛霉 ( m u c o rs 咖) 、鲁氏毛霉( mr o u x a n u s ) 、五通桥毛霉( mi i 氇t u n k i a o ) 、毛霉( m u c o rs p ) 、 总状毛霉( mr a c e m o u s e ) 、雅致放射毛霉( a c t i n o m u c o r e l e g a n s ) 、冻土毛霉( mh i e m d l i s ) 、 黄色毛霉( m f l a v u s ) 等【l3 】【1 ”。近年来，我国学者在腐乳生产用毛霉的选育t 作上做了很多 工作，得到许多优良菌株。王瑞芝等 1 5 l 通过诱变和培养条件试验等工作，选育出一株性能 较好的优良菌株。曾长顺等【1 6 】从四川忠县腐乳毛坯上分离得到一株高大毛霉( m u c o ， m u c e d o ) ，研究了该菌的最适培养条件。鲍松林i 。7 1 分离得到了一株腐乳生产菌布氏毛霉 4 ( m u c o rp r a i n i i ) ，可以在土豆、豆芽汁、蛋白胨等培养基上旺盛生长，并考察了它的最适 生长温度和p h 值。胡巅等f 1 8 】选育出耐热毛霉( m u c o rs p ) h 4 菌株，并研究了其酶学特性。 邓芳席i2 9 1 选用毛霉菌株m 2 6 3 为出发菌株，进行了诱变及高温培养驯化获得了耐高温突变 株毛霉，研究了其生长条什和产酶条件。 毛霉在生物工业中的主要用途是用来生产酸性蛋白酶。最适p h 低的酸性蛋白酶在细菌 中是罕见的，它们主要存在于真菌中。酸性蛋白酶与动物蛋白酶如胃蛋白酶及凝乳酶性质相 似。因此常取代动物蛋白酶而用于奶酪和酱油的制造。嗜热的毛霉菌株微小毛霉( m u c o r s “缸) 及米黑毛霉( m u c o rm i e h e i ) 是目前用于乳酪生产的毛霉蛋白酶的主要来源【埘】。利用 毛霉菌种生产中性蛋白酶的研究相对较少，这是因为毛霉分泌的中性蛋白酶的酶活力不高， 最高仅为6 5 5 2 单位克( 绝干基计) 口”。从国内外对毛霉中性蛋白酶的研究情况来看，大 部分是对毛霉在固体培养条件下的产酶特性和提取方法研究。李理忙日等比较了毛霉m 2 6 3 在不同同体培养基上的生长和产酶情况，并考察了毛霉蛋白酶对大豆分离蛋白的降解作用。 在李理的另一篇研究文章中口”，对从麸曲中提取蛋白酶的方法进行了研究，指出用4 0 c ， 0 3m o l l 的n a c i 溶液反复抽提培养物，可以获得最佳提取效果。此方法提取的粗酶液含 有中性和碱性蛋白酶，其中性蛋白酶活力为1 2 6 u g 干曲。f e r n a n d e z ，l a h o r e - - h m l 2 4 1 等研 究了毛霉m 一1 0 5 固体培养物中酸性蛋白酶的纯化方法和酶学性质。s e o a g - i il i m 等1 2 5 1 1 2 6 1 对从韩国传统麦酒中分离除的总状毛霉m u c o r r a c e m o s u s f r a c e m o s u sp d a1 0 3 的固态培养的 最优条件和酶的纯化与特性进行了研究。鲍松林田 等研究了浙江绍兴腐乳的生产菌种林木 毛霉( m u c o rs i t v a t i o u s ) 的提取和检测方法，并对该酶的酶学性质进行了研究，指出该酶的 最适作用温度为5 5 6 0 ，最适作用p h 值为6 7 。盐和乙醇对该酶的酶活有较好的保护 作用。王磊口8 喀研究了毛霉m 9 1 0 5 在固体培养基上产蛋白酶的条件，得出毛霉m 9 1 0 5 分泌蛋白酶的最适培养条件为；温度3 0 左右，时间4 8h ，p h 为6 左右，培养基含水量 6 6 7 ，在此条件下产酶量可达9 5 4u g 。 由毛霉的生物特性可以看出毛霉的适宜生长环境是固态培养。而要实现毛霉蛋白酶的 工业化生产就必需对毛霉的液体培养和产蛋白酶条件进行研究。在液体培养条件下利用腐乳 生产用菌株产蛋自酶的研究已经见诸报道。江峰等p i 对五通桥毛霉a s3 2 5 液体培养生产 蛋白酶的发酵条件进行了研究，指出在p h 值为3 ，n a c i 浓度为0 5m o l l 的大豆培养液中 7 2 小时司：以得到最大蛋白酶酶活。潘进权p o 喀对于雅致放射毛霉a s 3 2 7 7 8 产蛋白酶的特性 进行了研究，研究了影响腐乳毛霉a s 3 2 7 7 8 产蛋白酶的一些囡素，包括培养基的组成、发酵 温度、p h 以及发酵时间等。结果表明，毛霉蛋白酶是一种诱导酶，其液体培养的最佳产酶培 养基组成：蔗糖3 ，大豆分离蛋白3 ，k h 2 p 0 4 0 2 ，m g s 0 4 0 0 5 ，z n s o 。0 0 3 。较 合适的发酵条件为温度2 8 。c p h 5 6 ，发酵时间4 8 h 。王丽英f 3 1 l 等研究了在摇瓶液体培养条 件下，不同培养基成分及发酵条件对雅致放射毛霉菌丝体生长的影响，并经正交实验得到其 最优的培养基组成为：黄豆粉3 、饴糖0 5 、硫酸镁0 2 、磷酸二二氢钾0 2 、酵母膏 0 1 ，在此条件下，2 8 、2 0 0r m i n 摇瓶培养6 4h ，毛霉菌丝体生物量( 以菌丝体干重表 示) 可达1 0 2g 1 0 0 m 。 利用液体培养技术生产毛霉蛋白酶适宜采用气升式发酵罐。原因是毛霉在液体培养条彳牛 5 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 f 形成直径2 5 m m 的菌丝球，到达对数生长期后，培养基内菌丝球密度很高，在用通用机 械搅拌式发酵罐进行培养时，搅拌器对菌丝体容易产生剪切作用。气升式发酵罐利用气体喷 射动能和液体的比重差造成气液循环，既满足了菌体对于溶氧的需求，义避免了对菌体的破 坏作用1 ”1 。目前已经有丝状真菌如黑曲霉、红曲霉、香菇菌丝等应用气升式发酵罐进行液 体培养研究的报导。 毛霉蛋白酶属于细胞外酶属于细胞外酶。大量的蛋白酶存在于毛霉菌丝的表面，与菌丝 体疏松结合，利用氯化钠和其他盐类可以将蛋白酶释放出来1 3 。毛霉酸性蛋白酶在其活性 中心含有一个天冬氨酸残基，而且其活性不受螯合剂、巯基试剂或丝氨酸蛋白酶抑制剂的影 响。微小毛霉蛋白酶是典型的酸性蛋白酶，其分子量为3 0 k d 不含碳水化舍物。此酶对具 有芳香族氮基酸测链的肽键是具有特异性的，在p h 咱之间较为稳定，在6 5 1 5 m i n 失 活9 0 凹l 。杨少军等p 4 1 采用分步盐析和离子交换层析技术从米黑毛霉半固体培养物的浸提 液中提纯了天冬氨酸蛋白酶酶活的收率为1 9 5 ，比活力达到3 0 8 0 s u m g 蛋白，提纯8 5 倍。胡巅等“”研究了耐热性毛霉菌株的酶学特性，认为该菌株分泌的蛋白酶主要是由酸性 蛋白酶和中性蛋白酶组成，基本不含碱性蛋白酶。何熙等1 3 5 1 研究了不同的电场强度、频率、 波形、处理时间及不同的介质对毛霉蛋自酶活力的影响。表明在一定范围内，电场有提高酶 活力的作用。在含盐7 的酒水中，酶的活力受到抑制。但经电场处理后，在此介质中酶活的 增长率最大的达2 0 ，优于以水为介质的情况。 综上所述，尽管在毛霉蛋白酶的产酶菌种选育、产酶特性和酶学性质上均有了一些相关 的研究，但是研究的对象主要是酸性蛋白酶，培养的条件也主要是固体培养。对于专门用于 腐乳生产的雅致放射毛霉的液体培养条件和蛋白酶性质的研究并不多见。因此，为了获得具 有较高酶活的雅致放射毛霉蛋白酶制剂，有必要针对雅致放射毛霉a s 3 2 7 7 8 液体深层发酵 产蛋白酶的培养条件和产酶过程进行深入研究。 1 4 腐乳生产工艺的研究现状 1 4 1 传统腐乳生产工艺存在的问题 长期以来，我国的腐乳一直沿用着传统的生产工艺，尽管腐乳在我国年总产量达到3 0 万吨以上，生产技术及生产设备都有一定的更新和改造，我国腐乳业也基本上步入了工业化 和现代化生产的轨道。但是，目前中国腐乳的生产还是存在许多问题郾叩咖q ，主要表现在 以下几个方面： 1 菌种对生产的限制： 现行生产中常用的菌种绝大多数为毛霉菌，主要有五通桥毛霉( a s - - 3 2 5 m w u t u n g k i a o 】、 腐乳毛霉( m u c o rs u f u ) 和雅致放射毛霉( a s _ 一3 2 7 a c i n o m u c o r e l e g a n s ) 。与其它霉菌相比， 毛霉不易产生孢子，且孢子量少，在制备菌种时工艺较复杂，要得到优照菌种相对困难；同 时，毛霉的耐温性较差，最适生长温度为1 5 2 5 ，3 0 以上生长困难，使许多腐乳厂 6 中国农业大学硕上学位论文 第一章 绪论 不得不在夏季停产，从而带来管理上的不便和经济上的损失，因此，选育耐高温、生长快、 酶活力高的菌种一直是生产用菌种筛选的主要目标。 2 块形概念对腐乳发展的制约： 在传统的观念中，腐乳的形态是块状的。为了追求腐乳完美的块形，在很多t 序人们一 直沿用着手工操作，且前期培菌时对菌丝体生长的致密程度与长短、对白坯的渗透程度都有 严格的要求，使前期培菌工艺复杂、过程繁琐、劳动强度大、不易控制。导致了生产劳动量 大、效率低。从字面上释义腐乳并无块状的含义，因此块状不应是其唯一的形态【3 9 】，腐 乳的发展不应受到块形概念的制约。在传统的生产工艺中，前期培菌的重要作用之一是使毛 霉生成致密的菌丝，从而赋予腐乳以韧性嫩滑的皮膜和和完整的形状，如果抛弃腐乳的块形 概念生产膏状腐乳，则前期培菌就只是单纯的产酶过程，而微生物的产酶完全可以借助于 现代生物工程手段来大量获得。 3 腐乳高盐度带来的弊病： 腐乳是高盐分食品，食盐在腐乳生产中有三大作用：一是使腐乳坯渗透析出水分，使坯 体不松烂，赋予腐乳成味：二是具有杀菌防腐、保证发酵正常进行的功效；三是对蛋白酶有 抑制作用，有利于香气的生成，同时食盐和谷氨酸作用，可以增加成品的鲜味。 从生物学观点来看，豆腐基质中高浓度的食盐对于蛋白酶把坯体中的不溶性蛋白转化成 可溶性蛋白和多肽类的速度以及脂肪酶作用于脂质的速度有阻碍作用，从而使腐乳成熟期大 为延迟，因此需要较长时间的后酵，也需要高浓度的盐分来保证后酵的正常进行，而腐乳后 酵时间长、占用空间大，严重地影响了厂房的利用、资金的周转以及市场的供应，使得腐乳 生产难以大规模工业化。 近年来的研究表明，成人的高血压症等疾病与食盐的摄入过量显著相关，使国外的食品 工业向低盐化发展。腐乳的高盐度严重妨碍了其功能性成分的作用。限制了产品的消费。阻 碍了这一优秀的民族传统食品市场的国际化。 1 4 1 腐乳生产新工艺的研究进展 由于传统的腐乳生产存在着一些无法克服的缺点，因此对腐乳工艺的革新势在必行。近 年来在腐乳科技人员的努力下，已经取得了一些研究成果，主要有以下几个方面： 1 前期发酵菌种的研究 传统腐乳生产受到气候因素的制约，主要是由于用于腐乳生产的毛霉菌种耐高温能力较 差。寻找耐高温并且产酶性能良好的菌种是解决问题的最佳方案，该领域的研究目前己取得 了一定进展。邓芳席等【19 l 通过化学诱变、紫外诱变和t 射线诱变，得到了一株能在3 2 下 正常生长的毛霉菌株，命名为m 2 6 3 3 。孙兴民等| 4 0 l 研究了少孢根霉r t 一3 的特性及其在腐 乳生产中的应用，表明该菌适宜的生长温度为3 7 4 0 ，适宜生长的p h 值3 o 4 5 ，而 且具有很高的蛋白酶活力，在腐乳生产中的应用也取得了成功。胡巅等【4 1 j 筛选到一株具有 7 中国农业大学硕士学位论_ ! ：c = 第一章 绪论 较好产酶性能的耐热性霉菌k ，该菌能在3 5 条件f 在豆腐坯上生长良好。 在筛选耐高温腐乳生产菌种的同时，利用多菌种混合培养进行前期发酵的方法也被提了 出来。多菌种发酵优于单一纯种，在生化反应过程中能起到酶系的互补、调节作用。王瑞芝 i “l 采用毛霉：根霉= 2 ：1 的比例进行了混合接种实验，在豆腐白坯上经过3 0 4 0h 的培养， 菌丝已大部分生长成熟，酶系基本形成。毛霉分泌大量蛋白酶，使蛋白质水解生成肽类和多 种氨基酸，使腐乳形成鲜美的滋味，但酒化力低，后酵时间长。根霉生长温度范围较宽，淀 粉酶含量多，糖化力高，并有一定的酒化能力，能将豆腐中的淀粉等多糖转化成单糖，在转 化成酒精，提高了腐乳风味。因此，多菌种发酵能完成纯菌种难以完成的复杂生化反应，是 促使腐乳风味合成的有效途径之一。 2 缩短腐乳发酵周勰的研究 传统腐乳生产时，发酵周期较长，在一般情况下，要经过4 6 个月，腐乳的色、香、味才能 达到国家质量标准要求。刘会勇等阳】研究了在腐乳后酵时，通过调整温度、添加增香酵母和 复合酶米实现缩短腐乳发酵周期。结果显示，温度在4 3 4 5 时，添加增香酵母、复合酶； 腐乳在发酵6 0 天时，香气浓郁，口感细腻，各项指标均达到了国家标准要求。邵伟等m l 采用 乳酸菌产酸使大豆蛋白变性凝固来代替传统的凝固剂，在进行毛霉培菌发酵的方法，使腐乳 的后酵时间缩短为3 0 4 0 天，同样达到了缩短腐乳发酵周期的目的。李幼筠1 2 1 】等采用毛坯 直接装瓶，通过添加酶制荆强化后酵的方法，使产品发酵周期由半年以上缩短至二个月左右。 通过物理方法进行腐乳的催熟，也是有效缩短发酵周期的一个手段。何熙等 4 5 , 4 6 采用高 频电场和磁场对进入发酵后期的瓶装腐乳进行催熟，结果表明，高压电场强度在3 0 0 5 0 0 v c m 下作用6 m i n ，可以缩短1 5 的后发酵期。磁场强度0 6 1 2t 、处理时间5 1 0 m i n 可以缩短2 5 左右的发酵周期。 3 新型腐乳概念的提出 腐乳的酿造实质是豆腐坯和辅料中的在酶催化下进行的生物化学变化的综合表现，风味 物质的形成也是通过酶的作用转化生成。因此，腐乳完全可以通过酶法来获得1 4 7 1 。通过直 接加入酶制剂不经过传统的培菌阶段生产腐乳。这样既可以减少因培菌工艺带来的杂菌污 染又可以缩短生产周期，使品质稳定，还保证了产品的低盐化，不受气候影响全年生产。 日本在7 0 年代分离得到酱油中的纯蛋白酶，目前已经可以在几个小时内生产出风味优良的 酱油。林中煌【删提出了发展膏状腐乳的思路。李理p 9 】等提出采用蛋白酶制剂生产新型腐乳 的理论。a o y a m a 等1 4 9 , s 0 1 成功分离纯化了大豆凝乳酶并对该酶的基因进行了全序列的分析。 通过对该酶的性质研究表明，该酶实际上是一种丝氨酸蛋白酶，它在作用于豆乳蛋白时，先 将大豆球蛋白适度降解，再通过疏水作用而聚集凝乳。从而将腐乳的研究深入到了分子生物 学的水平。 从上面的讨论可以看出，今后腐乳工业的发展方向是朝着工艺稳定可靠、生产周期短、 低盐化和方便化的方向发展。采用现代酶法生产技术是解决现在腐乳生产存在的诸多问题的 根本方法，也是实现腐乳作为功能性食品的作用、开拓腐乳国际市场的有效选径。 8 中同农业大学碗上学位论文第一章 绪论 1 5 论文立题背景及研究内容 随着科学技术与经济的发展，人类的平均寿命大大提高，同时发展中国家的人口数量高 速增长，造成了世界范围内的粮食短缺。由此引发的优质蛋白质摄取量过低是造成人类，尤 其是第三世界人民营养不良的主要因素。动物蛋白生产周期长，成本较高，过量摄取容易引 起心脑血管疾病。作为人类的主要的蛋白质来源，动物蛋白已经越来越不能满足人们的需要。 大豆蛋白作为一种植物蛋白质，具有营养全面、生产周期短、成本低等优点，已经受到人们 广泛的关注。大豆发酵食品更是由于具有多种生理活性和功能性物质的特点，成为世界范围 内的研究重点和热点。目前，在大豆发酵食品的研究领域，人们对于酱油、纳豆、天培等起 源于东方的传统大豆发酵食品给予了相当多的关注，而对于腐乳的研究目前还基本处于起步 阶段。 从上面的讨论可以看出，尽管腐乳中含有大豆异黄酮等多种对人体有益的功能性成分， 然而由于受到生产工艺的制约，腐乳的高含盐量成为阻碍其成为功能性食品的主要因素。腐 乳传统工艺中开放式的前期培菌、发酵成熟后不经灭菌直接出厂等环节的存在，都是导致产 品质量不稳定的潜在原因。目前对腐乳生产工艺进行改进的研究，大多还集中在改良菌种、 缩短后酵周期等方面，并朱对腐乳的生产模式进行本质性的改革。 本文从研究腐乳生产的出发菌株雅致放射毛霉入手，通过对雅致放射毛霉产酶特性、发 酵条件和发酵过程规律的探讨，找出雅致放射毛霉蛋白酶的最佳生产条件。利用液体培养技 术大量获得雅致放射毛霉蛋白酶，并将其应用于新型腐乳的生产工艺中，为最终实现腐乳的 酶法生产奠定基础。 本论文主要的研究内容包括 ( 1 ) 通过对雅致放射毛霉产蛋白酶发酵条件的优化，筛选出最佳产酶培养基的组成，优 化了培养条件；以摇瓶发酵优化条件为基础，进行小型发酵罐分批发酵试验，并以此试验数 据进行雅致放射毛霉蛋白酶分批发酵动力学研究，建立了分批发酵动力学模型； ( 2 ) 从发酵液中分离提取雅致放射毛霉蛋白酶，对蛋白酶进行了初步纯化；研究了雅致 放射毛霉蛋白酶与水解相关的酶学性质； ( 3 ) 将雅致放射毛霉蛋白酶应用于豆腐的水解工艺中，考察水解的虽佳 _ = 艺条件：对豆 腐的水解物进行二次发酵，研究二次发酵的工艺条件；在此基础上对发酵产物进行调质、风 味调配、灭菌，最终形成新型腐乳产品，将该产品与红方腐乳进行了理化指标和风味的对比。 9 中国农业大学硕士学位论文 第二章雅致放射毛霉虽白酶发酵条件优化及产酶过程研究 第二章雅致放射毛霉蛋白酶发酵条件优化及产酶过程研究 2 1 引言 本研究的目的在于将雅致放射毛霉蛋白酶应用于新型腐乳的生产。大幅度提高雅致放 射毛霉液体深层发酵液中蛋白酶的活力，从发酵液中获取大量生产用蛋白酶，是本课题需 要优先解决的问题。目前，针对雅致放射毛霉液体培养的研究比较少。现有的研究也主要 是以获得最大生物量，并应用于腐乳生产的前期培菌过程为目的。这与本课题获得最高酶 活的研究出发点不同，因此有必要研究在液体培养条件下，雅致放射毛霉蛋白酶合成所必 需的培养基组成和培养条件，使雅致放射毛霉的产酶性能充分表现出来。 雅致放射毛霉蛋白酶发酵的主要影响因素包括培养基组成和培养条件两个方面。碳源、 氨源和无机盐是培养基的主要组成成分，接种量、p h 值和溶氧水平等构成雅致放射毛霉液 体培养条件的诸要素，它们共同作用，对雅致放射毛霉的产酶过程产生影响。本章采用摇 瓶分批发酵的方法，利用雅致放射毛霉作为出发菌，对其产生蛋白酶的发酵条件进行了初 步研究，并通过对发酵条件的优化得到了最佳的发酵生产条件。 对雅致放射毛霉蛋白酶发酵过程的动力学研究，是本章的另一个主要研究内容。研究 动力学，可以为发酵过程的优化控制，小型发酵罐数据的放大，以及从分批发酵过渡到补 料分批发酵提供理论依据【5 l 】。发酵动力学模型一般包括菌体生长动力学模型、底物消耗动 力学模型和产物生成动力学模型。本章在利用摇瓶分批发酵优化产酶条件的基础上，利用 5 l 发酵撼，对雅致放射毛霉蛋白酶发酵过程进行了较为深入研究。建立了菌体生长、底物 消耗和产物形成动力学模型，并对数学模型进行了验证，为进一步放大试验和工业化生产 提供了理论依据。 2 2 材料和方法 2 2 1 菌种 雅致放射毛霉( a c t i n o m u c o re l e g a n s ) a s 3 2 7 7 8 ，由北京市王致和食品集团有限公司王 致和食品厂提供。 2 2 2 主要试剂 本章实验中用到的试剂如f i o 中国农业人学硕士学位论文 第一二章雅致放射毛霉蛋白酶发酵条件优化及产酶过程研究 2 2 3 主要仪器 本章实验中用到的仪器如下： 仪器名称型号 厂家 电子天平b s2 0 0 s 北京赛多利斯天平有限公司 恒温磁力揽拌器8 5 _ 2上海司强仪器厂 电热干燥箱c s l 0 1 - - 1 a b 重庆银河试验仪器有限公司 高压灭菌锅y x - 2 8 0 江阴滨江医疗设备厂 超净工作台h p s - - 2 5 0 北京半导体设备一厂 振荡培养箱$ 2 1 2 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 循环水式多用真空泵h z q - - - x 1 0 0 郑州长城科工贸有限公司 恒温水浴锅 w 2 0 1 b 上海申生科技有限公司 紫外分光光度计 5 5 2 上海精密科学仪器有限公司 搅拌式生物反应器c b c s 一5 b 镇江东方生物工程设备公司 微型漩涡混匀仪w h - 2 j ：海沪西分析仪器厂 恒温培养箱psh-525 重庆银河试验仪器有限公司 生物显微镜xsz 重庆光学仪器厂 分光光度计7 2 2 s e 海精密科学仪器有限公司 酸度计phs-25上海雷磁仪器厂 一 皇! ： ! 塑! 型 圭塑皇垫至垒垡墅 中国农业大学硕士学位论文 第二章雅致放射毛霉蛋白酶发酵条件优化及产酶过程研究 2 2 4 培养基 斜面培养基：改进p d a 培养基，马铃薯2 0 、葡萄糖2 、琼脂1 2 5 、营养琼脂0 7 5 ，自然p h 值。 基础培养基：酵母膏2 、葡萄糖i 、硫酸镁0 3 、磷酸二氢钾0 1 、氯化钙 0 5 ，p h6 0 。 种子培养基：豆粕粉3 、饴糖0 5 、酵母膏0 1 、硫酸镁0 2 、磷酸二氢钾 0 2 ，p h6 0 。 优化产酶培养基：豆粕粉3 7 、蔗糖0 2 、硫酸镁0 0 4 、磷酸二氢钾0 4 、氯 化钙0 i 。 2 2 5 培养方法 斜面培养：将雅致放射毛霉原始菌株接种于p d a 培养基斜面上，2 5 ，培养7 2h ，诱 导产生子囊孢子，显微镜检测生孢情况，将生长良好的生孢斜面置于2 4 冰箱内保存。 种子培养：接种前将生孢斜面从冰箱取出，在2 5 条件下静置4h 。以2 0 m l 无菌 生理盐水洗涤生孢斜面，收集孢子悬浮液。将孢子悬浮液接入种子培养基中，